DE69200412T2

DE69200412T2 - 3-substituierte 1,2,3,4-oxatriazol-5-iminderivate, verfahren zur herstellung sowie diese enthaltende arzneimittel.

Info

Publication number: DE69200412T2
Application number: DE69200412T
Authority: DE
Inventors: B Rge Ingvar Frisch Dk-2670 Greve Strand Alhede; Finn Priess Dk-3450 Aller D Clausen; Tim Niss Dk-2800 Lyngby Corell; Gunnar Leo Dk-2300 Copenhagen S Karup; Bodil Gyllembourg Dk-2000 Frederiksberg Lissau; S Ren Bols Dk-2650 Hvidovre Petersen; Herbert Fritz Dk-3460 Birker D Preikschat
Original assignee: GEA Farmaceutisk Fabrik AS
Current assignee: Sandoz AS
Priority date: 1991-02-12
Filing date: 1992-02-11
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2012-02-12
Also published as: EP0571485B1; DE69200412D1; EP0571485A1; DK0571485T3; LTIP298A; US5405857A; CZ163993A3; JPH05286950A; LV10617B; BR9205624A; SI9210142A; LT3184B; SK78993A3; ES2062891T3; HUT68643A; NO932822L; BG97988A; IE66384B1; IE920436A1; ATE111455T1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft bisher unbekannte 3-substituierte 1,2,3,4-Oxatriazol-5-imin-Verbindungen, von denen sich zeigte, daß sie biologische Wirkungen haben, die sie für die Behandlung von kardiovaskulärer Erkrankungen (Blutgerinnsein) und Asthma geeignet machen, ein Verfahren zur Herstellung hievon und eine pharmazeutische Zubereitung, die diese Verbindungen enthält.

Technischer Hintergrund

K. Masuda et al., Chem. Pharm. Bull. 19 (3), S.559-563 (1971), offenbart 3-Aryl-1,2,3,4-oxatriazol-5-imin-Verbindungen und Acyl-Derivate hievon, worin die Acyl-Gruppe durch Methyl oder Halogen monosubstituiert sein kann. Auch wenn diese Verbindungen in der Hoffnung, neue hypotensive Mittel zu finden, synthetisiert wurden, werden keine biologischen Wirkungen der Verbindungen beschrieben.
C. Christophersen et al., Acta. Chemica Scandinavica 25, S.625-630 (1971), offenbart 3-substituierte 1,2,3,4-Oxatriazol- 5-imino-Verbindungen, worin der 3-Substituent Propyl oder Phenyl oder Cyclohexyl sein kann. Es werden jedoch keine biologischen Wirkungen der genannten Verbindungen beschrieben.
Hanley et al., J.C.S. Perkin Trans. I, 736-740 (1979), offenbart 3-Aryl-1,2,3,4-oxatriazol-5-imin-Verbindungen, worin die Aryl-Gruppe durch Methyl oder Halogen monosubstituiert sein kann. Es werden jedoch keine biologischen Wirkungen der Verbindungen beschrieben.
Die JP-Patente 20904/70 und 21102/70 offenbaren 3-substituierte 1,2,3,4-Oxatriazol-5-iminsalze und Acyl-Derivate hievon, worin der 3-Substituent Aryl, gegebenenfalls monosubstituiert durch Chlorid oder Methyl, sein kann. Es wird festgestellt, daß diese Verbindungen blutdrucksenkende Wirksamkeit aufweisen.
Die GB-A-2 015 878 offenbart 3-Phenyl-1,2,3,4-oxatriazol-5- imin-Verbindungen, bei welchen eine Pestizid- und/oder Schädlingsovicid- und/oder Herbizid-Wirksamkeit gefunden wurde.
Die US-A-4 329 355 offenbart Anhydro-5-imino-1,2,3,4-oxatriazoliumhydroxide mit einer Struktur ähnlich der Struktur der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Es wird jedoch nur angegeben, daß die aus diesem Patent bekannten Verbindungen bei der Behandlung von Krebs verwendbar sind.
Ferner sind aus J.C.S. Perkin Trans. I, 747-751 (1979), Verbindungen mit einer Struktur ähnlich der Struktur der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bekannt. Es wurden jedoch keine biologischen Wirkungen der genannten Verbindungen festgestellt.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft bisher unbekannte 3-substituierte 1,2,3,4-Oxatriazol-5-imin-Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und Säureadditionssalze hievon
worin R¹ die gleiche oder verschiedene Alkyl- oder Alkoxy- Gruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Phenyl oder Alkylsulfonyl-Gruppen bedeutet; n 1 bis 5 ist; und R² Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel (II)
-X - Y - Q -(Z)m (II),
worin X -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NH-, -S(O)&sub2; oder eine direkte Bindung bedeutet, darstellt; Y eine Alkylen-Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine direkte Bindung ist; und Q Alkyl, Cycloalkyl, Alkoxy oder eine Phenyl-, Pyridyl-, Furanyl-, Thienyl- oder Pyrazinyl-Gruppe, die gegebenenfalls durch Z substituiert ist, bedeutet; Z Alkyl- oder Alkoxy-Gruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Halogen, Hydroxy, Acyloxy, Trifluormethyl, Nitro, Cyano oder Alkylsulfonyl darstellt; und m Null bis 3 ist; wobei Z, wenn X die Bedeutung -C(O)- oder -C(O)NH- hat, Y eine direkte Bindung ist, und Q substituiertes Phenyl darstellt, auch die Struktur (I), worin R² die gleiche Bedeutung in bezug auf X, Y und Q hat, sein kann; mit der Maßgabe, daß R² nicht Wasserstoff, Alkyl, Benzoyl, Trifluoracetyl oder eine gegebenenfalls substituierte Phenyl-Gruppe ist, wenn R¹ Methyl oder Chlor darstellt, und n 1 ist, und R² nicht Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substuierte Phenyl-Gruppe ist, wenn R¹ Nitro, Alkoxy, Fluor oder Brom darstellt, und n 1 ist.
Diese Verbindungen unterscheiden sich von den obigen bekannten Verbindungen durch ihre chemische Zusammensetzung, da sie eine andere Substitution in Stellung 3 und/oder in Stellung 5 des Oxatriazolrings aufweisen, und sie unterscheiden sich von den aus den obigen Patenten bekannten Verbindungen durch ihre biologische Wirkung, da sie die Blutplättchenaggregation inhibieren und eine entspannende Wirkung auf die Trachea ausüben.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zubereitung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als aktiven Bestandteil eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) in Vereinigung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.
Gemäß der Erfindung sind die bevorzugten Verbindungen die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin n 2 bis 4 ist.
In der allgemeinen Formel (II) bedeutet Q vorzugsweise Alkyl- und Alkoxy-Gruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Die Verbindungen der Erfindung können Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren bilden. Geeignete Säuren sind beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Oxalsäure, Milchsäure, Weinsäure, Essigsäure, Salicylsäure, Benzoesäure, Ameisensäure, Propionsäure, Pivalinsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Sulfamidsäure, Phenylpropionsäure, Gluconsäure, Ascorbinsäure, Isonicotinsäure, Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Zitronensäure oder Adipinsäure.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der 3-substituierten 1,2,3,4-Oxatriazol-5-imin- Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und von Säureadditionssalzen hievon, welches Verfahren gekennzeichnet ist durch
a) Ringschluß eines 1-Arylthiosemicarbazid-Derivats der allgemeinen Formel (III)
worin R¹ die gleiche Bedeutung hat wie in Formel (I), und R³ entweder H oder eine Gruppe der Formel (IV)
-X-Y-Q-(Z)m (IV),
worin X eine direkte Bindung ist, und Y und Q-(Z)m die gleiche Bedeutung haben wie in Formel (I), darstellt, durch die Behandlung mit einem Alkylnitrit mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkalimetallnitrit unter sauren Bedingungen bei ungefähr 0 bis 10ºC, wonach das erhaltene Salz gegebenenfalls in die freie Verbindung übergeführt wird, und, wenn gewünscht, acyliert wird.
Das Verfahren unter Verwendung von Alkylnitrit mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist neu und wird zur Herstellung der Verbindungen gemäß der Erfindung bevorzugt, da dadurch eine quantitative Ausbeute vor der Reinigung erhalten wird.
Es wird bevorzugt, im Verfahren gemäß der Erfindung Ethylnitrit als Alkylnitrit mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Natriumnitrit als Alkalimetallnitrit zu verwenden.
Die Cyclisierung von 1,4-disubstituierten Thiosemicarbaziden mit salpetriger Säure (Natriumnitrit und Säure) ist an sich bekannt, wobei 3-substituierte 1,2,3,4-Oxatriazol-5- imine gebildet werden. Die Ausbeuten dieser Reaktion werden zwischen 18 und 57 % angegeben.
Zum Umsetzen von 1 Äquivalent des 1-Aryl-thiosemicarbazid- Derivats mit Alkylnitrit mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wird es bevorzugt, 2 bis 2,5 Äquivalente Alkylnitrit in einem geeigneten Lösungsmittel, wie einem Alkylalkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, zu verwenden, wobei das 3-arylsubstituierte 1,2,3,4- Oxatriazol-5-iminsalz in einer im wesentlichen quantitativen Ausbeute erhalten wird. Nach der Filtration des ausgefällten Schwefels und dem Abdampfen des Lösungsmittels wird das Produkt, wenn notwendig, beispielsweise aus einem Alkylalkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Acetonitril oder Nitromethan umkristallisiert, wodurch die erhaltenen Ausbeuten an reinem Produkt üblicherweise zwischen 60 und 95 % liegen.
Methanol oder Ethanol wird vorzugsweise als Alkylalkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen verwendet.
Die Herstellung der acylierten Verbindungen gemäß der Erfindung wird vorzugsweise durchgeführt, indem ein 3-Aryl- 1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorid in einem Zweiphasensystem, das Wasser und einen halogenierten Kohlenwasserstoff, vorzugsweise Methylenchlorid, enthält, gelöst wird, dem Basenmengen äquivalent zur Reaktion, beispielsweise Natriumhydrogencarbonat, und ein Acylierungsmittel, zugesetzt werden. Das erhaltene Produkt kann durch das Eindampfen der organischen Phase gebildet werden, und wird gegebenenfalls aus einem Alkylalkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Acetonitril umkristallisiert. Die Ausbeuten dieser Verbindungen liegen üblicherweise im Bereich von 50 bis 95 %. Außerdem können die acylierten Verbindungen gemäß der Erfindung auf an sich bekannte Weise durch das Umsetzen von 3-Aryl-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorid mit einem Acylierungsmittel in Pyridin hergestellt werden.
Geeignete Acylierungsmittel sind beispielsweise: Halogenameisensäureester, Säurechloride, Anhydride, O-Alkyl- und O-Arylester, Alkyl- und Arylisocyanate, Alkyl- und Arylisothiocyanate.
Die 5-imonoalkylierten Derviate von 3-Aryl-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminen gemäß der Erfindung werden vorzugsweise aus 1-Aryl-4-substituierten Thiosemicarbaziden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung eines C&sub1;-C&sub6;-Alkyl- alkohols, vorzugsweise Methanol oder Ethanol, als Lösungsmittel hergestellt. Die Ausbeuten dieser Verbindungen liegen üblicherweise zwischen 80 und 90 %.
Die Säureadditionssalze stammen üblicherweise von der Synthese der Verbindungen der Formel (I), worin R² die Bedeutung H, Aryl, Alkyl oder Cycloalkyl hat. Die freien Verbindungen können auf an sich bekannte Weise aus den Säureadditionssalzen erhalten werden, das heißt beispielsweise durch Lösen oder Suspendieren in Wasser und anschließendes Umsetzen mit der Base bis zu einer alkalischen Reaktion (vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,5), beispielsweise mit Natriumhydrogencarbonat, und anschließendes Isolieren.
Die erforderlichen Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel (III) können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden. Die Ausgangsverbindungen der Formel (III), worin R³ die Bedeutung H hat, können beispielsweise durch das Umsetzen des substituierten Arylhydrazinhydrochlorids mit einem Alkalithiocyanat oder einem Ammoniumthiocyanat in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Alkohol oder Wasser, am Rückfluß während 6 bis 18 Stunden hergestellt werden, wie beispielsweise von Houben- Weyl: "Methoden der organischen Chemie E4", S.513, beschrieben. Die Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel (III), worin R³ Alkyl oder Aryl darstellt, können ähnlich auf an sich bekannte Weise hergestellt werden, beispielsweise durch das Umsetzen eines Arylhydrazins mit einem Alkyl- oder Arylthiocyanat in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Ether, Methanol, Ethanol, Benzol oder Toluol, wie von Houben-Weyl: "Methoden der organischen Chemie E4", S.506, beschrieben.

