DE69112236T2 - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Ironen. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ironen; Gemische der entsprechenden drei Isomeren α, ß und γ werden wegen ihres Veilchengeruchs in der Lebensmittelindustrie, der Parfumindustrie und der Kosmetikindustrie eingesetzt.
• Bei der Ernte enthalten die Iriswurzeln praktisch keine Irone, die sich erst im Verlauf einer längeren Lagerung bilden, wahrscheinlich durch oxidative Umwandlung ursprünglich vorliegender Triterpene.
• Beim üblichen Verfahren zur Herstellung von Ironen muß entsprechend mehr als zwei Jahre nach der Ernte der Wurzeln gewartet werden, bis eine vernünftige Menge an Ironen durch Wasserdampfdestillation oder Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel gewonnen werden kann.
• Vor kurzem wurde in FR-A-2 620 702 ein Verfahren angegeben, bei dem die lange Lagerung entfällt; dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die aus den Rhizomen extrahierten Vorläuferverbindungen des Irons kurze Zeit nach der Ernte mit einem lipophilen Lösungsmittel aus den Rhizomen extrahiert und dann einer chemischen Oxidation unterworfen werden, wodurch die Ironmoleküle freigesetzt werden.
• Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, daß dabei chemische Reaktanten eingesetzt werden, aufgrund deren die so erhaltenen Irone nicht in der Lebensmittelindustrie verwendet werden können; es war daher wünschenswert, ein natürliches Abbauverfahren, beispielsweise ein mikrobiologisches Verfahren, aufzufinden. Es war allerdings nicht naheliegend, daß sich Mikroorganismen auffinden lassen würden, mit denen diese Umwandlung vorgenommen werden kann, die sonst durch die in den Pflanzen enthaltenen Enzyme im Lauf der Lagerung bewirkt wird.
• Es wurden nun aerobe Mikroorganismen aufgefunden, welche die Vorläuferverbindungen innerhalb einiger Tage und mit Ausbeuten an Ironen, bezogen auf die eingesetzte Menge an Iriswurzeln, die höher sind als die nach dem herkömmlichen Verfahren erhältlichen Ausbeuten, abbauen, ohne daß es gleichzeitig zu einem nennenswerten Abbau der gebildeten Irone kommt, was um so interessanter ist, als die Menge der auf dem europäischen Markt verfügbaren Iriswurzeln gegenwärtig abnimmt, ohne daß zugleich die Nachfrage nach Ironen abnimmt.
• Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in der Umwandlung der in den frischen Iriswurzeln vorliegenden Iron-Vorläuferverbindungen durch Einwirkung eines Mikroorganismus der Gattung Botryotinia, die auch als Sclerotinia bezeichnet wird, dessen unvollständige Form Botrytis genannt wird. Diese Pilze sind in der Monographie Hyphomycetes von M.B. Ellis, Commonwealth Mycological Institute, 1971, S. 178 - 184, beschrieben.
• Eine übliche Art dieses Fadenpilzes, von dem verschiedene Stämme in internationalen Mikroorganismensammlungen erhältlich sind, ist Botryotinia convulata, jedoch sind auch andere Arten, wie B. draytonii, B. ficariarum oder B. fuckeliana, ebenfalls geeignet; diese sind beschrieben in: Microfungi on land plants, an Identification Handbook, M.B. Ellis und J.P. Ellis, 1985, Croom Helm, London.
• Es ist möglich, den ganzen Mikroorganismus in seinem Kulturmedium oder lediglich das Mycel einzusetzen; ferner ist auch das Medium, in dem der Pilz kultiviert wurde, nach Abtrennung des Mycels verwendbar.
