DE69329247T2

DE69329247T2 - Kristallisierung von m-csf

Info

Publication number: DE69329247T2
Application number: DE69329247T
Authority: DE
Inventors: Andrew Bohm; Lisa Fear; Robert Halenbeck; Jarmila Jancarik; Sung-Hou Kim; Kirston Koths; Jayvardhan Pandit; Eric Taylor; Ralph Yamamoto
Original assignee: University of California; Chiron Corp; University of California Berkeley
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; University of California
Priority date: 1992-06-09
Filing date: 1993-06-09
Publication date: 2001-05-31
Anticipated expiration: 2013-06-10
Also published as: ATE195553T1; DE69329247D1; JPH08507916A; EP0955365A3; CA2137793C; EP0955365A2; CA2137793A1; US6184354B1; WO1993025687A1; EP0668914B1; JP2004285076A; EP0668914A1; US5866114A

Description

Die hierin beschriebene Arbeit wurde von der US-Regierung finanziell unterstützt. Die US- Regierung hält bestimmte Rechte an Erfindungen, die als Teil dieser Arbeit entstanden sind.
Die vorliegende Anmeldung ist eine Fortsetzungsanmeldung (continuation-in-part) der US- Anmeldung der Seriennummer 07/896,512, angemeldet am 9. Juni 1992.

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen kristalline Zusammensetzungen des Macrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors "M-CSF" und insbesondere Verfahren zur Verwendung der Strukturinformation (einschließlich der Röntgenbeugungsmuster) von kristallinem M-CSF für die Produktion von Agonisten und Antagonisten sowie Tests für die Detektion derselben.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Monozyten-Macrophagen-Kolonie-simulierende Faktor wird von einer Vielzahl von Zellen, einschließlich Macrophagen, Endothelzellen und Fibroblasten synthetisiert (siehe Ralph et al., "The Molecular and Biological Properties of the Human and Murine Members of the CSF-1 Family" in Molecular Basis of Lymphokine Action, Humana Press, Inc., (1987)). Der M-CSF besteht aus zwei "Monomer"-Polypeptiden, die ein biologisch aktives Dimer M-CSF Protein bilden (im Folgenden als "M-CSF-Dimer" bezeichnet). Der M-CSF gehört zu einer Gruppe biologischer Agonisten, die die Produktion von Blutzellen fördern. Insbesondere wirkt er als Wachstums- und Differenzierungsfaktor für Knochenmarksvorläuferzellen der Linie der mononucleären Phagocyten. Darüber hinaus stimuliert der M-CSF die Proliferation und Funktion von reifen Macrophagen über spezifische Rezeptoren auf ansprechbaren Zellen. In klinischen Untersuchungen hat sich der M-CSF erfolgversprechend als pharmazeutisches Mittel bei der Korrektur von Blutzellmängeln erwiesen, die als Nebenwirkung der Chemotherapie oder der Bestrahlungstherapie bei Krebs entstehen und kann vorteilhaft bei der Behandlung von Pilzinfektionen sein, die mit Knochenmarkstransplantaten verbunden sind. Der M-CSF kann außerdem eine signifikante biologische Rolle bei der Schwangerschaft, der Uveitis und der Artheriosklerose spielen. Die Entwicklung von M-CSF-Agonisten oder -Antagonisten kann sich als wertvoll beim Modifizieren der biologischen Ereignisse herausstellen, die in diesem Zuständen involviert sind.
Der M-CSF existiert in mindestens drei reifen Formen: kurz (M-CSFα), mittel (M-CSFγ) und lang (M-CSFβ). Ein reifer M-CSF wird so definiert, dass er die Polypeptid-Sequenzen umfasst, die in sekretiertem M-CSF nach dem aminoterminalen Processing zum Entfernen von Signalsequenzen (Leader-Sequenzen) und dem carboxyterminalen Processing zum Entfernen von Domänen, einschließlich einer möglichen Transmembranregion, enthalten sind. Die Variationen in den drei reifen Formen beruhen auf einem alternativen mRNS-Splicing (siehe Cerretti et al., Molecular Immunology, 25: 761, (1998)). Die drei Formen des M-CSF werden aus verschiedenen mRNS-Vorläufern translatiert, die Polypeptidmonomere von 256 bis 554 Aminosäuren kodieren, mit einer Signalsequenz von 32 Aminosäuren am aminoterminalen Ende und einem möglichen Transmembranbereich von etwa 23 Aminosäuren in der Nähe des carboxyterminalen Endes. Die Vorläuferpeptide werden anschließend über aminoterminale und carboxyterminale proteolytische Spaltungen zum Freisetzen des reifen M-CSF bearbeitet bzw. prozessiert. Die Reste 1 bis 149 aller drei reifen Formen des M- CSF sind identisch, und es wird angenommen, dass sie für die biologische Aktivität des M- CSF essenzielle Sequenzen umfassen. In vivo sind die M-CSF-Monomere über Disulfidbindung dimerisiert und sind glycosyliert. Einige, wenn nicht alle Formen des M-CSF können in membranassozüerter Form gewonnen werden. Ein solcher membrangebundener M- CSF kann gespalten werden, um einen sekretierten M-CSF freizusetzen. Von dem membranassozüerten M-CSF wird angenommen, dass er eine dem M-CSF ähnliche
biologische Aktivität aufweist, jedoch andere Aktivitäten haben kann, eingeschlossen die Zell-Zell-Assoziierung oder Aktivierung.
Polypeptide, einschließlich der M-CSFs weisen eine dreidimensionale Struktur auf, die über die primäre Aminosäuresequenz und die das Polypeptid umgebende Umgebung bestimmt wird. Diese dreidimensionale Struktur bestimmt die Aktivität, Stabilität, Bindungsaffinität, Bindungsspezifizität und andere biochemische Attribute bzw. Eigenschaften des Polypeptids. Somit kann die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur eines Proteins einen hilfreichen Leitfaden bei der Bestimmung von Mitteln darstellen, die dessen biologische Aktivität in löslicher oder in membrangebundener Form nachahmen, inhibieren oder verbessern.
Uic dreidimensionale Struktur eines Polypcptids kann über eine Vielzahl von Wegen bestimmt werden. Viele der präzisesten Verfahren benutzen die Röntgenkristallographie (für einen allgemeinen Überblick siehe Van Holde, Pbysical Biochemistry, Prentice-Hall, N. J. Seiten 221-239, (1971), der durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird). Diese Technik beruht auf der Fähigkeit von Kristallgittern, Röntgenstrahlen oder andere Strahlungsformen zu beugen. Beugungsexperimente, die für die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von Makromolekülen geeignet sind, erfordern typischerweise Kristalle hoher Qualität. Leider sind solche Kristalle für M-CSF wie für viele andere interessierende Proteine nicht verfügbar gewesen. Somit würden qualitativ hochwertige, beugende Kristalle von M-CSF die Bestimmung von dessen dreidimensionaler Struktur unterstützen.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung von kristallinen Proteinen und Polypeptiden sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise McPherson et al., Preparation and Analysis of Protein Crystals, A. McPherson, Robert E. Krieger Publishing Company, Malabar, Florida (1989); Weber, Advances irr Protein Chemistry 41 : 1-36 (1991); US-A- 4,672,108 und US-A-4,833,233). Obwohl viele Ansätze sowohl zum Kristallisieren von Polypeptiden vorliegen, stellt kein einziges Bedingungsset eine angemessene Erfolgsaussicht bereit, insbesondere dann, wenn die Kristalle für Röntgenbeugungsuntersuchungen geeignet sein müssen. Somit bleiben viele Proteine trotz umfangreicher Forschung unkristallisiert.
Zusätzlich zur Bereitstellung von Strukturinformation bieten kristalline Polypeptide andere Vorteile. Beispielsweise reinigt der Kristallisierungsprozess selbst die Polypeptide weiter auf und erfüllt eines der klassischen Kriterien an die Homogenität. Tatsächlich sorgt die Kristallisierung durch Entfernen von Verunreinigungen, die durch andere Aufreinigungsverfahren wie die HPLC die Dialyse, die herkömmliche Säulenchromatographie usw. nicht entfernt werden, häufig für die einmalige Aufreinigungsqualität. Darüber hinaus sind kristalline Polypeptide häufig bei Raumtemperatur stabil und frei von Protease-Verunreinungsgen und anderem Abbau, der mit der Lagerung in Lösung verbunden ist. Kristalline Polypeptide können außerdem als pharmazeutisch Zubereitung geeignet sein. Schließlich sind Kristallisationstechniken im Allgemeinen weitgehend frei von Problemen wie der Denaturierung, die mit anderen Stabilisierungsverfahren (beispielsweise der 1 Lyohilisierung) verbunden sind. Somit besteht ein signifikanter Bedarf an der Herstellung von M- CSF-Zusammensetzungen in kristalliner Form und zur Ermittlung ihrer dreidimensionalen Struktur. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen und andere Bedürfnisse. Sobald die Kristallisierung erzielt ist, stellen die kristallographischen Daten nützliche Strukturinformation bereit, die das Design von Peptiden unterstützen kann, die als Agonisten oder Antagonisten dienen können. Zusätzlich stellt die Kristallstruktur Information breit, die zum Kartieren der Rezeptorbindungsdomäne nützlich ist, die anschließend durch ein kleines, nichtpeptidisches Molekül nachgeahmt werden könnte, dass als Antagonist oder Agonist dienen kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt kristalline Formen von M-CSF-Dimeren bereit. Vorzugsweise werden die Dimere aus Polypeptiden gebildet, enthaltend zwischen 146 bis 162 Aminosäurenreste am oder in der Nähe des N-Terminus des reifen M-CSF (beispielsweise glu&sub1;glu&sub2;-val&sub3;...). In einer speziellen Ausführungsform umfasst das Polypeptid die Reste 4 bis 158 des reifen M-CSFα-Polypeptids, vorzugsweise in der nichtglycosylierten Form.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Kristallisierung eines M-CSFs bereit. Ein bevorzugtes Kristallisierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte: Mischen eines vorgewählten, im Wesentlichen reinen M-CSF- Dimeren und eines Fällungsmittel zur Bildung einer M-CSF-Mischung; Ausfällen des kristallinen M-CSF aus der Mischung und Isolieren des M-CSF in kristalliner Form. Die speziellen Ausführungsformen enthält das Fällungsmittel Polyethylenglycol. Andere Komponenten wie Ammoniumsulfat und/oder ionische Verbindungen können der Lösung zugesetzt werden. Mittels Röntgenkristallographie wurde gefunden, dass über das Verfahren der vorliegenden Erfindung produzierter M-CSF beispielsweise in den P2&sub1;2&sub1;2&sub1;-Raumgruppen kristallisieren kann.
Variationen des Kristallisierungsverfahrens werden ebenfalls bereitgestellt. Beispielsweise kann der Schritt des Ausfällens von Kristallen aus der M-CSF-Mischung das Equilibrieren der M-CSF-Mischung mit einer zweiten Mischung umfassen. Die zweite Mischung ist typischerweise eine Lösung, die aus einer höheren Konzentration des Fällungsmittels als derjenigen der ersten M-CSF-Mischung besteht. Der Equilibrierungsschritt besteht vorzugsweise aus dem Auftragen der M-CSF-Mischung auf eine Oberfläche und dem Equilibrieren lassen der aufgetragenen M-CSF-Mischung mit einem Reservoir der zweiten Mischung. In anderen Ausführungsformen kann der Ausfällungsschritt für M-CSF-Kristalle durch Animpfen der M-CSF-Mischung mit Impfkristallen oder durch Ändern der Temperatur der M-CSF-Mischung inizüert werden. Ein anderer Aspekt der Erfindung umfasst die Identifizierung von Verbindungen, die Strukturen aufweisen, die einen Rezeptorbindungsbereich der dreidimensionalen Struktur des M-CSF in unterschiedlichem Ausmaß nachahmen und die in vielen Fällen als M-CSF-Agonisten oder -Antagonisten fungieren können. Verbindungen, die mit dem Rezeptorbindungsbereich des M-CSF interagieren, können Antagonisten sein. Die dreidimensionalen α-Kohlenstoff-Koordinaten eines verkürzten M-CSF-Dimeren sind in Anlage 1 dargestellt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die dreidimensionale Struktur des M-CSF durch zunächst Kristallisieren eines M-CSF-Dimeren (mit M-CSF-Rezeptorbindungsresten) zur Bildung von mindestens einem M-CSF-Kristall erhalten. Als nächstes wird eine Strahlungsquelle zum Bestrahlen eines M-CSF-Kristalls eingesetzt, um ein Beugungsmuster des M-CSF-Kristalls zu erhalten. Schließlich wird eine dreidimensionale Struktur des M-CSF aus diesem Beugungsmuster erhalten. In den meisten Ausführungsformen umfasst die dreidimensionale Struktur einen M-CSF-Rezeptorbindungsbereich.
Die gemäß der Erfindung identifizierten Strukturmerkmale können zum Selektieren von möglichen Aminosäurensubstitutionen in einem Protein und insbesondere von M-CSF auf Basis von Strukturinformation verwendet werden, umfassend die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur des M-CSF über Verfahren der vorliegenden Erfindung, gefolgt vom Ermitteln der lösungsmittelzugänglichen Aminosäurereste des Proteins, Bestimmen, welche Reste nicht in die Dimerbildung involviert sind. Unter Anwendung dieser Kriterien werden Aminosäurereste im M-CSF, die lösungsmittelzugänglich sind und die nicht in die Dimerbildung involviert sind, zur Substitution mit nicht-konservativen Aminosäuren ausgewählt. Da der M-CSFß Intraketten-Disulfidbindungen aufweist, welche die Cysteine 157 und/oder 159 involvieren, nehmen wir an, dass sich der C-terminale Bereich des M-CSF vom "Hinterteil" der von uns gelösten Struktur erstreckt, eine "Halterung" variabler Länge für die membrangebundene Form des M-CSF bereitstellend. Somit befindet sich das "Vorderteil" oder der Rezeptorbindungsbereich des M-CSF auf der anderen Seite der Moleküle, bestehend aus lösungsmittelzugänglichen Resten in oder in der Nähe der Helixes A, C und D, umfassend die Reste von etwa 6 bis 26, 71 bis 90 bzw. 110 bis 130 des nativen M- CSF. Für die Substitution bevorzugte Aminosäuren und bevorzugte substituierende Aminosäuren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: H15 → A oder L; Q79 → A oder D; R86 → E oder D; E115 → A; E41 → K oder R; K93 -+ A oder E; D99 → K oder R; L55 → Q oder N; 518 → A oder K; Q20 → A oder D; 175 → K oder E; V78 → K oder R; L85 → E oder N; D69 → K oder R; N70 → A oder E; H9 → A oder D; N63 → K oder R; und T34 → Q oder K. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Substitutionen, die zu neuen M- CSF-Agonisten und M-CSF-Antagonisten führen. Zusätzlich richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Antagonisten und Agonisten durch Substituieren mindestens einer und vorzugsweise weniger als fünf lösungsmittelzugänglichen Resten pro M-CSF-Monomer.
Die Erfindung ermöglicht außerdem die Herstellung von heterodimerem M-CSF, in dem nur eine Untereinheit in die Signaltransduktion involvierte, substituierte lösungsmittelzugängliche Aminosäuren enthält, und von heterodimerem M-CSF, in dem jede Untereinheit verschieden substituierte, lösungsmittelzugängliche Aminosäuren, die in die Signaltransduktion involviert sind, enthält. Die vorliegende Erfindung ermöglicht außerdem die Herstellung von M-CSF mit Aminosauresubstitutionen, die die Bindung an den M-CSF- Rezeptor nicht behindern. Ein Überprüfen bzw. Screening auf Agonisten und Antagonisten wird anschließend unter Verwendung von Bioassays und Rezeptorbindungstest unter Anwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren durchgeführt, einschließlich derjenigen, die in den folgenden Beispielen beschrieben sind.
Zusätzlich richtet sich die Erfindung auf einen isolierten, gereinigten, löslichen und funktionalen M-CSF-Rezeptor. Die vorliegende Erfindung richtet sich außerdem auf ein Verfahren zur Überprüfung bzw. zum Screening von M-CSF-Agonisten und -Antagonisten unter Verwendung eines löslichen M-CSF-Rezeptors.
Ein weiteres Verständnis der vorliegenden Erfindung kann durch Bezugnahme auf die Zeichnungen und die Diskussion spezifischer Ausführungsformen erhalten werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist ein Ausschnitt aus einem Beugungsmuster eines gemäß der vorliegender Erfindung hergestellten M-CSFα-Kristalls;
Fig. 2 ist ein topologisches Diagramm, welches die Disulfidbindungen in einem verkürzten M-CSF-Dimner zeigt;
Fig. 3 ist ein Srereodiagramm des Cα-Rückgrats, in dem jeder zehnte Rest markiert ist und in dem die nichtkristallographische Symmetrieachse durch eine gestrichelte Linie gekennzeichnet ist;
Fig. 4A und 4B zeigen zwei Ansichten eines Banddiagramms, welches die Sekundärstrukturelemente von M-CSF betont. Die Cysteinreste werden durch ein Kugel- und Stabmodel dargestellt und die nichtkristallographische Symmetrieachse durch eine gestrichelte Linie angezeigt;
Fig. 5 A-C veranschaulichen die Größenausschluss-HPLC-Analyse (size-exclusion HPLC) des Kurzklon-M-CSF-Homodimeren NΔ3CΔ158 (158) (Fig. 5A), des Langklon-M-CSF-Homodimeren NΔ3CΔ221 C159S, (221F) (Fig. 5B) und des Kurzklon-Langklon-Heterodimeren (158/221F) (Fig. 5C) und deren entsprechende biologische Aktivitäten;
Fig. 6 A-C veranschaulichen die Größenausschluss-HPLC (Fig. 6A) und sowohl die nichtreduzierte (Fig. 6B) und die reduzierte (Fig. 6C) SDS-PAGE- Analyse der präparativen Reinigung des M-CSF; insbesondere veranschaulicht Fig. 6A graphisch die Auftrennung auf einer Phenyl-HPLC- Größenauschlusschromatographie der drei Spezies an M-CSF-Dimeren der Fig. 5A-C, d. h. das heißt des 158-Homodimeren, des 221F- Homodimeren und des 158/221-Heterodimeren, und zeigt, dass die drei Absorbtionspeaks bei 280 nm (durchgezogene Linie) mit der M- CSF Aktivität in U/ml · 10&supmin;&sup6; (gepunktete Linie) korrelieren; Fig. 6B veranschaulicht eine SDS-PAGE Analyse unter nicht-reduzierenden Bedingungen der präparativen Aufreinigung des 158/221F Heterodimeren (mittlere Molekulargewichtsspezies) relativ zum 158-Homodimer (niedrige Molekulargewichtsspezies) und dem 221F-Homodimeren (höchste Molekulargewichtsspezies); Fig. 6C veranschaulicht eine SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen der präparativen Aufreinigung des 158/221F-Heterodimeren (mittlere Spuren) bezogen auf das 158-Homodimer (linke Spuren) und des 221F-Homodimeren (rechte Suren); und
Fig. 7 veranschaulicht die kompetitive Verbindung von M-CSF und M-CSF- Muteinen an M-CSF-Rezeptoren von NFS60-Zellen. In Fig. 7 sind kompetitive Bindungskurven für M-CSFα NΔ3CΔ158 (geschlossene Kreise); M-CSFα NΔ3CΔ158 H9A, H15A/M-CSFβ NΔ3CΔ221 C157S, C1595-Heterodimer (geschlossene Quadrate); dimeres Q20A, V78KF-Mutein (offene Kreise) und dimeres H9A, H15A-Mutein (offene Quadrate) gezeigt.