HERSTELLUNG DER AUSGANGSMATERIALIEN

Herstellung von 1-(3-Chlor-2-methylphenyl)-thiosemicarbazid

19,3 g (0,1 mol) 3-Chlor-2-methylphenylhydrazinhydrochlorid wurden in 200 ml absolutem Ethanol gelöst. 11,64 g (0,12 mol) Kaliumthiocyanat wurden der Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde am Rückfluß 16 h lang erhitzt. Dann wurde die Mischung abgekühlt, wodurch das Produkt teilweise ausfiel, und die Mischung wurde anschließend mittels eines Rotationsverdampfers zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde aus 200 ml Wasser und 250 ml Methanol umkristallisiert, abfiltriert und sorgfältig mit Wasser gewaschen.
Ausbeute: 17,8 g = 82,5 %.
Fp. 192-193ºC.
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub8;H&sub1;&sub0;ClN&sub3;S: C 44,54; H 4,67; N 19,48; S 14,86 %
Gefunden: C 44,22; H 4,58; N 19,60; S 14,67 %.
500 MHz ¹H NMR (d&sub6;-DMSO):
δ 9,33 (br s, 1H, NH) δ 7,80 (br s, 1H, NH) δ 7,72 (br s, 1H, NH), δ 7,52 (br s, 1H, NH), δ 6,80 (m, 3H, ArH), δ 2,18 (s, 3H, CH&sub3;).

Herstellung von 1-(3-Chlor-2-methylphenyl)-4-(1-methylpropyl)- thiosemicarbazid

1,44 g (10 mmol) sek.Butylisothiocyanat wurden zu 1,56 g (10 mmol) 3-Chlor-2-methylphenylhydrazin, gelöst in 120 ml Toluol, zugesetzt, und die Mischung wurde 2 h lang am Rückfluß gehalten und anschließend eingedampft. Die Remanenz wurde mit einer geringen Menge an Hexan gerührt, abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 2,3 g = 96,6 %.
Fp. 145-146ºC.
Elementaranalyse:
Berechnet: C 53,02; H 6,67; N 15,46; S 11,79; Cl 13,04 %
Gefunden: C 53,22; H 6,33; N 15,52; S 11,84; Cl 13,02 %.
500 MHz ¹H NMR (CDCl&sub3;):
δ 7,48 (s, 1H, NH), δ 6,94 (m, 3H, ArH), δ 6,90 (br s, 1H, NH), δ 5,92 (s, 1H, NH), δ 4,40 (m, 1H, CH), δ 2,60 (s, 3H, CH&sub3;), δ 1,54 (m, 2H, CH&sub2;), δ 1,18 (d, 3H, CH&sub3;), δ 0,88 (t, 3H, CH&sub3;).

