DE69100768T2

DE69100768T2 - CD25-bindende Moleküle.

Info

Publication number: DE69100768T2
Application number: DE91810166T
Authority: DE
Inventors: Arne Nalpon Richmond Surrey Tw94Ld Akbar; Peter Lloyd London N9 9Bl Amlot; Salvatore Ch-4153 Reinach Cammisuli; Guenther Ch-4125 Riehen Heinrich
Original assignee: Sandoz AG; Royal Free Hospital School of Medicine
Current assignee: Sandoz AG; Royal Free Hospital School of Medicine
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1991-03-13
Publication date: 1994-05-11
Anticipated expiration: 2011-03-14
Also published as: IL97545A; JPH04316600A; PT97034B; US6521230B1; PL289436A1; SA92120358B1; NL990008I1; NL990008I2; DE19975033I2; DE69100768D1; CY1977A; EP0449769A1; IL97545A0; MY106161A; FI981799L; FI104047B1; AU7290991A; HU211885A9; ES2061216T3; EP0449769B1

Description

Diese Erfindung betrifft eine Immunsuppression und liefert genauer gesagt monoklonale Antikörper und andere bindende Moleküle gegen das CD25 Antigen.
Bei Organtransplantationsoperationen, insbesondere Nieren-, Leber-, Herz-, Lunge- und Knochenmarkstransplantationsoperationen ist es notwendig, das Immunsystem des Transplantatempfängers zu unterdrücken, um die Wahrscheinlichkeit für eine Transplantatabstoßung nach der Operation zu minimieren. Verschiedene immunsuppressive Arzneimittele wurden für diesen Zweck vorgeschlagen, aber ihre Anwendung muß sorgfältig überprüft werden, da zusätzlich zu den durch die Verwendung bestimmter immunsuppressiver Mittel auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen auch noch die Schwierigkeit besteht, daß die immunsuppressive Wirkung den Transplantatempfänger für eine Infektion durch Bakterien und Viren empfindlich macht, die durch ein normales Immunsystem unter Kontrolle wäre. Immunsuppressive Mittel, die in der Klinik erfolgreich angewendet wurden, beinhalten Steroide, Azathioprin und Cyclosporin A. Es ist in der Klinik wichtig, daß man versucht, den Grad an Immunsuppression zwischen dem zur Verhinderung oder Behandlung von Transplantatabstoßungsfällen erforderlichen und dem zum Erhalten einer bestimmten Stärke des Immunsystems des Empfängers notwendigen Maß einzustellen, um andere infektiöse Agentien zu bekämpfen und gleichzeitig alle möglichen unerwünschten Nebenwirkungen unter Kontrolle zu halten.
Zusätzlich zur Verwendung von immunsuppressiven Arzeimitteln, gilt die Aufmerksamkeit auch der Verwendung von bestimmten monoklonalen Antikörpern (mAks) zur Unterdrückung von Immunreaktionen, insbesondere gilt die Aufmerksamkeit monoklonalen Antikörpern, die verschiedene Oberflächenantigene von T-Zellen erkennen. Hier sind ebenfalls in der Klinik Probleme aufgetreten, genauer gesagt waren Antikörper nach dem Stand der Technik entweder zu stark oder nicht ausreichend wirksam und verursachten manchmal schwere Nebenwirkungen, wie hohes Fieber.
Diese mAks werden im allgemeinen durch erfolgreiche Leucozyten-Typisierungs-Workshops mit einer CD Nummer (Cluster Determination) bezeichnet. Obwohl ein Begriff, wie CD3 jetzt häufig für das Oberflächenantigen der Zelle verwendet wird und ein mAk gegen dieses Antigen oft als "anti-CD3" beschrieben ist, werden in der folgenden Beschreibung Begriffe, wie CD3, CD25 usw. für mAk's verwendet und die entsprechenden Oberflächenantigene der Zelle werden als "CD3 Antigen" usw. beschrieben.
Insbesondere monoklonale Antikörper gegen auf allen T-Zellen vorkommenden Membranantigenen (auch als Pan-T-Zellantigene bezeichnet), wie das CD3 Antigen, sind sehr potente Antikörper, da sie eine umfassende suppressive Wirkung auf das Immunsystem haben. Daher wird der menschliche Körper der Immunreaktion beraubt, die normalerweise durch die Gedächtnis-T-Zellen vermittelt wird, wenn eine Infektion auftritt. Dies ist bestimmt nicht wünschenswert, wenn man mehr versucht, Transplantatabstoßungsfälle zu verhindern, als sie zu heilen. Eine geeignete Behandlung in der Prophylaxe sollte im wesentlichen selektiv sein, das heißt der Pool an Gedächtnis-T-Zellen sollte intakt bleiben, während die Katagorie an T-Zellen (aktivierte T-Zellen), die direkt bei einem Abstoßungsfall beteiligt sind, inaktiviert werden sollten.
Dieses wünschenswerte Ziel kann erreicht werden, indem man Antikörper gegen aktivierte T-Zellen verwendet. Diese T-Zellen sind durch das Vorkommen des hochaffinen IL-2 Rezeptors auf ihrer Membranoberfläche charakterisiert. Dieser hochaffine IL-2 Rezeptor ist aus mindestens zwei verschiedenen Polypeptidketten, einer α- Kette, auch bekannt als CD25 Antigen, und einer β-Kette zusammengesetzt. Ruhende T-Zellen exprimieren diesen hochaffinen Rezeptor nicht, aber niedrig- und mittelaffine Rezeptoren, die aus Homodimeren von α- oder β-Ketten bestehen. Ein CD25 Antikörper, der die Bindung von IL-2 an dessen hochaffinen Rezeptor beeinträchtigt und daher die Immunantwort selektiv unterdrückt, ist ein Antikörper der Wahl zur Prophylaxe von Transplantatabstoßungsfällen.
Natürliche Immunglobuline oder Antikörper stellen im allgemeinen ein Y-förmiges, multimeres Molekül dar, das eine Antigenbindungsstelle an den Enden jedes der oberen Arme aufweist. Der Rest der Struktur, insbesondere der Stamm des Y vermittelt Effektorfunktionen, die mit den Immunglobulinen verbunden sind. Die allgemeine Struktur eines Antikörpers der IgG Klasse ist in Figur 1A schematisch gezeigt. Sowohl schwere als auch leichte Ketten enthalten eine variable Domäne und einen konstanten Teil. Eine Antigenbindungsstelle besteht aus der variablen Domäne der schweren Kette zusammen mit der variablen Domäne der leichten Kette. Die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten haben die selbe allgemeine Struktur, die in Figur 1B gezeigt ist.
Genauer gesagt werden die antigenbindenden Merkmale eines Antikörpers im wesentlichen durch 3 spezifische Regionen in der variablen Domäne der schweren und leichten Ketten bestimmt, die hypervariable Regionen oder Komplementarität-bestimmende Regionen (CDRs) genannt werden. Wie in Figur 1B gezeigt, wechseln sich diese 3 hypervariablen Regionen mit 4 Framework-Regionen (FRs) ab, deren Sequenzen relativ konserviert sind und die nicht direkt an der Bindung beteiligt sind. Die CDRs bilden Schlaufen und werden in unmittelbarer Nähe der Framework-Regionen gehalten, die großteils eine β-Faltblattstruktur annehemen. Die CDRs der schweren Kette zusammen mit den CDRs der verbundenen leichten Kette bilden im wesentlichen die Antigenbindungsstelle des Antikörpermoleküls.
Die Bestimmung, was eine FR oder CDR Region bildet, wird normalerweise durch einen Vergleich der Aminosäuresequenz einiger von der gleichen Art gebildeten Antikörper durchgeführt. Die allgemeinen Regeln zur Identifizierung der CDR und FR Regionen sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
Weiterhin wurde vor kurzem gefunden, daß der von der variablen Domäne der leichten Kette gelieferte Beitrag zur Bindungsenergie verglichen mit dem der Domäne der verbundenen schweren Kette klein ist und daß isolierte Domänen der schweren Kette selbst eine Antigenbindungsaktivität aufweisen. Solche Moleküle werden jetzt allgemein als Einzeldomänenantikörper bezeichnet.
Einige CD25 mAks aus der Maus existieren bereits und beinhalten 33B3-1 (Immunotech-Merieux), BDαIL-2R (Becton Dickinson), 2C8 (Amersham), Campath 6 (MRC, Cambridge) und ATH207 (freie Universität Berlin). Es wurde jedoch gefunden, dar ein neuer CD25 Antikörper aus der Maus des IgG2a Isotyps, hierin später als RFT5- IgG2a bezeichnet, bessere Eigenschaften als die CD25 Antikörper nach dem Stand der Technik aufweist, insbesondere in Bezug auf die Bindungsaffinität und daß es möglich ist, andere CD25 bindende Moleküle zu konstruieren, die dieselben hypervariablen Regionen, die RFT5-IgG2a aufweisen.
Demnach liefert die Erfindung ein CD25 bindendes Molekül, das mindestens eine Antigenbindungsstelle enthält, die mindestens eine Domäne enthält, die wiederum die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 in Folge enthält, wobei CDR1 die Aminosäuresequez Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2 die Aminosäuresequenz Ala-Ile-Tyr-Pro- Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly und CDR3 die Aminosäuresequenz Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe aufweist oder direkte Äquivalente hiervon.
Ein erster erfindungsgemäßer Aspekt ist, daß das CD25 bindende Molekül eine einzelne Antigenbindungsstelle enthält, die eine einzelne Domäne enthält.
Ein zweiter erfindungsgemäßer Aspekt ist, daß das CD25 bindende Molekül mindestens eine Antigenbindungsstelle enthält, die folgendes umfaßt
a) eine erste Domäne, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 aufweist, wobei CDR1 die Aminosäuresequenz Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2 die Aminosäuresequenz Ala-Ile-Tyr-Pro- Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly und CDR3 die Aminosäuresequenz Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe aufweist, und
b) eine zweite Domäne, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1' , CDR2' und CDR3' aufweist, wobei CDR1' die Aminosäuresequenz Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2' die Aminosäuresequenz Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser- und CDR3' die Aminosäueresequenz His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr aufweist
oder direkte Äquivalente hiervon.
Falls nichts anderes angegeben ist, hat jede hierin beschriebene Polypeptidkette eine Aminosäuresequenz, die mit dem N- terminalen Teil beginnt und mit dem C-terminalen Teil aufhört.
Wenn die Antigenbindungsstelle sowohl die erste, wie auch die zweite Domäne enthält, können diese auf demselben Polypeptidmolekül liegen, oder vorzugsweise kann jede Domäne auch auf einer unterschiedlichen Kette liegen, indem die erste Domäne ein Teil der schweren Kette eines Immunglobulins ist oder eines Fragments hiervon und die zweite Domäne ein Teil der leichten Kette eines Immunglobulins oder eines Fragments hiervon ist.
Mit "CD25 bindendes Molekül" ist jedes Molekül gemeint, das an das CD25 Antigen binden kann, wenn dieses entweder alleine oder unter Bildung des hochaffinen IL-2 Rezeptors zusammen mit anderen Molekülen vorliegt. Die Bindungsreaktion kann durch Standardverfahren (qualitative Tests) gezeigt werden, einschleißlich beispielsweise eines Bioassays zur Bestimmung der Hemmung der IL-2 Bindung an seinen Rezeptor oder jede Art von Bindungsassay bezüglich eines Negativkontrolltests, in dem ein unspezifischer Antikörper verwendet wird, beispielsweise ein anti-Lysozym Antikörper. Vorteilhaft ist auch, daß die Bindung des erfindungsgemäßen Moleküls an das CD25 Antigen in einem kompetitiven Test mittels des AHT207, BDαIL-2-R oder 33B3-1 Antikörpers als Gegenspieler gezeigt werden kann. Vorzugsweise wird der AHT207 oder BDαIL-2-R Antikörper als Gegenspieler gewählt. Ein bestimmtes Beispiel eines Bindungsassays ist im folgenden dargestellt.
Humane mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (HPBM) werden im Kulturmedium RPMI 1640 gezogen, das mit 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 25 mM Natriumbicarbonat und 10 % fetalem Kälberserum (FCS) versetzt ist. 1 ug/ml Phytohämagglutinin (PHA) wird zur Stimulation der HPBM verwendet. Nach 3 Tagen werden die Blasten in einer Konzentration von 3 x 10&sup6;/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert, die mit 2 % Rinderserumalbumin (RSA) und 2 % Azid versetzt ist. 50 ul Proben dieser Suspension werden für 10 min bei 20ºC mit abgestuften Konzentrationen von 1 bis 100 ug/ml eines Antikörpers zum Blocken (Gegenspieler) unter Bedingungen inkubiert, die kein Capping ermöglichen. Dann wird 1 ug/ml erfindungsgemäßer, biotinylierter Antikörper zu den Zellen gegeben und die Inkubation wird für 10 min fortgesetzt. Die Zellen werden gewaschen und für weitere 10 min mit Fluorescein-markiertem Streptavidin inkubiert. Die Zellen werden erneut gewaschen, mit Formaldehyd fixiert und mit einem Fluorocytometer analysiert, das die Bindung des biotinylierten Antikörpers detektiert. Parallel dazu wird ein Experiment als Negativkontrolle mit einem unspezifischen Antikörper ausgeführt.