BESCHREIBUNG DER DEFINITIONEN DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Wie hier verwendet, bezeichnet "M-CSF-Polypeptid" ein Humanpolypeptid mit im Wesentlichen derselben Aminosäurensequenz wie die reifen human M-CSFα-, M-CSFβ- oder M- CSFγ-Polypeptide beschrieben in Kawasaki et al., Science 230: 291 (19859, Cerretti et al., Molecular Immunology, 25: 761 (1988), oder Ladner et al., EMBO Journal 6: 2593 (1987). Eine solche Terminologie spiegelt das Verständnis wider, dass die drei reifen M-CSFs verschiedene Aminosäuresequenzen haben, wie oben beschrieben.
Bestimmte Modifikationen an der Primärsequenz des M-CSF können durch Deletion, Addition oder Änderung der von der DNS-Sequenz kodierten Aminosäuren gemacht werden, ohne die gewünschte Struktur zu zerstören (beispielsweise die Rezeptorbindungsfähigkeit des M-CSF), gemäß wohlbekannter rekombinanter DNS-Techniken. Weiterhin wird ein Fachmann erkennen, dass einzelne Aminosäuren substituiert oder über Oxidation, Reduktion oder andere Derivatisierung modifiziert werden können und dass das Polypeptid zum Erhalt von Fragmenten gespalten werden kann, die die aktive Bindungsstelle und die Strukturinformation aufrecht erhalten. Solche Substitutionen und Änderungen führen zu Polypeptiden mit einer Aminosäurensequenz, die in die Definition von Polypeptiden "mit im Wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die reife M-CSFα-, M-CSFβ- und M-CSFγ- Polypeptide" fällt.
Zum Zwecke der Kristallisation liegen bevorzugte Längen der M-CSFα-, β- oder γ-Monomere zwischen etwa 145 und 180 Aminosäuren (gezählt vom reifen Aminoterminus) und stärker bevorzugt zwischen etwa 145 und 162 Aminosäuren Länge. Ein spezielles Monomer, das in einem kristallisierbaren Dimer vorhanden sein kann, ist das M-CSFα und ist das NΔ3M-CSF-αCΔ158 (3 Aminosäuren sind vom Aminoterminus deletiert und die Gesamtlänge beträgt 155 Aminosäuren). Alle Längen sind einschließlich. Wie er hier verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck "M-CSFα (4-158)" ein M-CSF mit den Aminosäureresten 4 bis 158 des reifen, prozessierten M-CSFα-Pulypeptids. Andere Nomenklaturbezeichnungen für C-terminale und N-terminale Verkürzungen des nativen M-CSFs werden in der US-A-4,929,700 beschrieben.
Kristallisierbare Glykosylierungsvarianten der M-CSF-Polypeptide sind im Schutzbereich dieser Erfindung umfasst. Diese Varianten schließen Polypeptid, denen eine Glycosylierung vollständig fehlt, und Varianten mit mindestens einer Glycosylierungsstelle weniger als die reifen Formen wie auch Varianten ein, in denen das Glycosylierungsmuster von der nativen Furor geändert wurde. Ebenso umfasst sind deglycosylierte und nicht-glycosylierte Aminosauresequenzvarianten, wie auch deglycosilierte und nicht-glyeosylierte M-CSF- Untereinheiten mit der reifen Aminosäurensequenz (siehe US-A-5,032,626).
Das "M-CSF"-Dimer bezeichnet zwei M-CSF-Polypeptidmonomere die dimerisiert sind. Die M-CSF-Dimere können zwei identische Polypeptidmonomere (Homodimere) oder zwei verschiedene Polypeptidmonomere (Heterodimere wie ein M-CSfα-MCSFβ-Dimer, ein ein M- CSF-Langklon- und -Kurzklon-Dimer) umfassen. Die M-CSF-Monomere können zu M- CSF-Dimeren in vitro, wie in US-A-4,929,700 beschrieben, umgewandelt werden. Rekombinant exprimierte M-CSFs können ebenfalls variabel glycosyliert werden, wie sie in vivo vorliegen, insbesondere glycosiliert oder vollständig frei von Glycosilierung (unglycosyliert). Glycosylierte M-CSF können in vivo mit Kohlenhydratketten erzeugt werden, die später enzymatisch in vitro deglycosyliert werden können.
Ein biologisch aktiver M-CSF weist ein im Stand der Technik verstandenes Aktivitätsspektrum auf. Beispielsweise stimuliert der M-CSF die Proliferation und Funktion von reifen Macrophagen über spezifische Rezeptoren an ansprechbaren Zellen. Weiterhin wirkt der M- CSF als Wachstumsfaktur für mononucleäre Phagocytenvorläufer. Der in vitro Kolonie-stimulierende Standardtest von Metcalf, J. Cell Physiol. 76: 89 (1970) führt hauptsächlich zur Bildung von Macrophagenkolonien, wenn M-CSF auf Stammzellen angewandt wird. Andere biologische Tests beruhen auf der von M-CSF induzierten Proliferation von M-CSF abhängigen Zellen wie der NFS-60-Zelllinie. Wie hierin verwendet, bezieht sich "M-CSF mit biologischer Aktivität" auf ein M-CSF, eingeschlossen Fragmente und verschiedene Varianten desselben, wie hierin beschrieben, das ein im Stand der Technik anerkanntes Aktivitätsspektrum in Bezug auf biologische Systeme aufweist. Ein solcher M-CSF mit biologischer Aktivität wird typischerweise bestimmte strukturelle Attribute aufweisen, in Übereinstimmung mit denjenigen der reifen M-CSF-Formen wie die Tertiärstruktur der Rezeptorbindungsstelle.
Agonisten sind Substanzen, die per se eine größere Aktivität als der native Ligand aufweisen, während Antagonisten Substanzen sind, die die biologische Aktivität eines nativen Liganden suprimieren, inhibieren oder mit dieser interferieren. Agonisten und Antagonisten können über die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen hergestellt werden, in denen M-CSF entweder eine potentielle Behandlung (beispielsweise zur Behandlung von Blutzellmängeln, die als Nebeneffekt bei der Chemotherapie zur Behandlung von Pilzinfektionen in Verbindung mit Knochenmarktransplantaten und anderen entstehen) oder als bei der Pathogenese der Erkrankung (beispielsweise Ovartumoren, Uveitis, Artheriosklerose) eine Rolle spielend impliziert wurde.
Die Kristallisation von M-CSF-Spezies gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst vier allgemeine Schritte: die Expression, die Reinigung, die Kristallisation und die Isolierung.

