JPH07507558A - 活性化された血小板の上清の製造装置並びに該装置を用いる方法及び得られた上清 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 活性化された血小板の上清の製造装置 並びに該装置を用いる方法及び得られた上清本発明は、血小板因子（血小板顆粒 の中身である）の調製方法並びに短時間で、外部からの汚染の危険なしに、生物 活性を有する可溶性分子を得るために、重合体構造の上或いは中に置かれている 、人又は動物由来の血小板を活性化する装置に関する。

活性化された血小板（プレートレッドとも言う）によって放出される血小板因子 の溶液は、しばしば、“活性化された血小板の上清”という表現で示される。

活性化された血小板の上清は、現在、生物分子、例えば、血小板由来成長因子、 トランスフォーミング成長因子−β、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板第４因 子、血小板由来内皮細胞成長因子、ヘパリン結合性表皮細胞成長因子、インシュ リン様成長因子１、結合組織活性化ペプチド■、β−トロンボグロブリン、表皮 細胞成長因子、プラスミノーゲン、フォンウィルブランド因子、フィブリノーゲ ン、セロトニン、ヒスタミン、アデノシン　ジー及びトリーリン酸、フィブロネ クチン、ビトロネクチン、血小板第４因子、蛋白分解性或いは糖分解性酵素、又 はアラキドン酸の代謝産物（以下のレビーを参照、炎症及び修復、Ｂ、　Ｌ、　 Ｙｏｎｇ　アンドＳ、　Ｍ、　Ｙａｈｌ、“ペプチド成長因子及びそれらのレセ プター”、第５１０頁、５ｐｏｒｎアンドＲｏｂｅｒｔｓ編Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、血小板及び損傷に対する応答、Ｒ，Ａ。

ＴｅｒｋｅｌｔａｕｂアンドＭ、Ｂ、　Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、“創傷修復の分子及 び細胞生物学”、第３８頁、Ｃ１ａｒｋアンドＨｅｎ５ｏｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）の精製のための開始物質として用いられてい る。

ある種の精製方法が公知であり、そして、特許出願の主体となり得た。特に、ト ランスフォーミング成長因子−βの精製に関するヨーロッパ特許第８９１００１ ４８．９号、血小板由来成長因子の精製に関する米国特許第４４７９８９６号明 細書に注目されたい。

活性化された血小板の上清（又は、これらの上清の両分）は、例えばそれらの治 癒活性故に、治療に用いられることができ（Ｄ、　Ｋｎｉｇｈｔｏｎｓら、Ａｎ ｎ、　Ｓｕｒｇ、、１９８２年、第１９６巻、第３７９〜３８ｇ頁、Ｄ、Ｍ、　 Ｃａｒｔｅｒら、創傷治癒における成長因子及びその他の特徴”、第３０３〜３ １７頁、Ｂａｒｂｕｌ、　Ｐｉｎｅｓ。

Ｃａｄｖｅｌｌ、Ｈｕｎｔ編、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、１９８８年、米国特許第４７６０１３１号明細書、国際公開　ＷＯ３８ １０３４０９、ＷＯ３６１０３１２２及びＷＯ３９１０５６５６号公報）、又は たとえばそれらの脱毛を調節する有益な効果故、化粧品において用いられること ができる（国際公開ＷＯ９０１０７９３１号公報）。

活性化された血小板の上清中に含まれる血小板因子は、特に、潰瘍の治療に用い ることができる。

血小板の上清の調製のために現在までに報告されている方法は、大変長く　（最 小時間で約１時間３０分）、退屈なものであり（試験管から試験管への移動、バ ランス調製された遠心分離や、ピペッティングが要求されるので）、自動化が実 質的に不可能であり、そして、その環境（開口された容器中の液体の移動）によ る生成物の汚染、又は取り扱われる生成物（伝染性の病原菌により感染されてい るといることがありうる）による作業者の危険がある。

事実、これらの調製法は、順次の遠心分離により、血液から血小板を単離するこ とから始まる。次いで、血漿を除去するため血小板を遠心分離により洗浄する（ 血小板の単離は、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１６９巻、第 １章、第３〜２７頁、Ｂａｗｉｇｅｒ編、Ａｃａｄｅ＋＊ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌ ｏｎｄｏｎ、１９８９年、国際公開ＷＯ３６１０３１２２号公報、米国特許第４ ７６０１３１号明細書にある）。次に、精製した血小板を活性化剤の存在下で懸 濁する。多くの活性化剤が公知である（血小板及び損傷に対する応答、Ｒ，Ａ、 　ＴｅｒｋｅｌｔａｕｂアンドＭ、　１１゜Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、“損傷修復の分 子及び細胞生物学”第３５〜５５頁、Ｃ１ａｒｋアンドＨｅｎ５ｏｎ編、Ｐｌｅ ｎｕｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