Zu Beispielen für antigenbindende Moleküle gehören unter anderem Antikörper, wie sie von B-Zellen oder Hybridomzellen gebildet werden und chimäre oder humanisierte Antikörper oder jedes Fragment hiervon, wie beispielsweise F(ab')&sub2; und Fab Fragmente, wie auch Einzelketten- oder Einzeldomänenantikörper.
Ein Einzelkettenantikörper besteht aus den variablen Domänen von schweren und leichten Ketten eines Antikörpers, die durch einen aus im allgemeinen 10 bis 30 Aminosäuren, vorzugsweise 15 bis 25 Aminosäuren bestehenden Peptidlinker kovalent verbundenen sind. Daher enthält eine solche Struktur nicht den konstanten Teil der schweren und leichten Ketten, und der kleine Peptidspacer dürfte weniger Antigenität aufweisen, als ein vollständiger konstanter Teil. Mit "chimärer Antikörper" ist ein Antikörper gemeint, bei dem die konstanten Regionen der leichten und schweren Ketten oder beide humanen Ursprungs sind, während die variablen Domänen sowohl der leichten Ketten als auch der schweren Ketten nicht humanen Ursprungs sind (beispielsweise von der Maus). Mit "humanisierter Antikörper" ist ein Antikörper gemeint, bei dem die hypervariablen Domänen (CDRs) nicht-humanen Ursprungs sind (beispielsweise von der Maus), während alle oder im wesentlichen alle anderen Teile des Immunglobulins, beispielsweise die konstanten Regionen und die hoch konservierten Teile der variablen Domänen, das heißt die Framework-Regionen, humanen Ursprungs sind. Ein humanisierter Antikörper kann jedoch wenige Aminosäuren der Maussequenz in den Teilen der Framework-Regionen beibehalten, die direkt an die hypervariablen Regionen anschließen.
Hypervariable Regionen können mit jeder Art von Framework-Regionen verbunden sein, die bevorzugt humanen Ursprungs oder aus der Maus sind. Geeignete Framework-Regionen werden in "Sequenzes of Proteins of immunological interest", E. A Kabat et al., US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health, beschrieben. Das bevorzugte Framework der schweren Kette ist jedoch das von RFT5-IgG2a, das in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigt ist. Es besteht der Reihe nach aus FR1, FR2, FR3 und FR4 Regionen. In ähnlicher Weise zeigt die Sequenzzuordung Nr. 2 das bevorzugte RFT5-IgG2a Framework für die leichte Kette, das der Reihe nach aus den FR1', FR2', FR3' und FR4' Regionen besteht.
Demnach liefert die Erfindung auch ein CD25 bindendes Molekül, das mindestens eine Antigenbindungstelle enthält, die entweder eine erste Domäne mit der Aminosäuresequenz enthält, die im wesentlichen identisch zu der in der Sequenzzuordung Nr. 1 gezeigten ist, die mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 117 endet, oder eine wie oben beschriebene erste Domäne und eine zweite Domäne mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen identisch zu der in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigten ist, die mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 104 endet.
Gegen ein natürlich bei allen Menschen auftretendes Protein müssen notwendigerweise monoklonale Antikörper in einem nicht-humanen System entwickelt werden, beispielsweise in der Maus. Als direkte Konsequenz daraus ruft ein von einer Hybridomzelle gebildeter xenogener Antikörper bei Verabreichung an Menschen eine unerwünschte Immunantwort hervor, die hauptsächlich durch den konstanten Teil des xenogenen Immunglobulins verursacht wird. Dies beschränkt die Verwendung solcher Antikörper deutlich, da sie nicht über einen langen Zeitraum hinweg verabreicht werden können. Daher ist es insbesondere bevorzugt, Einzelketten-, Einzeldomänen- , chimäre oder humanisierte Antikörper zu verwenden, die höchstwahrscheinlich keine wesentliche allogene Reaktion hervorrufen, wenn sie Menschen verabreicht werden.
In Anbetracht des Vorangegangenen ist ein erfindungsgemäß bevorzugteres CD25 bindendes Molekül aus einem chimären anti-CD25 Antikörper ausgewählt, der zumindest enthält
a) eine schwere Kette eines Immunglobulins oder ein Fragment hiervon, das umfaßt (i) eine variable Domäne, die Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 enthält, und (ii) den konstanten Teil einer humanen schweren Kette oder ein Fragment hiervon, wobei CDR1 die Aminosäuresequenz Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2 die Aminosäuresequenz Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr- Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly und CDR3 die Aminosäuresequenz Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe aufweist, und
b) eine leichte Kette eines Immunglobulins oder ein Fragment hiervon, die umfaßt (i) eine variable Domäne die in Folge die drei hypervariablen Regionen CDR1', CDR2' und CDR3' enthält, und (ii) den konstanten Teil einer humanen leichten Kette oder ein Fragment hiervon, wobei CDR1' die Aminosäuresequenz Ser-Ala-Ser-Ser-Ser- Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2' die Aminosäuresequenz Asp-Thr-Ser-Lys- Leu-Ala-Ser- und CDR3' die Aminosäueresequenz His-Gln-Arg-Ser-Ser- Tyr-Thr aufweist,
und direkte Äquivalente hiervon.
Alternativ dazu kann ein erfindungsgemäßes CD25 bindendes Molekül aus einem einzelkettigen Bindungsmolekül ausgewählt werden, das eine Antigenbindungsstelle enthält, die folgendes umfaßt
a) eine erste Domäne, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 enthält, wobei die hypervariablen Regionen die in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen,
b) eine zweite Domäne, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1', CDR2' und CDR3' enthält, wobei die hypervariablen Regionen die in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen,
c) einen Peptidlinker, der entweder an den N-terminalen Teil der ersten Domäne und an den C-terminalen Teil der zweiten Domäne oder an den C-terminalen Teil der ersten Domäne und an den N-terminalen Teil der zweiten Domäne gebunden ist,
und direkte Äquivalente hiervon.
Es ist bekannt, daß geringe Änderungen in einer Aminosäuresequenz, wie Deletion, Addition oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren zu einer Allelform des ursprünglichen Proteins führen kann, das im wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweist. Daher meint der Ausdruck "direkte Äquivalente hiervon" auch jedes CD25 bindende Molekül mit einer einzelnen Domäne (Molekül X)
(i) worin die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 als Gesamtheit mindestens 80 % homolog, vorzugsweise mindestens 90 % homolog, insbesondere mindestens 95 % homolog zu den in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten hypervariablen Regionen sind und,
(ii) das zur Hemmung der Bindung von IL-2 an dessen Rezeptor im gleichen Ausmaß in der Lage ist, wie ein Referenzmolekül, das die zu denen von Molekül X identischen Framework-Regionen aufweist, aber die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 zu denen in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten identisch sind,
oder jedes CD25 bindende Molekül, das mindestens zwei Domänen pro Bindungsstelle aufweist (Molekül X')
(i) worin die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' und CDR3' als Gesamtheit mindestens 80 % homolog, vorzugsweise mindestens 90 % homolog, insbesondere mindestens 95 % homolog zu den in den Sequenzzuordnungen Nr. 1 und 2 gezeigten hypervariablen Regionen sind und,
(ii) das zur Hemmung der Bindung von IL-2 an dessen Rezeptor im gleichen Ausmaß in der Lage ist, wie ein Referenzmolekül, das die zu denen von Molekül X' identischen Framework-Regionen aufweist, aber die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' und CDR3' zu denen in den Sequenzzuordnungen Nr. 1 und 2 gezeigten identisch sind.
Das letztere Kriterium kann in verschiedenen Assays einschließlich des Bioassays der gemischten Lymphocytenkultur (MLR), einem antigenspezifischen HPBM Reaktionsbioassay und einem IL-2 abhängigen T-Lymphoblasten Proliferationsbioassay getestet werden. Solche Assays werden später im Text beschrieben. Mit dem Ausdruck "im gleichen Ausmaß" ist gemeint, dar die Referenz und die entsprechenden Moleküle statistisch gesehen im wesentlichen gleiche IL-2 Bindungshemmkurven in einem der obigen Bioassays zeigen.
Insbesondere enthält der chimäre CD25 Antikörper zumindest
a) eine schwere Kette, die eine variable Domäne mit einer Aminosäuresequenz enthält, die im wesentlichen zu der in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten identisch ist und mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 117 endet, und den konstanten Teil einer humanen schweren Kette, und
b) eine leichte Kette , die eine variable Domäne mit einer Aminosäuresequenz enthält, die im wesentlichen zu der in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigten identisch ist und mit Glutaminsäure an er Position 1 beginnt und mit Glutaminsäure an der Position 104 endet, und den konstanten Teil einer humanen leichten Kette.
Der konstante Teil einer humanen schweren Kette kann vom γ&sub1;, γ&sub2;, γ&sub3;, γ&sub4;, u, α&sub1;, α&sub2;, δ oder &epsi; Typ, vorzugsweise vom γ Typ, insbesondere vom γ&sub1; Typ sein kann, während der konstante Teil der humanen leichten Kette vom κ oder λ Typ (der die λ&sub1;, λ&sub2; und λ&sub3; Subtypen beinhaltet) sein, aber vorzugsweise vom κ Typ ist. Die Aminosäuresequenzen von allen diesen konstanten Teilen sind in Kabat et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health wiedergegeben.
Konjugate des erfindungsgemäßen CD25 bindenden Moleküls, beispielsweise Enzym-, Toxin- oder Radioisotopenkonjugate sind ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten.
Ein erfindungsgemäßes CD25 bindendes Molekül kann durch rekombinante DNA Techniken hergestellt werden. In Anbetracht dessen müssen ein oder mehrere DNA Moleküle, die das Bindugsmolekül kodieren, konstruiert, unter geeignete Kontrollsequenzen gestellt und in einen geeigneten Wirtsorganismus zur Expression transferiert werden.
Sehr allgemein formuliert werden demnach bereitgestellt
(i) DNA Moleküle, die ein erfindungsgemäßes CD25 bindendes Molekül mit einer Domäne kodieren, ein erfindungsgemäßes einkettiges CD25 bindendes Molekül, eine schwere oder leichte Kette oder Fragmente hiervon eines erfindungsgemäßen CD25 bindenden Moleküls und
(ii) die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA Moleküle zur Herstellung eines erfindungsgemäßen CD25 bindenden Moleküls durch rekombinante Mittel.
Der gegenwärtige Stand der Technik sieht so aus, daß Fachleute in der Lage sind, mit der hier angegebenen Information die erfindungsgemäßen DNA Moleküle zu synthetisieren, das heißt die Aminosäuresequenzen der hypervariablen Regionen und die dafür kodierenden DNA Sequenzen. Ein Verfahren zur Konstruktion eines Gens für eine variable Domäne ist beispielsweise in EP-A 0 239 400 beschrieben und kann kurz wie folgt zusammengefaßt werden: Ein Gen, das eine variable Domäne eines mAk beliebiger Spezifität kodiert, wird kloniert. Die die Framework- und variablen Regionen kodierenden DNA Segmente werden bestimmt und die die hypervariablen Regionen kodierenden DNA Segmente werden entfernt, so daß die für die Framework-Regionen kodierenden DNA Segmente mit geeigneten Restriktionsschnittstellen an den Verbindungspunkten fusioniert werden. Die Restriktionsschnittstellen können an den geeigneten Positionen durch Mutagenese des DNA Moleküls mittels Standardtechniken hergestellt werden. Doppelsträngige synthetische CDR Kassetten werden durch DNA Synthese gemäß den in den Sequenzzuordnungen Nr. 1 oder 2 angegebene Sequenz hergestellt. Diese Cassetten werden mit klebrigen Enden geliefert, so daß sie an die Verbindungspunkte des Frameworks ligiert werden können. Ein Protokoll zum Erhalt eines DNA Moleküls, das eine variable Domäne eines Immunglobulins kodiert, ist in Figur 5 gezeigt.