Beispiel 1: 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorid

8,6 g (40 mmol) 1-(3-Chlor-2-methylphenyl)-thiosemicarbazid wurden in 100 ml Methanol und 5 ml 37 % Salzsäure unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Die Mischung wurde mittels eines Eisbades auf 0 bis 5ºC gekühlt, und dann wurden 6,3 g (7 ml) Ethylnitrit in kleinen Mengen während eines Zeitraums von ungefähr 5 min zugesetzt. Die Mischung färbte sich dunkel durch die salpetrigen Dämpfe, wurde jedoch nach einigen Minuten gleichzeitig mit der Ausfällung von freiem Schwefel hell. Die Mischung wurde 10 min lang gerührt, und weitere 0,9 g (1 ml) Ethylnitrit wurden zugesetzt, und dann wurde die Reaktionsmischung etwa 20 min lang unter Rühren stehengelassen. Der Schwefel wurde abfiltriert und die Mischung auf einem Rotationsverdampfer bei einer Badtemperatur von 30ºC eingedampft. Wenn notwendig, wurde die Mischung durch Eindampfen mit Toluol/Ethanol dehydratisiert. Die Kristalle wurden mit Diethylether gerührt, abfiltriert und mit weiteren geringen Mengen an Diethylether gewaschen.
Ausbeute: 9,2 g = 94 %.
Fp. 194-195ºC (Zersetzung).
IR: 1700 cm&supmin;¹.
Elementaranalyse:
Berechnet für
C&sub8;H&sub7;ClN&sub4;O.HCl.¼H&sub2;O: C 38,19; H 3,41; N 22,28; Cl 28,18 %
Gefunden: C 38,07; H 3,19; N 22,30; Cl 28,58 %.
500 MHz ¹H NMR (D&sub2;O):
δ 7,52 (m, 3H, ArH), δ 2,38 (s, 3H CH&sub3;)

Beispiele 2 bis 28:

Die in Tabelle 1 angegebenen Verbindungen wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Tabelle 1 Bsp. (R¹)n Ausbeute Schmelzpunkt/ºC IR (KBr) (cm&supmin;¹) UV Wasser a/Ethanol b (nm) Tabelle 1 (Fortsetzung) Bsp. (R¹)n Ausbeute Schmelzpunkt/ºC IR (KBr) (cm&supmin;¹) UV Wasser a/Ethanol b (nm)

Beispiel 29: 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-imin

1,23 g (5 mmol) des in Beispiel 1 hergestellten 3-(3-Chlor- 2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorids wurden in einem Zweiphasensystem, bestehend aus 30 ml Wasser und 10 ml Dichlormethan, gelöst. Die Mischung wurde in einem Eisbad auf 5ºC abgekühlt, und anschießend wurden 0,84 g (10 mmol) Natriumhydrogencarbonat in kleinen Mengen vorsichtig zugesetzt. Nachdem die Kohlendioxid-Entwicklung aufgehört hatte, wurde die Mischung etwa 10 min lang heftig gerührt, wonach die organische Phase abgetrennt und eingedampft wurde.
Ausbeute: 0,89 g = 84,6 %.
Fp. 54-56ºC.
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub8;H&sub7;ClN&sub4;O: C 45,62; H 3,35; N 26,60; Cl 16,83 %
Gefunden: C 45,95; H 3,35; N 26,30; Cl 17,27 %.

Beispiel 30: 3-(3-Trifluormethylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-(N-3-trifluormethylbenzylcarbonyl)-imin

2,66 g (10 mmol) des in Beispiel 3 hergestellten 3-(3-Trifluormethylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorids wurden in 45 ml Wasser gelöst und dann 1,68 g (20 mmol) Natriumhydrogencarbonat in kleinen Mengen vorsichtig zugesetzt. 20 ml Dichlormethan wurden der ausgefällten freien Base zugesetzt, die sich darin vollständig löste, und die Mischung wurde in einem Eisbad auf 5ºC gekühlt. 2,23 g (10 mmol) 3-Trifluormethylbenzyl- carbonsäurechlorid, gelöst in 10 ml Methylenchlorid, wurden dann der Mischung unter heftigem Rühren zugesetzt. Anschließend wurde die Mischung 45 min lang gerührt, wonach die organische Phase abgetrennt und 2 x mit je 30 ml Wasser gewaschen wurde. Das Methylenchlorid wurde auf einem Rotationsverdampfer abgedampft, und die erhaltene Substanz wurde mit Diethylether sorgfältig gerührt, abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 2,98 g = 71,6 %.
Fp. 106-108ºC.
IR: 1655 cm&supmin;¹, 1620-1590 cm&supmin;¹, 1350-1320 cm&supmin;¹.
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub0;F&sub6;N&sub4;O&sub2;: C 49,04; H 2,42; N 13,46 %
Gefunden: C 48,87; H 2,30; N 13,59 %.
500 MHz ¹H NMR (d&sub6;-DMSO):
δ 8,02 (m, 8H, ArH), δ 3,88 (s, 2H, CH&sub2;)

Beispiele 31 bis 45:

Die in Tabelle 2 angegebenen Verbindungen wurden wie in Beispiel 30 beschrieben hergestellt. Tabelle 2 Bsp. (R¹)n R² Ausbeute Schmelzpunkt/ºC IR (KBr) (cm&supmin;¹) UV Ethanol b (nm)

Beispiel 46: 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-(N-2-pyrazinoyl)-imin

2,47 g (10 mmol) des in Beispiel 1 hergestellten 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorids wurden in 30 ml Wasser gelöst, welchem anschließend 2,1 g (25 mmol) Natriumhydrogencarbonat unter Rühren zugesetzt wurden. Nachdem die Kohlendioxid-Entwicklung aufgehört hatte, wurden 30 ml Dichlormethan zugesetzt, wonach sich die ausgefällte Substanz löste. Dann wurden 2,21 g (10 mmol) Pyrazin-2- carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester zugesetzt. Die Mischung wurden unter starkem Rühren 16 h lang stehengelassen, wonach die Methylenchlorid-Phase abgetrennt wurde. Diese Phase wurde 2 x mit je 30 ml Wasser gewaschen und abgedampft. Die Substanz wurde mit einer geringen Menge an Diethylether gerührt und abfiltriert.
Ausbeute: 2,03 g = 64,3 %.
Fp. 111-112ºC.
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub9;ClN&sub5;O: C 49,30; H 2,86; N 26,54; Cl 11,19 %
Gefunden: C 49,10; H 2,89; N 26,37; Cl 11,40 %.
500 MHz ¹H NMR (CDCl&sub3;):
δ 9,26 (d, 1H, J = 1,5 Hz, ArH), δ 8,56 (d, 1H, J = 2,5 Hz, ArH), δ 8,39 (dd, 1H, J = 1,5 Hz und J = 2,5 Hz, ArH), δ 7,21 (m, 3H, ArH), δ 2,58 (s, 3H, CH&sub3;)

Beispiel 47: 3-(2-Chlor-3-chlorphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-(N-phenylcarbamoyl)-imin

2,31 g (10 mmol) des in Beispiel 21 hergestellten 3-(2-Chlor-3-chlorphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorids wurden in 30 ml Wasser gelöst, welchem 0,9 g (10,7 mmol) Natriumhydrogencarbonat zugesetzt wurden. Nachdem die Kohlendioxid-Entwicklung aufgehört hatte, wurden 30 ml Dichlormethan und 1,20 g (10 mmol) Phenylisocyanat in 5 ml Dichlormethan zugesetzt. Dann wurde die Mischung 30 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt, wodurch das Produkt teilweise ausfiel. Weitere 50 ml Dichlormethan und 30 ml Wasser wurden zugesetzt, wonach sich die Phasen trennten. Die Dichlormethan-Phase wurde mit 50 ml Wasser gewaschen und abgedampft. Die Umkristallisation wurde in absolutem Ethanol durchgeführt.
Ausbeute: 2,10 g = 60,9 %.
Fp. 149-151ºC.
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub9;Cl&sub2;N&sub5;O&sub2;: C 48,02; H 2,59; N 20,01; Cl 20,25 %
Gefunden: C 48,06; H 2,67; N 19,68; Cl 20,17 %.
500 MHz ¹H NMR (CDCl&sub3;):
δ 6,69 (m, 3H, ArH), δ 7,58 (br s, 1H, NH), δ 7,19 (m, 5H, ArH).

