DE69424657T2

DE69424657T2 - Osteogene wachstums-oligopeptide und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69424657T2
Application number: DE69424657T
Authority: DE
Inventors: Itai Bab; Michael Chorev; Zvi Greenberg; Nura Mansur; Andras Muhlrad; Arie Shteyer
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1993-03-04
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 2001-02-08
Anticipated expiration: 2014-03-05
Also published as: DK0687270T3; EP0687270B1; JP3621099B2; ATE193305T1; AU6146794A; CA2157506A1; US5814610A; DE69424657D1; IL104954A; PT687270E; IL104954A0; ES2149258T3; CA2157506C; GR3034218T3; JPH08509960A; WO1994020529A1; EP0687270A1

Description

Fachbereich der Erfindung

Die Erfindung betrifft osteogene Wachstums-Oligopeptide, die eine stimulierende Wirkung auf osteoblastische und fibroblastische Zellen besitzen.

Hintergrund der Erfindung

Es wurde festgestellt, daß sich neubildendes Knochenmark eine osteogene Reaktion an entfernt gelegenen Stellen des Skeletts auslöst und daß diese Wirkung durch Faktoren vermittelt wird durch Faktoren, die durch das heilende Gewebe in den Blutkreislauf freigesetzt werden [Bab I. et al (1985) Calcif. Tissue Int. 37: 551; Foldes, J. et al (1989) J. Bone Min. Res. 4: 643; Einhorn, T. A. et al (1990) J. Bone Joint Surg. Am. 72: 1374; Gazit D., et al (1990) Endocrinology 126: 2607; Mueller, M. et al (1991) J. Bone Min. Res. 6: 401]. Einer dieser Faktoren, ein osteogenes Wachstums- Polypeptid aus 14 Aminosäuren (OGP), das mit dem C-Terminus von Histon H4 identisch ist, wurde vor kurzem identifiziert [Bab, I. et al (1992) EMBO J. 11: 1867; Europäische Patentanmeldungen Nrn. 89201608.0 und 90301862.0]. Ein Histon-H4- Fragment der Formel Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly ist beschrieben bei Kharchenko, E. P. et al (1989) Vopr. Med. Khim. 35(2): 106-9 und bei Kharchenko, E. P. et al (1987) Biull. Eksp. Biol. Med. 103(4): 418-20. Bei diesem Peptid wurde eine analgetische und opioide Wirkung nachgewiesen.
Ein synthetisches osteogenes 14-meres Wachstums-Polypeptid (sOGP), das hinsichtlich seiner Struktur mit dem nativen Molekül identisch ist, wurde als potenter Stimulator der Vermehrung von osteoblastischen und fibroblastischen Zellen in vitro nachgewiesen. Dieses synthetische Polypeptid stimuliert auch die alkalische Phosphatase-Aktivität der osteoblastischen Zellen. Bei in vivo-Verabreichung an Ratten in sehr geringen Injektionsdosen erhöhte das synthetische osteogene Wachstums-Polypeptid die Knochenbildung und die trabekuläre Knochenmasse.
Wie im Falle anderer polypeptidischer Wachstums-Regulatoren, wie etwa dem Wachstumshormon und dem Insulin-artigen Wachstumsfaktor [Hintz, R. L. (1990) Horm. Res. 33: 105], kann das osteogene Wachstums-Polypeptid-bindende Protein/e (OGPBP) das osteogene Wachstums-Polypeptid gegen proteolytischen Abbau schützen [Bab, I. et al (1992) EMBO J. 11: 1867].
C-terminal modifizierte Analoga des osteogenen Wachstums-Polypeptids, wie zum Beispiel [Cys¹&sup5;(NEM)]OGP-NH&sub2;, binden an das OGPBP. Die modifizierten Analoga zeigen aber nicht die stimulierende Wirkung der OGP auf die Zellproliferation und reagieren nicht mit bestimmten Anti-OGP-Antikörpern. Diese Polypeptid-Analoga können zur Freisetzung von OGP aus seinem Komplex mit einem OGPBP verwendet werden. Findet die kompetitive Reaktion in einem Gewebekulturmedium statt, das zuvor mit Zellen oder einer biologischen Flüssigkeit mit Peptidase-Aktivität inkubiert wurde, so wird das freigesetzte OGP einem proteolytischen Abbau ausgesetzt, der aus dieser Peptidase-Aktivität resultiert. Nichtsdestotrotz bestand die Möglichkeit, daß kurze Peptide, die aus dem proteolytischen Abbau zurückbleiben, die OGP-Aktivität beibehalten.