Weiterhin ist es nicht notwendig, Zugang zu der mRNA einer produziernden Hybridomzellinie zu haben, um ein DNA Konstrukt zu erhalten, das für die erfindungsgemäßen mAks kodiert. Daher gibt die Internationale Veröffentlichung WO 90 07861 vollständige Anleitungen zur Herstellung eines mAk's durch rekombinante DNA Techniken, wobei nur die schriftliche Information der Nukleotidsequenz des Gens gegeben ist. Das Verfahren umfaßt die Synthese einiger Oligonukleotide, ihre Vervielfältigung durch die PCR Technik und ihr Splicen unter Bildung der gewünschten DNA Sequenz.
Expressionsvektoren, die einen geeigneten Promotor oder Gene enthalten, die die konstanten Teile der schweren und leichten Kette enthalten, sind frei erhältlich. Daher kann ein einmal hergestelltes erfindungsgemäßes DNA Molekül bequem in einen geeigneten Expressionsvektor transferiert werden. Die DNA Moleküle, die Einzelkettenantikörper kodieren, können auch durch Standardverfahren hergestellt werden, wie beispielsweise in WO 88 1649 beschrieben.
In Anbetracht des Vorangegangenen und da der mAk der Maus als natürlich durch die Hybridomzelle sekretierter nicht der vorzuziehende mAk Typ ist, dürfte keine Hinterlegung einer Hybridomzelle notwendig sein, um den Kriterien einer ausreichenden Beschreibung zu entsprechen.
Bei einer bestimmte Ausführungsform der Erfindung beinhalten die rekombinanten Mittel zur Herstellung eines CD25 bindenden Moleküls erste und zweite DNA Konstrukte, wie sie im folgenden beschrieben werden:
Das erste DNA Konstrukt kodiert eine schwere Kette oder ein Fragment hiervon und umfaßt
a) einen ersten Teil, der eine abwechselnd Framework und hypervariable Regionen enthaltende variable Domäne kodiert, wobei die in Folge auftretenden hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 die in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten Aminosäueresequenzen sind und dieser erste Teil mit einem Codon beginnt, das die erste Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und mit einem Codon endet, das die letzte Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und
b) einen zweiten Teil, der einen konstanten Teil einer schweren Kette oder ein Fragment hiervon kodiert, der mit einem die erste Aminosäure des konstanten Teils der schweren Kette kodierenden Codon beginnt und mit einem die letzte Aminosäure des konstanten Teils oder eines Fragments hiervon kodierenden Codon gefolgt von einem Stopcodon endet.
Vorzugsweise kodiert dieser erste Teil eine variable Domäne mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen zu der in der Sequenzzuordnung Nr. 1 identisch ist und mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 117 endet. Insbesondere weist der erste Teil die in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigte Nukleotidsequenz auf und beginnt mit dem Nukleotid an der Position 142 und endet mit dem Nukleotid an der Position 492. Der zweite Teil kodiert ebenfalls vorzugsweise den konstanten Teil einer humanen schweren Kette, insbesondere den konstanten Teil der humanen γ&sub1; Kette. Dieser zweite Teil kann ein DNA Fragment genomischen Ursprungs (mit Introns) oder ein cDNA Fragment (ohne Introns) sein.
Das zweite DNA Konstrukt kodiert eine leichte Kette oder ein Fragment hiervon und umfaßt
a) einen ersten Teil, der eine abwechselnd Framework und hypervariable Regionen enthaltende variable Domäne kodiert, wobei die in Folge auftretenden hypervariablen Regionen CDR1', CDR2' und CDR3' die in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigten Aminosäueresequenzen sind und dieser erste Teil mit einem Codon beginnt, das die erste Aminosäure der variablen Domäne kodiert und mit einem Codon endet, das die letzte Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und
b) einen zweiten Teil, der einen konstanten Teil einer leichten Kette oder ein Fragment hiervon kodiert, der mit einem die erste Aminosäure des konstanten Teils der leichten Kette kodierenden Codon beginnt und mit einem die letzte Aminosäure des konstanten Teils oder eines Fragments hiervon kodierenden Codon endet, gefolgt von einem Stopcodon.
Vorzugsweise kodiert dieser erste Teil eine variable Domäne mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen zu der in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigten identisch ist und mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 104 endet. Insbesondere weist der erste Teil die in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigte Nukleotidsequenz auf und beginnt mit dem Nukleotid an der Position 244 und endet mit dem Nukleotid an der Position 555. Der zweite Teil kodiert ebenfalls vorzugsweise den konstanten Teil einer humanen leichten Kette, insbesondere den konstanten Teil der humanen κ Kette.
Beim ersten und zweiten DNA Konstrukt sind der erste und der zweite Teil vorzugsweise durch ein Intron getrennt. Im zwischen dem ersten und zweiten Teil liegenden Intron wird vorzugsweise ein Enhancer inseriert. Das Vorhandensein dieses genetischen Elements, das transkribiert aber nicht translatiert wird, könnte für eine effiziente Transkription des zweiten Teils benötigt werden. Insbesondere sollten das erste und zweite DNA Konstrukt den Enhancer des Gens der schweren Kette enthalten, wobei ein humaner Ursprung vorteilhaft ist.
Für das erste und zweite DNA Konstrukt ist es vorteilhaft, einen dritten Teil zu enthalten, der stromaufwärts des ersten Teils liegt und der Teile eines Signalpeptids kodiert, wobei dieser dritte Teil mit dem Codon beginnt, das die erste Aminosäure des Signalpeptids kodiert, und mit dem Codon endet, das die letzte Aminosäure des Signalpeptids kodiert. Dieses Peptid wird für die Sekretion der Ketten durch den Wirtsorganismus benötigt, worin sie exprimiert werden und wird durch den Wirtsorganismus danach ent- fernt. Vorzugsweise kodiert der dritte Teil des ersten DNA Konstrukts ein Signalpeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit der in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz identisch ist und mit der Aminosäure an der Position -19 beginnt und mit der Aminosäure an der Position -1 endet. Ebenfalls kodiert der dritte Teil des zweiten DNA Konstrukts vorzugsweise ein Signalpeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit der in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz identisch ist und mit der Aminosäure an der Position -22 beginnt und mit der Aminosäure an der Position -1 endet.
Jedes der DNA Konstrukte wird unter die Kontrolle geeigneter Kontrollsequenzen gestellt, insbesondere unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors. Es kann jede Art von Promotor verwendet werden, vorausgesetzt, daß dieser an den Wirtorganismus angepaßt ist, in den die DNA Konstrukte für die Expression transferiert werden. Falls die Expression jedoch in einer Säugetierzelle stattfindet, ist besonders der Promotor eines Immunglobulingens bevorzugt.
Der gewünschte Antikörper kann in einer Zellkultur oder in einem transgenen Tier hergestellt werden. Ein geeignetes transgenes Tier kann gemäß den Standardtechniken erhalten werden, die die Mikroinjektion der unter geeigneter Kontrolle stehenden ersten und zweiten DNA Konstrukte in Eier und den Transfer der so hergestellten Eier in geeignete pseudo-schwangere Weibchen und die Selektion eines den gewünschten Antikörper sekretierenden Abkömmlings beinhalten. Falls die Antikörperketten in einer Zellkultur gebildet werden müssen, müssen die DNA Konstrukte entweder in einem einzelnen Expressionsvektor oder in 2 getrennte aber kompatible Expressionsvektoren inseriert werden, wobei letzteres bevorzugt ist.
Demnach liefert die Erfindung ebenfalls einen Expressionsvektor, der zur Replikation in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zellinie fähig ist und mindestens eines der oben beschriebenen DNA Konstrukte enthält.
Jeder ein DNA Konstrukt enthaltende Expressionsvektor wird dann in einen geeigneten Wirtsorganismus transferiert. Falls die DNA Konstrukte getrennt in zwei Expressionsvektoren inseriert werden, können sie einzeln transferiert werden, das heißt ein Vektortyp pro Zelle, oder kotransferiert werden, wobei die letztere Möglichkeit zu bevorzugen ist. Ein geeigneter Wirtsorganismus kann ein Bakterium, eine Hefe oder eine Säugetierzellinie sein, wobei letztere bevorzugt ist. Inbesondere sollte die Säugetierzellinie lymphoiden Ursprungs sein, wie beispielsweise eine Myelom-, Hybridom-, oder normal immortalisierte B-Zelle, aber endogen keine schwere oder leichte Kette eines Antikörpers bilden.
Es ist ebenfalls bevorzugt, daß der Wirtsorganismus eine große Anzahl an Vektorkopien pro Zelle enthält. Falls der Wirtsorganismus eine Säugetierzellinie ist, kann dieses erstebenswerte Ziel durch Vervielfältigung der Kopiezahl gemäß Standardtechniken erreicht werden. Die Vervielfältigungsverfahren bestehen gewöhnlich aus einer Selektion auf gesteigerte Resistenz gegenüber einer Droge, wobei die Resistenz auf dem Expressionsvektor kodiert ist.
Durch einen weiteren erfindungsgemäßes Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung eines mehrkettigen CD25 bindenden Moleküls bereitgestellt, das gekennzeichnet ist durch (i) Kultivieren eines Organismus, der mit den ersten und zweiten erfindungsgemäßen DNA Konstrukten transformiert ist, und (ii) Gewinnen eines aktiven CD25 bindenden Moleküls aus der Kultur.
Alternativ dazu können die schweren und leichten Ketten getrennt gewonnen werden und zu einem aktiven Bindungsmolekül nach einer in vitro Faltung rekonstituiert werden. Die Rekonstitutionsverfahren sind im Fachgebiet gut bekannt und Beispiele hierfür werden insbesondere durch EP-A 0 120 674 oder durch EP-A 0 125 023 bereitgestellt.
Daher kann ein Verfahren ebenfalls gekennzeichnet sein durch
(i) Kultivieren eines ersten Organismus, der mit einem ersten erfindungsgemäßen DNA Konstrukt transformiert ist, und Gewinnen der schweren Kette oder eines Fragments hiervon aus der Kultur und
(ii) Kultivieren eines zweiten Organismus, der mit einem zweiten erfindungsgemäßen DNA Konstrukt transformiert ist, und Gewinnen der leichten Kette oder eines Fragments hiervon aus der Kultur, und
(iii) In vitro Rekonstitution eines aktiven CD25 bindenden Moleküls aus der in (i) erhaltenen schweren Kette oder des Fragments hiervon und der in (ii) erhaltenen leichten Kette oder des Fragments hiervon.
In ähnlicher Weise wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines CD25 bindenden Moleküls aus einer einzelnen Kette oder Domäne bereitgestellt, das gekennzeichnet ist durch (i) Kultivieren eines Organismus- der mit einem DNA Konstrukt transformiert ist, das das erfindungsgemäße CD25 bindende Molekül aus einer einzelnen Kette bzw. Domäne kodiert, und (ii) Gewinnen des Moleküls aus der Kultur.
Die erfindungsgemäßen CD25 bindenden Moleküle zeigen gute immunmodulatorische Wirkung, wie es beispielsweise in einer gemischten Lymphozytenkultur (MLR) (Akabar et al, J. Immunol. 140, 2171-8) gezeigt wurde. Die MLR wird im allgemeinen als in vitro Entsprechung der allogenen Transplantatreaktion angesehen, die in vivo zur Abstoßung führt.