Beispiel 47a: 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-(N-3,4-dimethoxyphenylethylcarbamoyl)-imin

2,47 g (10 mmol) des in Beispiel 1 hergestellten 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorids wurden in 30 ml Wasser gelöst, welchem 0,9 g (10,7 mmol) Natriumhydrogencarbonat zugesetzt wurden. Nachdem die Kohlendioxid-Entwicklung aufgehört hatte, wurden 30 ml Dichlormethan und 2,1 g (10 mmol) Homoveratrylisocyanat in 5 ml Dichlormethan zugesetzt. Dann wurde die Mischung 30 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt, wonach die Phasen getrennt wurden. Die Methylenchlorid-Phase wurde mit Wasser gewaschen, filtriert und abgedampft. Anschließend wurde die Substanz mit Diethylether gewaschen.
Ausbeute: 3,60 g = 86,12 %.
Fp. 148-151ºC.
IR: 1660 cm&supmin;¹ (N&supmin;-CO-NH); 1260, 1030 cm&supmin;¹ (OCH&sub3;).
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub1;&sub9;H&sub2;OClN&sub5;O&sub4;: C 54,61; H 4,82; N 16,76 %
Gefunden: C 54,22; H 4,67; N 16,72 %.

Beispiel 48: 3-(4-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-(N-4-pyridinoyl)-imin

0,90 g (5 mmol) Isonicotinsäurechlorid wurden einer eisgekühlten Suspension von 1,24 g (5 mmol) des in Beispiel 13 hergestellten 3-(4-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-imin- hydrochlorids in 15 ml Pyridin zugesetzt.
Die Mischung wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt, und anschließend wurden 20 ml Wasser zugesetzt (Wärmeentwicklung). Die Mischung wurde mit Eis abgekühlt und die Substanz abfiltriert. Dann wurde die Substanz sorgfältig mit Wasser und Ether gewaschen.
Ausbeute: 1,35 g = 85,52 %.
Fp. 180-184ºC.
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub0;ClN&sub5;O&sub2;: C 53,36; H 3,20; N 22,13; Cl 11,23 %
Gefunden: C 53,26; H 3,19; N 22,18; Cl %.
500 MHz ¹H NMR (d&sub6;-DMSO):
δ 8,77 (dd, 2H, PyrH, J = 6 Hz, J = 1,5 Hz), δ 7,99 (dd, 2H, PyrH, H = 6 Hz, J = 1,5 Hz), δ 7,77 (d, 1H, ArH, J = 9 Hz), δ 7,81 (d, 1H, Arh, J = 2Hz), δ 7,71 (dd, 1H, Arh, J = 9Hz, J = 2 Hz).

Beispiele 49 bis 59:

Die in Tabelle 3 angegebenen Verbindungen wurden auf eine Weise hergestellt, die jener in Beispiel 48 entspricht. Tabelle 3 Bsp. (R¹)n R² Ausbeute Schmelzpunkt/ºC IR (KBr) (cm&supmin;¹) UV Ethanol b (nm)

Beispiel 60: 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-(N-1-methylpropyl)-iminhydrochlorid

1,5 g (20 mmol) Ethylnitrit wurden einer eisgekühlten Mischung von 2,16 g (8 mmol) 1-(3-Chlor-2-methylphenyl)-4-(1- methylpropyl)-thiosemicarbazid und 2 ml 37 % Salzsäure in 80 ml Ethanol während eines Zeitraums von 5 min tropfenweise zugesetzt. Kurz danach begann der Schwefel auszufallen. Anschließend wurde die Mischung 1 h lang gerührt, wonach der Schwefel abfiltriert und die Mischung eingedampft wurde. Etwa 50 ml Ether wurden zugesetzt, und die Substanz wurde langsam kristallin. Die Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 2,00 g = 93,73 %.
Fp. 151-153ºC.
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub5;ClN&sub4;O.HCl.-H&sub2;O: C 47,54; H 5,32; N 18,48; Cl 23,48 %
Gefunden: C 46,91; H 5,34; N 18,17; Cl 23,45 %.
500 MHz ¹H NMR (d&sub6;-DMSO):
δ 7,84 (m, 3H, ArH), δ 3,77 (m, 1H, CH), δ 1,69 (m, 2H, CH&sub2;), δ 1,33 (d, 3H, CH&sub3;), δ 0,96 (t, 3H, CH&sub3;)

Beispiele 62 und 63:

Die in Tabelle 4 angegebenen Verbindungen wurden auf die in Beispiel 60 beschriebene Weise hergestellt. Tabelle 4 Bsp. (R¹)n R² Ausbeute Schmelzpunkt/ºC IR (KBr) (cm&supmin;¹)

Beispiel 64: 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-(N-3-methoxypropyl)-iminhydrochlorid

1,15 g (4 mmol) 1-(3-Chlor-2-methylphenyl)-4-(3-methoxypropyl)-thiosemicarbazid wurden in 40 ml 96 % Ethanol und 1 ml konzentrierter Salzsäure suspendiert. Die Mischung wurde eisgekühlt und eine Lösung von 0,55 g (8 mmol) Natriumnitrit in 2 ml Wasser tropfenweise zugesetzt, mit dem Ergebnis, daß die Suspension so gelöst wurde, und nach einiger Zeit die Ausfällung von Schwefel begann. Die Mischung wurde erneut 1 h lang gerührt und anschließend klarfiltriert. Die Mischung wurde bei einem Maximum von 30ºC eingedampft, und dann wurden 10 ml Ethanol, gefolgt von 50 ml Ether der Substanz zugesetzt, mit dem Effekt, daß die Substanz ausfiel. Das erhaltene Produkt wurde abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 1,0 g = 78 %.
Fp. 133,1-133,3ºC.
IR (KBr) (cm&supmin;¹): 3000-2700 (aliphatisch); 1710 (C-N&supmin;-C, HCl); 1085 (OCH&sub3;).

Beispiel 65: 3-(4-Methylsulfonylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorid

Eine Lösung von 4,66 g (25 mmol) 4-Methylsulfonylphenyl- hydrazin in 100 ml trockenem Tetrahydrofuran wurde bei 0ºC einer Lösung von 1,32 g (12,5 mmol) Cyanogenbromid in 10 ml Ether zugesetzt. Die Mischung wurde 1 h lang kalt gerührt, dann abfiltriert und mit trockenem Ether gewaschen. Das Filtrat wurde auf zwischen -20 und -40ºC gekühlt, wonach Stickstoffoxid etwa 45 min lang zugesetzt wurde.
Anschließend wurde ein Ethanol/Salzsäure-Überschuß der Mischung zugesetzt, die dann 4 h lang bei 5ºC gerührt wurde. Die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert und aus Ethanol umkristallisiert.
Ausbeute: 1,20 = 35 %.
Fp. 193-195ºC.
Die IR- und UV-Ergebnisse sind gleich wie jene, die durch das in Beispiel 10 hergestellte Produkt erhalten werden.