Expression von rekombinanten M-CSF

Die M-CSF-Kristallisation erfordert eine reichliche bzw. ergiebige Quelle von M-CSF, der in einer relativ homogenen Form isoliert werden kann. Eine Vielzahl von Expressionssystemen und -wirten sind für die Expression von M-CSF geeignet und werden dem Fachmann leicht erkenntlich sein. Aufgrund der Variabilität der Glycosilierung und anderer posttranslationaler Modifikationen, die in einem in bestimmten eukaryontischen Wirten produzierten M-CSF vorhanden sein können, kann die Expression in E. coli M-CSF mit vorteilhaften Eigenschaften im Hinblick auf die Kristallisation bereitstellen. Typische in vitro M-CSF- Expressionssysteme sind beispielsweise im US-Patent der Nummer 4,929,700 beschrieben.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von M-CSF-Polypeptiden leicht designed bzw. entworfen und unter Verwendung von rekombinanten DNS-Techniken, die dem Fachmann wohl bekannt sind, hergestellt werden. Beispielsweise kann die M-CSF-Aminosäuresequenz von der natürlich auftretenden Sequenz auf dem Primärstrukturlevel durch Aminosäuresubstitutionen, -insertionen, -deletionen und dergleichen abweichen. Diese Modifikationen können in einer Anzahl von Kombinationen verwendet werden, um die fertige modifizierte Polypeptidkette zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung ist für die Kristallisierung solcher Polypeptide und von Dimeren derselben geeignet.
Im Allgemeinen lassen sich Modifikationen der das M-CSF-Polypeptid kodierenden Gene leicht durch eine Vielzahl wohlbekannter Techniken wie die Site-Directed-Mutagenesis (ortsspezifische Mutagenese) erzielen (vgl. Gillmann and Smith, Gene 8: 81-97 (1979) und S. Roberts et al., Nature 328: 731-734 (1987) und US-A-5,032,676). Die meisten Modifikationen werden durch Serientesten (screening) in einem geeigneten Test auf die gewünschte Eigenschaft bewertet. Beispielsweise kann eine Änderung in M-CSF- Rezeptorbindungscharakter des Polypeptids durch kompetitive Tests mit einem geeigneten Referenzpolypeptid oder über die in der US-A-4,847,201, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschriebenen Bioassays detektiert werden.
Insertionsvarianten der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, in denen eine oder mehrere Aminosäurereste an einer vorbestimmten Suite in den M-CSF eingeführt werden. Beispielsweise kann es sich bei den Insertionsvarianten um Fusionen heterologer Proteine oder Polypeptide an den Amino- oder Carboxylterminus der Untereinheiten handeln. Substitutionsvarianten sind diejenigen, in denen mindestens ein Rest entfernt wurde und ein anderer Rest an dessen Stelle insertiert wurde. Nicht natürliche Aminosäuren (d. h. Aminosäuren, die sich im nativen Protein nicht finden), wie auch isostere Analoga (Aminosäuren oder andere) sind ebenfalls für die Verwendung in der Erfindung geeignet, Beispiele geeigneter Substitutionen sind im Stand der Technik wohl bekannt, wie beispielsweise Glu→Asp, Ser→Cys und Cys→Ser, His→ Alanin. Eine andere Klasse von Varianten sind Deletionsvarianten, die durch die Entfernung eines oder mehrerer Aminosäurereste(s) aus dem M-CSF charakterisiert ist.
Andere Varianten der vorliegenden Erfindung können durch chemisches Modifizieren der Aminosäuren des nativen Proteins erzeugt werden (beispielsweise Diethylpyrocarbonatbehandlung, die die Histidinreste modifiziert). Bevorzugt sind chemische Modifikationen, die für bestimmte Aminosäureseitenketten spezifisch sind. Die Spezifität kann auch erzielt werden, indem man andere Seitenketten mit gegen diese zu schützenden Seitenketten gerichteten Antikörpern blockiert. Die chemische Modifikation umfasst solche Reaktionen wie die Oxidation, Reduktion, Amidierung, Desamidierung oder Substitution voluminöser Gruppen wie Polysaccharide oder Polyethylenglycol (vgl. beispielsweise US-A-4, 179, 337 und WO91/21029).
Veranschaulichende Modifikationen umfassen die Modifikation von lysinyl- und aminoterminalen Resten durch Reaktion mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden. Eine Modifikation mit diesen Mitteln hat die Wirkung der Ladungsumkehr der Lysinylreste. Andere zum Modifizieren von Amino-enthaltenden Resten geeignete Reagenzien schließen Irnidoester wie Methylpiccolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxalchlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und eine Transaminase katalysierte Reaktion mit Glyoxylat sowie die N-Hydroxysuccinamidester des Polyethylenglykols oder andere voluminöse Substitutionen ein.
Arginylreste können durch Umsetzung mit einer Anzahl von Reagenzien modifiziert werden, eingeschlossen Phenyl; glyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Modifikation der Argininreste erfordert, dass die Reaktion unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird, aufgrund des hohen pL der funktionellen Guanidingruppe. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Gruppen des Lysins wie auch der C-Aminogruppe des Arginins reagieren.
Tyrosylreste können ebenso mit dem speziellen Interesse der Einführung von Spektralmarkern in Tyrosylreste modifiziert werden, und zwar durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan, die verwendet werden, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Die Tyrosylreste können außerdem unter Verwendung von ¹²&sup5;I oder ¹³¹I jodiert werden, um markierte Proteine zur Verwendung in Radioimmungssays herzustellen.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) können selektiv durch Umsetzung mit Carbodümiden (R-N=C=N-R¹) modifiziert werden, worin R und R¹ verschiedene Alkylgruppen darstellen, wie 1--Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)-carbodümid oder 1-Ethyl- 3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)-carbodiimid. Darüber hinaus werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgewandelt.
Umgekehrt können Glutaminyl- und Asparaginylreste unter leicht sauren Bedingungen zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desaminiert werden. Jede Form dieser Reste fällt in den Bereich dieser Erfindung.
Andere Modifikationen schließen die Hydroxilierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen der Seryl- oder Threonylreste, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin, Aginin und der Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, Seiten 79-86 [1983]), die Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung jeder C-terminalen Carboxylgruppe ein.
Die Verfügbarkeit der M-CSF kodierenden DNS-Sequenz gestattet die Verwendung verschiedener Expressionssysteme, um die gewünschten Polypeptide zu erzeugen. Die Konstruktion von Expressionsvektoren und die rekombinante Erzeugung aus den geeigneten DNS-Sequenzen werden über im Stand der Technik wohl bekannte Verfahren durchgeführt. Diese Techniken und verschiedene andere Techniken werden im Allgemeinen gemäß Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989) und M. Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, New York (1990) durchgeführt.

Aufreinigung von M-CSF

Aufreinigungsschritte werden angewandt, um sicherzustellen, dass der M-CSF vor der Kristallisation in einem relativ homogenen Zustand isoliert wird. Im Allgemeinen erhöht eine Lösung höherer Reinheit die Wahrscheinlichkeit des Erfolgs des anschließenden Kristallisierungsschritts. Typische Aufreinigungsverfahren schließen die Verwendung von Zentrifugation, teilweiser Fraktionierung unter Verwendung von Salz oder organischen Verbindungen, die Dialyse, die konventionelle Säulenchromatographie (wie Ionenaustausch- Molekularsieb-Chromatographie usw.) die Hochleistungsflüssigkeitschromatograpie (HPLC) und Gelelektrophoreseverfahren ein (siehe beispielsweise Deutcher, "Guide to Protein Purifleation", in Methods in Enzymology (1990), Academic Press, Berkeley, CA, der durch Bezugnahme für alle Zwecke hierin aufgenommen wird). Bevorzugte Aufreinigungsbedingungen zum Erzeugen ungewöhnlich homogener M-CSF-Spezies wie auch die Aufreinigung dieser Spezies sind beispielsweise im US-Patent der Nummer 4,929,700 offenbart. Andere Aufreinigungsverfahren sind bekannt und sind dem Fachmann offensichtlich.

Kristallisierung von M-CSF

Obwohl viele ähnliche physikalische Prinzipien sowohl die Kristallisierung von Polypeptiden (eingeschlossen M-CSF-Dimere) und von kleinen Molekülen leiten, unterscheidet sich der aktuelle Kristallisierungsmechanismus signifikant. Beispielsweise schließt das Kristallgitter von Kristallen kleiner Moleküle effektiv Lösungsmittel aus, während dasjenige von Polypeptidkristallen eine substantielle Anzahl von Lösungsmittelmolekülen umfasst. Somit müssen zum Kristallisieren von Polypeptiden typischerweise spezielle Techniken angewandt werden.
Die Polypeptidkristallisiation tritt in Lösungen auf, in denen die Polypeptidkonzentration sein Löslichkeitsmaximum übersteigt (d. h. die Polypeptidlösung ist übersättigt). Solche "thermodynamisch metastabilen" Lösungen können wieder auf Gleichgewicht gebracht werden, indem man die Polypeptidkonzentration vorzugsweise über Ausfällung der Polypeptidkristalle verringert. Häufig können Polypeptide zur Kristallisation aus übersättigten Lösungen induziert werden, indem man Mittel zusetzt, die die Oberflächenladungen des Polypeptids ändern oder die Wechselwirkungen zwischen dem Polypeptid und dem Gesamtwasser stören, um Assoziationen zu fördern, die zur Kristallisation führen.
Verbindungen, die als "Fällungsmittel" bekannt sind, werden häufig zum Vermindern der Löslichkeit des Polypeptids in einer konzentrierten Lösung benutzt. Fällungsmittel induzieren die Kristallisation, indem sie eine energetisch ungünstige, Fällungsmittel abgereicherte Schicht um die Polypeptidmoleküle herum bilden. Um die relative Menge dieser abgereicherten Schicht zu minimieren, bilden die Polypeptide Assoziationen und schließlich Kristalle, wie in Weber, Advances in Protein Chemistry 41 : 1-36 (1991) erklärt. Zusätzlich zu den Fällungsmitteln werden der Polypeptid-Kristallisationslösung manchmal andere Materialen zugesetzt. Diese umfassen Puffer, um den pH der Lösung einzustellen (und somit die Oberflächenladung des Peptids), sowie Salze, um die Löslichkeit des Polypeptids zu verringern. Zahlreiche Fällungsmittel sind im Stand der Technik bekannt und schließen die Folgenden ein: Ethanol, 3-Ethyl-2,4-pentandiol und viele der Polyglycole wie Polyethylenglycol. Ein für die Kristallisation von M-CSF geeignetes Lösungsmittel ist Polyethylenglykol (PEG), das einige der Eigenschaften der Salze und anderer organischer Fällungsmittel miteinander kombiniert (siehe beispielsweise Ward et al., J. Mol. Biol. 98: 161 (1975) und McPherson, J. Biol. Chem. 251: 6300 (1976)).
Herkömmlich verwendete Polypeptidkristallisierungsverfahren schließen die folgenden Techniken ein: Chargenverfahren, Schwebetropfentechnik, Animpfung und Dialyse. In jedem dieser Verfahren ist es wesentlich, die fortgesetzte Kristallisation nach der Keimbildung zu fördern, indem man eine übersättigte Lösung aufrechterhält. Im Chargenverfahren wird das Polypeptid mit Fällungsmitteln zum Erzielen der Übersättigung gemischt, der Behälter verschlossen und Beiseite gestellt, bis Kristalle auftreten. Beim Dialyseverfahren wird das Polypeptid in einer verschlossenen Dialysemembran gehalten, die in eine das Fällungsmittel enthaltende Lösung eingebracht wird. Die Equilibrierung über die Membran hinweg erhöht die Konzentrationen von Polypeptid und Fällungsmittel, wodurch sie ein Erreichen des Übersättigungslevels des Polypeptids verursacht.
Im Schwebetropfenverfahren wird eine anfängliche Polypeptidmischung durch Zusatz eines Fällungsmittels zur konzentrierten Peptidlösung hergestellt. Die Konzentration des Polypeptids und des Fällungsmittels sind so bemessen, dass in dieser anfänglichen Form das Polypeptid nicht auskristallisiert. Ein kleiner Tropfen dieser Mischung wird anschließend auf einem Glasträger angeordnet, der umgedreht und über einem Reservoir einer zweiten
Lösung angebracht wird. Das System wird anschließend verschlossen. Typischerweise enthält die zweite Lösung eine höhere Konzentration des Fällungsmittels oder eines anderen dehydrierenden Mittels (Trockenmittels). Die Fällungsmittelkonzentrationsunterschiede führen dazu, dass die Proteinlösung einen höheren Dampfdruck als die Lösung hat. Da das die zwei Lösungen enthaltende System verschlossen ist, bildet sich ein Gleichgewicht aus, und Wasser wird von der Polypeptidmischung zur zweiten Lösung überführt. Dieses Gleichgewicht erhöht die Polypeptid- und Fällungsmittelkonzentration in der Polypeptidlösung. Bei einer kritischen Konzentration von Polypeptid und Fällungsmittel wird sich ein Kristall des Polypeptids bilden. Das Schwebetropfenverfahren ist im Stand der Technik wohl bekannt (siehe McPherson, J. Biol. Chem. 251: 6300 (1967)).
Ein anderes Kristallisierungsverfahren führt eine Keimbildungsstelle in eine konzentrierte Polypeptidlösung ein. Allgemein wird eine konzentrierte Polypeptidlösung hergestellt und ein Impfkristall des Polypeptids in diese Lösung eingeführt. Sind die Konzentrationen von Polypeptid und jeglichen Fällungsmitteln richtig, wird der Impfkristall eine Keimbildungstelle bereitstellen, um die herum sich ein größerer Kristall bildet.
In bevorzugten Ausführungsformen sind Kristalle der vorliegenden Erfindung aus einem Dimer von M-CSF-Polypeptiden gebildet. Bevorzugte Kristalle sind typischerweise mindestens etwa 0,2 · 0,2 · 0,05 mm groß, stärker bevorzugt größer als 0,4 · 0,4 · 0,4 mm, und meisten bevorzugt stärker als 0,5 · 0,5 · 0,5 mm. Nach der Kristallisation kann das Protein vom Kristallisationsgemisch über Standardverfahren abgetrennt werden.
Die so erzeugten Kristalle haben einen weiten Anwendungsbereich. Beispielsweise sind qualitativ hochwertige Kristalle für die Röntgenstrahl- oder Neutronenbeugungsanalyse geeignet, um die dreidimensionale Struktur des M-CSF zu bestimmen und insbesondere bei der Identifizierung seiner Rezeptorbindungsstelle zu assistieren. Die Kenntnis des Bereichs der Bindungsstelle und der lösungsmittelzugänglichen Reste, die für den Kontakt mit den M-CSF-Rezeptor zur Verfügung stehen, gestattet ein rationales Design und die Konstruktion von Agonisten und Antagonsten für M-CSFs. Die Kristallisierung und Strukturbestimmung von M-CSF-Muteinen mit geänderter Rezeptorbindungsfähigkeit oder Bioaktivität gestattet
die Bewertung, ob solche Änderungen von allgemeinen strukturellen Deformationen oder durch Seitenkettenänderung an dem Substitionsort verursacht werden.
Zusätzlich kann die Kristailisierung selbst als Reinigungsverfahren genutzt werden. In einigen Fällen wird ein Polypeptid oder Protein aus einer heterogenen Mischung zu Kristallen kristallisieren. Die Isolierung solcher Kristalle über Filtration, Zentrifugation usw., gefolgt von Rücklösung des Polypeptids stellt eine gereinigte Lösung bereit, die für die Anwendung zum Züchten qualitativ hochwertiger Kristalle geeignet ist, die für Beugungsuntersuchungen erforderlich sind. Diese qualitativ hochwertigen Kristalle können außerdem in Wasser gelöst und anschließend formuliert werden, um eine wässrige M-CSF-Lösung mit verschiedenen im Stand der Technik bekannten Anwendungen, einschließlich pharmazeutischer Zwecke bereitzustellen.
Selbstverständlich können auch Aminosäuresequenzvarianten des M-CSF kristallisiert und eingesetzt werden. Diese Mutanten können unter anderen Zwecken für den Erhalt von Strukturinformationen genutzt werden, die für die Zielrichtung von Modifikationen der Bindungsaffinität für M-CSF-Rezeptoren geeignet sind. Wie bei den natürlich auftretenden Formen können die modifizierten M-CSF-Formen als pharmazeutische Mittel zum Stimulieren der Knochenmarksproliferation, zum Überwinden der Immunsuppression und von Pilzerkrankungen, die von der Chemotherapie induziert werden, zum Verbessern der therapeutischen Wirksamkeit und zum Verringern des Schweregrades oder des Auftretens von Nebenwirkungen während der therapeutischen Anwendung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Darüber hinaus können modifizierte M-CSFs für die Behandlung von Erkrankung geeignet sein, in denen lösliches oder membrangebundenes M-CSF den Krankheitszustand verursacht oder verschlimmert.