1. Hemmung der MLR

Aus der HPBM Präparation eines ersten Spenders werden 10&sup5; HPBM enthaltende 100 ul Proben gezogen, zu welchen verschiedene Konzentrationen eines erfindungsgemäßen Moleküls im Bereich von 0 bis 300 ng/ml (einschließlich dieser Grenzwerte) gegeben werden. Dann wird jede Probe mit einem 100 ul Anteil gemischt, der 10&sup5; HLA-inkompatible röntgenbestrahlte HPBM eines zweiten Spenders enthält oder HPBM, aus denen die T-Zellen entfernt wurden. Das Gemisch wird für 6 Tage bei 37ºC inkubiert und dann wird 1 uCi Methyl-³H- thymidin (³H-Tdr) in einem Volumen von 10 ul zugegeben. Nach 6 Stunden Inkubation wird die Zellproliferation durch Aufnahme der Radioaktivität gemessen.
In diesem bestimmten Test zeigen die erfindungsgemäßen Moleküle in vitro eine immunmodulatorische Wirkung in Konzentrationen ab 0, 3 ng/ml, wie es in Figur 6 gezeigt ist. 50 % des Zellwachstums werden bei etwa 3 ng/ml gehemmt.
Die immunmodulatorische Wirkung der erfindungsgemäßen Moleküle kann auch durch Messung einer antigenspezifischen HPBL Antwort auf die Hemmung der IL-2 abhängigen Proliferation der T-Lymphoblasten wie folgt bestimmt werden:

2. Hemmung der antigenspezifischen HPBM Antwort

Die erfindungsgemäßen Moleküle hemmen das Hervorrufen einer PPD (Tuberkulin) spezifischen, HLA Klasse II restringierten T-Zellantwort, wobei ihre Fähigkeit zur Bindungshemmung des endogen gebildeten IL-2 an dessen Rezeptor deutlich wird. In vivo dürften diese antigenspezifischen Reaktionen eine entscheidende Rolle bei der Auslösung der Autoimmunität und der Transplantatabstoßung spielen.
Aus einer HPBM Präparation werden 10&sup5; HPBM enthaltende 100 ul Proben gezogen, zu denen verschiedene Konzentrationen eines erfindungsgemäßen Moleküls im Bereich von 0 bis 300 ng/ml (einschließlich dieser Grenzwerte) und Tuberkulin (PPD) in einer Endkonzentration von 30 ug/ml gegeben werden. Die Proben werden für 6 Tage bei 37ºC inkubiert und dann wird 1 uCi Methyl-³H-thymidin in einem Volumen von 10 ul zugegeben. Nach 6 Stunden Inkubation wird die Zellproliferation durch Aufnahme der Radioaktivität gemessen.
In diesem bestimmten Test zeigen die erfindungsgemäßen Moleküle in vitro eine immunmodulatorische Wirkung in Konzentrationen ab etwa 10 ng/ml, wie es in Figur 7 gezeigt ist. 50 % des Zellwachstums werden bei etwa 50 ng/ml gehemmt.