３つのタイプの活性化剤が区別される：すべでの顆粒からの分泌を誘導すること ができる強力な活性化剤（トロピン、コラーゲン、カルシウムイオン透過担体Ａ ２３１８７）　、中間の活性化剤、例えばトロンボキサンＡ２、カルシウムイオ ン存在下或いは不存在下でのＡＤＰ又はアドレナリン、そして顆粒の分泌を誘導 しない弱い活性化剤（セトロニン）である。最もよく用いられる活性化剤はトロ ンビンである。

その他の活性化方法は、継続的な凍結／解凍又は超音波による血小板の溶解のた めの物理的方法を用いたものである。

血小板膜及び他の不溶性成分を除くために、血小板の上清を遠心分離及び／又は 濾過により清澄する。

加えて、慣用の方法においては、血漿由来の汚染物質を除くことは困難であり、 そして、これらの血漿汚染物質を除くことを目的とした連続洗浄は、血小板の損 失又は血小板の部分的活性化により血小板由来の分子の収率の減少を招く。最後 に、血小板が懸濁されているところの血漿を、他の用途のために回収することは 困難である。

本発明は、血小板の上清の調製において現在の方法に固有の上記の問題、例えば 汚染の危険、収率の損失及び長時間でしかも問題のある操作の必要性、を解決す ることを可能にする。

本発明の主体は、血小板活性他剤溶液に接触させることによる血小板の活性化の 段階を含み、活性化段階の間に血小板から放出された血小板因子の溶液を集める ことを含む、血小板因子の溶液を得るための方法であって、該方法は、血小板の 懸濁物を含む液を血小板を保持できるフィルターに通過させ、フィルター上に保 持された血小板に活性他剤溶液を加え、そして溶液中に血小板因子を含む濾液を 濾過により分離し、一方、血小板はフィルター上に保持されていることを特徴と する。

フィルター上で活性化を行うことにより血小板の活性化を調節する試みは自明で はないということを指摘しておく。

なぜなら、フィルター上での血小板の自発的活性化が、通常予想されるからであ る。例えば、Ｊ、Ｎ、　Ｌｉｎｄｏｎら、１１ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙＩ ｌｏｌｏｇｙ、第１６９巻、第１０４〜１０７頁、１９８９年を参照。

実際のところ、先行技術は、慣用の遠心分離法に代えて単純な濾過を行うことを 示唆していない。これは濾過に対する先入観が存在し続けたためと考えられる。

つまり、濾過は血小板の早期の、自発的活性化を引き起し、血小板因子の精製す なわち、血漿の構成成分のがなりの部分からそれらを分離することを妨げると心 配されていた。事実、自発的活性化が起ると、作られた血小板因子（それは可溶 性である）が、他の血漿生成物とともにフィルターを通過するか、又は活性化剤 により誘発される活性化段階以前に精製の目的で場合により用いられる水洗前に フィルターを通過する。そしてこの場合は、この活性化段階は効果のないものと なる。なぜならそれは、手遅れであるが又は非常に低い収率においてのみ血小板 因子を得ることを可能にするからである。

実際に、今、驚くべきことに、市販のフィルターを含む多くの公知のフィルター を用いて、血小板因子の著しい損失をもたらす自発的活性化を観察することなし に血小板をフィルター上に保持できることが判った。適したフィルターは、単純 な日常試験により決定できる。フィルター上に血小板を保持した後に、活性化剤 を用いて活性化を引き起こす前に、血小板因子のひどい損失なしに、予備洗浄を 行うことさえできることが判った。このようにして、血漿の構成成分を少ない割 合でのみ含んでいる精製した血小板因子調製物を得ることができる。

本発明の他の主体は、単純な方法で、既に記述した方法を行うことができる装置 である。この装置は、閉鎖系の形態で提供され、血小板懸濁物を含む液体から始 めて、血小板を活性化し、血小板因子の溶液を滅菌した状態で得ることができる 装置であって、該装置は、血小板を保持できるフィルターを有する濾過手段を含 み、該フィルターは囲い中に配置され、該囲い中で上流部及び下流部の境界を画 し、該囲いの上流部は、開始液を含む貯留部に該上流部を連結しているか或いは 連結可能にする、適当な開閉手段を備えた少なくとも１つの管と連絡しており、 そして、該囲いの下流部は、開始液の濾液及び該血小板因子の溶液を継続的に回 収することを可能にする、適当な開閉手段を備えた少なくとも１つの管と連絡し ており、かっ血小板活性化剤を含む貯留部を更に含み、該貯留部は、該上流部中 に溶液の形態で活性化剤を導入できるように該上流部と連結されているか或いは 連結され得るものであることを特徴とする。