Charakterisierung von M-CSF

Nach der Reinigung, Kristallisation und Isolierung können die jeweilige Kristalle über im Stand der Technik bekannte Verfahren analysiert werden. Typische Analysen ergeben strukturelle, physikalische und mechanistische Information über die Peptide. Wie oben angesprochen, stellt die Röntgenkristallographie detaillierte Strukturinformation bereit, die in
Verbindung mit weiterverbreitet verfügbaren Programmen zum Modellieren von Molekülen eingesetzt werden kann, um bei einer dreidimensionalen Anordnung der Atome im Peptid anzukommen. Beispielhafte Modell-Programme umfassen "Homology" von Biosym (San Diego, CA) "Biograf" von BioDesign, "Nemesis" von Oxford Molecular, "SYBEL" und "Composer" von Tripos Associates, "CHARM" von Polygen (Waltham, Massachusetts), "AMBER" von der University of California, San Fransisco, und "NIM2" und MMP2" von Molecular Design, Ltd..
Das Modellieren von Peptiden kann eingesetzt werden, um eine Vielzahl von Mitteln zu designen, die die Aktivität des jeweiligen Peptids modifizieren können: Beispielsweise können unter Verwendung der dreidimensionalen Struktur der "Acive Site" oder des aktiven Zentrums Agonisten und Antagonisten mit Komplementärstrukturen erstellt werden, um die therapeutische Nützlichkeit der M-CSF-Behandlung zu erhöhen oder um die biologische Aktivität von M-CSF zu blockieren. Darüber hinaus ist die Strukturinformation über M- CSF nützlich zum Dirigieren des Designs von proteinartigen oder nicht-proteinartigen M- CFS-Agonisten und -Antagonisten auf Basis der Kenntnis der Kontaktreste zwischen dem M-CSF-Liganden und seinem Rezeptor. Solche Reste werden über die M-CSF-Kristallstruktur als diejenigen identifiziert, die lösungsmittelzugänglich sind, sich distal zum carboxyterminalen Bereich der Membranverankerung befinden, der nicht in die Stabilisierung der Dimer-Grenzflächenstabilisierung involviert ist, und möglicherweise umfassend Reste, die zwischen humanen und M-CSF aus Mäusen (das den Human-M-CSF-Rezeptor nicht erkennt) nicht konserviert sind.

Beispiel 1

Systematische Kristallisationsversuche mit M-CSF wurden unter Verwendung des Schwebetropfenverfahrens durchgeführt. Ein Mikrotropfen (5 ul) einer Mutterlauge wurde hängend an der Unterseite eines Mikroskop-Deckgläschen angebracht, das über eine Vertiefung angeordnet wurde, die 1 ml der Fällungslösung enthält. 60 bis 70 anfängliche Untersuchungen wurden angesetzt, in denen der pH, die Temperatur, das Gegenion und das Fällungsmittel variiert wurden. Unter diesen Versuchen wurden diejenigen, die erfolgversprechende Mikrokristalle ergaben, zur sorgfältigeren Untersuchung ausgewählt.
Es wurde gefunden, dass geeignete Kristalle aus einem 20 ul Tropfen gezogen werden können, der enthält: 10 mg/ml Protein, 100 mM MgCl&sub2;, 50 mM Tris.Cl, pH 8,5, und 12% PEG 4000. Dieser Tropfen wurde gegen einen Vorrat, enthaltend 24% PEG 4000, equilibriert. Kleine nadelähnliche Kristalle erschienen innerhalb von 2 bis 3 Tagen, die in 10 ul Wasser rückgelöst und bei Raumtemperatur rekristallisiert wurden. Große Kristalle guter Qualität erschienen in 7 bis 9 Tagen in Größen, die von 0,3 · 0,3 · 0,3 mm bis 0,5 · 0,5 · 1,0 mm reichten.
Präzisionsphotographien erleben, dass die Raumgruppe P2&sub1;2&sub1;2&sub1; mit Einheitszelldimensionen von: a = 33,53 Å, b = 65,11 Å, c = 159,77 Å war. Dies ergibt ein Einheitszellvolumen von 349.084,5 Å³, was mit einem Dimer in der kristallographisch asymmetrischen Einheit konsistent ist, und 52% des Einheitszellvolumens sind vom Lösungsmittel besetzt. Die Kristalle brachen bzw. beugten auf eine Auflösung von 3 Å auf einem Rigaku- Röntgengenerator mit rotierender Anode (Danvers, Massachusetts), betrieben bei 50 kV und 60 mA, und auf 2,6 Å in Synchrotronstrahlung.
Das Screening auf Schwermetallatomderivate wurde durch Einweichen der Kristalle in Schwermetallsalzlösungen durchgeführt. Null-Level-Präzisionsphotographien der Einweichlinge wurden verwendet, um potentielle Derivate zu identifizieren. Etwa 30 verschiedene Einweichbedingungen wurden untersucht, aus denen vier potentielle Derivate identifiziert wurden. Unvorteilhafterweise führten einige Einweichungen dazu, dass die Kristalle nicht isomorph sind (d. h. das Einweichen in Schwermetallatome induzierte eine Veränderung der Zelldimensionen, was diese für die Phasenrechnung ungeeignet machte).
Die dreidimensionalen Identitätsdaten wurden auf einem Film gesammelt, unter Verwendung einer Oszillationskamera auf der Röntgenstrahllinie am National Synchrotron Light Source Brock Haven. Zahlreiche andere Datensets des nativen (nicht derivatisierten M-CSF) wie auch potentielle Derivatkristalle wurden auf einem Rigaku-Röntgengenerator gesammelt. Die folgenden Datensets wurden gesammelt.

Beispiel 2

Rekombinante M-CSF-Polypeptide wurden aus E. coli gereinigt und, wie im US-Patent Nr. 4,929,700 beschrieben, zur Bildung eines disulfidverbrückten dimeren Proteins renaturiert. Die Kristallisation des resultierenden nicht-glycosylierten M-CSFα-Proteins (Aminosäuren 4-158 in homodimerer Form) wurde über das Schwebetropfenverfahren durchgeführt. Mikroskop-Glasobjektträger wurden vor der Anwendung durch Eintauchen zur Immersion in eine 1%ige (Vol.: Vol.) Lösung der Organosilanverbindung Prosil-28 (PCR Incorporated, Gainesville, Florida, 32602), Waschen der behandelten Glasplatten mit Wasser und Einbrennen bei 180ºC silikonisiert.
Eine wässrige Lösung von gereinigtem human-rekombinanten M-CSF (2 mg/ml) wurde dialysiert und gegen 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) unter Verwendung einer Dialyseröhre mit einer Ausschlußgrenze von 10 kD konzentriert. Die Endkonzentration des Polypeptids (10 mg/ml) wurde über UV-Spektroskope bei 280 nm ermittelt.
Etwa 7 ul der konzentrierten Lösung wurden in jeder Vertiefung der Tüpfelplatte mit 7 ul 20% (Vol.: Vol.) PEG 4000, 0,2 M MgCl&sub2;, 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) gemischt. Die Tüpfelplatte wurde anschließend in eine klare Sandwichbox aus Plastik, enthaltend 20 ml 23% PEG 4000, 0,2 M MgCl&sub2;, 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5), eingegeben, und die Box wurde unmittelbar verschlossen und bei Raumtemperatur gelagert. Geringfügigere Abweichungen an dieser Vorgehensweise wie eine Veränderung der Pufferbedingungen sind im Bereich der
vorliegenden Erfindung. Beispielsweise wurden bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Konditionen geändert, um 150 mM MgCl&sub2; und 24% PEG 4000 zu umfassen.
Nach 3 bis 5 Tagen erschienen kleine Mikrokristalle mit einer Größe von 0,1 · 0,1 · 0,05 mm in jeder Vertiefung. Diese Mikrokristalle wurden isoliert und in 25 Mikroliter 50 mM Tris-HCl rückgelöst und bei Raumtemperatur stehengelassen. Das gereinigte M-CSF kristallisierte aus der Lösung zu großen Kristallen in Form eines hexagonalen Prismas, die in einem Größenbereich von 0,3 · 0,3 · 0,3 mm bis 1 mm · 2 mm · 0,5 mm lagen. Diese Kristalle waren bei Raumtemperatur über mindestens drei Monate stabil. In einigen Fällen wurde unter Verwendung von 23% PEG 4000 und 150 mM MgCl&sub2; eine künstliche Mutterlauge hergestellt, Kristalle wurden anschließend dieser Mutterlauge zugesetzt. In diesen Fällen wurden die Kristalle unmittelbar vor der Analyse aus der Mutterlauge entnommen. Unter Anwendung der reduzierenden und nicht-reduzierenden SDS-PAGE-Analyse konnte gezeigt werden, dass der M-CSF in den Kristallen hinsichtlich seines Molekulargewichts zum biologisch aktiven Ausgangsmaterial identisch war. Somit ist die von den Kristallen erhaltene M-CSF-Struktur wahrscheinlich der Struktur des biologisch aktiven M-CSF im wesentlichen identisch.

Beispiel 3

Mikroskop-Glasobjektträger wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. 7 Mikroliter derselben konzentrierten M-CSFα-Proteinlösung wurde in jeder Vertiefung der Tüpfelplatte mit 7 ul 30% (Vol./Vol.) PEG 4000, 0,2 M Ammoniumacetat, 0,1 M Acetatpuffer (pH 7,5) gemischt. Die Tüpfelplatte wurde anschließend in eine klare Sandwichbox aus Plastik gegeben, enthaltend 20 ml 30% PEG 4000, 0,2 M Ammoniumacetat, 0,1 M Acetatpuffer (pH 7,5), und die Box wurde unmittelbar verschlossen und bei Raumtemperatur gelagert. Nach 3 bis 5 Tagen erschienen dünne, plättchenähnliche, zerbrechliche Kristalle mit einer Größe von etwa 0,3 · 0,3 · 0,05 mm.

Beispiel 4

Vorläufige Röntgenanalyse

Die röntgenkristallographische Analyse unter Verwendung von Präzisionsphotographien zeigte, dass die in Beispiel 2 erzeugten Kristalle ein orthorhombisches Kristallgitter in der Raumgruppe P2&sub1;2&sub1;2&sub1; mit Zelldimensionen von a = 33,54, b = 65,26, c = 159,63, d = 90,0, c = 90,0 und f = 90,0 Å hatten und auf eine nominale Auflösung von 2,6 Å unter Verwendung von Synchrotron-Strahlung beugen. Diese Daten ergaben ein Einheitszellvolumen von 348084,5 Å³, das mit einem Dimer in der kristallographisch asymmetrischen Einheit konsistent ist, wobei 52% des Einheitszellvolumens von Lösungsmittel eingenommen werden. Fig. 1 ist eine 12º Präzisionsphotographie des Okl-Zonenabschnitts des M-CSF- Kristalls. Die Aufnahme wurde unter Verwendung einer Präzisonskamera, hergestellt von der Enraf-Nonius Company (Deift, Holland), montiert auf einem Rigaku RU-200 Röntgengenerator, betrieben bei 50 kV und 50 mA, aufgenommen.

Beispiel 5

Testen der M-CSF-Rezeptor-Bindungsfähigkeit unter Verwendung eines löslichen M-CSF-Rezeptors

Ein wesentlicher Schritt in der biologischen Funktion von M-CSF in vivo ist die Bindung an den M-CSF-Rezeptor, auch als das c-fms-Genprodukt bezeichnet. Ein rekombinanter humaner löslicher M-CSF-Rezeptor (rhsM-CSFR), die Aminosäuren 20 bis 511 repräsentierend (L. Coussens et al., Nature, 320: 277 (1986)), wurde als in vitro-Testreagens verwendet, um die Rezeptorbindungsfähigkeit des M-CSF-Proteins zu testen. Um eine lösliche Form des Transrnembranrezeptors zu erzeugen, wurde nur die extrazelluläre Domäne des human M-CSF-Rezeptors in einem rekombinanten Expressionssystem Baculovirus/Insektenzelle exprimiert. Um den löslichen Rezeptor aufzureinigen, ohne die Tertiär- oder Quaternärstruktur nachträglich zu beeinflussen, wurden nicht-denaturierende Chromatographieverfahren verwendet, wie unten beschrieben. Es gibt andere Wahlmöglichkeiten für die Aufreinigung des rekombinanten Rezeptors. Die Affinitätschromatographie kann angewandt werden, wenn entweder ein geeigneter Antikörper gegen oder ein Ligand für den Rezeptor verfügbar ist. Alternativ können dem C-Terminus des rekombinanten Rezeptors
"tags" oder "Marker" angehängt werden, d. h. eine KT3-Antikörper-Erkennungssequenz, und durch einen Anti-tag-Antikörper, d. h. eine KT3-Säule, aufgereinigt werden, bei der Anwendung in der Afinitätschromatographie. In Expressionssystemen, in denen der rhsM- CSFR glycosyliert wird, kann die Lectin-Chromatographie zum Anreichern auf spezifische Glycoproteine eingesetzt werden.
Der rhsM-CSFR kann verwandt werden, um Ligand/Rezeptor-Wechselwirkungen wie auch Ligand-induzierte Rezeptor-Dimerisierung zu untersuchen. Der zur Detektion der Ligand/Rezeptor-Bindung angewandte Test setzt die Verwendung der Größenausschluss-HPLC ein, im Wesentlichen wie in der Europäischen Patentanmeldung WO92/21029 an C. Cunningham et al., beschrieben, mit den folgenden Modifikationen: die eingesetzte Säule war eine Superose 6 (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) und die mobile Phase war PBS mit 0,5 mllmin und ein Verhältnis von M-CSF zu rhsM-CSFR von 1 : 2. In diesem Verhältnis chromatographierte der Komplex aus M-CSF/rhsM-CSFR mit einem apparenten hydrodynamischen Radius des Molekulargewichts von 190000, dem für einen M-CSF(rhsM- CSFR)2-Komplex erwarteten Molekulargewicht. Andere Test können zum Messen der Ligand/Rezeptor-Bindung oder der Rezeptor-Dimerisierung angewandt werden, wie die chemische Quervernetzung und SDS-PAGE oder Immunfällung und die SDS-PAGE. Moleküle, die die Rezeptordimerisierung inhibieren, jedoch nicht die Ligandenbindung, stellen ein weiteres Verfahren, den M-CSF-Wirkungen entgegenzuwirken, dar.
Die rhsM-CSFR codierende DNS wurde zur Expression in Insektenzellen unter Verwendung der folgenden allgemeinen Strategie kloniert. Ein Teil des c-fms-Gens entsprechend den Aminosäuren 1 bis 511, wurde aus humaner Makrophagen-cDNS über die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Upstream-Primers von: 5'-GCGTAC- CATGGGCCCAGGAGTTCTGC-3' (SEQ ID Nr. 9) und eines Downstream-Primers von: 5'-AGTCGAGGATCCTCAATCCGGGGGATGCGTGTG-3' (SEQ ID Nr. 10) hergestellt.
Die unterstrichenen Sequenzen sind die Schnittstellen von NcoI und BamHI, die zur Subklonierung des PCR-Produkts in dem pAcCS-Vektor (Luckov et al., Bio/Technology 6: 47-55) verwendet wurden. Der pAcCS:hsM-CSFR-Vektor wurde in Sf9-Insektenzellen unter Verwendung eines Helfervektors des Baculovirus, wie zuvor beschrieben (Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures (1987)) exprimiert.
Etwa 2 l von serumfreiem, 72 Stunden lang konditionierten Medium wurde durch Zentrifugieren und Filtrieren aus mit dem oben beschriebenen pAcCS:hsM-CSFR-Konstrukt infizierten Sf9-Zellen gesammelt. Das Material wurde mit DEAE-Puffer A [10 mM Tris, pH 8, 8, enthaltend die folgenden Proteaseinhibitoren (die allen Puffern während der Aufreinigung zugesetzt wurden): 1 mM EDTA, 2 ug/ml Leupeptin und 100 uM PMSF] diafiltriert und 20-fach konzentriert mit einer Pyrostat Ultrafiltrationsmembran mit einer Ausflussgrenze von 20000 Molekulargewicht (Sartorius). Das Retentat wurde auf eine DEAE- Sepharosesäule (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, New Jersey) mit einem Bettvolumen von 100 ml geladen, die mit einem DEAE-Puffer A vorequilibriert worden war. Die Elution erfolgte bei 5 ml/min mit einem 0-0,8 M NaCl Gradienten in 500 ml DEAE-Puffer A. Bezüglich. rhsM-CSFR angereicherte Fraktionen wurden über Western- Analyse detektiert (R. Burnett, Anal. Biochem., 112: 195 (1981)) und über dot blot-Analyse seriell verdünnter Fraktionen, unter Verwendung von monoklonalen Anti-cFMS-Antikörpern (Oncogene Sciences, Inc.). Der dot-blot-Test wurde über die Aufreinigung hinweg verwendet, um Fraktionen zu identifizieren, die rhsM-CSF enthalten. Angereicherte Fraktionen wurden vereinigt, auf 0,8 M Ammoniumsulfat gebracht, auf pH 7,0 eingestellt und auf eine Phenyl-TSK-5-PW-HPLC-Säule (7,5 · 75 mm) geladen (BioRad). Die Säule wurde mit 1 ml/rnin mit einem abnehmenden Ammoniurnsulfatgradienten über 45 Minuten eluiert; Peak-Fraktionen wurden vereinigt und mit einem Rührzellkonzentrator unter Verwendung einer YM30-Membran (Amicon) 10-fach konzentriert. Das Retentat wurde mit einer FG3000XL-Grössenausschlusssäule (DU PONT, Wilmington, Delaware) unter Verwendung von Phosphat-gepuffertem · Kochsalz (PBS) mit 3 ml/min als mobiler Phase chromatographiert. Der gereinigte Rezeptor wurde vereinigt, wie oben auf 1 mg/rnl konzentriert und bei 4ºC gelagert. Dieses Verfahren ergab 650 ug an 200-fach gereinigtem rhsM-CSFR. Die Präparation war zu etwa 95% homogen, getestet über mit Coomassie Blue gefärbter SDS-PAGE.