Da das OGP-Molekül zur wirksamen oralen Verabreichung zu groß ist, wäre es von therapeutischer Bedeutung, Oligopeptide von sechs oder weniger Aminosäure- Resten zu finden, die die biologische OGP-Aktivität beibehalten. Solche kurzen Oligopeptide könnten zu einer festen pharmazeutischen Präparation modifiziert werden, die zur oralen oder anderweitig systemischen Behandlung verschiedener pathologischer Zustände geeignet wäre, besonders solcher Zustände, die einen Verlust von Knochengewebe beinhalten. Außerdem würde die Identifikation solcher Oligopeptide einen wesentlichen Schritt in Richtung der Definition der minimalen Aminosäuresequenz bedeuten, bei der die OGP-Aktivität noch beibehalten ist, was die Grundlage für ein weiteres Arzneimittel-Design darstellen kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher solche nativen oder synthetischen osteogen aktiven Oligopeptide.
Im folgenden werden die nachstehenden Abkürzungen verwendet:
GOP - osteogenes Wachstums-Polypeptid
OGPBP - osteogenes Wachstums-Polypeptid-bindendes Protein
irOGP - immunreaktives OGP
sOGP - synthetisches OGP.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein biochemisch reines Oligopeptid mit einer stimulierenden Wirkung auf osteoblastische und/oder fibroblastische Zellen, einem Molekulargewicht von 200 bis 1.000 und einer Formel bereit, gewählt aus (a) Tyr-Gly-Phe-His-Gly; (b) Tyr-Gly-Phe-Gly; (c) Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly; und (d) Gly-Phe-Gly-Gly-NH&sub2;.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Isolierung eines biochemisch reinen Oligopeptids bereit, definiert wie obenstehendes (a) oder durch die Formel (e) Tyr- Gly-Phe-Gly-Gly oder (f) Gly-Phe-Gly-Gly aus einer biologischen Probe, umfassend die folgenden Schritte: (a) Entfernen aus der biologischen Probe der Peptide mit einem Molekulargewicht von unter 3.000; (b) Inkubieren des in Schritt (a) erhaltenen Mediums mit einem Polypeptid, das an ein osteogenes Wachstums-Polypeptidbindendes Protein/e bindet und nicht an einen gegen das osteogene Wachstums- Polypeptid gerichteten Antikörper bindet, in Gegenwart eines Protease-Inhibitors, um das osteogene Wachstums-Polypeptid aus seinem Komplex mit dem osteogenen Wachstums-Polypeptid-bindenden Protein/en herauszukonkurrieren; und (c) Abtrennen des immunreaktiven osteogenen Wachstumspeptids aus dem in Schritt (b) erhaltenen Reaktionsmedium mittels chromatographischer Methoden.
Außerdem stellt die Erfindung biochemisch reine Peptide mit einer stimulierenden Wirkung auf osteoblastische oder fibroblastische Zellen bereit, die mittels dieses Verfahrens erhalten werden.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen zur Stimulierung der Bildung osteoblastischer oder fibroblastischer Zellen und die daraus resultierende Knochenbildung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Oligopeptid (a), (b), (c), (d) oder (f) gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