Beispiel 66: 1,2-Bis-(3-(3-chlor-2-methylphenyl)- 1,2,3,4-oxatriazolyl-5-carbamoyl)-benzol

4,94 g (20 mmol) des in Beispiel 1 hergestellten 3-(3-Chlor-2-methyphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorids wurden in 60 ml Wasser gelöst, wonach 3,78 g (45 mmol) Natriumhydrogencarbonat unter Rühren zugesetzt wurden. Nachdem die Kohlendioxid-Entwicklung aufgehört hatte, wurden 60 ml Dichlormethan zugesetzt, was dazu führte, das sich die ausgefällte Substanz löste. Dann wurden 2,13 g (10 mmol) Phthalylchlorid der Mischung zugesetzt. Die Mischung wurde unter Rühren 45 min lang bei Raumtemperatur stehengelassen, wonach die Methylenchlorid- Phase abgetrennt wurde. Diese Phase wurde 2 x mit je 60 ml Wasser gewaschen und dann abgedampft. Die Substanz wurde mit einer geringen Menge an Diethylether gerührt und abfiltriert.
Ausbeute: 3,53 g = 64,1 %.
Fp. 176-178ºC.
IR: 1685 cm&supmin;¹ breit. (C-N-CO).
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub1;&sub6;Cl&sub2;N&sub2;O&sub4;: C 52,28; H 2,93; N 20,32; Cl 12,86 %
Gefunden: C 51,87; H 3,17; N 20,02; Cl 12,55 %.

Beispiel 67: 1,4-Bis-(3-(3-chlor-2-methylphenyl)- 1,2,3,4-oxatriazolyl-5-carbamoylamino)-benzol

3,40 g (13,4 mmol) des in Beispiel 1 hergestellten 3-(3-Chlor-2-methyphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorids wurden in 50 ml Wasser gelöst, welchem anschließend 2,25 g (26,8 mmol) Natriumhydrogencarbonat unter Rühren der Mischung zugesetzt wurden. Nachdem die Kohlendioxid-Entwicklung aufgehört hatte, wurden 50 ml Dichlormethan zugesetzt, was dazu führte, das sich die ausgefällte Substanz löste, und dann wurden 1,1 g (6,9 mmol) 1,4-Phenylendiisocyanat in 20 ml Methylenchlorid zugesetzt. Die Mischung wurde unter Rühren 60 min lang bei Raumtemperatur stehengelassen, wonach die Methylenchlorid-Phase abgetrennt wurde. Diese Phase wurde anschließend 2 x mit je 50 ml Wasser gewaschen und abgedampft. Die Substanz wurde mit einer geringen Menge an Diethylether gerührt und abfiltriert.
Ausbeute: 3,02 g = 78,5 %.
Fp. 200-201ºC Zers.
IR: 1660 cm&supmin;¹ (N-CO-NH).
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub1;&sub8;Cl&sub2;N&sub1;&sub0;O&sub4;: C 49,53; H 3,12; N 24,10; Cl 12,20 %
Gefunden: C 49,52; H 3,10; N 23,33; Cl 12,50 %.

Beispiel 68: 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-(N-1-adamantyl)-iminhydrochlorid

5,1 g (14,6 mmol) 1-(3-Chlor-2-methylphenyl)-4-(1- adamantyl)-thiosemicarbazid wurden in 1,5 l Methanol und 1,5 ml konzentrierter Salzsäure gelöst. Die Mischung wurde eisgekühlt, und 1,26 ml (30 mmol) Ethylnitrit wurden dieser zugesetzt, wonach die Mischung erneut 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt wurde. Anschießend wurde die trübe Lösung abfiltriert und eingedampft. Die Substanz kristallisierte nach einigen Stunden in Anwesenheit von Diethylether, gemischt mit einer geringen Menge an Ethanol. Die Substanz wurde abfiltriert und mit Ether gewaschen.
Ausbeute: 2,9 g = 52,1 %.
Fp. 204,3-204,8ºC.
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub1;ClN&sub4;O.HCl: C 56,79; H 5,82; N 14,69 %
Gefunden: C 55,18; H 5,80; N 14,17 %.
IR: 2910 cm&supmin;¹, 2860 cm&supmin;¹ (aliphatisch); 1695 cm&supmin;¹ (C-N-C, HCl).

Beispiel 69: 3-(3-Chlor-2-methylphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-(N-3-hydroxyphenylcarbamoxyl)-imin

2,47 g (10 mmol) des in Beispiel 1 hergestellten 3-(3-Chlor-2-methyphenyl)-1,2,3,4-oxatriazol-5-iminhydrochlorids wurden in 30 ml Wasser gelöst, welchem anschließend 0,9 g (10,7 mmol) Natriumhydrogencarbonat unter Rühren zugesetzt wurden. Nachdem die Kohlendioxid-Entwicklung aufgehört hatte, wurde 3-Hydroxyphenylisocyanat in 30 ml Toluol unter intensivem Rühren zugesetzt. Dann wurde die Mischung weitere 30 min lang gerührt, mit dem Ergebnis, das eine gelbe Substanz ausfiel. Die Substanz wurde abfiltriert und zweimal mit Ethanol und einmal mit Diethylether gewaschen.
Ausbeute: 1,1 g = 31,8 %.
Fp. 164-165ºC.
Elementaranalyse:
Berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub2;ClN&sub5;O&sub3;: C 52,11; H 3,50; N 20,26 %
Gefunden: C 51,37; H 3,42; N 19,36 %.
IR: 1630 cm&supmin;¹ (N-CO-NH), 1320 cm&supmin;¹, 1210 cm&supmin;¹ (Ar-OH).