Beispiel 6

Kristallisation eines Komplexes aus M-CSF/löslichem M-CSF-Rezeptor

Um die M-CSF/rhsM-CSFR-Komplexe zu kristallisieren, wurden Glasmikroskop-Objektträger, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Die verwendete M-CSF-Zusammensetzung wird mit einer gereinigten, löslichen Form des M-CSF-Rezeptors inkubiert, der bei einem Rest vor dem Transmembranbereich verkürzt war, um einen Komplex aus M-CSF- Rezeptor zu bilden. In bestimmten Fällen wird der rhsM-CSFR vor dem Schritt der Grössenausschlusschromatographie durch Inkubation mit N-Glycanase (Genzyme, Cambridge, Massachusetts) gemäß den Angaben des Herstellers deglycosyliert. Eine kleine Menge der M-CSF-RRezeptorlösung wird in jeder Vertiefung der Tüpfelplatte mit einer vergleichbaren Menge einer Tropfenlösung (wie etwa 20% (Vol.: Vol.) PEG 4000, 0,2 M MgCl&sub2;, 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5)) gemischt. Die Tüpfelplatte wird anschließend in einer klaren Sandwichbox aus Plastik angeordnet, enthaltend eine kleine Menge einer Fällungslösung (wie etwa 23 % PEG 4000, 0,2 M MgCl&sub2;, 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5)). Die Box wird sofort verschlossen und bei Raumtemperatur gelagert.
Nach einigen Tagen wird ein kristalliner M-CSF-Rezeptor-Komplex isoliert und in einer Lösung, enthaltend etwa 50 mM Tris-HCl, rückgelöst und bei Raumtemperatur stehengelassen. Der gereinigte M-CSF-Rezeptor-Komplex kristallisiert aus der Lösung zur Bildung von Kristallen für die Röntgenstrukturanalyse. Um die Lösung der Kristallstruktur solcher Komplexe zu erleichtern, können verkürzte, nicht-glycosylierte Formen des rhsM-CSFR (oben beschrieben) verwendet werden, die die M-CSF-Bindungsfähigkeit beibehalten, um die M- CSF-Rezeptor-Komplexkristalle zu erzeugen.

Beispiel 7

Es wurde gezeigt, dass die biologische Aktivität der in den Beispielen 2 und 3 verwendeten nicht-glycosylierten, verkürzten Sequenz derjenigen des aus menschlichem Urin aufgereinigten reifen Proteins identisch war (R. Halenbeck et al., Bio/Technology, 7: 710-715 (1989). Wie angemerkt, wiesen die resultierenden Kristalle ein orthorhombisches Kristallgitter in der P212121 Raumgruppe mit Zelldimensionen von a = 33,54, b = 65,26 und c = 159,63 Å auf. Die Intensitätsdaten wurden unter Verwendung von Bildplatten gesammelt, die auf einer Weissenberg-Kamera befestigt waren, modifiziert für die makromolekulare Kristallographie, in der Photon Factory in Tsukuba, Japan. Native Daten auf eine nominale Auflösung von 2,0 Å und Quecksilber und Platin derivatisierte Daten wurden unter Verwendung einer Strahlung von 1,0 Å gesammelt. Zur Sammlung der nativen Daten wurden zwei Kristallansätze verwendet (Rmerge (I) = 7,0%, unter Verwendung aller Messungen mit I > 0,0).
Die Schwermetallatomderivate der M-CSF-Kristalle wurden durch Einweichen der Kristalle in in der Vorratslösung gelösten Schwermetallverbindungen hergestellt. Isomorphe und anormale Patterson-Differenzkarten zeigten klar eine Stelle für Quecksilber und zwei Stellen für die Platinderivate. Anormale und isomorphe Phaseninformation wird in der anfänglichen Phasenverfeinerung mit dem PROTEIN Program Package verwendet. Die fertige Verdienstgrösse war 0,62 (8,0-3,0 Å, 6960 Reflexionen). Nach dem "solvent flatgening" (Lösungsmittelabgleich), B. C. Wang, Methods Enzymol, 115: 90 (1985), waren zwei Bündel von vier alpha-Helices, verbunden über eine etwa 2-fache Achse, in der Elektronendichtekarte zu sehen. Rotations- und Translationsparameter dieser nicht-kristallographischen Achse wurden über ein Dichtekorrelationsverfahren verfeinert (J. M. Cox, J. Mol. Biol. 28: 151 (1967)). Die Phasen wurden anschließend iterativ über Bildung molekularer Durchschnitte und solvent flattening verfeinert (G. Bricogne, Acta Cryst., 32 : 832 (1976)), unter Verwendung einer Hülle, die durch Anlegen von 5 Å-Kugeln um alle Atome in den vierhelikalen Bündeln berechnet wurde. Die Kettenveffolgung und der Modellaufbau erfolgten in der resultierenden Karte (unter Verwendung des FRODO-Programms; T. A. Jones, Methods Enzymol. 115: 157 (1985)) unter Beibehaltung der ursprünglichen MIR-Karte als Bezug.
Das Ausgangsteilmodell für die Verfeinerung enthielt nur ein Polyalaninrückgrat für die acht Helices, aus denen die zwei Bündel bestanden. Die Positionsverfeinerung unter Verwendung des XPLOR-Programms (A. T. Brunger, J. Mol. Biol. 203: 803 (1985)) ergab einen R-Faktor von 0,49 bis 3,0 Å. Die Phasenkombination mit den verfeinerten MIR- Phasen führte zu einer Karte ausreichender Qualität, um eine Verfolgung der zwei längeren Loops, die die vier helikalen Bündel durchquerten, und eines kurzen Loops, der zwei der Helices verband, zu gestatten. Die zwei starken Dichte-Peaks, einer an der Spitze der ersten Helix, und der zweite direkt auf der molekularen 2-fachen Achse, wurden den disulfidverbrücken Cysteinen zugeschrieben. Die Anzahl der Reste zwischen diesen zwei Peaks identifizierte einmalig die Position dieser Cysteine in der Sequenz und in Folge dessen auch die Sequenz der dazwischenliegenden Reste. Diese anfängliche Registrierung wurde durch die Anwesenheit einer Anzahl von Bereichen starker Dichte entsprechend den aromatischen Seitenketten in der Sequenz bestätigt. Die Teilmodell-Phasenkombination unter Verwendung der hinzugefügten Loops und derjenigen Seitenketten, die sichtbar waren, gestattete eine Registrierung der verbleibenden Reste, wodurch die Gesamttopologie des Moleküls ermittelt wurde. Die Anwesenheit von sieben Disulfidbrücken in dem Dimer diente als wesentliche "Ankerpunkte", um die Richtigkeit der Verfolgung bzw. des Tracings zu bestätigen.
Wie in Fig. 2 gezeigt, ist die Gesamttopologie dieser Form von M-CSF diejenige eines antiparallelen Bündels aus vier alpha-Helices, worin die Helices auf-auf-ab-ab verlaufen, anders als die herkömmlich beobachtete auf-ab-auf-ab-Verbindung der meisten Bündel aus vier Helices. Eine lange Querverbindung verknüpf Helix A mit Helix B und eine vergleichbare Verbindung findet sich zwischen den Helices C und D.
Ein bemerkenswerter Unterschied zu anderen Cytokinen und anderen Bündelstrukturen aus vier Helices besteht darin, dass das verkürzte M-CSFα ein disulfidverbrücktes Dimer bildet, in dem die Bündel Ende-an-Ende verknüpft sind, wodurch sie eine extrem flache, elongierte Struktur bilden (ungefähre Dimensionen 85 · 35 · 25 Å), wie in Fig. 3 und 4A und 4B gezeigt. In jedem Monomer gibt es drei intramolekulare Disulfidbindungen (Cys7- Cys90, Cys48-Cys139, Cys102-Cys146), die alle am distalen Ende des Moleküls liegen. Eine Interkettendisulfldbindung (Cys31-Cys31) befindet sich an der Dimergrenzfläche, wobei die nicht-kristallographische 2-fache Symmetrieachse durch dieselbe verläuft, wie in den Fig. 3 und 4A und 4B gezeigt. Mutationsexperimente weisen darauf hin, dass alle Cysteinreste in dieser Form des M-CSF für die volle biologische Aktivität notwendig sein könnten. Die hier beschriebene Struktur legt nahe, dass ihre Rolle eher strukturellen Charakter hat als mit der Rezeptorerkennung verknüpft ist.
Anhang 1 gibt die dreidimensionale Struktur des verkürzten rekombinanten M-CSFα-Dimeren wieder, wie es über die Position der α-Kohlenstoffatome der in der Sequenz befindlichen Aminosäurereste identifiziert wurde. Die fünf carboxyterminalen Aminosäuren jedes Polypeptids des Dimeren wurden nicht umfasst. Der Fachmann wird erkennen, dass die Information in Anhang 1 in dem Format bereitgestellt wird, das von der Brookhaven Protein Datenbank verwendet wird.
Wie gezeigt, weist das Molekül eine unübliche Topologie auf, die wichtige Bereiche des M- CSF bezüglich der M-CSF-Rezeptorbindung identifiziert. Spezifische Reste in den Helices A, B und D scheinen in die Spezifität der Wechselwirkung involviert zu sein. Eine Veränderung der lösungsmittelzugänglichen Reste in diesen Bereichen über ortsspezifische Mutagenese (site directed mutagenesis), um die Seitenkettenwechselwirkungen mit dem Rezeptor zu erhöhen oder zu verringern, kann geeignet sein, um M-CSF-Agonisten oder -Antagonisten zu erzeugen. Beispielsweise kann der Austausch eines oder mehrerer Histidine gegen Aminosäuren älhnlicher Grösse, die keine Wasserstoffdonoren sind, ein M-CSF mit geänderter Rezeptor-Bindungsfähigkeit erzeugen.

Beispiel 8

Herstellung von M-CSF-Heterodimeren

Aufreinigung von M-CSF-Monomeren:

E. coli, welche den pL-Mf-CSF-Vektor für NΔ3CΔ158 M-CSFα, beschrieben in US-A- 4,929,700, oder NΔ3CΔ221 M-CSFß C157S, C159S tragen (Kawasaki et al., in Colony- Stimulating Factors, Herausgeber T. Dexter, J. Garland und N. Testa (1990)), wurden in 1 l eines Miminalsalzmediums, enthaltend Glucose und das geeignete Antibiotikum, gezogen. Die Expression von M-CSF wurde durch Verschieben der Temperatur auf 39ºC für 4 h induziert, nach Zugabe von Casaminosäuren auf 2%. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und durch Beschallung in 50 mM Tris (pH 8,5), 10 mM EDTA lysiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren gewonnen, mit 30% Saccharose, enthaltend 10 mM EDTA, gewaschen und ein Teil der Paste aus Bruchkörper in 8 M Harnstoff unter reduzierenden Bedingungen solubilisiert. Nach Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC wurde der solubilisierte M-CSF durch Zentrifugieren und Filtrieren geklärt und anschließend auf eine Bio-Gel TSK-DEAE-5-PW-Säule (7,5 · 75 mm) (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornien), equilibriert in 8 M Harnstoff in 10 mM Tris (pH 8,5), 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA, geladen. Der monomere M-CSF wurde mit einem 45-minütigem 0-0,6 M NaCl- Gradienten eluiert. Die M-CSF-Peakfraktionen wurden vereinigt und mit einem Centricon 10 Mikrokonzentrator (Amicon) auf 10 mg/ml konzentriert.