このようにして、本発明の装置は好ましくは、適した貯留部中の溶液の形態で或 いは粉末の形態（特にトロンビンの場合）で活性化剤を有する、すぐ使用できる キットの形で供給される。後者の場合は、活性化剤の溶液は、粉末に適当な液体 ビヒクルを加えることによって再構成される。

液体ビヒクルは、コンパニオン（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　）バッグ中に含まれた滅 菌ビヒクルであり得る。活性化剤溶液はまた、慣用の液体ビヒクルで再構成され 得るか又は使用時に調製され得、滅菌は、活性化剤溶液を搬送するための管に滅 菌フィルターを備えることによりもたらされる。洗浄溶液は、同様の方法により 処置され得る。

更に詳しくは、本発明は、活性化された血小板の上清（１２）を得ることができ る装置に関し、該装置は、血小板を保持するフィルター（５）を含み、該フィル ター（５）は、その一方、すなわち上流において、液体（１５）中の懸濁物に含 まれる血小板を搬送するための第１の手段（２）及び血小板活性化剤の溶液（７ ）を搬送するための第２の手段（４）に連結されており、そして他方、すなわち 下流において、該懸濁液体（１３）を排出するための手段（８）及び、該上清（ １２）を回収するための手段（９）に連結されており、該それらの手段を、適当 な手段（６）により可逆的に閉じることができる、ことを特徴とする。

上記装置は、好ましくは、上流において、洗浄液（１４）、特に補助薬を含むこ とができる緩衝洗浄液を搬送するための手段（３）に連結され、そして、下流に おいて、使用済洗浄液（１６）を排出するための手段（１０）に連結されている 集成装置により完全となる。

この装置においては、液体中の懸濁物に含まれる血小板及び血小板活性化剤の溶 液、そして場合により洗浄液を搬送するための該手段は、それぞれ該血小板懸濁 液、該血小板活性他剤溶液及び該洗浄液を含むためのそれぞれの貯留部と連結さ れた管であり、該排出手段は、それぞれ濾過後の血小板の懸濁液及び洗浄液を含 むための受け器に連結された管であり、該回収手段は、活性化された血小板の上 清を含むための受け器と連絡された管である。

本発明に従った装置は一般に一回の使用を予定しているので、好ましくはそれぞ れ１又は多数の単純な、場合により並置した移動バッグ又は注射器（それらはと もに使い捨てである）を含む複数個の貯留部及び受け器を用いる。閉じるための 手段は、変形しつる医用グレードのプラスチック、例えばポリエチレンで作られ た管を押さえつけるクランプである。

これらの装置は、バッグの内容物によるフィルターの汚染を避けるためにフィル ターをバイパスするための手段により完全となり得、そして、上清を回収するた めの手段は、上清のウィルス負荷（ｖｉｒａｌ　１ｏａｄ）を減少するための手 段に連結されている。

種々の液体は、好ましくは、重力又は螺動タイプのポンプシステムによって搬送 され、例えば、そのシステムは閉鎖されそして滅菌されている。

既に示したように、血小板を含む懸濁液は、好ましくは、ヒト或は動物由来の全 血、又は血小板を含む血液画分の一つ特に血漿又は血小板に富んだ血漿である。

血小板活性化剤の溶液は、好ましくは、水性溶液である。

本発明に従った装置は、完全な滅菌条件下でかつ自家移植の用途に適合するコス トで、活性化された血小板の上清を得ることができるものである。

本発明に従った方法及び装置の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明の記述及 び添付の図面を参照することにより明らかになる。

図面の説明 第１図は、本発明の装置の特定の具体例の概要を表わしている。

第２図は、以下の実施例６に記載した、フィルターシステムの特定の具体例の概 要を表している。

本発明の装置（１）は、図１に示されたように活性化された血小板の上清を得る ことを可能にする。

血小板を保持するためのフィルター（５）は、装置の中心部を構成する。濾過シ ステムは、例えば、ディプスフイルター（ｄｅｐｔｈ　ｆｉｌｔｅｒ）又は微孔 質フィルターを含むことができる。濾過は、正面又は接線であり得る。