• Das Kulturmedium kann ein Medium sein, wie es allgemein für diesen Typ von Pilzen verwendet wird, d.h., ein Medium aus Wasser, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle sowie Metallsalze enthält. Als Kohlenstoffquelle können Zucker, wie Glucose, Maltose oder Lactose, oder Glycerin genannt werden; Beispiele für Stickstoffquellen sind Casein, Aminosäuren oder Peptide und Proteine, wozu Gelatine und Gelatinehydrolysate, Malzextrakt oder Maiskolbenkamm- bzw. -stielmaterial, Fleischextrakt, Harnstoff oder Sojamehl gehören; Beispiele für Metallsalze sind Phosphate, Citrate und Acetate von Natrium, Magnesium, Kupfer, Mangan oder Eisen und noch günstiger Gemische von Eisen-, Kupfer- und Mangansalzen. Der pH-Wert des Kulturmediums ist sauer oder neutral und liegt im Bereich von 3,5 bis 7 und vorzugsweise im Bereich von 5,5 bis 6; der pH-Wert des Mediums kann gegebenenfalls mit einem Puffer auf der Basis von Phosphat, Phthalat oder Tris fixiert oder im Verlauf der Entwicklung des Pilzes eingestellt werden. Die Temperatur des Mediums bei der Kultivierung ist die für die Entwicklung des Mikroorganismus günstigste Temperatur. Sie liegt im allgemeinen zwischen 15 und 30 ºC; die Umwandlung der Vorläuferverbindungen der Irone wird vorzugsweise bei dieser Temperatur vorgenommen.
• Die vorgeschaltete Stufe der Extraktion der Vorläuferverbindungen aus den frischen Wurzeln, die gegebenenfalls getrocknet wurden, insbesondere zur Erleichterung ihres Transports, wird durch Suspendieren der zerschnittenen oder zerkleinerten Wurzeln in einem organischen Lösungsmittel vorgenommen, wie es allgemein in der Aromaindustrie verwendet wird; hierzu gehören beispielsweise alkoholische Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, chlorierte Lösungsmittel, wie Methylenchlorid oder Dichlorethan, sowie aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Hexan oder Benzol; gegebenenfalls können Gemische von Lösungsmitteln eingesetzt oder zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit unterschiedlichen Lösungsmitteln vorgenommen werden, beispielsweise mit einem mit Wasser mischbaren sowie mit einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel. Es ist bevorzugt, alkoholische oder chlorierte Lösungsmittel zu verwenden, wobei noch bevorzugter Methanol und Methylenchlorid eingesetzt werden. Die bei einer ersten Extraktion mitextrahierten wasserlöslichen Verbindungen können durch Wiederauflösen des Extrakts in einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel und Waschen dieser organischen Phase abgetrennt werden, bevor das Lösungsmittel abgetrennt wird, um so einen Extrakt zu erhalten, welcher der Einwirkung des Pilzes unterworfen wird.
• Als Ausgangsmaterial können Iris germanica, Iris pallida oder Iris florentina unterschiedlicher Herkunft, etwa aus Marokko oder Italien, verwendet werden. Es ist bekannt, daß die Ausbeute an Ironen und das Verhältnis der Isomeren im erhaltenen Produkt in Abhängigkeit von Art, Herkunft und Reife der eingesetzten Iriswurzeln erheblich schwanken können; in allen Fällen liefert das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren deutlich vorteilhaftere Ergebnisse.