3. Hemmung der IL-2 abhängigen Proliferation der T-Lymphoblasten

Die erfindungsgemäßen Moleküle hemmen das durch MLR oder PPD Stimulation induzierte IL-2 abhängige Wachstum der T-Zellblasten effizient. Diese Zellen dürften eine große Rolle im Verlauf von Autoimmunitäts- und Abstoßungsfällen spielen.
Dreifach angelegte Kulturen, die 20 x 10³ 5 Tage alte durch PPD oder MLR stimulierte HPBM in einem Endvolumen von 200 ul enthalten, werden bei 37ºC für 48 Stunden in Gegenwart von 5, 10, oder 20 ng/ml rekombiantem IL-2 und einem erfindungsgemäßen Molekül in verschiedenen Konzentrationen von 0 bis 10 ug/ml (einschließlich dieser Grenzwerte) inkubiert. Dann wird ³H-Tdr zugegeben. Nach 6 Stunden wird die Zellproliferation durch die Aufnahme an Radioaktivität gemessen. In diesem bestimmten Test zeigen die erfindungsgemäßen Moleküle eine immunmodulatorische Wirkung bei Konzentrationen von 0, 1 ug/ml, wie es in den Figuren 8A, 8B, 8C und 8D gezeigt ist.
Daher liefert die Erfindung ebenfalls
(i) die Verwendung eines erfindungsgemäßen CD25 bindenden Moleküls zur Immunsuppression eines humanen Immunsystems
(ii) ein Verfahren zur Immunsuppression des humanen Immunsystems, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer immunsuppressiv wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen CD25 bindenden Moleküls an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
(iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Immunsuppression des humanen Immunsystems, die ein erfindungsgemäßes CD25 bindendes Molekül und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthält.
Insbesondere ist ein erfindungsgemäßes CD25 bindendes Molekül zur Verhinderung oder Behandlung von Transplantatabstoßungsvorfällen brauchbar.
Für diese Indikationen hängt die geeignete Dosierung beispielsweise natürlich von dem im einzelnen verwendeten erfindungsgemäßen Molekül, dem Wirt, der Verabreichungsart und der Art und Schwere des zu behandelnden Zustands ab. Bei einer prophylaktischen Anwendung erhält man im allgeinen jedoch befriedigende Ergebnisse bei Tagesdosen von etwa 0, 1 mg bis 1 mg pro Kilogramm Körpergewicht. Diese Dosierungen sollten zur Behandlung eines gegenwärtig auftretenden Abstoßungsvorfalls nicht über einen Faktor von 4 erhöht werden. Ein erfindungsgemäßes Molekül wird bequemerweise parenteral verabreicht, normalerweise intravenös, beispielsweise in eine antekubitale oder sonstige periphere Vene. Eine prophylaktische Behandlung umfaßt typischerweise die Verabreichung des erfindungsgemäßen Moleküls einmal täglich bis einmal wöchentlich für 2 bis 4 Wochen, indem man am Tag der Transplantation beginnt, vorzugsweise einige Stunden vor der Transplantation.
Die erfindungsgemäßen Moleküle können auch bei der Behandlung von Malignitäten bei CD25 Antigen exprimierenden Zellen nützlich sein, beispielsweise zur Behandlung der T-Zelleukämie und bestimmten anderen Leukämien und Lymphomen. Zu diesem Zweck kann das CD25 bindende Molekül in Form eines Radiokonjugats verwendet werden, worin das Molekül an ein alpha-emittierendes Radionuklid gekuppelt ist.
Die erfindungsgemäßen Moleküle können auch bei der Behandlung oder Prophylaxe der HIV Infektion nützlich sein. Es scheint, daß das HIV Virus proliferierende T-Zellen zu seiner Vervielfältigung benötigt, und daher sollte die T-Zellproliferation durch Blockierung des CD25 Antigens ebenfalls die Vermehrung des Virus hemmen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf herkömmliche Weise hergestellt werden.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung wird bevorzugt in lyophilisierter Form geliefert. Zur sofortigen Verabreichung wird sie in einem geeigneten wässrigen Träger gelöst, beispielsweise sterilem Wasser zur Injektion oder steriler gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung. Falls es gewünscht wird, eine Lösung mit einem größeren Volumen zur Verabreichnug durch Infusion statt einer Bolusinjektion herzustellen, ist es vorteilhaft, humanes Serumalbumin oder das eigene heparinisierte Blut des Patienten bei der Herstellung in die Kochsalzlösung einzuarbeiten. Das Vorkommen im Überschuß eines solchen physiologisch inerten Proteins verhindert den Verlust des monoklonalen Antikörpers durch Adsorption an die zusammen mit der Infusionslösung verwendeten Gefäß- und Schlauchwände. Falls Albumin verwendet wird, beträgt eine geeignete Konzentration 0,5 bis 4,5 Gewichtsprozent der Kochsalzlösung.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wurde gefunden, daß förderliche Ergebnisse durch die Verwendung von mindestens zwei antigenbindenden Molekülen gegen aktivierte T-Zellen in Kombination erhalten werden können, wobei diese bindenden Moleküle mindestens zwei verschiedene, für aktivierte T-Zellen typische Antigene erkennen.
Vorzugsweise wird eine Kombination von zwei verschiedenen antigenbindenden Molekülen verwendet, wobei jedes ein unterschiedliches Antigen erkennt. Daher konkurrieren sie nicht miteinander um dieselbe Bindungsstelle auf aktivierten T-Zellen, obwohl beide antigenbindenden Moleküle Oberflächenantigene von aktivierten T- Zellen erkennen.
Vorzugsweise ist eines der antigenbindenden Moleküle ein CD25 bindendes Molekül.
Demnach liefert die vorliegende Erfindung auch eine immunsuppressive Zusammensetzung, die eine Mischung von mindestens einem CD25 bindenden Molekül und mindestens einem antigenbindenden Molekül gegen ein anderes, für aktivierte T-Zellen typisches Antigen als CD25 enthält.
Die Erfindung liefert weiterhin mindestens zwei antigenbindende Moleküle gegen aktivierte T-Zellen in Kombination zur Immunsuppression des Säugetiersystems, wobei die antigenbindenden Moleküle mindestens zwei verschiedene Antigene erkennen, die für aktivierte T-Zellen typisch sind und eines davon das CD25 Antigen ist.
Mit "antigenbindendes Molekül gegen aktivierte T-Zellen" ist ein bindendes Molekül gemeint, das stark mit aktivierten T-Zellen reagiert, während es nur schwach oder gar nicht mit ruhenden T- Zellen reagiert. Vorzugsweise sind die antigenbindenden Moleküle vollständige Immunglobulinmoleküle, insbesondere solche aus der Maus, chimäre oder humanisierte monoklonale Antikörper, vor allem chimäre monoklonale Antikörper. Die bevorzugten monoklonalen CD25 Antikörper sind diejenigen, die die CDR's mit den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen aufweisen.
Vorteilhafterweise enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung auch ein immunsuppressives Arzeimittel, wie Cyclosporin A, oder wird in Kombination damit verwendet.
Die bevorzugten monoklonalen Antikörper gegen andere aktivierte T-Zellantigene als CD25 sind typischerweise im CD7 Cluster eingeteilt, wie es durch den Boston Workshop festgelegt und in "Leucocyte Typing II, Vol. I human T lymphocytes" durch Reinherz, Haynes, Nadler und Berstein, Springer Verlag, 1985 beschrieben ist. Das CD7 Antigen wird heterogen auf etwa 80 % der ruhenden T- Zellen exprimiert. Die Expression steigt jedoch stark durch Aktivierung an (ein 2-3 facher Anstieg in der Intensität).
Eine bevorzugte Antikörperkombination ist daher eine Kombination eines CD7 Antiköpers mit einem CD25 Antikörper. Demnach enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung vorzugsweise eine Mischung von mindestens einem CD25 Antikörper zusammen mit mindestens einem CD7 Antikörper, insbesondere einem CD25 Antikörper zusammen mit einem CD7 Antikörper. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß beide Antikörper vom IgG Isotyp sind.
Die zwei Antikörper können wahlweise zusammen mit einem immunsuppressiven Arzneimittel klinisch auf verschiedene Arten angewendet werden. Vorzugsweise werden sie zusammengemischt, und die physikalische Mischung wird dem Patienten verabreicht. Ein alternatives Verfahren ist die Verabreichung der Antikörper und wahlweise des immunsuppressiven Arzneimittels in irgendeiner Reihenfolge an den Empfänger aus getrennten Behältnissen aber zur gleichen Zeit. Die Zusammensetzung kann hergestellt und parenteral verabreicht werden, wie es oben für den einzelnen CD25 Antikörper beschrieben ist. Alternativ dazu kann das immunsuppressive Arzneimittel oral verabreicht werden, und die monoklonalen Antikörper werden zusammen oder als Mischung parenteral verabreicht.