ディプス濾過のためのシステムは、例えば、球状濃縮物から白血球を除くために 用いられる不織ポリエステルフィルター（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ社（ フレスネス、フランス）製のＥｒｙｐｕｒ　Ｏｐｔｉｍａ　Ｇ−０及びＧ−２フ イルター、Ｐａ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　（パリ）製のＰａ１ｌ　ＲＣｌ ｏｏ及びＲＣ５０フィルター、アサヒ　メディカル（フランクフルト／マイン、 ドイツ）製の５ｅｐａｃｅｌｌ　Ｒ５００フイルター）を含むことができる。そ れらの特徴及び使用に従い、これらのシステムは血小板の５０％から１００％を 保持する。血小板を保持するために特に設計された他のフィルター材料も公知で ある（ヨーロッパ特許第３１５０２２号）。

微孔質濾過システムは、例えば、図２に示されている中空ファイバー（２０）の カートリッジ（２１）（Ａ／Ｇ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＭｉｃｒｏｇｏｎ、　Ｇ ａｍｂｒｏ、Ｅｎｋａ、ヨーロッパ特許第１１６６２６号のカートリッジ）であ り得る。微孔質材料を通る濾過は、例えば、接線的に行われる。接線濾過を行う ために、管（１９）を繊維（２０）の両端に連結させる。ポンプ、例えば、螺動 ポンプ（１８）は、この管と組み合わせることにより、フィルター繊維内での保 持物質の循環を提供する。ポンプ例えば螺動ポンプ（１７）に備えられ、そして 、上流部でかつ（１９）で管に連結されている管（２２）は、濾過されるべき溶 液の（１９）への搬送を可能にする。カートリッジ（２１）に連結された管（２ ３）は、フィルターの排出口を構成する。

このフィルター（５）は、上流にて、搬送手段（２）によって、懸濁された血小 板を含む生物液体（１５）を有する受け器に連絡されており、該液体は、血小板 に富む血漿、軟層（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）、標準血小板濃縮物又は、一単位の 血小板濃縮物であり得る。

フィルター（５）はまた、上流にて、搬送手段（３）により、血小板活性化剤（ ７）の溶液を有する受け器に連結されている。活性化剤は、トロンビン、アデノ シンニリン酸、コラーゲン又はカルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７であり得 る。

フィルター（５）は、追加的に、下流において、排出手段（８）により、懸濁さ れた血小板を含む生物液体（１３）受ける受け器に連結されている。フィルター （５）はまた、回収手段（９）により、活性化された血小板の上清（１２）を受 ける受け器に連結されている。

この装置に、血小板を洗浄するための液体（１４）を搬送する手段（３）を加え ることが可能であり、使用済液体（１Ｇ）はそれを受けるための受け型中に排出 手段（１ｏ）により排出される。

（１５）、（１４）、（７）　、（８）　、（１３）、（１６）及び（１２）を 含む貯留部及び受け器は、例えば、移動バッグ（例えば、血液生成物を集めるた めに一般に用いられる柔軟性のある移動バッグ）である。搬送手段及び排出手段 はそれぞれ、管であり得る。それぞれの管は、例えばクランプを用いて閉じられ 得る。

この装置のすべての構成部品は、閉鎖された循環路（バッグ、管、ニートノベコ ネクター、フィルター、溶液）を形成し、該循環路は使用前に、適当な手段によ り滅菌され得る。

本装置の使用の態様の一つを以下に示す。

管（３）　、（４）　、（９）及び（１（１）は閉じる。懸濁された血小板（１ ５）を含む容器は、フィルター（５）を通り、回収バッグ（１３込と重力により （又は、管又は空にされるべきバッグを絞る機構をもつポンプシステム又は滅菌 されたシリンジピストンの使用により）空にされる。管（２）及び（８）を閉じ る。管（３）及び（１ｏ）を開ける。洗浄液（１４）は重力により、フィルター （５）を通過した後、使用済洗浄液（１６）を受けるバックへと排出される。管 （３）及び（１ｏ）を閉じ、そして、管（４）及び（９）を開く。バッグ（７） は、重力により空にされ、そして、得られた上清（１２）は、バッグ中に集めら れる。

次いですべての管を閉じる。

接線濾過システムを用いる場合は、螺動ポンプ（エフ）は、（１５）、（１４） 又は（７）を管（１９）の方へ搬送する。（１９）上の螺動ポンプ（１８）は、 フィルター繊維中の保持物の再循環を提供する。螺動ポンプは、前段落で記載し たすべての操作の間中、動いている。