• Erfindungsgemäß wird der Extrakt, vorzugsweise in Suspension in Wasser oder in Lösung in einem kleinen Volumen eines hydrophilen organischen Lösungsmittels, wie Aceton, einem Alkohol oder Dioxan, in das Medium gegeben, in dem der Pilz bis zur Erzielung eines Maximums an Biomasse, d.h. etwa 48 h, kultiviert wurde, und zwar in einer Menge von 1 bis 20 g Extrakt pro Liter Medium; aufgrund der Unlöslichkeit des Extrakts im Medium kann gleichzeitig, wie auf diesem Gebiet geläufig ist, eine kleine Menge eines grenzflächenaktiven Mittels zugesetzt werden; Beispiele hierfür sind Ester von Sorbit mit Fettsäuren, wie Tween , sowie Antischaummittel, wie Siliconöle, Polyalkylenglycole, Soja- oder Maisöl. Das Medium wird unter Rühren gehalten und gegebenenfalls beispielsweise während 20 bis 60 h bei 20 ºC belüftet; anschließend werden die Zellkörper abfiltriert und das gebildete Iron durch Wasserdampfdestillation oder Extraktion mit einem organischen, nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gewonnen. Die optimale Dauer und optimale Temperatur bei dieser Reaktion hängen von den Verfahrensbedingungen ab, nämlich von Material, Art und Konzentration der Reaktanten sowie Art und Stamm der Pilze. Der Fachmann ist in der Lage, durch Vorversuche die optimalen Reaktionsparameter zu ermitteln, wobei zu berücksichtigen ist, daß das gebildete Iron durch den Pilz abgebaut werden kann; der Ablauf der Reaktion kann insbesondere durch Gaschromatographie verfolgt werden.
• Die zur Umwandlung einer gegebenen Extraktmenge erforderliche Biomasse kann kleiner sein, wenn der Extrakt entsprechend einem bekannten Induktionsverfahren in das Vorkulturmedium und das Kulturmedium des Pilzes in einer geringen Konzentration von 0,05 bis 0,1 % eingebracht wird.
• Die Ausbeuten an Ironen sind ferner deutlich verbessert, wenn am Ende der Kultivierung zur Permeabilisierung der Zellmembranen ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel vor der Zugabe des abzubauenden Extrakts zugesetzt wird; Beispiele hierfür sind Ester von Polyolen und Fettsäuren, wie Tween , oder Polyalkylenglycole, wie Octylphenoxypolyethoxyethanol, oder Triton X. Diese grenzflächenaktiven Mittel werden allgemein in einer Konzentration von 0,05 bis 0,25 % eingesetzt.
• Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung kann die Biomasse vor der Zugabe des Extrakts und gegebenenfalls nach der Permeabilisierung der Membranen aus dem Kulturmedium abfiltriert werden.
• Es ist ferner möglich, obgleich hierbei die Ausbeuten der Umwandlung weniger gut sind, das Mycel vom Kulturmedium abzutrennen, gegebenenfalls nach der Permeabilisierung der Membranen, und das Mycel wieder in einer wäßrigen Pufferlösung, die vorzugsweise 5 bis 15 g/l Glucose enthält, zu suspendieren und in dieses Medium, vorzugsweise in Gegenwart eines grenzflächenaktiven Mittels, den umzuwandelnden Extrakt einzubringen.
• Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das Verfahren mit immobilisierten Mikroorganismen durchgeführt, wodurch eine kontinuierliche Verfahrensführung ermöglicht wird; die Immobilisierung wird in herkömmlicher Weise entweder durch Kultivierung des Pilzes in einem Medium, das einen Feststoff in Form von Kugeln, Plätzchen, Ringen oder anderen Formkörpern aus Glas oder einem inerten Polymer enthält, worauf das im Wachstum befindliche Mycel gebunden werden kann, oder durch Abtrennung des Pilzes oder des Mycels aus dem Kulturmedium und Einbringen in eine poröse Matrix, die durch chemische Vernetzung geeigneter Monomerer oder Coazervation von Polymeren gebildet wurde, vorgenommen werden.
• Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben.
• Zunächst wird die Extraktion der Vorläuferverbindungen erläutert:
• 2,5 kg Wurzeln von aus Italien stammender Iris pallida, die getrocknet sind, aber noch 60 % Wasser enthalten, werden gereinigt und zusammen mit 24 l 96 %igem Ethanol in einen Behälter aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 60 l gegeben, der einen in der Mitte vorgesehenen Blattrührer aufweist. Das Gemisch wird 20 h auf der Rückflußtemperatur des Lösungsmittels gehalten; anschließend wird auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und filtriert; das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die abgetrennten Feststoffe werden zusammen mit 12 l Methylenchlorid wieder in den Behälter gegeben, worauf das Gemisch 20 h auf der Rückflußtemperatur des Lösungsmittels gehalten wird; nach Filtrieren bei Raumtemperatur wird das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der mit dem vorher erhaltenen Rückstand vereinigte Rückstand wird wieder in 2 l Methylenchlorid aufgelöst. Die organische Phase wird zweimal mit Wasser gewaschen und dann zur Trockne eingedampft, wobei 1 kg trockener Extrakt erhalten wird.