In Abb. 1 ist die Produktion von Steady-state- und Total-irOGP durch osteoblastisches ROS 17/2.8- und osteoblastische MC3T3 E1- und fibroblastische NIH 3T3-Zellen gezeigt. Während der Meßperiode wurden die Zellen in chemisch definiertem Medium gezüchtet, das 4% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt. Teilmengen des Mediums für die irOGP-Bestimmung wurden sofort nach Zugabe des BSA-haltigen Mediums (Zeitpunkt "0") und zu den angegebenen Zeitpunkten danach erhalten. Steady-state- und Total-irOGP wurden bestimmt wie zuvor [Bab et al (1992) EMBO J. 11: 1867].
In Abb. 2 ist ein Fließdiagramm gezeigt, das die Ausreinigung von irOGP aus 24 Std.-Gewebekulturmedium beschreibt, wie in obenstehender Abb. 1 unter Verwendung von MC3T3 E1-Zellen beschrieben. Peptide eines geringeren Molekulargewichts als 3.000 wurden mittels dreier wiederholter Verdünnungs/Zentrifugations-Zyklen abgetrennt. Das Retentat wurde dann mit [Cys¹&sup5;(NEM)]OGP-NH&sub2; inkubiert und nochmals zentrifugiert. Das Filtrat wurde abgesammelt und das irOGP vom [Cys¹&sup5;(NEM)]OGP-NH&sub2; unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC abgetrennt und weitergereinigt, wie in Abb. 3 gezeigt. Das ausgereinigte irOGP in den in Abb. 3 erkennbaren Peaks wurde einer Aminosäure- Sequenzierung durch automatischen Edamschen Abbau unterzogen und auf seine proliferative Aktivität getestet, wie in Abb. 4 gezeigt.
In Abb. 3 ist eine HPLC-Auftrennung von A - irOGP und [Cys¹&sup5;(NEM)]OGP- NH&sub2; unter Verwendung einer Umkehrphasen-Vydac-C4-Säule gezeigt; und B - der beiden irOGP-Peaks, unter Verwendung einer Merck-C18-Umkehrphasen-Säule. Die gestrichelten und durchgehenden Linien stehen für Lichtextinktion bzw. Immunreaktivität.
In Abb. 4 ist die Wirkung von OGP(10-14) (A) und OGP(10-14)His¹³ (B) (siehe Tabelle D) (rückgewonnen aus den jeweiligen B-1- und B-2-Peaks aus Abb. 3) auf osteoblastische MC3T3 E1-Zellzahlen in vitro gezeigt. Gestrichelte Linie - Wirkung der positiven sOGP-Kontrolle. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SEM von Triplikat-Kulturen.
In Abb. 5 ist die Wirkung des synthetischen OGP(10-14) (o---o---o---o---o) und OGP(10-14)His¹³ ( - - )auf osteoblastische MC3T3 E1-(A) und fibroblastische NIH 3T3 (B)-Zellzahlen in vitro gezeigt. Die Zellkulturen wurden angesetzt und herausgefordert, wie in Abbn. 1 und 4 gezeigt. Wirkung der positiven sOGP-Kontrolle ( - - ). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SEM von Triplikat-Kulturen, dargestellt als das Verhältnis von Behandlung zu nur-BSA-Kontrolle (B/K-Verhältnis).
In Abb. 6 ist die Wirkung von synthetischem Ac-Met&sup0;OGP(10-14) auf osteoblastische MC3T3 E1-(A) und fibroblastische NIH-3T3-(B)-Zellzahlen in vitro gezeigt. Die Zellkulturen wurden angesetzt und herausgefordert, wie in Abbn. 1 und 4 gezeigt. Gestrichelte Linie - Wirkung der positiven sOGP-Kontrolle. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SEM von Triplikat-Kulturen, dargestellt als das Verhältnis von Behandlung zu nur-BSA-Kontrolle (B/K-Verhältnis).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Bei OGP handelt es sich um ein Polypeptid aus 14 Resten, das in regenerierendem Knochenmark identifiziert wurde, und das dafür bekannt ist, die Vermehrung und alkalische Phosphatase-Aktivität von osteoblastischen und fibroblastischen Zellen in vitro zu stimulieren und die Knochenbildung und trabekulare Knochenmasse in Ratten bei in vivo-Injektion zu erhöhen. Die Aminosäuresequenz von OGP ist die folgende:
AlA-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly
Synthetisches OGP mit einer identischen Aminosäuresequenz und biologischen Aktivität wurde mittels einer standardmäßigen Festphasen-Methodik hergestellt. Es wurde auch festgestellt, daß in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten OGP einen Komplex mit OGPBP bildet und daß sOGP-Analoga, die an ihrer C-terminalen Region modifiziert waren, zur kompetitiven Freisetzung des Total-irOGP aus OGP- OGPBP-Komplexen verwendet werden können, wie oben beschrieben.
Die Erfinder haben festgestellt, daß dann, wenn die kompetitive Reaktion in einem Gewebekulturmedium stattfindet, das zuvor mit Zellen oder einer biologischen Flüssigkeit mit Peptidase-Aktivität inkubiert wurde, das aus dem OGP-OGPBP- Komplex freigesetzte OGP einem proteolytischen Abbau durch diese Peptidase- Aktivität ausgesetzt wird. Überraschenderweise haben die Erfinder festgestellt, daß kurze Oligopeptide, deren Vorhandensein in diesem kompetitiven Reaktionsmedium festgestellt wurde, die stimulierende Wirkung auf osteoblastische und fibroblastische Zellen und darus resultierend auf die Knochenbildung beibehalten.
So stellt die Erfindung ein biochemisch reines Oligopeptid mit einer stimulierenden Wirkung auf osteoblastische und/oder fibroblastische Zellen, einem Molekulargewicht von 200 bis 1.000 und einer Formel bereit, gewählt aus (a) Tyr-Gly-Phe-His-Gly; (b) Tyr-Gly-Phe-Gly; (c) Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly; und (d) Gly-Phe-Gly-Gly-NH&sub2;.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Isolierung eines biochemisch reinen Oligopeptids mit der Formel (a) oder (e) der Erfindung und mit einer stimulierenden Wirkung auf osteoblastische oder fibroblastische Zellen, aus einer biologischen Probe bereit, umfassend die folgenden Schritte: (a) Entfernen aus der biologischen Probe der Peptide mit einem Molekulargewicht von unter 3.000; (b) Inkubieren des in Schritt (a) erhaltenen Mediums mit einem Polypeptid, das an ein osteogenes Wachstums-Polypeptid-bindendes Protein/e bindet und nicht an einen gegen das osteogene Wachstums-Polypeptid gerichteten Antikörper bindet, in Gegenwart eines Protease-Inhibitors, um das osteogene Wachstums-Polypeptid aus seinem Komplex mit dem osteogenen Wachstums-Polypeptid-bindenden Protein/en herauszukonkurrieren; und (c) Abtrennen des immunreaktiven osteogenen Wachstumspeptids aus dem in Schritt (b) erhaltenen Reaktionsmedium mittels chromatographischer Methoden.
Die Peptide mit einem geringeren Molekulargewicht als 3.000 können zum Beispiel mittels Ultrafiltration bei einem Rückhaltevermögen von 3.000 MG entfernt werden. Die Protease-Inhibitoren können handelsübliche Hemmer sein, z. B. E-64, Leupeptin oder PMSF oder Gemische davon. Die Abtrennung des immunreaktiven osteogenen Wachstumspeptids in Schritt (c) kann mittels verfügbarer HPLC-Methoden vorgenommen werden. Eine spezifische Ausführungsform dieses Verfahrens der Erfindung ist in den Beispielen beschrieben.
Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, besitzen die Oligopeptide gemäß der Erfindung, ob nun mittels dieses Isolierverfahrens oder mittels Synthese erhalten, eine stimulierende Wirkung auf osteoblastische oder fibroblastische Zellen und können daher von großem therapeutischem Nutzen sein. Die Erfindung betrifft daher auch pharmazeutische Zusammensetzung zur Stimulierung der Bildung von osteoblastischen und fibroblastischen Zellen, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines biochemisch reinen Oligopeptids mit den Formeln (a), (b), (c), (d) oder (f) der Erfindung.
Bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines Oligopeptids, umfassend die Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Phe-His-Gly oder Gly-Phe-Gly-Gly oder ein Gemisch davon; und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können besonders nützlich für die Stimulierung osteoblastischer Zellen und/oder fibroblastischer Zellen und folglich für eine vermehrte Knochenbildung bei verschiedenen pathologischen Zuständen sein, zum Beispiel bei Osteoporose (oder Osteopenie einer beliebigen Ätiologie), der Bruchheilung, der Wundheilung, intraossalen Implantaten und Knochensupplementationen, oder anderen Zustände, die einer vermehrten Knochenbildung bedürfen.
Demgemäß stellt die Erfindung ein biochemisch reines Oligopeptid der Formeln (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) der Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie, oder in der Diagnostik bereit, worin vorzugsweise das Behandlungsverfahren der Stimulierung oder Bildung von osteoblastischen oder fibroblastischen Zellen, einer vermehrten Knochenbildung bei osteopenisch pathologischen Zuständen, der Bruchheilung, der Wundheilung, von intraossalen Implantaten und der Knochensupplementation, als auch anderer Zustände, die einer vermehrten Knochenbildung bedürfen, dient. Die Erfindung stellt auch die Verwendung solcher Peptide in der Herstellung von Medikamenten zur Verwendung bei diesen Therapien bereit.
Außerdem stellt die Erfindung die Verwendung eines Oligopeptids mit der Formel (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung oder Bildung von osteoblastischen oder fibroblastischen Zellen, zur vermehrten Knochenbildung bei osteopenisch pathologischen Zuständen, der Bruchheilung, der Wundheilung, von intraossalen Implantaten und der Knochensupplementation, als auch anderer Zustände, die vermehrt knochenbildende Zellen erfordern, bereit.
Die Größe einer therapeutischen Dosis eines Polypeptids der Erfindung variiert natürlich in Abhängigkeit von der Patientengruppe (Alter, Geschlecht etc.), der Natur des zu behandelnden Zustands und dem speziell verwendeten Polypeptid und seinem Verabreichungsweg. In jedem Fall wird die therapeutische Dosis vom behandelnden Arzt bestimmt werden.
Es kann jeglicher geeignete Verabreichungsweg gewählt werden, um einem Säuger, besonders einem Menschen, eine wirksame Dosis eines Polypeptids dieser Erfindung darzureichen. Die intravenöse oder orale Verabreichung kann bevorzugt sein.
Die pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung können in Form von Dosiereinheiten hergestellt werden. Die Dosierungsformen können auch Formen zur verzögerten Freisetzung umfassen. Die Zusammensetzungen können mittels eines beliebigen der im pharmazeutischen Fachbereich wohlbekannten Verfahren hergestellt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung umfassen als einem Wirkstoff ein Oligopeptid der Formel (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) dieser Erfindung oder ein Gemisch solcher Oligopeptide in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, Vehikel oder Stabilisator, und wahlweise weitere therapeutische Bestandteile. Zu geeigneten Trägern, Vehikeln oder Stabilisatoren zählen nicht-toxische für Empfänger bei den angewandten Dosierungen und Konzentrationen, und umfassen Puffer, wie etwa Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und ähnliche physiologisch geeignete Puffer, und allgemeiner sämtliche im Fachbereich bekannte geeigente Träger, Vehikel und Stabilisatoren.