この装置はある種の変更も可能である。例えば、以下のような変更を挙げること ができる。

ａ）　フィルターをバイパスするための、ブロッキング装置を含む管（１１）を 、フィルターをパージするため、又は二（１５）、（１４）或いは（７）の一部 がフィルター上に流れ出スのを防ぐために追加できる。例えば、全血は注射器中 で遠心されることができ、注射器のオリフィスは、（１５）を含んでいるバッグ の代りに連結されることができ、注射器中に沈殿された赤血球はバイパス中に押 し出され、そして、上清血漿は、フィルターを通して押し出されることができる 。

ｂ）　（１６）の収集を（１３）のための収集バッグ中で行うことができる。

Ｃ）上清（１２）を集めるためのバッグは、例えば血小板上清を治癒補助薬又は 安定化剤に富むようにするため或いは上清を決められた割合に希釈するために、 いかなる性質の添加剤も含み得る。

ｄ）いずれのバッグも、様々な装置、例えば、試料採取部位を備えられることが できる。

ｅ）上清（１２）を回収するためのバッグは、試料採取部位を備えられて完成さ れることができ、又は閉鎖循環路において、長期間処理の間に生成物の使用に合 うように分配することを可能にするように、より小さいバッグと連結されうる。

管のコネクターは混合、分離そして分配操作に適した任意のデザインの滅菌した 集成装置を作るための公知の溶接装置によって、滅菌的に作り得る。

ｆ）上清（１２）は、公認された条件下で、水浴中に浸漬することによる低温殺 菌法、抗体中和、或いは濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　（Ｂｅｄｆｏｒｄ、　（１ ，Ｓ、Ａ、）によって開発されたＶｉｒｏｓｏｌｖｅシステム：アサヒシステム 、Ｐａ１ｌシステム）、又は処理生成物の十分な活性を保持しながらウィルス負 荷を減少させるのに効果があるその他の任意方法により、ウィルス不活性化の段 階にさらすことができる。ウィルス不活性化のシステムは、上述の装置と一体結 合されて、その結果、該装置の閉鎖性が維持されるように製造し得る。

ｇ）血小板の上清のある種の分子を特異的に保持する基質が、生物分子の直接精 製工程を行うために、上清（１２）を集めるためのバッグの上流又は下流に取り 付けられ得る。　一般に、いずれの装置も、該システムの閉鎖性を維持する限り において追加され得る。

本発明を以下の実施例により説明する。（１）〜（１６）の数字は、図１を指し 、（１７）〜（２３）の数字は図２を指す。

実施例１ ａ−４ｏｏ　ｍｌ容の移動バッグ（Ｂａｘｔｅｒ　、照会番号Ｒ２０７４）を、 無菌的ｌｅａ！ｉｏ　ｍｌノ０．０４　Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ＢＣＩ（ｐＨ７，４） 、０．１５　ＭＮａＣＩ溶液（１４）で満たす。

ｂ−同じバッグを２５０　ｍｌの同じ溶液で満たし、そして、１２５０　ＮＩ■ Ｕのウシトロピン（Ｒｏｃｈｅ、照会番号０７２８４６２）　（７）を加える。

Ｃ−すべての管をクランプで締めた後、０ｐｔｉｎａ　Ｇ２フィルター（Ｏｒｇ ａｎｏｎ　丁ｅｋｎｉｋａ、フレスネス、フランス）を、滅菌雰囲気下にて、そ の赤い上流端で、ａ−に記載のものと同じタイプの移動バッグ中に含まれている ５つ標準血小板濃縮物の混合物（１５）と連結する。

ｄ−フィルターの白い上流端を（７）を含むバッグに連結する。フィルターは、 下流に１及び２と番号が付された２つの移動バッグを含むように作られている。

当該２つの移動バッグは、それぞれ１つは（１２）を集めるために、そして他は （１３）及び（１６）を集めるために用いられる。

ｅ−（１５）を含むバッグは、５〜５０ｃｍもち上げられ、そしてバッグ２は同 じ高さ分、フィルターから低められる。

ｆ−管（２）及び（８）を開ける。血漿（１５）はバッグ（２）に１０±５分間 かけて流れ込む。

ｇ−管を再び閉じる。

）１−（１５）を含んでいたバッグを滅菌雰囲気下ではずす。

（１４）を含んでいるバッグを、（１５）を含んでいたバッグの代りに連結する 。ｅ、ｆ及びｇに記した操作を繰り返す。

ｉ−管（４）及び（９）を開け、モしてｅＳｆ及びｇに記した操作を繰り返す。

ｊ−次いで、管（９）を溶かすことにより閉じ、切断する。

最初ニ、（１５）ｉ；ｉ、２４３　ｍｌ（７）　血Ｗｔ　中１：　３１８　Ｘ　 １０９（７）　血小板を含む。操作後、（１５）及び（１６）は１３．６５　Ｘ ｌ０９の血小板を含む。従って、フィルターは血小板の９５．７％を保持してい た。