Um das Herstellen von geeigneten Zusammensetzungen zu erleichtern, können die monoklonalen Antikörper und wahlweise das immunsuppressive Arzneimittel getrennt im selben Behältnis zusammen mit Anleitungen zum Mischen oder zur gemeinsamen Verabreichung verpackt werden. Beispiele dieser Kombinationspackungen beinhalten beispielsweise eine Mehrkammerspritze oder eine Doppelpackung, die getrennt eine Einheitsdosierungsform von mindesetns zwei Antikörpern gegen aktivierte T-Zellen enthält, wobei diese Antikörper mindestens zwei verschiedene, für aktivierte T-Zellen typische Antigene erkennen, wovon eines das CD25 Antigen ist.
Untersuchungen zeigen soweit, dar die Verabreichung der Antikörper in Kombination miteinander und wahlweise mit einem immunsuppressiven Arzneimittel bei den verwendeten Dosierungsmengen frei von unakzeptablen Nebenwirkungen ist und dar keine Potentierung von Nebenwirkungen auftritt, die mit den einzelnen Antikörpern beobachtet werden. Zur Verwendung in der Prophylaxe erfordert eine geeignete Dosierung eine Verabreichung in der Größenordnung von 0,05 - 0,5 Milligramm eines ersten Antikörpers (wie der CD25 Antikörper) pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten und 0,05 - 0,5 Milligramm eines zweiten Antikörpers (wie ein CD7 Antikörper) pro Kilogramm Körpergewicht. Falls das immunsuppressive Arzneimittel Cyclosporin ist, beträgt die wahlweise verwendete empfohlene Menge 2 bis 5 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht bei parenteraler Verabreichung und 10 - 15 mg/Kilogramm Körpergewicht bei oraler Verabreichung. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann täglich oder wöchentlich verabreicht werden, vorzugsweise wöchentlich.
Obwohl die erfindungsgemäße Zusammensetzung speziell für den prophylaktischen Einsatz bei Transplantatabstoßungsfällen gedacht ist, kann deren Einsatz auch leicht auf die Behandlung von aktuell auftretenden Abstoßungsvorfällen ausgedehnt werden. In diesem all sollten die Dosierungen bis um den Faktor 4 erhöht werden.
Monoklonale Antikörper aus der Maus zur erfindungsgemäßen Werwendung sind an sich bekannt. Viele monoklonale Antikörper gegen Oberflächenantigene von aktivierten T-Zellen sind von Kultursammlungen in verschiedenen Ländern der Welt erhältlich und insbesondere kann die American Type Culture Collection, Maryland, USA solche geeigneten monoklonalen Antikörper oder Hybridomzellen liefern, die solche Antikörper sekretieren. Ein Beispiel für eine Hybridomzelle, die erfindungsgemäß verwendbare monoklonale CD7 Antikörper sekretiert , und von der ATCC erhältlich ist, ist T3- 3A1. Andere CD7 Antiköper sind RFT-2 und CHH 380 (ein chimärer Antikörper). CD25 Antikörper beinhalten neben dem oben beschriebenen bevorzugten RFT-5 und dessen chimären Derivats den M7/2 (Gaulton et al., Clin. Immunol. and Immunopath. (1985) 36: 18), den anti-tac Antikörper (Uchiyama et al., J. Immunol. (1981) 126 (4): 1393) und den monoklonalen Campath 6 Antikörper.
Der synergistische Effekt einer Kombination von monoklonalen CD25 und CD7 Antikörpern wird in vitro mit dem oben beschriebenen MLR Bioassay gezeigt und ebenfalls in vivo bei klinischen Tests an Patienten.
Beim MLR Bioassay wird die Hemmung der ³H-TdR Aufnahme in Kulturen beobachtet, zu denen ein monoklonaler CD7 (RFT2) oder ein CD25 (RFT5) Antikörper einzeln zugegeben wurde und man findet einen wesentlich höheres Ausmaß an Hemmung, wenn beide Antikörper zusammen in der gleichen Gesamtkonzentration verwendet werden. Die MLR ist das in vitro Äquivalent der allogenen Transplantatreaktion, die in vivo zur Abstoßung führt, während die oben beschriebene Hemmung mit der Immunsuppression in vivo gleichgesetzt werden kann.
Bei MLRs, zu denen Cyclosporin in einem Dosierungsbereich von 10 Nanogramm/ml bis 100 ug/ml gegeben wurde, findet sich in Gegenwart der monoklonalen CD7 und CD25 Antikörper eine erhöhte Hemmung der ³H-TdR Aufnahme, verglichen mit Cyclosporin alleine über den gesamten Dosierungsbereich. Die Kombination von CD7, CD25 und Cyclosporin zeigt einen größeren Hemmeffekt, als irgendeine andere Kombination.
In klinischen Tests werden Patienten, die sich einer Nieren-, Leber- oder Herztransplantation zu unterziehen haben, zur prophylaktischen Therapie ausgewählt. Am Tag der Transplantation wird 2 Stunden vor der Operation eine erste intravenöse Infusion des chimären CD25 Antikörpers von Beispiel 5 zusammen mit einen chimären CD7 Antikörper (CHH 380) in einer Dosis von 0,2 mg jedes Antikörpers pro Kilogramm Körpergewicht verabreicht. Zwei Tage nach der Operation wird eine identische Infusion der beiden Antikörper mit 0,4 mg/kg Körpergewicht verabreicht und dann für einen Monat in wöchentlichen Intervallen wiederholt.
Die intravenösen Infusionen werden wie folgt hergestellt: Die lyophilisierten Antikörper werden zusammengemischt und in 100 ml steriler gepufferter Kochsalzlösung dispergiert, die 4,5 Gewichtsprozent humanes Albumin enthält. Diese Kochs alzdispersion wird den Patienten während 30 Minuten verabreicht. Die Patienten erhalten ebenfalls eine Standardtherapie mit Cyclosporin. Kein Patient erleidet einen Abstoßungsfall während dem ersten Monat der Therapieperiode.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figur 1A ist ein schematisches Diagramm, das die Struktur eines IgG Moleküls zeigt, wie auch die Gene, die die schweren und leichten Ketten kodieren. Die Figur 1B gibt schematisch die Anordnung einer variablen Domäne einer schweren oder leichten Kette von Framework (FR) und hypervariabler Regionen (CDR) wieder.
Die Figuren 2A und 2B zeigen die Analyse der EcoRI-verdauten genomischen DNA der Maushybridomzelle RFT5-IgG2a (1), RFT5-IgG1 (2), RFT4 (3) und NS-1 (4) durch Southernblot mittels einer ³²P markierten DNA Sonde, die entweder den Enhancer der schweren Kette aus der Maus (Fig. 2A) oder Cκ und die fünf Jκ Gensegmente der Maus (Fig. 2B) kodiert. 10 ug genomischer DNA werden mit EcoRI verdaut und dann der Größe nach auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufgetrennt. Dann werden die Fragmente auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und mit der Sonde hybridisiert. Nach dem raschen wird die Membran über Nacht auf einem Kodak X-0 Mat Film exponiert.
Die Figuren 3A und 3B zeigen die Ausgangsexpressionsvektoren pSV2-neo-huCγ1 und pSV2-DHFR-Eu-huCκ. Beide Plasmide enthalten ein Ampicillinresistenzgen (ampR) und den Replikationsursprung :on pBR322 und SV40 (pBR322 ori und SV40 ori). pSV2-neo-huCγ1 ist durch das Vorkommen eines Neomycinresistenzgens (neoR) und des den humanen konstanten γ&sub1; Teil kodierenden (huCγ&sub1;) Gens charakterisiert, während pSV2-DHFR-Eu-huCκ ein Dihydrofolatreduktasegen (DHFR) (Methotrexatresistenz) und das den humanen konstanten κ Teil (huCκ) kodierende Gen inseriert beinhaltet. Die schließlichen Vektoren zur Expression der chimären schweren oder leichten Ketten werden jeweils durch Insertion eines DNA Fragments, das das Signalpeptid (L) und die variable Domäne (VDJ&sub2;) der schweren Kette von RFT5-IgG2a zusammen mit dem Enhancer der humanen schweren Kette kodiert, in pSV2-neo-huCγ1 und durch Insertion eines DNA Fragments, das das Signalpeptid (L) und die variable Domäne (VJ&sub2;) der leichten Kette von RFT5-IgG2a kodiert, in pSV2-DHFR-Eu-huCκ erhalten.
Die Figuren 4A und 4B zeigen die Produktivität der einzelnen Zellpools, die bei steigenden Konzentrationen Methotrexat (MTX) jeweils gemäß den in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren A und B gezogen werden. Die Y-Achse der Graphik gibt die gebildete Menge an monoklonalen Antikörper in mg/10&sup9; Zellen in 72 Stunden an.
Die Figur 5 zeigt ein Protokoll zur Konstruktion von CDR Substututionen durch die Insertion von CDR Kassetten in einen Vektor, der 4 zusammenfusionierte Frameworkregionen enthält.
Die Figur 6 zeigt die Hemmung der MLR durch (x) RFT5-IgG2a (γ&sub2;a, κ) und (o) einen erfindungsgemäßen Maus-Mensch chimären mAk (γ&sub1;, κ). Beide mAks besitzen die in den Sequenzzuordnungen Nr. 1 und 2 gezeigten variablen Domänen.
Die Figur 7 zeigt die Hemmung einer PPD spezifischen HPBM Reaktion durch (x) RFT5-IgG2a und (o) dem gleichen Maus-Mensch chimären mAk.
Die Figur 8 zeigt die Wirkung von RFT5-IgG2a und des gleichen Maus-Mensch chimären mAk auf die PPD T-Lymphoblastenproliferation (Fig. 8B und 8A) und auf die MLR T-Lymphoblastenproliferation (Fig. 8D und 8C) bei einer IL-2 Konzentration von 5 ng/ml (o), 10 ng/ml ( ) und 20 ng/ml (x).
Nur durch Schilderung wird die Herstellung eines erfindungsgemäßen chimären CD25 Antikörpers folgendermaßen beispielhaft dargestellt:

Beispiel 1

Klonierung des Gens, das die variable Domäne der schweren Kette von RFT5-IgG2a kodiert