BEISPIELE

Beispiel 1 - Ausreinigung und Charakterisierung von Pentapeptiden aus Gewebekulturmedium

Materialien

Die Zusatzstoffe für die Gewebekultur wurden bezogen von Biological Industries (Beit Haemek, Israel). Die Kulturschalen stammten von Nung (Roskilde, Dänemark). BSA, Protease-Inhibitoren und N-Ethylmaleimid (NEM) stammten von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO; Kat-Nr. A 7030). Centricon-3-Mikrokonzentratoren wurden bezogen von Amicon, Inc. (Beverly, MA). t-Boc-Gly OCH&sub2;-Pam-Harz, N-Box- geschützte Aminosäure-Derivate, N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 1- Hydroxybenzotriazol (HOBt), Diisopropylethylamin (DIEA), Trifluoressigsäure (TFA), N,N-Dimethylformamid (DMF) und Dichlormethan (DCM) wurden von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) bezogen. Fluorwasserstoff (HF) wurde bezogen von Mathesohn (Seracus, NJ), Boc-3-1-Tyr(BZ1)-OH von Bachem (Torrance CA), p- Cresol von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) und Sephadex G15F von Pharmacia (Uppsala, Schweden). Die C18-Umkehrphasen-Säule und Acetonitril stammten von E. Merck, Darmstadt, Deutschland. Die C4-Umkehrphasen-Säule stammte von The Separation Group, Hesparia CA.

Methoden

Messung der irOGP-Anreicherung in Gewebekulturmedien

ROS 17/2.8- oder osteoblastische MC3T3 E1-Zellen oder NIH 3T3-Fibroblasten wurden in α-Minimal Essential Medium, ersetzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), aufbewahrt und zweimal pro Woche subkultiviert. Die Zellen für die Experimente wurden den Erhaltungskulturen bei Konfluenz entnommen. Für das Experiment wurden die Zellen in 25 cm², Gewebekultur-Kolben bei 1 · 10&sup4; Zellen/cm² ausgesät. Die Kulturen wurden bei 37ºC in CO&sub2;-Luft inkubiert. Für die ersten 46 Std. wurde das Medium mit 10% FCS und 0,2% Nukleosiden/Ribonukleosiden supplementiert, gefolgt von einer weiteren 2stündigen Starvationsperiode unter Serumfreien Bedingungen. Dann wurde das Serumfreie Medium durch 8 ml Medium, enthaltend 4% BSA, ergänzt. Teilmengen des Mediums von einem halben Milliliter für die irOGP-Bestimmungen wurden sofort nach Zugabe des BSA-haltigen Mediums (Zeitpunkt "0") und nach 12, 24, 36 und 48 Std. entnommen. Steady-state- und Total-irOGP wurden in diesen Teilmengen wie zuvor bestimmt [Bab et al. (1992) EMBO J. 11: 1867].

Trennung von irOGP und OGPBP

Abb. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Trennung von irOGP und OGPBP. Eine Probe des Mediums von 3,75 ml, die 24 Std. nach Zellstarvation entnommen wurde, wurde mit einer gleichen Menge (1 : 1) Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. Das verdünnte Medium wurde in multiplen Centricon-3- Mikrokonzentratoren über 1,5 Std. hinweg bei 5.000 · g zentrifugiert. Kleinere Polypeptide als 3.000 MG wurden aus dem Retentat mittels dreier wiederholter Verdünnungs/Zentrifugations-Zyklen unter Verwendung von 1 mM Natriumazid in 165 nM Ammoniumacetat, pH 7,0, als Verdünnungsmittel ausgewaschen. Das in jedem Mikrokonzentrator zugelassene minimale Retentatvolumen betrug 250 ul. Zur Freisetzung von irOGP aus dem OGP-OGPBP-Komplex wurde das 1 : 1-verdünnte Retentat 30 Min. lang bei 37ºC mit 450 nMol/ml [Cys¹&sup5;(NEM)]OGP-NH&sub2; in 165 nM Ammoniumacetat, enthaltend 50 uM E-64, 50 uM Leupeptin und 500 uM PMSF, inkubiert und nochmals zentrifugiert.