（１２）について行った分析の結果を表Ｉに示す。

トロンビンは、同等のＡＤＰ溶液により代えることができる。

実施例２ 装置を、以下の変更を行い、実施例１と同様にして準備し、用いる。（１４）は ４００　ｍｌ量の緩衝液を有し、（１５）を含むバッグは３つの血小板に富んだ 血漿の混合物で満たされた８００　ｉｌ容の移動バッグ（Ｆｅｎｖａｌ、照会番 号ＲＯ５３）である。

バッグ２の内容物（１３）は、血漿の濾過の間連続的に、バッグ２に連結された 付属の８００１容のバッグに移される。濾過後、（１４）はフィルターを通って バッグ２に入り空にされる。

ｆｉ　初ニ、（１５）　ハ、７８２１１１ｃＤ血Ｍｌ　中ニ１９８．６×１０９ ノ血小板を含む。操作後、（１３）及び（１６）を合わせると１４．４Ｘ　１０ ９の血小板を含む。従って、フィルターは９６．５％の血小板を実施例３ 装置を、以下の変更を行い、実施例１と同様にして準備し、用いる。（１４）は ３６０　ｍｌ量の緩衝液を有し、（１５）を含むバッグは、３つの白血球／血小 板濃縮物（又は軟層’）　（１５）の混合物を含む。

最初、（１５）は１２５　Ｘｌ０９の血小板を含む。操作後、（１３）及び（１ ６）を含むバッグ２は、４．８Ｘ１０９の血小板を含む。

従って、フィルターは、９６．１６％の血小板を保持している。

（１２）について行った分析結果を表１に示す。

この実施例は、本発明の方法を用いて、白血球／血小板濃縮物から始めた場合で さえ、血漿タンパク質の大部分を除くことができることを示している。血漿は、 １ｏ億の血小板当り少なくとも約０．３ｇの遊離タンパク質を含むということが 思い出される。

実施例４ 装置を、以下の変更を行い実施例１と同様に準備し、用いる。（１４）を含むバ ッグは、４６４　ｉｆのｌ１ｅｐｅｓ　（１２ｇ／ｌ）、ＮａＣ１（５，８ｇ／ ｌ）　、グルコ−ス（５，４ｇ／ｌ）　、ｌ［ｃＩ（０，２５ｇ／ｌ）緩衝液（ １４）を含み、そして（７）を含むバッグは、２２１Ｕのヒトトロンビンの入っ た２２１　ｍｌの同じ緩衝液（７）を含む。

操作の全時間は３６分間であり、これは標準血小板濃縮物の濾過のための７分間 、フィルターを洗浄するための１４分間（（１４）の流れ）、及び血小板の活性 化のための１０分間（フィルター（５）を通る（７）の流れ）を含む。血小板の ９８％がフィルターに保持されている。

（１２）について行った分析結果を表工に示す。

実施例５ 以下の集成装置を準備する。５ｅｐａｃｅｌｌ　Ｒ−５００Ｂ１フイルター（ア サヒ）を、上流及び下流にて、５ＣＤｎＢ装置（Ｄｕ　Ｆｏｎｔ）を用いて、閉 鎖装置及びバーホレーターを備えた３方向アダプターに連結する。６つの４００ 　ｍｌ容バッグ（Ｂａｘｔｅｒ、照会番号Ｒ２０７４）を、それぞれのパーホレ ーター上に相次いではめ、図１に記した装置を作る。下流に配置されそして（１ ２）、（１３）及び（１６）を集めるためのバッグを空にする。上流の移動バッ グの一つに含まれた（１５）は、５つの標準血小板濃縮物の混合物である。第２ の上流の移動バッグ中に含まれた（１４）は、４４７　ｍｌの実施例４に記載し た１ｉｅｐｅｓ緩衝液からなる。第３の上流の移動バッグ中に含まれた（７）は 、２４５　ＩＩのヒトトロンビンを含む、２４５　ｉｌの同じ緩衝液からなる。