PHARMAKOLOGISCHE TESTS

1. Inhibierung der Blutplättchenaggregation

Verbindungen gemäß der Erfindung wurden auf ihre Inhibierung des Zusammenklumpens (Aggregation) von Blutplättchen (Thrombozyten) getestet, was die erste Phase bei der Entstehung von Blutgerinnseln (Thromben) darstellt. Eine derartige Inhibierung kann die Bildung von Blutgerinnseln verhindern, und die Entwicklung neuer Thromben nach einem diagnostizierten Thrombus kann inhibiert werden.
Das Verfahren zum Nachweis dieser Wirkung ist eine sogenannte Aggregometer-Messung, die erstmals von Born (Nature (Lond.) 194, 927-929, 1962) beschrieben wurde. Es wird Citratstabilisiertes (0,38 % Natriumzitrat, Endkonzentration) venöses Blut von gesunden Probanden verwendet, die zumindest 8 Tage lang keine Medikamente eingenommen haben. Geringfügiges Zentrifugieren (160 x g während 10 Minuten) führt zu PRP (plättchenreichem Blutplasma), das pipettiert wird. PPP (plättchenarmes Plasma) wird durch intensives Zentrifugieren (3000 x g während 10 Minuten) des verbleibenden Blutes erhalten. Die Lichttransmission wird durch das Aggregometer (CHRONOLOG) gemessen. PRP ermöglicht nahezu keine Lichttransmission, wohingegen PPP eine vollständige Lichttransmission zuläßt. Das PRP wird bei 37ºC in das Aggregometer gegeben, während es von einem Magneten gerührt wird. Der Zusatz einer pro-aggregierenden Substanz bewirkt, daß das PRP allmählich aggregiert, und gleichzeitig findet eine zunehmende Lichttransmission statt. Bei der vollständigen Aggregation wird eine PPP entsprechende Lichttransmission erhalten. Adenosindiphosphat (ADP) wird als pro-aggregierende Substanz verwendet, welche Substanz einen zentralen biochemischen Mechanismus zur Aggregation von Blutplättchen darstellt. Die Testsubstanzen werden in in das Aggregometer gegebenem PRP unter Magnetrühren 3 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Dann wird eine vorherbestimmte zwangsweise aggregierende Dosierung von Adenosindiphosphat (ADP) (2 bis 4 uM) zugesetzt. Zumindest 3 verschiedene Konzentrationen der Testsubstanzen werden getestet, um eine dosierungsabhängige Inhibierung der Aggregation nachzuweisen. Ein sogenannter IC&sub5;&sub0;-Wert (dies ist die Konzentration, welche die Aggregation relativ zur Kontrolaggregation um 50 % inhibiert) wird für jede Testsubstanz durch lineare Regressionsanalyse (log-Konzentration uM als Konstante auf der Abszisse und % Inhibierung als Variable auf der Ordinate) berechnet. Die folgenden bekannten Referenzsubstanzen wurden verwendet: Nitroglycerin (GTN), Natriumnitroprussid (NNP) und SIN-1 (der aktive Metabolit von Molsidomin).
Die Ergebnisse für 8 Verbindungen gemäß der Erfindung und 3 Referenzsubstanzen sind in Tabelle 5 ersichtlich. Aus Tabelle 5 geht hervor, daß die Verbindungen gemäß der Erfindung den besten Referenzsubstanzen wesentlich überlegen sind. Nitroglycerin war in diesem Test inaktiv. Tabelle 5 Inhibierung der Blutplättchenaggregation (R¹)n R² IC&sub5;&sub0; uM GIN NNP SIN-1 Beispiel Nr. 3-Cyano 2-Methyl, 3-Chlor 2-Methyl, 4-Chlor 3-Trifluormethyl, 4-Chlor 2-Methoxy, 5-Chlor 3-Trifluormethyl 3-Trifluormethyl 2-Methyl, 3-Chlor H, HCl Nicotinoyl Isonicotinoyl Acetylsalicyl

2. Inhibierung des Plasminogenaktivatorinhibitors (PAI) von Blutplättchen - (fibrinolytische Wirksamkeit)

Verbindungen gemäß der Erfindung wurden auf ihre Inhibierung des Plasminogenaktivatorinhibitors (PAI) getestet. Ein etablierter Thrombus umfaßt aggregierte Plättchen, die von Fibrin zusammengehalten werden. Der Organismus hat ein fibrinolytisches System zur Aufrechterhaltung normaler physiologischer Zustände. Endogenes Plasminogen wird mittels eines Gewebe-Plasminogenaktivators (t-PA) zu Plasmin aktiviert (Fibrinolysin, dies ist ein proteolytisches Enzym, das Fibrin zersetzt). Die Plättchen enthalten das Enzym PAI-1, das die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin und so auch die Zersetzung von Fibrin inhibiert.
Eine allgemeine Stimulation des fibrinolytischen Systems kann zu ernsten hemostatischen Nebenwirkungen (Blutungen) führen. Eine spezifische Inhibierung von PAI-1 induziert eine erhöhte Fibrinolyse in Bereichen mit vielen Plättchen, was bei einem Thrombus genau der Fall ist. Folglich wird ein thrombolytischer Effekt erhalten.
Das Verfahren zum Nachweis der Inhibierung von PAI-1 wird von Lidbury et al. (Brit. J. Pharmacol. 101, 527-530, 1990) beschrieben. Humanes PRP, hergestellt durch geringfügiges Zentrifugieren, wie oben erwähnt, wird verwendet, jedoch bei einer niedrigen Temperatur (4ºC). Durch die Inkubation von PRP (1 ml in einem Plastikröhrchen) unter leichtem Schütteln bei 37ºC wird die PAI-1-Wirksamkeit freigesetzt, welche PAI-1-Wirksamkeit spektrophotometrisch mittels eines zweistufigen Verfahrens unter Verwendung kommerzieller Kits gemessen wird (Spectro-lyse /Fibrin-Kit von BIOPOOL, Schweden).
Die PAI-1-Wirksamkeit des Kontroll-PRP und PPP, inkubiert mit 6 Verbindungen gemäß der Erfindung und der Referenzsubstanz Natriumnitroprussid (NNP) (jeweils 50 uM während 60 Minuten), ist in Tabelle 6 ersichtlich. Die gleiche Tabelle zeigt auch die perzentuelle Inhibierung der PAI-1-Wirksamkeit verglichen mit Kontrollinkubationen.
Aus Tabelle 6 geht hervor, daß die Verbindungen gemäß der Erfindung alle wirksame Inhibitoren der PAI-1-Freisetzung aus Plättchen sind. Die Wirkungsstärke ist mit der Wirkungsstärke von Natriumnitroprussid (NNP) vergleichbar. Tabelle 6 Inhibierung der PAI-1-Wirksamkeit Substanz (50 pM) PAI-1-Wirksamkeit (E/10&sup8; Plättchen) % Inhibierung Kontrolle Natriumnitroprussid NNP Beispiel Nr. (Base)

3. Stimulation von Guanylatcyclase aus Blutplättchen

Verbindungen gemäß der Erfindung wurden auf ihre Stimulation von Guanylatcyclase getestet. Die biologische Wirkung von NO (Stickstoffoxid) in einer Vielzahl von Zellen (beispielsweise Plättchen und polymorphen nuklearen Leukozyten) wird durch eine Stimulation des Enzyms, löslicher Guanylatcyclase, geprüft. Folglich wird cyclisches Guanosinmonophosphat (c-GMP) gebildet. Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind alle NO-Donatoren. Eine Erhöhung des cyclischen Guanosinmonophosphats (c-GMP) in Plättchen führt u.a. zu einer reduzierten Aggregationsfähigkeit und zu einer reduzierten Fähigkeit, an den Wänden der Blutgefäße zu haften.
Das Verfahren zum Nachweis der Stimulation von Guanylatcyclase wird von Axelsson und Andersson (European J. Pharmacol. 88, 71-79, 1983) beschrieben. Humane Plättchen werden homogenisiert und zentrifugiert in einem eiskalten Medium. Die Guanylatcyclase-Wirksamkeit im Überstand nach der Inkubation mit und ohne die Testsubstanz während 15 Minuten bei 37ºC wird mittels einer Radioimmuntest (RIA)-Technik gemessen. Das Prinzip ist, daß in einer konstanten Menge zugesetztes Guanosintriphosphat (ADP) durch Guanylatcyclase in cyclisches Guanosinmonophosphat (c-GMP) übergeführt wird, welches durch den Radioimmuntest bestimmt wird.
11 Verbindungen gemäß der Erfindung und die Referenzsubstanzen Natriumnitroprussid (NNP) und SIN-1 wurden in Konzentrationen von 0,01 uM, 0,1 uM, 1,0 uM und 10 uM getestet. Eine dosisabhängige Stimulation der Guanylatcyclase-Wirksamkeit zeigt sich für alle Verbindungen.
Tabelle 7 zeigt die Stimulation nach 0,01 uM und 10 uM. Die Verbindungen gemäß der Erfindung stimulieren die Guanylatcyclase-Wirksamkeit bereits in der schwächsten Konzentration, was in bezug auf Natriumnitroprussid (NNP) und SIN-1 nicht der Fall ist. Tabelle 7 Stimulation von Guanylatcyclase in Plättchen