• Im folgenden wird die Einwirkung des Mikroorganismus erläutert. Es wurden Stämme von Botryotinia convulata eingesetzt, die in der Sammlung des Centraalbureau Voor Schimmelcultures, Baarn, (CBS), Delft, Niederlande, unter den Hinterlegungsnummern 285-38, 286-38, 428-38 verfügbar sind.
BEISPIEL 1 Kultivierung des Mikroorganismus
• Der in einem PDA-Medium (Potato Dextrose Agar), das von Merieux (Frankreich) im Handel ist, konservierte Pilz wird zur Beimpfung von 100 ml eines Vorkultivierungsmediums von ph 5,7 verwendet, das aus 15 g Malzextrakt pro Liter Wasser, 10 g/l Glucose, 2 mg/l Kupfersulfat, 2 mg/l Eisenund Ammoniumcitrat und 2 mg/l Zinkchlorid mit einem Tropfen einer Acetonlösung des Extrakts besteht; nach 48 h unter Rühren bei 20 ºC wird die Vorkultur in 800 ml Kulturmedium von pH 5,7 gegeben, das aus 25 g/l wäßriger Maisweichlauge (corn steep liquor) und 2 mg/l Kupfersulfat, Eisen- und Ammoniumcitrat und Zinkchlorid mit 1 ml einer Acetonlösung des Extrakts besteht. Nach 48 h Rühren bei 20 ºC wird Triton X 100 in einer Konzentration von 0,1 % zu dem Kulturmedium zugegeben; danach werden 2 h später 5 g Extrakt in Emulsion in 10 ml Wasser und 1 ml Aceton mit einem Gehalt von 0,2 % Tween 80 zugesetzt. Das Medium wird bei 20 ºC inkubiert, worauf die Irone durch Wasserdampfdestillation abgetrennt werden. Die nach Versuchen mit einer Dauer von 12 bis 72 h erhaltenen Mengen an Ironen, die durch Gaschromatographie gemessen wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt; sie sind in Gramm Irone pro Kilogramm trockenes Wurzelmaterial, das zur Herstellung des behandelten Extrakts eingesetzt wurde, angegeben. TABELLE 1 Dauer g Irone/kg Wurzel-Trockenextrakt
BEISPIEL 2
• Es wird wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß am Ende der Kultivierung kein Triton zugegeben wird. Man erhält dann lediglich 1,1 g Irone nach 48 h.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von Ironen, dadurch gekennzeichnet, daß die aus frischen Iris-Rhizomen extrahierten Vorläuferverbindungen der Einwirkung eines Pilzes der Gattung Botryotinia unterworfen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pilz der Art Botryotinia convulata verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Eisensalz in das Kulturmedium des Pilzes eingebracht wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen pH-Wert des Kulturmediums von 5,5 bis 6.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Induktion des Pilzes durch Zusatz von Spuren von Rhizomextrakt zum Vorkulturmedium und zum Kulturmedium des Pilzes vorgenommen wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Pilz vor dem Inkontaktbringen mit den Vorläuferverbindungen mit einem Mittel zur Membranpermeabilisierung behandelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mittel zur Membranpermeabilisierung Triton X verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorläuferverbindungen mit einem unter alkoholischen Lösungsmitteln, chlorierten Lösungsmitteln, aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen sowie deren Gemischen ausgewählten Lösungsmittel aus den Rhizomen extrahiert werden.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorläuferverbindungen mit einem unter Methanol, Ethanol und Methylenchlorid ausgewählten Lösungsmittel aus den Rhizomen extrahiert werden.