濾過、洗浄及び活性化の操作は、実施例１に記載した操作と同様の方法で行う。

装置のすべてが完全に閉鎖されているので、操作はすべて、無菌雰囲気の外で行 われる。

操作の全時間は、４１分間である（濾過のための７分間、洗浄のための１１分間 及び活性化のための１２分間を含む）。

フィルターは、血小板の８９％を保持した。

（１３）は、血小板が激減した血漿１７５　ｍｌ、すなわち、濾過された血漿の 全量を８７．５％を含む。

（１２）について行った分析結果を表工に示す。

実施例６ 以下の集成装置を準備する。ＰＦ２０００中空ファイバー（Ｇａｉｂｒｏ）を有 するカートリッジを管に連結し、図２に記載のフィルターシステムを作る。（２ ２）は、管（２）　、（３）及び（４）に連結されている。（２３）は、管（８ ）　、（９）及び（１０）に連結され、図１に記載の装置を成す。上流の移動バ ッグの１つに含まれる（１５）は、血小板に富んだ血漿の混合物である。第２の 上流の移動バッグ中に含まれる（１４）は、実施例４に記載の１ｌｌｅｐｅｓ緩 衝液７４０　ｍｌより成る。この第２の上流のバッグは、追加的に、洗浄操作の 最後にシステムをパージするために、約２００１の滅菌空気を含む。第３の上流 の移動バッグに含まれる（７）は、２０００　Ｕのヒトトロンビンが加えられた 同じ緩衝液４５０　ｍｌから成る。螺動ポンプ（１７）は連続的な２２　ｍ１７ 分の流れを提供し、螺動ポンプ（１８）は、連続的な、８０１／分の流れを提供 する。

濾過、洗浄及び活性化の操作は実施例１に記載の操作と同様な方法により行なわ れる。

装置のすべてが完全に閉鎖されているので、操作はすべて、無菌雰囲気の外で行 われる。

上記操作の結果、血小板は（１２）、（１３）及び（１６）中には検出されない 。それ故、フィルターは、すべての血小板を保持した。

（１２）について行なった分析結果を表■に示す。

実施例７ 中空ファイバー（＾／Ｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を有するカートリッジを用い た。穴が０．２μｍ１繊維の内径が０．７５ｍｍ、全濾過面積が０．００９　ｍ ２である。このようなフィルターは、バクテリアを保持するので滅菌フィルター となり得る。集成装置を、ポンプ（１７）を省いたことを除いては図２に示され た通りに構成する。ポンプ（１８）の流速は、１３０　ｍ１７分である。開始物 質は、１９５　ｍｌ量の血小板に富んだ血漿である。用いた他の物質は、実施例 ６に記載したそれと同じである。

操作は、上記実施例６に記載したそれとほぼ同じ方法により行った。

結果は、 １０億の血小板当り、β−トロンボグロブリン：　５０．３　ｇｇ集めた血小板 抽出物の量：　１５６　ｍｌ使用済洗浄溶液の量：　１８４　ｍ１０洗浄溶液は 、血小板抽出物中に含まれたβ−トロンボグロブリンの全量の１％未満（０，８ ９％）を含む。このことは、洗浄操作の開面小板の早期活性化が起こっていない ということを意味する。

トロンビンは、ＡＤＰによって置き代えられ得る。

慣用の方法と比べての本発明の利点 実施例に示された結果より以下の利点を規定できることが明らかである。

時間の節約：慣用の方法の最小時間６０分間に代わり、血小板に富んだ血漿の作 成からの全時間は３０〜４５分間である。

で得られる。それ故、外部から生じる汚染の危険を排除しある。作業者は、血液 生成物に直接接触しない環境下に置かれ得る。

鎖循環路においての、液体を移動する単純な操作に減った。

なく　（フード、グローブボックス、１０．０００クラス構成部品を省ける）、 そして、遠心機及び様々の使いすての部品と試験管を省ける。

良好品質の最終製品：血小板は、連続遠心分離による洗浄に比べ、はるかに多量 で洗浄される。その結果血漿タンパク質は、はるかに低い濃度で存在する。更に 、フィルター上に保持された血小板残留物は、最終製品を汚染しない。

高収率：特にβ−トロンボグロブリン及びトランスフォーミング成長因子−βは 、より短い操作時間及び血小板の部分的脱顆粒を引き起こす遠心分離がないので 、収率が高い。

血漿の良好な回収：開始血漿の少なくとも８５％が滅菌された状態で回収され他 の目的に使用され得る。

全血又は、副分画例えば白赤球／血小板濃縮物を、直接用いることが可能。フィ ルターが血小板を特異的に保持し、赤血球を保持しないフィルターであるため。

この一連の利点は、活性化された血小板の上清を調製することにおいて、特に有 利な性質を本装置に与えている。

本発明によって得られた製品の用途は、血小板の上清の用途であり、例えば、 一血小板由来分子（トランスフォーミング成長因子−β、血小板由来成長因子等 ）の、研究、試薬の製造、治療の用途をもった活性素の製造、又はその他の目的 のための精製、−治療又は化粧品の用途をもった調製、特に組織修復、例えば皮 膚治療の補助薬の製造、 一個人の血小板顆粒の含量を評価することを目的とした、診断又は予後（診断） の用途を有する分析試験の実施である。