Die genomische DNA der Hybridomzellen RFT5-IgG2a (CD25, γ2a, κ), RFT5-IgG1 (CD25, γ&sub1;, κ) und RFT4 (CD4, γ&sub1;, κ) und der ursprünglichen Myelomzellinie der Hybridomzellen nämlich NS-1 wird isoliert und mit EcoRI verdaut. Jede verdaute DNA wird dann auf demselben Agarosegel aufgetrennt. Nach dem Lauf wird das Agarosegel mittels Southernblot analysiert, indem ein ³²P-markiertes 0,7 kb XbaI-EcoRI DNA Fragment als Sonde verwendet wird, das den Enhancer der schweren Kette aus der Maus kodiert (Heinrich et al, J. of Immunol. (1989) 143: 3589). 3 Arten von Banden erscheinen nach der Hybridisierung auf dem Gel, wie in Figur 2 gezeigt. Das 6,5 kb EcoRI Fragment ist im DNA Verdau aller drei Zellinien vorhanden, einschließlich der ursprünglichen Myelomzellinie NS-1 und ist daher nicht von Interesse. Das 2,9 kb EcoRI Fragment wird nur im DNA Verdau der Hybridomzelle RFT5-IgG1 detektiert und dürfte von einer annormalen Genumlagerung stammen. Das 6,8 kb EcoRI Fragment, das im DNA Verdau der ursprünglichen Zellinie NS-1 fehlt, ist daher das Fragment der Wahl und eine weitere Reinigung dieses Fragments wird anschließend durch präparative Agarosegelelektrophorese ausgeführt.
DNA Fragmente von etwa 5-7 kb werden in die Restriktionsschnittstelle EcoRI des Bacteriophagen ZAP (Stratagene) kloniert. Mittels der oben beschriebenen Sonde werden 6 x 10&sup6; rekombinante Phagen gescreent und 11 Klone hybridisieren. Das DNA Insert der 11 Klone wird aus Phagenplattenlysaten mittels der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, indem man als Primer ein erstes Oligonukleotid verwendet, das das J&sub2; Gen der Maus kodiert, und ein zweites Oligonukleotid, das den Anfang der schweren Kette von RFT5 bis Aminosäure Nr. 7 kodiert (Sequenz vorher bestimmt). Der zweite Primer wird unter Berücksichtigung des häufigsten Codongebrauchs der Gene entworfen. Die von jedem der 11 Klone erhaltenen DNA Fragmente werden durch Southernblot analysiert, indem man als Sonde ein Oligonukleotid verwendet, das die zwischen den Aminosäuren 20 und 27 der schweren Kette von RFT5 enthaltene Aminosäuresequenz kodiert, die ebenfalls gemäß des häufigsten Codongebrauchs entwickelt wurde. 9 identische Phagenklone treten unter Verwendung der Sonde auf. Ein Teil des DNA Inserts, das die variable Domäne kodiert, wird durch die Didesoxyabbruchmethode sequenziert und ist in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigt.

Beispiel 2

Konstruktion eines Gens für die chimäre schwere Kette von RFT5

Ein 6 kb EcoRI Fragment, das durch den Verdau der DNA von einem der 9 Phagenklone erhalten wird und das Gen für die variable Domäne der schweren Kette von RFT5 enthält (einschließlich des Promotors und des Enhancers) wird in die EcoRI Schnittstelle des eukaryontischen Expressionsvektors pSV2 neo-human γ&sub1; konstanter Teil (siehe obige Literaturstelle Heinrich et al, J. of Immunol. (1989) 143: 3589) kloniert, wie es in Figur 3A gezeigt ist. Die Nukleotidsequenzen des Gens, das die variable Domäne der schweren Kette von RFT5 kodiert, wird erneut bestimmt, um die Möglichkeit auszuschließen, daß eine Mutation in diesem Gen während der Herstellung des Plasmids aufgetreten ist.

Beispiel 3

Klonierung des Gens, das die variable Domäne der leichten Kette von RFT5 kodiert

Die genomische DNA der Hybridomzellen RFT5, RFT5* und RFT4 und der ursprünglichen Zellinie NS-1 wird isoliert und mit EcoRI verdaut. Jede verdaute DNA wird dann auf demselben Agarosegel aufgetrennt. Nach dem Lauf wird das Agarosegel mittels Southernblot analysiert, indem man als Sonde ein ³²P markiertes DNA Fragment verwendet, das 5 Jκ Gene der Maus und das Cκ Gen der Maus enthält.
3 Hauptbanden von etwa 12, 16 und 18 kb tauchen auf dem Gel nach der Hybridisierung auf, wie es in Figur 2B gezeigt ist. Die größten Fragmente sind die einzigen, die spezifisch für die RFT5 Hybridomzelle sind. Nach Größe aufgetrennte EcoRI Fragmente von etwa 18 kb werden in den Phagen EMBL4 (Stratagene) kloniert, 7 x 10&sup5; rekombinante Phagenklone werden mit der oben beschriebenen Sonde gescreent und zwei Klone hybridisieren , wobei beide ein identisches 18 kb Insert enthalten. Ein 4,4 kb EcoRI-XbaI Subfragment enthält das gesamte Gen , das die variable Domäne der leichten Kette von RFT5 kodiert und dies wird in das Plasmid pGEM4 (Stratagene) kloniert. Die Sequenz des 4,4 kb Fragments wird bestimmt. Ein Teil des 4,4 kb Inserts, das die variable Domäne kodiert, wird sequenziert. Die Sequenz ist in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigt.

Beispiel 4

Konstruktion eines Gens für die chimäre leichte Kette von RFT5

Ein den Enhancer der schweren Kette der Maus kodierendes 1,1 kb XbaI-XbaI Fragment (siehe obige Literaturstelle Heinrich et al, J. of Immunol. (1989) 143: 3589) wird zusammen mit einem den humanen konstanten κ Teil kodierenden HindIII-SphI Fragment in den Phagen mp18 (Stratagene) subkloniert. Nach Zerstörung der Restriktionsschnittstellen durch Mutagenese wird ein aufgefülltes EcoRI- HindIII Fragment, das die Sequenz für den Enhancer der schweren Kette der Maus (Eu) und den humanen konstanten κ Teil (huCκ) enthält, in die aufgefüllte EcoRI-BamHI Stelle von pSV2-DHFR kloniert. Man erhält pSV2-DHFR durch Ersetzten des BamHI-HindIII Fragments von pSV2-neo durch ein BamHI-HindIII Fragment, das das DHFR Gen kodiert.
Das 4,4 kb EcoRI-XbaI Fragment von Beispiel 3 wird dann in pSV2-DHFR-Eu-huCκ inseriert.

Beispiel 5

Expression eines chimären RFT5 Antikörpers

Die wie in den Beispielen 2 und 4 erhaltenen Plasmide werden in die Maus-Myelomzellinie SP2/0 (ATCC CRL 1581) durch Elektroporation mittels eines Elektroporationsgeräts von Biorad cotransferiert. Von dieser Technik ist bekannt, daß sie mit großer Häufigkeit stabile Transfektanden bildet. Der SP2/0 Zellinie gelingt es nicht, endogen schwere und leichte Ketten zu bilden und sie ist gegenüber Geneticin (G 418) in einer Konzentrtion von 0,8 mg/ml sensitiv.
Die SP2/0 Zellen werden im normalen Wachstumsmedium gezogen (RPMI + 10% FCS + 5x10&supmin;&sup5; M β-Mercaptoethanol), in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet und mit Elektroporationspuffer (Bio- Rad) gewaschen. Die Zellkonzentration wird auf 2 x 10&sup7; Zellen/ml eingestellt. Zu 0,8 ml der Zellsuspension werden 15-20 ug jedes Plasmids gegeben. Das Gemisch wird auf Eis gestellt und für 10 min stehengelassen. Dann werden die Zellen einem elektrischen Puls (280 Volt, 25 uF) unterzogen und erneut für 15 Minuten stehengelassen. Die Zellen werden in gewöhnliches Wachstumsmedium überführt und bei 37ºC in einem CO&sub2; Inkubator inkubiert.
Nach einer dreitägigen Inkubation beginnt die Selektion auf G 418 Resistenz. Die Zellen werden in frischem Medium resuspendiert, das 1,4 mg/ml G 418 enthält. Die Kulturen zeigen nach 10-14 Tagen Inkubation in Gegenwart von G 418 wachsende Zellen. Nach einer zweiwöchigen Inkubation werden die Überstände der geschlossen wachsenden Kulturen auf die Expression von humanem IgG in einem Sandwich-ELISA (Antikörper gegen die humane leichte κ Kette / Überstand / Antikörper-alkalische Phosphatase-Konjugat gegen humanes IgG) untersucht.
Dieser Test zeigt, daß vollständige Antikörpermoleküle von allen Kulturen in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen von 50- 500 ng/ml sekretiert werden.
Um die Zellen zu selektieren, in denen das DHFR Gen amplifiziert wird und die daher große Mengen des gewünschten Antikörpers sekretieren, werden zwei Selektionsverfahren auf Methotrexatresistenz (MTX) wie im folgenden beschrieben durchgeführt. Zu diesem Zweck werden die G 418 resistenten Zellpools jeweils geteilt und die Amplifikation wird entweder gemäß dem Verfahren A (MTX Steigerung um den Faktor 2 oder 2, 5) oder gemäß dem Verfahren B (MTX Steigerung um den Faktor 5) durchgeführt. Verfahren
Jeder Amplifikationsschritt beinhaltet das Animpfen mit Zelldichten von 2 x 10&sup5; Zellen/ml im gewöhnlichen Wachstumsmedium, das mit 1,4 mg,/ml G 418 und mit MTX in der gewählten Konzentration versetzt ist. Nach 72 h Inkubation werden die Zellen und der Überstand getrennt. Die Antikörperbildung wird entweder mittels ELISA oder mittlels HPLC unter Verwendung einer Protein A Säule verfolgt.
Die Figuren 4A und 4B zeigen die Antikörperproduktivität einiger Transfektandenpools. Die meisten Pools erreichen das Maximum der spezifischen Antikörperproduktion bei einer bestimmten MTX Konzentration. Die am besten produzierenden Pools werden durch Grenzverdünnung kloniert. Aus einigen hundert analysierten Klonen werden die 15 am besten produzierenden Klone ausgewählt. Die Produktivität der Klone reicht von 30 bis 50 mg mAk/10&sup9; Zellen in 72 Stunden.
Der Antikörper wird aus dem Kulturüberstand durch Elution von einer Protein A Affinitätssäule gereinigt. Sequenzzuordnung Nr. 1 Untersuchter Gegenstand: Die variable Domäne der schweren Immunglobulinkette des RFT5 Antikörpers Sequenztyp: Nukleotidsequenz und deren entsprechende Aminosäuresequenz Molekültyp: genomische DNA Länge: 492 Nukleotide ursprüngliche Quelle: Maushybridomzelle Merkmale der Nukleotidsequenz: Ein Intron kommt von Nukleotid 47 bis 130 vor. Segment Gen: von Nukleotid Merkmale der Aminosäuresequenz: Signalpeptid: von Aminosäure (AS) -19 bis -1 Sequenzzuordnung Nr. 2 Untersuchter Gegenstand: Die variable Domäne der leichten Immunglobulinkette des RFT5 Antikörpers Sequenztyp: Nukleotidsequenz und deren entsprechende Aminosäuresequenz Molekültyp: genomische DNA Länge: 455 Nukleotide ursprüngliche Quelle: Maushybridomzelle Merkmale der Nukleotidsequenz: Ein Intron kommt von Nukleotid 50 bis 226 vor Segment Gen: von Nukleotid Merkmale der Aminosäuresequenz: Signalpeptid: von Aminosäure (AS) -22 bis -1 Tabelle 1 Region Lage auf der schweren Kette Lage auf der leichten Kette Aminosäure 1 bis 30 (mit einem eventuellen Rest bei 0) Aminosäure (mit möglichen mittels nummerierten Insertionen) Aminosäure 1 bis 23 (mit einem eventuellen Rest bei 0 und einer Deletion bei 10 in den λ Ketten