Substanz Guanylatcyclase-Wirksamkeit (pmol c-GMP/mg Prot. x 15 Minuten) Konzentration Natriumnitroprussid NNP SIN-1 Beispiel (Base)

4. Entspannede Wirkung auf die Trachea

Verbindungen gemäß der Erfindung wurden auf ihre Fähigkeit getestet, eine präkontrahierte Trachea zu entspannen. Eine Kontraktion der Atemwege in Kombination mit einer Schwellung der Schleimhaut darin ist ein vitaler Faktor bei asthmatischen Zuständen. Die Entspannung oder Dilatation der kontrahierten Atemwege bessert den asthmatischen Zustand.
Das Verfahren zum Nachweis der Entspannung einer präkontrahierten Trachea wird von Emmerson & MacKay (J. Pharm. Pharmacol. 31, 798, 1979) beschrieben. Es wurde eine aus einem Meerschweinchen isolierte Trachea verwendet. Nach der Präparierung eines Streifens, der die zirkuläre Muskulatur hielt, wird das Organ in zwei Teile gleicher Größe geteilt. Die beiden Tracheastreifen werden in ihrem entsprechenden Organbad suspendiert und mit einem Wandler verbunden, der die Kontraktion und Relaxation des Organs mittels eines Schreibers aufzeichnet. Die beiden Tracheastreifen werden kontinuierlich in einem Krebs-Puffer bei 37ºC gebadet, wobei Carbogen (95 % O&sub2; und 5 % CO&sub2;) konstant durchgeperlt wird. Nach einer Äquilibrierungszeit von etwa 3 Stunden werden die Organe auf ihre Empfindlichkeit (Kontraktilität) für Carbamoylcholin getestet, wobei ein Bolus direkt dem Bad Zugesetzt wird (0,3 uM). Wenn die Konzentration zufriedenstellend ist, werden die Organe in den Krebs-Puffer, der die gleiche Carbamoylcholin-Konzentration enthält, transferiert. Nun werden die Organe dem Carbamoylcholin ausgesetzt und entwicklen langsam eine permanente Kontraktion ("Asthma"). Die Testsubstanzen werden in Bolus-Form dem Organbad direkt zugesetzt. Nach der maximalen Wirkung (Entspannung) werden die Substanzen durch Auswaschen entfernt, und der Tracheastreifen kehrt in seinen permanenten Kontraktionszustand zurück. Zumindest 3 verschiedene Konzentrationen der Testsubstanzen werden getestet, um eine dosisabhängige Entspannung des Organs nachzuweisen. Ein EC&sub5;&sub0;- Wert (das ist die Konzentration, die das Organ um 50 % relativ zur maximalen Relaxation entspannt) wird für jede Testsubstanz mittels einer linearen Regressionsanalyse (log-Konzentration (uM) als Konstante auf der Abszisse und % Relaxation als Variable auf der Ordinate) berechnet. Natriumnitroprussid (NNP) und SIN-1 werden als Referenzsubstanzen verwendet.
Die Ergebnisse für 8 Verbindungen gemäß der Erfindung und für zwei Referenzsubstanzen sind in Tabelle 8 angegeben.
Aus Tabelle 8 geht hervor, daß die Verbindungen gemäß der Erfindung bei der Entspannung präkontrahierter Tracheastreifen genauso wirkungsstark sind wie NNP und wirkungsstärker sind als SIN-1. Es ist hervorzuheben, daß die Verbindungen gemäß der Erfindung eine viel länger anhaltende Wirkung verglichen mit den Referenzsubstanzen aufweisen. Tabelle 8 Relaxation der Trachea Substanz EC&sub5;&sub0; uM Natriumnitroprussid (NNP) SIN-1 Beispiel 1/29 (Base)

5. Inhibierung der Leukozytenfunktion

Verbindungen gemäß der Erfindung wurden auf ihre Fähigkeit zur Erhöhung des Gehalts an cyclischem Guanosinmonophat (c-GMP) getestet, um die Synthese des Leukotriens B&sub4; (LTB&sub4;) zu inhibieren, und um die chemotaktische Bewegung polymorpher nuklearer Leukozyten (PMN) zu inhibieren. Die polymorphen nuklearen Leukozyten spielen eine vitale Rolle beim zellulären Teil des Entzündungsprozesses. Bei Erkrankungen wie Asthma ist die Schleimhaut der Atemwege als Folge einer Entzündung insbesondere mit einer signifikanten Infiltration polymorpher nuklearer Leucozyten (PMN) angeschwollen. Besonders wirksame Substanzen zur Behandlung von Asthma sind jene, die zusätzlich zur Entspannung der Muskulatur in den Atemwegen auch eine entzündungshemmende Wirkung auf die zelluläre Phase des Entzündungsprozesses ausüben, das heißt die Leukozytenfunktion inhibieren.
Die Verfahren zum Nachweis einer Inhibierung der Leucozytenfunktion werden von Moilanen et a. (Abstracts, 2nd International Symposium on Endothelium Derived Vasoactive Factors, Basel, 1992) beschrieben. Isolierte humane PMN werden 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, wonach der Gehalt an cyclischem Guanosinmonophosphat (c-GMP) gemessen wird. Ferner wird die Synthese von LTB&sub4; nach Stimulation mit Ca-Ionophoren (A23187) bestimmt, und die Chemotaxis (gesteuerte Bewegung) zu FMLP (einer Substanz, welche die polymorphen nuklearen Leukozyten, PMN, anzieht) wird bestimmt.
3 Verbindungen gemäß der Erfindung und die Referenzsubstanz SIN-1 wurden auf ihre Fähigkeit zur Stimulation des Gehalts an cyclischem Guanosinmonophosphat (c-GMP) getestet.
Tabelle 9 zeigt eine dosisabhängige Erhöhung des c-GMP- Gehalts in PMN. Die Verbindungen der Erfindung sind alle wirkungsstärker als SIN-1.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung inhibierten weiters die Leukotrien B&sub4;-Synthese in den PMN und die PMN-Chemotaxis zu FMLP. SIN-1 konnte diese Leukozytenfunktionen auch inhibieren, jedoch nur, wenn es in höheren Konzentrationen verwendet wurde.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig.1 veranschaulicht die Inhibierung der Chemotaxis für 2 Verbindungen gemäß der Erfindung.
Fig.2 veranschaulicht die Inhibierung der Leukotrien B&sub4;- Synthese verglichen mit der Erhöhung des c-GMP-Gehalts in den polymorphen nuklearen Leukozyten (PMN) für eine Verbindung gemäß der Erfindung.
Es scheint, daß eine Parallele zwischen der Zunahme des cyclischen Guanosinmonophosphats (c-GMP) und der Abnahme der LTB&sub4;-Synthese und der chemotaktischen Bewegung der PMN gezogen werden kann. Tabelle 9 Stimulation von c-GMP in PMN Substanz Konzentration uM c-GMP (fmol*/10&sup6; Zellen) SIN-1 Beispiel 24 Beispiel 20 Beispiel 1/29 (Base) * f = 10&supmin;¹&sup5;

TOXIZITÄTSTESTS

2 Tests wurden bei männlichen Ratten durchgeführt, nämlich die Bestimmung der "maximalen verträglichen Dosis" (MTD) und ein Test unter Verwendung mehrfacher peroraler Dosen. Außerdem wurde ein LD&sub5;&sub0;-Test intravenös bei Mäusen durchgeführt.