表Ｉは、実施例１〜６に記載の操作において得られた活性化された血小板の上清 について行った分析結果、及び、国際公開ＷＯ３６１０３１２２号公報に記載の 手順に従って行った一連の１０の操作において得られた結果の平均値を示す。

表Ｉ タンパク　質（１）　β−ＴＧ　（２）　ＰＤＧＦ　（３）　ＴＧＦ−β　ミト ゲン　活性ｐｇ／１０９Ｔｈｒ事、　ｐｇ／１０９Ｔｂｒ、　ｎ／１０９Ｔｈｒ 、　ｎ／１０９Ｔｈｒ、　／１０９Ｔｈｒ。

実施例１　７５　６７　１７．４　１．６　４４実施例２　１５１　６０．４　 １１　１．７　３２．２実施例３　２１６０　６８．８　１５　２　４１１実施 例４　１３８　２０　１０．６　０．８　１８実施例５　６２．４　１１　？、 ６　１．１　１７．２実施例６　７４２　９．２　８．１　２．９　５．１に従 った例　２１９　３８　３９　１．４　３４＊　Ｔｈｒ、・血小板 ＋１１　Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏｒａｄ試薬、参照番号５００−０００６） により決定した。

■　β　トロンボグロブリン（β−ＴＧ）は、ＥＬＩＳ＾定量試験（Ｓｔａｇｏ ｓ参照番号０４１９）により決定した。

（３）血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、ＥＬＩＳＡ定量試験により決定した 。

（４）トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）は、６０℃で１０時間 加熱した後、寒天上でのクローニング試験（Ａｓｓｏｉａｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｔ、第２５８巻、第７５５５頁、１９８３年）により決定した。

（５）　ミトゲン活性の値は、２４時間誘導後に、ｍＭ状！Ｉ　（ｃｏｎｆ　Ｉ ｕｅｎｃｅ）に培養した３Ｔ３　クローン　Ａ３１細胞によるトリチウム標識さ れたチミジンの最大取込みの半分を引き起こす試料の希釈度に相当する。

ＰＣＴ／ＦＲ９３１００５４４ フロントページの続き （５１）　ｆａｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｍ　１１００　 Ｚ　７４１７−４ＢＩ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．血小板活性化剤溶液に接触させることによる血小板の活性化の段階を含み、 活性化段階の間に血小板から放出される血小板因子の溶液を集める方法において 、血小板の懸濁物を含む液体を血小板を保持できるフィルターに通過させ、フィ ルター上に保持された血小板に活性化剤溶液を加え、そして溶液中に血小板因子 を含む濾液を濾過により分離し、一方、血小板はフィルター上に保持されている ことを特徴とする方法。
2. ２．活性化された溶液を添加する前に、適当な洗浄液をフィルター上に保持され た血小板に加えること、及び洗浄液を濾過により取り除くことを特徴とする請求 の範囲第１項記載の方法。
3. ３．閉鎖系の形態で、血小板懸濁物を含む液体から始めて、血小板を活性化し、 そして、滅菌された状態で血小板因子の溶液を得ることができる装置において、 血小板を保持できるフィルターを有する濾過手段を含み、該フィルターは囲い中 に配置され、該囲い中で上流部及び下流部の境界を画し、該囲いの上流部は、開 始液を含む貯留部に該上流部を連結しているか又は連結可能にする、適当な開閉 手段を備えた少なくとも一つの管と連絡されており、そして該囲いの下流部は開 始液の濾液及び該血小板因子の溶液を継続的に集めることを可能にする、適当な 開閉手段を備えた少なくとも一つの管と連絡されており、かつ、血小板活性化剤 を含む貯留部を更に含み、該貯留部は、溶液の状態で活性化剤を上流部に導入で きるように上流部に連結されているか又は連結されることができることを特徴と する装置。
4. ４．上流部に連絡している少なくとも一つの管が、フィルター上に保持された血 小板を洗浄するための液体を含む貯留部に連絡されているか又は連結されること ができ、かつ下流部に連絡している少なくとも一つの管が洗浄液の濾液を別に集 めることを可能にすることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の装置。