Bildung und Analyse der aktiven M-CSF-Heterodimere

Die M-CSF-Homodimere wurden durch Verdünnen auf eine Proteinkonzentration von 0,5 mg/ml in vorgekühltem 50 mM Tris (pH 8,5), 5 mM EDTA, 2 mM reduziertem Glutathion und 1 mM oxidiertem Glutathion und anschließendes Inkubieren bei 4ºC rückgefaltet. Das Heterodimer wurde durch Verdünnen von 158-221F-Monomerpools auf 1 mg/ml in demselben Puffer rückgefaltet. Um die Rückfaltung zu überwachen, wurde eine Grössenausschluss-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (SE-HPLC)-Analyse durchgeführt durch sofortiges Injizieren von Reakaionsproben auf eine G3000SW-Ultropack -Grössenausschlusssäule (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, New Jersey; 7,5 · 600 mm), equilibriert in PBS (pH 6,8).
Fraktionierte Produkte wurden auf einer reduzierenden SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie gefärbt, gemäß dem Verfahren von Laemmli, Nature (Kanada), 227: 680-685 (1970). Die biologische Aktivität wurde unter Verwendung des M-CSF-abhängigen NFS-60-Bioassays (siehe Beispiel 10 unten) ermittelt. Neutralisierungsexperimente mit Antikörpern wurden ausgeführt durch Vorinkubieren von etwa 5000 Einheiten an M-CSF-Dimer mit verschiedenen Verdünnungen des neutralisierenden M-CSF 5H410Mab (gezogen gegen rückgefaltetes E. coli CΔ150 M-CSFα-Dimer) vor dem Bioassay (Halenbeck et al., Bio/Technology, 7 : 710 (1989)).
Das heterodimere M-CSF-Produkt wurde so designed, dass es aus einer Kette des Kurzklons (aus den Aminosäuren 4 bis 158) und einer Kette des Langklons (aus den Aminosäuren 4 bis 221) bestand. Die Kette des Langklons (221F) enthielt ausserdem Substitutionen von Serin für die zwei nicht wesentlichen Cysteine (in Position 157 und 159), um die Möglichkeit der Bildung Oligomerer höherer Ordnung zu minimieren.
Die solubilisierten Bruchkörper der M-CSF 158 und 221F wurden separat mittels DEAE- HPLC in 8 M Harnstoff chromatographiert. Nur ein Proteinhauptpeak eluierte in jedem Fall, und die Peakfraktionen wurden vereinigt, auf Basis einer Analyse auf Reinheit über nicht reduzierende SDS-PAGE und Coomassiefärbung (Daten nicht gezeigt). Das resultierende Monomer war in jedem Fall über 90% rein. Die Monomere wurden separat auf 10 mg/ml konzentriert, in Rückfaltpuffer verdünnt und bei 4ºC rückgefaltet.
Um die Dimerisierungsraten des Kurz- und des Langklon M-CSFs zu vergleichen, wurden 20 ul jeder Rückfaltungsreaktion in eine SE-HPLC-Säule nach 0, 2, 18 und 72 Stunden injiziert. Die Menge an gebildeten M-CSF-Dimeren wurde aus der Peakfläche beim für das Dimer erwarteten Molekulargewicht ermittelt. In beiden Rückfaltungsreaktionen war der M- CSF zum Zeitpunkt t = 0 hauptsächlich mit dem Monomer equilibriert und wurde zu etwa 40% Dimer nach 2 Stunden und zu beinahe 75% Dimer nach 18 Stunden. Die Ähnlichkeit des Verhältnisses von Dimer zu Monomer zwischen dem rückgefalteten 158 und 221F legt stark nahe, dass die Geschwindigkeit der Dimerbildung für den Lang- und Kurzklon M-CSF gleich ist. Somit werden dann, wenn gleiche Molzahlen von 158 und 221F in einer Rückfaltungsreaktion vorhanden sind, die relativen Endverhältnisse von 158-Homodimer zu 221F-Homodimer zu 158/221F-Heterodimer auf 1 : 1 : 2 vorausgesagt (vergleichbare Verteilungen sind in vivo für die Isozyme der Lactatdehydrogenase beobachtet worden.).

Biologische Aktivität der rückgefalteten Homodimere und Heterodimere

Die biologische Aktivität der oben beschriebenen rückgefalteten Homodimere und Heterodimere wurde unter Verwendung des M-CSF-abhängigen NFS-60 in vitro Bioassay (siehe Beispiel 10 unten) untersucht. Die Fig. 5A bis 5C zeigen die Ergebnisse dieser Untersuchungen. Die SE-HPLC- und die biologischen Aktivitätsprofile, analysiert nach 72 Stunden des Rückfaltens, zeigen, dass das Heterodimer (Fig. 5C) eine den zwei Homodimeren (Fig. 5A und Fig. 5B) sehr ähnliche Aktivität zeigt. Unter der Annahme, dass die Abtrennung des Heterodimers von den Homodimeren nahezu vollständig war, kann geschlossen werden, dass das Heterodimer in vitro voll biologisch aktiv ist.
Um zu verifizieren, dass das von diesen Säulen an der vorhergesagten Heterodimerposition (zwischen den zwei Homodimeren) eluierende Protein tatsächlich aus gleichen Molen der Kurzklon- und Langklon-Monomere bestand, wurde eine Analyse der präparativen Aufreinigung des 158/221F Heterodimeren durchgeführt. Eine Phenyl-HPLC wurde wie oben beschrieben durchgeführt und zeigte, dass sie das Heterodimer vollständig von den 158- 221F-Homidimeren abtrennte, wie in Fig. 6A zu sehen.

Präparative Aufreinigung des M-CSF-Heterodimeren

Das rückgefaltete M-CSF wurde mit 1 N HCl auf pH 7,0 eingestellt und Ammoniumsulfat auf 1, 2 M zugegeben. Das Protein wurde auf eine in 1, 2 M Ammoniumsulfat, 100 mM Phosphat (ph 7,0) equilibrierte Bio-Gel TSK-Phenyl-5-PW-Säule (7,5 · 75 mm) (BioRad, Richmond, Kalifornien) geladen. Das M-CSF wurde mit einem absteigenden Ammoniumsulfatgradienten von 40% auf 80% Puffer B (10 mM Phosphat, pH 7,0) in 24 Minuten eluiert.
Reduzierende und nicht reduzierende SDS-PAGE (Fig. 6b und c) zeigten, dass interne Kontrollen (die 158 und 221F-Dimere) auf etwa 95% Homogenität über diese Säule gereinigt wurden; und jedes bestand aus der einzelnen erwarteten Monomerbande. Die Gelanalyse zeigte außerdem, dass das Heterodimer auf etwa 35% gereinigt wurde und dass es auch equivalenten Mengen von 1.58- und 221F-Monomeren bestand. Die Wiedergewinnung/Ausbeute des aufgereinigten 158/221F-Heterodimeren aus der Bruchkörperpaste zum Endprodukt war größer als 15%.
Die Bioaktivität der Dimeren M-CSF-Spezies wurde bestimmt und bestätigt beim Vergleich mit dem A&sub2;&sub8;&sub0;-Profil in Fig. 6A das gefundene Ergebnis, dass das Heterodimer voll aktiv ist. Die spezifische Aktivität des 158/221F-Heterodimeren, berechnet unter Verwendung der Peakfraktion, betrug 8,0 · 10&sup7; Einheiten/mg, verglichen mit 9,0 · 10&sup7; bzw. 6,8 · 10&sup7; Einheit/mg für die 158- bzw. 221F-Homodimere.
Die biologische Aktivität aller drei Dimerspezies wurde in demselben Ausmaß in Neutralisierungsexperimenten serieller Verdünnung unter Verwendung des 5H410 M-CSF Mab in dem NSF-60-Bioassay neutralisiert. Dieser Antikörper neutralisiert außerdem natürlich rückgefaltetes, in chinesischen Hamsterovarzellen (CHO) exprimiertes M-CSF auf ähnliche Weise. Dieses Ergebnis legt weiterhin nahe, dass die rückgefaltete Konformation des neuen M-CSF-Heterodimeren im Wesentlichen der nativen ähnelt, zumindest im Hinblick auf den Bereich innerhalb der ersten 150 Aminosäuren, der für die in vitro Aktivität verantwortlich ist.

Beispiel 9

Auswahl der Aminosäuresubstitutionen in M-CSF auf Basis der kristallographischen Daten

Die röntgenkristallographischen Daten, die oben beschrieben wurden, stellten ausreichend Strukturinformation bezüglich des M-CSF bereit, um in der Lage zu sein, einen begrenzten Untersatz der Aminosäuren im Protein zu identifizieren, die wahrscheinlich für die M-CFS- Rezeptorbindung und die biologische Aktivität entscheidend sind und die somit wahrscheinliche Kandidaten für die Mutagenese mit dem Endziel der Bereitstellung von M-CSF- Muteinen mit geänderter biologischer Aktivität (d. h. Agonisten oder Antagonisten) darstellen. Auf Basis dieser Information wurden zahlreiche Kriterien eingesetzt, um eine Liste möglicher Zielaminosäuren für die Substitution zu erzeugen.
Das erste Kriterium war die Lösungsmittelexposition oder Lösungsmittelzugänglichkeit, die sich auf Aminosäurereste an der Oberfläche des Proteins bezieht. Reste mit einer lösungsmittelzugänglichen Oberfläche von mehr als etwa 0,25 und vorzugsweise mehr als etwa 0,4 sind bevorzugt, auf Basis einer Normalisierung der Oberfläche der zugänglichen Aminosäure, wenn diese sich im Tripeptid gly-x-gly befindet (W. Kabsch et al., Biopolymers 22: 2577 (1983)). Es wurden Reste gewählt, die nicht mit anderen Teilen des Proteins wie der Dimergrenzfläche interagieren, um die relative Orientierung der Monomere beizubehalten und eine Störung des Proteinfaltprozesses zu vermeiden. Ein weiteres Kriterium, das in bestimmten Fällen beim Auswählen von Aminosäuresubstitutionskandidaten angewandt wurde, ist die Beziehung der Reste zu entsprechenden Resten im M-CSF aus Mäusen. Ein anderes wesentliches Selektionskriterium war, dass die Substitutionen nicht konservativ sein sollten, um zu versuchen, mögliche Wasserstoffbrückenbindungen oder hydrophobe Wechselwirkungen mit Resten des M-CSF-Rezeptors zu unterbrechen.
Tabelle 1 listet exemplarisch Aminosäurereste und exemplarische Substitutionen auf. Unter Verwendung der Kriterien zur Wahl von Substitutionskandidaten, wie oben angegeben, kann der Fachmann leicht andere mögliche Substitutionskandidaten bestimmen. Tabelle I Substitutionskandidaten
Es ist nicht zu erwarten, dass jede aufgeführte mögliche Substitution zur Erzeugung eines M-CSF-Agonisten oder -Antagonisten führt (siehe Beispiel 12 unten). Sie stellen eher eine nicht abschliessende Liste von Kandidaten dar, die wahrscheinlich zur Produktion von Antagonisten oder Agonisten führen, und zwar auf Basis der oben angeführten Selektionskriterien. Es sollte angemerkt werden, dass sogar dann, wenn eine Variante nicht als Agonist oder Antagonist wirkt, wenn sie mit dem nativen M-CSF verglichen wird, die Variante noch immer für herkömmliche Anwendungen des Liganden nützlich ist (falls sie dieselbe Aktivität wie der Ligand beibehält) oder beispielsweise als diagnostisches Reagens.