1. Bestimmung der maximalen verträglichen Dosis

In einem MTD-Test wurde 10 Tieren eine Dosis der Substanz einmal täglich während einer Woche verabreicht, während welches Zeitraums die klinischen und hematologischen Parameter aufgezeichnet wurden. Wenn keine Anzeichen von Nebenwirkungen auftraten, wurde die Dosis in den folgenden Wochen erhöht, bis Nebenwirkungen auftraten. Die gemessenen hematologischen Parameter waren die folgenden: die Anzahl roter und weißer Blutzellen, die Anzahl von Blutplättchen, der Hemoglobin-Prozentsatz, der Hematokrit und für die roten Blutzellen auch das mittlere Zellvolumen, der mittlere Hemoglobin-Zellgehalt und die mittlere Hemoglobin-Zellkonzentration. Ferner wurde eine Differentialzählung der weißen Blutzellen vorgenommen.
Die Testergebnisse sind in Tabelle 10 ersichtlich. Tabelle 10 Beispiel Dosis mg/kg klinische Beobachtungen* hematologische Parameter* Gewichtszunahme* MTD-Untersuchung i.p. ZNS-Wirkung erhöhte neutrophile Granulozyten mit toxischer Granulation reduziert MTD-Untersuchung - p.o. reduzierte RBC¹ reduzierter HGB² erhöhte WBC³ * ermittelt relativ zur Kontrollgruppe N.R.: unauffällig ¹: rote Blutzellen ²: Hemoglobin-Prozentsatz ³: weiße Blutzellen
Die durch das Verfahren von Beispiel 1 hergestellte Verbindung wurde bei intraperitonealer Verabreichung an Ratten nur mit geringen Nebenwirkungen bis zu 20 mg/kg ( MTD) vertragen. Die signifikantesten Nebenwirkungen bei 20 mg/kg waren eine vorübergehende ZNS-Wirkung, wobei die Tiere einige Minuten nach der Verabreichung nervös und hyperaktiv wirkten, und wobei Anzeichen einer toxischen Reaktion im weißen Blutbild (erhöhte Anzahl neutrophiler Granulozyten und toxische Granulation in einigen Zellen) auftraten.
Der entsprechende Wert (MTD) unter Verwendung derselben Verbindung bei peroraler Verabreichung betrug 40 mg/kg. Nach der Verabreichung dieser Dosis traten nach einer Woche Anzeichen einer Anämie und ein erhöhter Gehalt weißer Blutzellen auf.

2. Perorale Verabreichung mehrfacher Dosen

Bei diesem Test wurden die Substanzen peroral in einer Dosis von 20 mg pro kg als Lösungen oder Suspensionen einmal täglich 5 Tage lang an Gruppen von 5 Tieren verabreicht. Jeden Tag wurden klinische Beobachtungen angestellt, und die obigen hematologischen Parameter wurden am dritten Tag des Tests gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angegeben. Tabelle 11 Beispiel Dosis mg/kg klinische Beobachtungen* hematologische Parameter* Gewichtszunahme* perorale Verabreichung über 5 Tage * ermittelt relativ zur Kontrollgruppe N.R.: unauffällig
Bei einer Dosis von 20 mg/kg verursachten die in den Beispielen 21, 26, 43, 38 und 50 hergestellten Verbindungen bei Ratten nach der Verabreichung über 5 Tage keine Nebenwirkungen.

3. LD&sub5;&sub0;-Test

(Gemäß Litchfiled and Wilcoxon, J. Pharmacol. Exp. Therap. 96, 99-113, 1949).
Der intravenöse LD&sub5;&sub0;-Wert wurde nach einer Einzelinjektion verschiedener Dosen der in Beispiel 4 hergestellten Verbindung bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 ersichtlich. Tabelle 12 Beispiel LD50 mg/kg bei männlichen Mäusen 95 % Konfidenzgrenzen weibliche Mäuse

4. Pharmakologischer Schluß

Die Verbindungen der Erfindung haben pharmakologische Eigenschaften, die sie für die Behandlung von Thrombosen und Asthma geeignet machen.

Thrombosen

Die Inhibierung der Blutplättchenaggregation zusammen mit der Inhibierung von PAI und der Stimulation von c-GMP in Plättchen machen die Verbindungen für die Prävention von Thrombosen sowie für das Auflösen bereits etablierter Thromben interessant.

Asthma

Die Entspannung der Atemwege zusammen mit der Inhibierung der Leukozytenfunktion machen die Verbindungen für die Behandlung von Asthma interessant, wobei die letztere Eigenschaft die entzündliche Schwellung der Schleimhaut in den Atemwegen inhibiert.
Abgesehen von den bereits erwähnten pharmakologischen Eigenschaften haben die Verbindungen der Erfindung auch eine entspannende Wirkung auf andere glatte Muskelzellen beispielsweise in Arterien, Venen und Hohlraumgeweben. Außerdem senken sie den Blutdruck bei Ratten.

Claims

1. 3-substituierte 1,2,3,4-Oxatriazol-5-imin-Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und Säureadditionssalze hievon, gekennzeichnet durch

worin R¹ die gleiche oder verschiedene Alkyl- oder Alkoxy- Gruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Phenyl oder Alkylsulfonyl-Gruppen bedeutet; n 1 bis 5 ist; und R² Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel (II)

-X - Y- Q -(Z)m (II),

worin X -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NH-, -S(O)&sub2; oder eine direkte Bindung bedeutet, darstellt; Y eine Alkylen-Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine direkte Bindung ist; und Q Alkyl, Cycloalkyl, Alkoxy oder eine Phenyl-, Pyridyl-, Furanyl-, Thienyl- oder Pyrazinyl-Gruppe, die gegebenenfalls durch Z substituiert ist, bedeutet; Z Alkyl- oder Alkoxy-Gruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Halogen, Hydroxy, Acyloxy, Trifluormethyl, Nitro, Cyano oder Alkylsulfonyl darstellt; und m Null bis 3 ist; wobei Z, wenn X die Bedeutung -C(O)- oder -C(O)NH- hat, Y eine direkte Bindung ist, und Q substituiertes Phenyl darstellt, auch die Struktur (I), worin R² die gleiche Bedeutung in bezug auf X, Y und Q hat, sein kann; mit der Maßgabe, daß R² nicht Wasserstoff, Alkyl, Benzoyl, Trifluoracetyl oder eine gegebenenfalls substituierte Phenyl-Gruppe ist, wenn R¹ Methyl oder Chlor darstellt, und n 1 ist, und R² nicht Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substuierte Phenyl-Gruppe ist, wenn R¹ Nitro, Alkoxy, Fluor oder Brom darstellt, und n 1 ist.

2. 3-substituierte 1,2,3,4-Oxatriazol-5-imin-Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß n in der allgemeinen Formel (I) 2 bis 4 ist.

3. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Zubereitung als aktiven Bestandteil eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) nach Anspruch 1 in Vereinigung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.

4. Verfahren zur Herstellung von 3-substituierten 1,2,3,4-Oxatriazol-5-imin-Verbindungen der allgemeinen Formel (I) nach Anspruch 1 und Säureadditionssalzen hievon, gekennzeichnet durch

a) Ringschluß eines I-Arylthiosemicarbazid-Derivats der allgemeinen Formel (III)

worin R¹ die gleiche Bedeutung hat wie in Formel (I), und R³ entweder H oder eine Gruppe der Formel (IV)

-X-Y-Q-(Z)m (IV),

worin X eine direkte Bindung ist, und Y und Q-(Z)m die gleiche Bedeutung haben wie in Formel (I), darstellt, durch die Behandlung mit einem Alkylnitrit mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkalimetallnitrit unter sauren Bedingungen bei ungefähr 0 bis 10ºC, wonach das erhaltene Salz gegebenenfalls in die freie Verbindung übergeführt wird, und, wenn gewünscht, acyliert wird.