Claims

1. CD25 bindendes Molekül, das mindestens eine Antigenbindungsstelle enthält, die mindestens eine Domäne enthält, die wiederum die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 in Folge enthält, wobei CDR1 die Aminosäuresequenz Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2 die Aminosäuresequenz Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp- Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly und CDR3 die Aminosäuresequenz Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe aufweist oder direkte Äquivalente hiervon.

2. CD25 bindendes Molekül nach Anspruch 1, das mindestens eine Antigenbindungsstelle enthält, die folgendes umfaßt

a) eine erste Domäne, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 aufweist, wobei CDR1 die Aminosäuresequenz Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2 die Aminosäuresequenz Ala-Ile-Tyr- Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly und CDR3 die Aminosäuresequenz Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe aufweist, und

b) eine zweite Domäne, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1', CDR2' und CDR3' aufweist, wobei CDR1' die Aminosäuresequenz Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2' die Aminosäuresequenz Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser- und CDR3' die Aminosäueresequenz His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr aufweist

oder direkte Äquivalente hiervon.

3. CD25 bindendes Molekül nach Anspruch 1, das mindestens eine Antigenbindungsstelle enthält, die entweder eine Domäne mit der in Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz beginnend mit der Aminosäure an Position 1 und mit der Aminosäure an Position 117 endend enthält oder eine wie oben beschriebene erste Domäne und eine zweite Domäne, die die in Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz beginnend mit der Aminosäure an der Position 1 und mit der Aminosäure an der Position 104 endend enthält oder direkte Äquivalente hiervon.

4. CD25 bindendes Molekül nach Anspruch 2 oder 3, das zumindest enthält

a) eine schwere Kette eines Immunglobulins oder ein Fragment hiervon, die umfaßt (i) eine variable Domäne, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 enthält, und (ii) den konstanten Teil einer humanen schweren Kette oder ein Fragment hiervon, wobei CDR1 die Aminosäuresequenz Arg-Tyr- Trp-Met-His, CDR2 die Aminosäuresequenz Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly- Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly und CDR3 die Aminosäuresequenz Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe aufweist, und

b) eine leichte Kette eines Immunglobulins oder ein Fragment hiervon, die umfaßt (i) eine variable Domäne, die in Folge die drei hypervariablen Regionen CDR1', CDR2' und CDR3' enthält, und (ii) den konstanten Teil einer humanen leichten Kette oder ein Fragment hiervon, wobei CDR1' die Aminosäuresequenz Ser- Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2' die Aminosäuresequenz Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser- und CDR3' die Aminosäueresequenz His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr aufweist,

oder direkte Äquivalente hiervon.

5. CD25 bindendes Molekül nach Anspruch 4, das zumindest enthält

a) eine schwere Kette, die eine variable Domäne mit der in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz beginnend mit der Aminosäure an der Position 1 und mit der Aminosäure an der Position 117 endend und den konstanten Teil einer humanen schweren Kette enthält, und

b) eine leichte Kette, die eine variable Domäne mit der in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigten Sequenz beginnend mit der Glutaminsäure an der Position 1 und mit der Glutaminsäure an der Position 104 endend und den konstanten Teil einer humanen leichten Kette enthält

oder direkte Äquivalente hiervon.

6. CD25 bindendes Molekül nach Anspruch 4 oder 5, worin der konstante Teil der humanen schweren Kette oder ein Fragment hiervon vom γ&sub1; Typ ist und der konstante Teil der humanen leichten Kette oder ein Fragment hiervon vom κ Typ ist.

7. DNA Molekül, das die Nukleotidsequenzen enthält, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3, wie in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigt, kodieren.

8. DNA Konstrukt nach Anspruch 7, das eine schwere Kette oder ein Fragment hiervon kodiert und folgendes umfaßt

a) einen ersten Teil, der eine abwechselnd Framework und hypervariable Regionen enthaltende variable Domäne kodiert, wobei die in Folge auftretenden hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 die in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten Aminosäueresequenzen sind und dieser erste Teil mit einem Codon beginnt, das die erste Aminosäure der variablen Domäne kodiert und mit einem Codon endet, das die letzte Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und

b) einen zweiten Teil, der einen konstanten Teil einer schweren Kette oder ein Fragment hiervon kodiert, der mit einem die erste Aminosäure des konstanten Teils kodierenden Codon beginnt und mit einem die letzte Aminosäure des konstanten Teils oder eines Fragments hiervon kodierenden Codon endet, gefolgt von einem Stopcodon.

9. DNA Konstrukt nach Anspruch 8, das einen ersten Teil enthält, der eine variable Domäne mit der in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz enthält, beginnend mit der Aminosäure an der Position 1 und mit der Aminosäure an der Position 117 endend oder direkte Äquivalente hiervon.

10. DNA Konstrukt nach Anspruch 7, das eine leichte Kette oder ein Fragment hiervon kodiert und folgendes umfaßt

a) einen ersten Teil, der eine abwechselnd Framework und hypervariable Regionen enthaltende variable Domäne kodiert, wobei die in Folge auftretenden hypervariablen Regionen CDR1', CDR2' und CDR3' die in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenzen sind und dieser erste Teil mit einem Codon beginnt, das die erste Aminosäure der variablen Domäne kodiert und mit einem Codon endet, das die letzte Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und

b) einen zweiten Teil, der einen konstanten Teil einer leichten Kette oder ein Fragment hiervon kodiert, der mit einem die erste Aminosäure des konstanten Teils kodierenden Codon beginnt und mit einem die letzte Aminosäure des konstanten Teils oder eines Fragments hiervon kodierenden Codon endet, gefolgt von einem Stopcodon.

11. DNA Konstrukt nach Anspruch 10, das einen ersten Teil enthält, der eine variable Domäne mit der in der Sequenzzuordnung Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz enthält, beginnend mit der Aminosäure an der Position 1 und mit der Aminosäure an der Position 104 endend oder direkte Äquivalente hiervon.

12. Verfahren zur Herstellung eines mehrkettigen CD25 bindenden Moleküls, gekennzeichnet durch (i) Kultivieren eines Organismus, der mit einem DNA Konstrukt nach Anspruch 8 oder 9 und mit einem DNA Konstrukt nach Anspruch 10 oder 11 transformiert ist und (ii) Gewinnen eines aktiven CD25 bindenden Moleküls aus der Kultur.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Immunsuppression des humanen Immunsystems oder zur Behandlung von Malignitäten der CD25&spplus; Zellen oder zur Behandlung der HIV Infektion, die ein CD25 bindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthält.

14. Immunsuppressive Zusammensetzung, die eine Mischung von mindestens einem CD25 bindenden Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und mindestens ein antigenbindendes Molekül gegenüber mindestens einem anderen Antigen als CD25, das für aktivierte T-Zellen charakteristisch ist, enthält.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, die zusätzlich Cyclosporin A enthält.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, worin das antigenbindende Molekül anders als das CD 25 bindende Molekül ein CD7 Antikörper ist.

17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin die Antikörper chimäre Antikörper sind.

18. Doppelpackung, die getrennte Einheitsdosierungsformen von mindestens zwei Antikörpern gegenüber aktivierten T-Zellen enthält, wobei die Antikörper mindestens zwei verschiedene, für aktivierte T-Zellen charakteristische Antigene erkennen, wobei ein Antikörper ein CD25 bindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 ist, zusammen mit Anleitungen zum Mischen oder zur gemeinsamen Verabreichung.

19. Doppelpackung nach Anspruch 18, die zusätzlich eine Einheitsdosierungsform eines immunsuppressiven Arzneimittels enthält.

20. Verwendung eines CD25 bindenden Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kombination mit einem antigenbindenden Molekül, das ein anderes Antigen als CD25 erkennt, das für aktivierte T-Zellen charakteristisch ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Immunsuppression des Säugetiersystems.