Beispiel 10

Herstellung von H9A, H15A M-CSF-Muteinen

Eine Anzahl von M-CSF-Muteinen mit geänderten lösungsmittelzugänglichen Resten aus den Bereichen des reifen N-Terminus des M-CSF und den Helices A, C und D wurden unter Anwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren konstruiert. Beispielsweise wurden zwei Histidine im Bereich des N-terminus/A Helix durch ausschließliche Mutagenese einer trunkierten Form von M-CSFα (codiert von pLCSF158A) gegen Alanin ausgetauscht. Die Verwicklung einer der drei M-CSF-Histidinreste in die M-CSF-Rezeptor- Wechselwirkung wurde von unserer Beobachtung impliziert, dass die Diethylpyrocarbonat (DEPC)-Modifikation der Histidine im M-CSF in einem 1 : 100 DEPC: Histidin-Verhältnis (wie in Meth. in Enzymol. 47 : 431(1977)) beschrieben, die Bioaktivität signifikant verringerte.
Die Plasmid-DNS pLCSF158A wurde aus dem E. coli-Stamm HW22 hergestellt, der das Plasmid pLCSF158A trug (US-Patent Nr. 4,929,700, Bsp. 6, "E. coli strain HW22 transformed with pJN653 containing the asps9SCSF/NA3CΔ158 gene"). Der Stamm wurde in 350 ml R2-Medium (2X Luria-Brühe enthaltend 1% Natriumchlorid und keine Glucose, J. Bact., 74: 461 (1957)), enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, bei 30ºC mit Schütteln über Nacht gezogen. Die Plasmid-DNS wurde aus den Zellen unter Verwendung einer Qiagen-Tip 100- Säule gemäß den Angaben des Herstellers hergestellt.
20 ug der pLCSF158A-DNS wurden mit 66 Einheiten HindIII und 66 Einheiten StuI bei 37 ºC für 3 h 20 min. in 200 Mikroliter 1x New England Biolabs NEB-Puffer 2 (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) angedaut. Die DNS wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert, anschließend mit Ethanol gefällt. Die DNS wurde mit einer Einheit intestinaler alkalischer Phosphatase (Kalb) in 100 ul 1 · Dephosphorylierungspuffer, bereitgestellt von Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana) bei 37ºC für 30 min. behandelt. Eine weitere Einheit der intestinalen alkalischen Phosphatase (Kalb) wurde der Reaktion zugesetzt und die Inkubation bei 50ºC für eine Stunde fortgesetzt.
Die resultierende DNS wurde anschließend auf einem 1%-igen FMC Bioproducts (Rockland, Main) Sea KEM® GTG® Agarosegel laufen gelassen. Das pLCSF158A-Fragment mit 5,7 kb wurde aus dem Gel ausgeschnitten und auf Qiagen (Chatsworth, Kalifornien) Qiax- Kügelchen gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt.
Anschließend wurde eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) durchgeführt und ein PCR-Produkt erzeugt, dass eine mutierte M -CSF-Sequenz enthielt, in der die Histidine 9 und 15 (Zählung vom reifen N-Terminus) zu Alanin geändert waren (erzeugend ein H9A; H15A- PCR-Fragment). Der 5'-Anteil des M-CSF-Gens wurde vom Plasmid pLCSF158A in einer PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer LF73 und LF74 amplifiziert. Details of PCR sind von K. Mullis et al., US-A-4,683,202; H. Ehrlich, US-A-4,582,788; Saiki et al., US- A-4,683,195; K. B. Mullis, Cold Spring Harbor xSymp. Quant. Biol. 51 : 263-273 (1986); Saiki et al., Bio/Technology 3: 1008-10012 (1985) und K. B. Mullis et al., Meth. Enzymol 155: 335-350 (1987) bereitgestellt, die alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden. Die Sequenzen dieser Primer sind:
Das erwartete PCR-Produkt war so maßgeschneidert, dass es 337 Basenpaare der pLCSF158A-Sequenz mit den HiqdIll und StuI-Stellen an jedem Ende des Produkts zum Klonieren sowie die Histidin-Codons für His 9 und His 15, CAC, die zu den Alanin-Codons GCC mutiert waren, umfasste.
Dieses Produkt wurde in vier separaten PCR-Reaktionen amplifiziert, in die jeweils 100 ng pLCSF158A-DNS, 50 umol LF73, 50 umol LF74, 37,5 uM dNTPs, 5% Glycerin, 1 · Perkin Eimer Cetus-PCR-Puffer und 2,5 Einheiten Perkin Eimer Cetus AmpliTaq®-DNS- Polymerase in einem 100 ul Volumen enthielt. Die Amplifikation wurde in einem Perkin Eimer Cetus-DNS-Thermocycler durchgeführt. Vor Zugabe der AmpliTaq® wurden die Reaktionen auf 95ºC gebracht. Die Amplifikation erfolgte für 25 Zyklen mit einem Aufwärmen auf eine Denaturierungstemperatur von 95ºC in 1 sec, ein Denaturieren bei 95ºC für 1 min. einem Abkühlen auf die Annealingtemperatur von 68ºC in 1 sec, einem Annealing bei 68ºC für 1 min. einem Aufwärmen auf eine Extensionstemperatur von 72ºC in 30 sec, einem Verlängern bei 72ºC für 1 min. 30 sec. Die letztendliche Extension erfolgte bei 72ºC für 10 min.
5 ul jeder Reaktion wurden auf einem 3%igen Agarosegel laufen gelassen (1,5% FMC Bioproducts SeaKem® GTG® Agarose, 1,5% FMC Bioproduct NuSeive® GTG® Agarose in Tris-Borat-Puffer) (FMC Bioproducts, Rockland, Maine). Die Gele wurden anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt. Für jede Reaktion war eine Hauptbande bei etwa 337 bp sichtbar.
Die vier Reaktionen wurden vereinigt, mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt, resuspendiert und mit 250 Einheiten StuI in einem Endvolumen von 500 ul 1 · NEB-Puffer 2 bei 37ºC für 2 h angedaut, 500 Einheiten HindIII wurden der Reaktion zugesetzt, das Volumen auf 1 ml in 1 · NEB-Puffer 2 erhöht und das Andauen bei 37ºC für weitere 2,5 h fortgesetzt. Die DNS wurde auf einem 3% Agarosegel der Elektrophorese unterworfen. Das angedaute Produkt von 300 bp wurde aus dem Gel ausgeschnitten und auf Quiagen Qiaex-Kügelchen gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt.
Etwa 68 ng des mit HindII/StuI angedauten PCR-Produkts wurden anschießend an etwa 28 ng des 5,7 kb HindIII/StuI-angedauten pLCSF158A-DNS-Vektors in einem Insert/Vektor- Verhältnis von etwa 5 : 1 ligiert. Die Ligation erfolgte mit einer Einheit der Boehringer Mannheim T4-DNS-Ligase in 1 · Ligationspuffer, bereitgestellt vom Hersteller, in einem 20 ul Volumen bei 16ºC äber Nacht. Als Kontrolle wurden 28 ng des 5,7 kb Hindllh/StuLangedauten pLCSF158A-DNS-Vektors selbst unter denselben Bedingungen ohne vorhandenes Insert ligiert.
Die Hälfte jeder Ligationsmischung wurde zur Transformation kompetenter E. coli-Zellen DG116 (ATTC# 53606) unter Verwendung eines dem Calciumchloridverfahren ähnlichen Protokolls, beschrieben in Molecular Cloning a Laboratory Manual, Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Die transformierten Zellen ließ man bei 30ºC ohne Selektion für 90 min exprimieren, platierte auf R2-4 Platten (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 2 Tropfen Antifoam A, 4 ml 50% Glucose und 15 g Agar in einem Liter), enthaltend 50 ug/ml Amplicillin. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 72 h lang inkubiert. Ein Viertel dieser Transformation wurde ausplatiert. Für die das Insert enthaltende Ligation erschienen 66 Amicillin-resistente Kolonien auf den Platten. Für die Ligation ohne Insert erschienen keine Kolonien.
Eine dieser Kolonien, die als Stamm TAF172-2 bezeichnet wurde, wurde ausgepickt und in 350 ml R2-Brühe mit 50 ug/ml Amplicillin bei 30ºC unter Schütteln über Nacht kultiviert. Ein eingefrorener Stamm in 40% Glycerin wurde aus dieser Kultur hergestellt und bei -70 ºC gelagert. Die DNS wurde aus der Kultur unter Verwendung von Qiagen-tip 100-Säulen wie oben beschrieben isoliert.
Die aufgereinigte DNS, pTAF172-2, wurde unter Verwendung des Didesoxyverfahrens sequenziert und es wurde gezeigt, dass sie die Sequenz des pLCSF158A, kodierend für M- CSF NΔ3CΔ158 enthielt, wobei His 9 und His 15 zur Kodierung von Ala mutiert waren. Das von pTAF172-2 kodierte M-CSF-Mutein MΔCΔ158 H9A, H15A wurde exprimiert, gereinigt, zur Bildung des dimeren Proteins gefaltet und im Wesentlichen wie in der US-A- 4,929,700, Beispiel 5 beschriebenq getestet, unter Verwendung von 8M Harnstoff als Denaturierungsmittel und in dem DEAE-Aufreinigungsschritt.
Die N-terminale Sequenz des aufgereinigten Muteins wurde über 20 Zyklen unter Anwendung eines standardautomatisierten Edman-Abbauverfahrens ermittelt und es wurde gezeigt, dass sie derjenigen des parentalen NΔ3CΔ158 M-CSFα-Referenzproteins identisch ist, mit der Ausnahme, dass His 9 und His 15 zu Ala geändert worden waren. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung der A280 und eines Extinktionskoefiizienten von 0,68 ermittelt.
Die aufgereinigten Muteindimere wurden einem Bioassay unter Verwendung von NFS-60- Zellen unterworfen, die eine M-CSF-abhängige Zelllinie darstellen, die in Anwesenheit von aktivem M-CSF Kolonien bildet. Standards und aufgereinigte Muteinproben wurde seriell 1 : 2 in RPMI-Medium (10% fetales Kalbsserum) in einen 50 ul Volumen in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verdünnt. 50 ul NFS-60-Zellen (ATCC Nr. CRL1838), gehalten in 4000 U/ml M-CSF, zweimal gewaschen und auf eine Konzentration von 1 · 105 Zelleniml verdünnt, wurden jeder Probenvertiefung zugesetzt. Die Platten wurden bei 37 ºC, 5% CO&sub2; für 44 h inkubiert. 5 mg/ml MTT-Farbstoff wurden jeder Probe zugesetzt und die Inkubation für 4 h fortgesetzt. 20% SDS wurde jeder Probe zugesetzt. Die Platten wurden in Folie eingepackt: und über Nacht stehen gelassen. Die Absorbtion jeder Probe wurde bei 570 nm abgelesen und mit einem Standard von bekannter M-CSF-Konzentration verglichen. Das H9A, H15A-Mutein zeigte eine spezifische Aktivität von 7,6 · 10³ U/mg, verglichen mit 6,9 · 10&sup7; U/mg für die parentale M-CSF NΔ3CΔ158-Referenz im selben Test. Dies stellt eine beinahe 10.000-fache Verringerung der biologischen Aktivität für das Mutein dar. Dieselbe M-CSF-Muteinpräparation zeigte eine wesentlich verringerte M-CSF- Rezeptorbindungsfähigkeit, unter Verwendung des NSF-60-Rezeptorkompetitionstest, beschrieben in diesem Beispiel. Da das H9A, HISA M-CSF-Mutein sich ansonsten nicht signifikant vom parentalen M-CSFα unterschied, einschließlich der Kristallisierbarkeit und der Raumgruppe (siehe Beispiel 12), nehmen wir an, dass die Abnahme der biologischen ,Aktivität nicht auf der Gesamtstrukturdeformation beruht, sondern eine Änderung wesentlicher M-CSF-Rezeptor-Kontakte widerspiegelt.
Unter Anwendung der im Wesentlichen gleichen Vorgehensweise wurden zwei M-CSF- Muteine hergestellt, die einzeln in Kontakt gebracht einzeln die Histidine der Reste 9 und 15 ersetzend (beispielsweise H9A und HISA). Das H9A-Konstrukt verwendete LF80:
sowie LF73 (beschrieben in diesem Beispiel) al PCR-Primer. Das HISA-Konstrukt verwendete LF81:
und LF73 (auch beschrieben in diesem Beispiel) als PCR-Primer. Biologische Tests der gereinigten Muteine unmittelbar nach dem Rückfaltungsschritt, wie er oben beschrieben wurde, zeigten ungefähr die folgenden spezifischen biologischen Aktivitäten: 4 · 10&sup6; U/mg für H9A und weniger als 3 · 10³ U/ml für HISA, in einem Test, in dem das parentale M- CSF-Konstrukt 8 · 10&sup7; U/mg aufwies. Diese Information, in Kombination mit der oben beschriebenen, legte nahe, dass HISA wie auch möglicherweise H9A Kontakte repräsentieren, die für die M-CSF-Rezeptorbindung wesentlich sind. In der Nähe befindliche, lösungsmittelzugängliche Reste wie Y6 und S13 (siehe auch Tabelle 1) können ebenfalls M-CSF- Rezeptorkontaktreste darstellen. Nichtproteinhaltige Imitate der Seitenketten von H9, HIS und der in der Nähe befindlichen, lösungsmittelzugänglichen Seitenketten können M-CSF- Agonisten oder -Antagonisten darstellen. Solche Reste sollten in M-CSF-Muteinkonstrukten unverändert belassen werden, die designed werden, um die volle M-CSF-Rezeptorbindung zu erhalten, jedoch M-CSF-Antagonist-Eigenschaften haben sollen, da ihnen eine signifikante M-CSF-Bioaktivität fehlt. Homodimere von Muteinen, die die vollständige Rezeptorbindungsfähigkeit beibehalten haben und eine wesentlich verringerte Bioaktivität zeigen, sollten M-CSF-Antagonisten darstellen. M-CSF-Muteine, deren M-CSF-Bioaktivität wie auch die
Rezeptorbindungsfähigkeii wesentlich verringert ist (wie H15A), können im Allgemeinen in M-CSF-Immunoassay-Anwendungen nützlich sein und können geeignete therapeutische Mittel für Patienten mit Autoantikörpern gegen M-CSF darstellen.

Beispiel 11

Herstellung von Q20A, V78K M-CSF-Muteinen

Im Wesentlichen die gleiche Vorgehensweise anwendend wie in Beispiel 10 beschrieben, wurde eine Doppelmutante von M-CSF (Q20A, V78K) konstruiert, um die Bedeutung der lösungsmittelzugänglichen Reste im Zentralteil der Helices A und C zu testen. Die folgenden PCR-Primer wurden eingesetzt.
Das erhaltene Mutein wurde exprimiert, rückgefaltet, gereinigt und wie in Beispiel 8 beschrieben getestet. Die spezifische biologische Aktivität betrug 1,4 · 10&sup7; U/mg, etwa 8-10- fach geringer als diejenige des parentalen M-CSFα-Referenzstandards. Die Rezeptorbindungsaktivität dieses Muteins war ebenfalls verringert.
Dieses Ergebnis stützt wiederum die Vorhersage der kristallographischen Untersuchungen des verkürzten M-CSFα, aus der geschlossen wurde, dass wichtige M-CSF-Rezeptorkontaktreste unter den lösungsmittelzugänglichen Resten in den Helices A und/ oder C und/ oder D vorhanden sind. Bestimmte dieser Mutationen werden, was wir gezeigt haben, eine geringere biologische Aktivität und eine geringere M-CSF-Rezeoptorbindungsfähigkeit aufweisen. Einige können eine geringere biologische Aktivität ohne eine Verringerung der Rezeptorbindungsfähigkeit haben. Einige können eine gesteigerte biologische Aktivität und Rezeptorbindungsfähigkeit aufweisen; und einige können keine Auswirkungen auf beides zeigen.
Zwei Beispiele für letzteres sind Q17A, R21A (hergestellt unter Verwendung der PCR-Primer LF72:
und LF73 (beschrieben in Beispiel 9) sowie E115A, N119A (hergestellt unter Verwendung von LF75:
und LF79:
Beide Konstrukte veränderten die Seitenketteneigenschaften der lösungsmittelzugänglichen Aminosäuren in den interessierenden Gebieten, beeinflußten jedoch die spezifische biologische Aktivität, verglichen mit dem parentalen Referenzmolekül, nicht. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Reste Q17, R21, E115 und N119 in Muteinen nicht geändert werden müssen, die M-CSF-Agonistwirkung oder -Antagonistwirkung haben sollen. Um die Wahrscheinlichkeit der Antikörperbildung gegen mögliche verabreichte proteinhaltige Drogen auf M-CSF-Basis zu minimieren, ist es tatsächlich wünschenswert, die lösungsmittelzugänglichen parentalen M-CSF-Reste wann immer möglich beizubehalten (um das native Molekül nachzuahmen).
Die beibehaltene Aktivität der Muteine, umfassend die Änderungen der Reste Q17, R21, E115 und N119, schließt große Effekte auf die Aktivität, die von in der Nähe befindlichen Resten (wie HIS) beigetragen werden, nicht aus. Tatsächlich werden die Bereiche, die wir geändert haben, von der Kristallstruktur als wichtig für die Rezeptorbindung und/oder die Signalgebung vorhergesagt. Antagonistische M-CSF-Muteine können die Anwendung von Änderungen in mehreren Resten pro Mutein erfordern oder die Verwendung von heterodimeren Molekülen, die eine oder mehrere Mutationen in jeder Polypeptidkette enthalten, da für die Rezeptorsignaltransmission wesentliche M-CSF-Reste angenommenermaßen aus diskontinuierlichen Bereichen des M-CSF zusammengesetzt sind.

Beispiel 12

Bildung von M-CSF-Heterodimeren mit verringerter Rezeptorbindungsfähigkeit und/oder verringerter spezifischer biologischer Aktivität

Der M-CSF kann in vitro gefaltet werden, um vollständig aktive Heterodimere zu erzeugen, wie in Beispiel 8 gezeigt. Durch Herstellung von Heterodimeren des M-CSF, die M-CSF- Muteine mit geänderter M-CSF-Signalfähigkeit enthalten, sollte es möglich sein, Antagonisten des M-CSF zu erzeugen, die für die Behandlung von Patienten mit M-CSF vermittelten Erkrankungen nützlich sind. Um ein Heterodimer zu erzeugen, dass eine Untereinheit von M-CSFα NΔ3CΔ158, H9A/H15A und eine Untereinheit von M-CSFß NΔ3CΔ221, C157S/C159S enthielt, wurde jedes Mutein in E. coli exprimiert und separat über DEAE- Sepharose unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen wie in Beispiel 8 beschrieben aufgereinigt. Die zwei Mutein-Untereinheiten wurden vor dem Rückfalten untereinander vermischt, um eine Lösung zu erhalten, die ein molares Endverhältnis der Muteine von 1 : 1 enthielt, anschließend wurde die Lösung auf 0,2 mg/ml mit Rückfaltungspuffer wie in Beispiel 8 beschrieben verdünnt. Nach dem Rückfalten wurden die heterodimeren Moleküle von den Homodimeren über zwei aufeinanderfolgende Durchläufe über eine Phenyl-TSK-5-PW HPLC-Säule, wie in Beispiel 8 beschrieben, abgetrennt. Bei Untersuchung der gereinigten Heterodimerpräparation über nichtreduzierende SDS-PAGE oder Größenausschluß-HPLC unter Verwendung einer BioSil SEC250-Säule (BioRad) wurden keine Kontaminationen detektiert.
Das gereinigte Heterodimer wurde dem in Beispiel 8 beschriebenen Bioassay auf Basis von NFS60-Zellen unterworfen. Die berechnete spezifische Aktivität betrug 2,9 · 10&sup6; U/mg, was einer 35-fachen Verringerung im Vergleich zur Aktivität des parentalen M-CSF- Heterodimeren, beschrieben in Beispiel 10, entsprach. Die relative Bindungsaffinität zum M-CSF-Rezeptor auf der Zelloberfläche wurde durch Radioligandverdrängung gemessen, wobei die Verdrängung von ¹²&sup5;I-M-CSF von einem M-CSF-Rezeptor durch ein M-CSF- Mutein unter Anwendung; im Stand der Technik bekannter Verfahren gemessen wurde. Kurz gesagt, wurden das folgende in ein Endvolumen von 100 ul in jede Vertiefung einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen eingegeben: etwa 80.000 cpm eines gereinigten, rekombinanten human M-CSF, markiert mit ¹²&sup5;I (unter Verwendung von "Iodobeads" wie vom Hersteller Pierse, Rockford, IL beschrieben), 300.000 NFS-60-Zellen, die gewaschen und anschließend für 18 h in einem Wachstumsmedium ohne den normalen Erhaltungslevel von M-CSF gewachsen waren, plus nicht markierter M-CSF, der seriell im selben Medium verdünnt worden war. Die Platten wurden bei 4ºC 20 h lang inkubiert und die Zellen auf Glasfaserfiltern gesammelt. Die maximale Bindung wurde in Abwesenheit des nicht markierten M-CSF gemessen und die unspezifische Bindung wurde in Anwesenheit einer 1.000-fach größeren Konzentration an nicht markierem M-CSF (verglichen mit dem markierten M-CSF) gemessen. Die Konzentration von M-CSF, die zur Inhibition von 50% der markieren M-CSF-Bindung an die Zellen (IC&sub5;&sub0;) erforderlich war, wurde zur Ermittlung der Affinitätsunterschiede eingesetzt. Die Ergebnisse werden als Prozentverdrängung des radioaktiven M-CSF über die Muteinkonzentration ausgedrückt (Fig. 7). Der IC&sub5;&sub0; des Heterodimeren (Fig. 7, geschlossene Quadrate) war auf etwa 500 pM 30-fach reduziert im Vergleich zu einem IC&sub5;&sub0; von etwa 17 pM für M-CSFα NΔ3CΔ158 (158) (Fig. 7, geschlossene Kreise). Die Ähnlichkeit zwischen der Verringerung der spezifischen Aktivität und der Rezeptoraktivität des Heterodimers zeigt an, dass die Verringerung der Bioaktivität auf der verringerten Rezeptorbindungsfähigkeit beruht. Ähnlich wurden auch die Bindungsaffmitäten der Q20A, V78KF (Fig. 7, offene Kreise) und der H9A/H 15A-Muteine (offene Quadrate) in diesem Radioligandverdrängungstest gemessen. Das Q20A, V78K- Mutein wies einen IC&sub5;&sub0; von etwa 100 pM und das H9A, H15A-Mutein einen ICso von etwa 1 uM auf, entsprechend einer verringerten Bindungsaffinität von 5-fach bzw. 50000-fach. Für jedes Mutein war die Verringerung der Rezeptoraffrnität ähnlich der Verringerung der spezifischen Aktivität, was wiederum anzeigt, dass die Verringerung der Bioaktivität auf der verringerten Rezeptorbindungsfähigkeit beruht.

Beispiel 13

Kristallisation und Charakterisierung von M-CSF H9A, H15A-Muteinen

Das in Beispiel 10 beschriebene H98, H15A-Mutein wurde unter Verwendung des Schwebetropfenverfahrens, beschrieben in den Beispielen 1 und 2, unter Anwendung der folgenden Pufferbedingungen kristallisiert: 30% Polyethylenglykol 4000; 100 mM Li&sub2;SO&sub4; und 100 mM Tris pH 8,5. Die unter diesen Bedingungen erzeugten Kristalle waren rhomboedrische Prismen mit Dimensionen von 0,7 mm · 0,2 mm · 0,2 mm. Die röntgenkristallographische Analyse unter Verwendung von Präzisionsfotografien zeigte Kristalle in der Raumgruppe P212121 mit Dimensionen einer Zelle von a = 33,99, b = 65,37, c = 159,90, d = 90, e = 90 und f = 90 Ängström und eine Beugung auf eine nominale Auflösung von 3 Ängström. Diese physikalischen Eigenschaften sind im Wesentlichen dieselben, wie diejenigen, die für das parentale NΔ3CΔ158 M-CSFα-Molekül beobachtet wurden, und legen nahe, dass die biologischen Wirkungen der H9A, H15A-Änderungen nicht die Folgen der groben Gesamtänderungen in der M-CSF-Struktur darstellen, sondern eher das Ergebnis von geänderten Seitenketten sind, die bei der Wechselwirkung mit dem M-CSF-Rezeptor wesentlich sind. Die Änderung dieser Histidin-Seitenketten kann die Rezeptorbindung durch die Änderung von Atomen beeinflußt haben, die mit der Rezeptorbindung interagieren, diese stabilisieren oder erleichtern oder die Rezeptorkonformation ändern. Änderungen wie H15A können diese Funktion außerdem durch Ändern der Position der in der Nähe befindlichen Seitenketten im M-CSF beeinflußt haben, am Wahrscheinlichsten im Bereich der A und/oder C-Helices.
Die obigen Beispiele sind als Beispiele gegeben und sollen den Schutzbereich der Erfindung, wie er in den angefügten Ansprüchen dargelegt ist, nicht einschränken. ANHANG 1

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: CHIRON CORPORATION und
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY
OF CALIFORNIA
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: KRISTALLISATION VON M-CSF
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADF; ESSAT: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Borun
(B) STRASSE: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive
(C) STADT: Chicago
(D) LAND: Illinois
(E) STAAT: U. S. A.
(F) POSTLEITZAHL: 60606-6402
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUM TYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) VORANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/896,512 CIP
(B) ANMELDEDATUM: 09-JUN-1992
(viii) ANWALTS-/VERTRETERINFORMATION:
(A) NAME: Clough, David W.
(B) ZULASSUNGSNUMMER: 36,107
(C) ANWALTSAKTE: 31436
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELLEFON: 312/474-6300
(B) TELEFAX: 312/474-0448
(C) TELEX: 25-3856
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 56 Basenpaare
(3) TYP: Nucleinsäure
(C) SRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: DNS
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 58 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TYPOLOGIE: linear
(ü) MOLEKÜL-TYP: DNS
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
(2) INFORMATION FUR SEQ ID NR. 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 58 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TYPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: DNS
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 58 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TYPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: DNS
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
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(ii) MOLEKÜL-TYP: DNS
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR. 5:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 85 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TYPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: DNS
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR. 6:
(3) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 76 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: DNS.
(xi): SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TYPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: DNS
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR. 8:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: DNS
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR. 9:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TYPOLOGIE: linear
(iii) MOLEKÜL-TYP: DNS
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend kristallines M-CSF, wobei M-CSF ein Dimer aus zwei M-CSF-Polypeptidmonomeren ist, in dem jedes Monomer im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie ein Polypeptid hat, das aus der Gruppe, bestehend aus reifem M-CSFα-Polypeptid, reifem M-CSFβ-Polypetid und reifem M-CSFy-Polypeptid, ausgewählt wird.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das kristalline Dimer P2&sub1;2&sub1;2&sub1;-Symmetrie aufweist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin M-CSF biologisch aktiv ist, wenn es wieder in Lösung gebracht wird.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die zwei M-CSF- Polypeptidmonomeren disulfidverbrückt sind.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin jedes der zwei M- CSF-Polypeptidmonomeren ein M-CSFα-Polypeptid ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin jedes Monomer eine Aminosäuresequenz einer Länge zwischen etwa 145 und etwa 156 Aminosäuren aufweist und wobei die Sequenz einen Carboxylterminus aufweist, der sich etwa zwischen den Resten 145 und 156 befindet, gemessen von dem Aminoterminus des reifen M-CSF-Polypeptids.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin mindestens eines der Polypeptide die Reste 4 bis 158 des reifen M-CSFα- Polypeptids enthält.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei mindestens eines der M-CSF-Polypeptidmonomeren nicht glykosyliert ist.

9. Verfahren zum Kristallisieren eines M-CSFα-Dimers mit zwei Polypeptidmonomeren, wobei jedes 146 bis 162 Aminosäuren des reifen M-CSFα enthält und das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Mischen einer Lösung des M-CSFα-Dimers mit einem Fällungsmittel, wobei ein M-CSFα-Gemisch gebildet wird,

b) Ausfällen des kristallinen M-CSFα-Dimers und

c) Isolieren des kristallinen M-CSFα-Dimers.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Fällungsmittel Polyethylenglycol umfasst

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin das M-CSFα-Dimer aus rekombinantem, aus einer Bakterienzelle isoliertem M-CSFα hergestellt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 9, worin mindestens eines der Polypeptidmonomere nicht glykosyliert ist.

13. Verfahren nach Anspruch 9, worin mindestens eines der Polypeptidmonomere die Reste 4 bis 158 des reifen M-CSFα- Polypeptids enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 9, worin das kristalline M-CSFα- Dimer biologisch aktiv ist, wenn es wieder in Lösung gebracht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Fällungsschritt des M-CSFα-Kristalls das Equilibrieren des M-CSFα-Dimergemisches mit einer Fällungsmittel-Lösung umfasst.

16. Verfahren nach Anspruch 15, in dem die Lösung des Fällungsmittels eine höhere Fällungsmittelkonzentration umfasst als das M-CSFα-Gemisch.

17. Verfahren nach Anspruch 15, in dem der Equilibrierungsschritt das Auftragen des M-CSFα-Gemisches auf eine Oberfläche und das Equilibrieren des aufgetragenen M-CSFα- Gemisches mit einem Reservoir der Lösung des Fällungsmittels umfasst.

18. Verfahren nach Anspruch 9, in dem der Fällungsschritt des kristallinen M-CSFα-Dimers einen Schritt umfasst, bei dem M-CSFα-Impfkristalle dem M-CSFα-Dimergemisch zugeführt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 9, in dem der Fällungsschritt des M-CSFα-Dimers einen Schritt umfasst, bei dem die Temperatur des M-CSFα-Gemisches verändert wird.

20. Kristallines M-CSFα (4-158).

21. Kristallines M-CSF nach Anspruch 20, umfassend M-CSF- Kristalle mit Abmessungen von mindestens etwa 0,3 mm in mindestens zwei Dimensionen.

22. Kristallines M-CSF nach Anspruch 20, das in der Lage ist, Röntgenstrahlung zu beugen, um ein Beugungsbild zu erzeugen, das die dreidimensionale Struktur von M-CSF repräsentiert.

23. Kristallines M-CSF nach Anspruch 22, wobei das Beugungsbild die dreidimensionale Struktur eines Teils von M-CSFα (4-158) mit einer Genauigkeit von mindestens 5 Angström repräsentiert, und dieser Teil Aminosäurereste zwischen Rest 4 und etwa Rest 153 umfasst.

24. Verfahren zur Bestimmung einer dreidimensionalen Struktur eines M-CSF-Dimers mit zwei M-CSF-Polypeptidmonomeren, wobei jedes etwa zwischen 146 und 162 Aminosäuren aufweist, ausgehend von etwa Rest 1 bis etwa Rest 5 des reifen M- CSF, das Verfahren umfassend:

a) Kristallisieren des M-CSF-Dimers;

b) Bestrahlen von kristallinem M-CSF, um ein für kristallines M-CSF charakteristische s Beugungsbild zu erhalten und

c) Transformieren des Beugungsbildes in eine dreidimensionale Struktur des M-CSF-Dimers.

25. Verfahren zur. Verwendung einer aus einem M-CSF-Kristall abgeleiteten dreidimensionalen Struktur von M-CSF, wobei die dreidimensionale Struktur von M-CSF einen M-CSF- Rezeptorbindungsbereich umfasst und das Verfahren die Identifizierung von Verbindungen umfasst, die Strukturen haben, die mit einem Rezeptorbindungsbereich der dreidimensionalen Struktur von M-CSF wechselwirken und als M- CSF-Agonist oder -Antagonist fungieren.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die dreidimensionale Struktur von M-CSF alpha-Kohlenstoffkoordinaten umfasst, die im Wesentlichen die gleichen sind wie diejenigen der Strukturinformationen in Anhang 1.

27. Verfahren zur Identifizierung von M-CSF-Agonisten oder Antagonisten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Kristallisieren eines M-CSF-Dimers unter Bildung von mindestens einem M-CSF-Kristall, wobei das M-CSF- Dimer eine Gruppe von Aminosäureresten enthält, die einen M-CSF-Rezeptorbindungsbereich definieren;

b) Bestrahlen eines durch das Verfahren von Schritt (a) hergestellten M-CSF-Kristalls, um ein Beugungsbild des M-CSF-Kristalls zu erhalten;

c) Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von M-CSF aus dem Beugungsbild, wobei die dreidimensionale Struktur einen M-CSF-.Rezeptorbindungsbereich umfasst und

d) Identifizierung einer M-CSF-Agonisten- oder Antagonistenverbindung mit einer dreidimensionalen Struktur, die in funktioneller Weise wesentliche, dem Lösungsmittel zugängliche M-CSF-Rezeptorbindungsreste, die in der dreidimensionalen Struktur des M-CSF- Rezeptorbindungsbereichs vorliegen, dupliziert, wobei der M-CSF-Agonist oder -Antagonist ein verändertes Signalübertragungsvermögen gegenüber auf M-CSF ansprechenden Zellen aufweist.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die dem Lösungsmittel zugänglichen Reste nicht an der Bildung der M-CSF-Dimergrenzfläche teilnehmen.