Trennung von irOGP und [Cys¹&sup5;(NEM)]OGP-NH&sub2;

Das mittels des Mikrokonzentrationsschritts erhaltene Filtrat wurde auf ein Endvolumen von 600 ul teilverdampft. Der irOGP-Gehalt des Filtrats betrug 0,31 nMol. Das Filtrat wurde in drei gleiche Teilmengen aufgeteilt. Das irOGP in jeder dieser Teilmengen wurde vom [Cys¹&sup5;(NEM)]OGP-NH&sub2; mittels HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasen-Vydac-Protein-C4-Säule abgetrennt, wobei der folgende Acetonitril-Gradientenlauf bei einer Flußrate von 1 ml/Min. vorgenommen wurde: 3 ml 12% Acetonitril; und 30 ml 12-19% Acetonitril.

Trennung zweier irOGP-Peaks

Fraktionen von einem halben Milliliter, umfassend den aus der C4-Säule rückgewonnenen Haupt-irOGP-Peak, wurden gepoolt und auf ein Endvolumen von 400 ul teilverdampft. Der irOGP-Gehalt dieses Peaks betrug 0,26 nMol. Das Filtrat wurde in zwei gleiche Teilmengen aufgeteilt. Das irOGP in jeder dieser Teilmengen wurde einer HPLC auf einer Umkehrphasen-C18-Säule unterzogen, wobei der folgende Acetonitril-Gradientenlauf bei einer Flußrate von 1 ml/Min. vorgenommen wurde: 3 ml 14% Acetonitril; und 30 ml 14-19% Acetonitril.

Bestimmung der Aminosäuresequenz

Das aus der C18-Säule rückgewonnene Protein in den beiden irOGP-Peaks wurde einer automatischen Peptid-Sequenzanalyse in einem Applied Biosystems 470A- Sequenziergerät unter Verwendung des vom Hersteller mitgelieferten Programms und der Reagentien unterzogen. Die freigesetzten Aminosäure-Derivate wurden mit Hilfe eines online-HPLC-Systems identifiziert.

Ergebnisse

Abb. 1 zeigt, daß in allen drei untersuchten Zellsystemen der Total-irOGP 24 Std. nach Starvation und Aussetzen dem chemisch definierten Medium einen Peak erreichte. Dieser Zeitraum deckt sich mit der Konfluenz der Kulturen. Während der folgenden 24 Std. fand eine nahezu 50%ige Abnahme beim Total-irOGP statt. Der Steady-state-irOGP zeigte einen mehr oder weniger linearen Anstieg während der gesamten Nachweisperiode. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß Stromazellen irOGP und das OGPBP produzieren. Die Syntheserate des irOGP und/oder des OGPBP nimmt ab, wenn die Kulturen Konfluenz erreichen.
Das 24 Std.-Kulturmedium aus den MC3T3 E1-Zellen wurde wiederholten Verdünnungs/Zentrifugations-Zyklen zur Entfernung des nicht-gebundenen irOGP und anderer Peptide mit kleinerem Molekulargewicht als 3.000 unterzogen (Abb. 2). Lediglich 0,96% des Total-irOGP konnten auf diese Weise entnommen werden. Das verbliebene irOGP wurde in Form des im Retentat enthaltenen OGP-OGPBP- Komplexes aufgrund seines hohen Molekulargewichts belassen (Tabelle A). Die HPLC-Abtrennung von [Cys¹&sup5;(NEM)]OGP-NH&sub2; ergab drei Haupt-Lichtextinktions- Peaks. Der größere dieser Peaks eluierte bei 19,5-23,5 Min. Rückhaltezeit, einer Position ähnlich der von [Cys¹&sup5;(NEM)]OGP-NH&sub2;, das unter denselben Bedingungen separat verlief. Dieser Peak zeigte keine OGP-Immunreaktivität. Die beiden anderen Peaks waren lediglich teilweise voneinander getrennt und zeigten einen hohen irOGP-Gehalt (Abb. 1A), nämlich 11,5% des im Kulturmedium vorhandenen TotalirOGP (Tabelle A). Es ist wahrscheinlich, daß ein Großteil dieser Abnahme im irOGP-Gehalt aus der Peptidase-Aktivität während der Verdrängungsreaktion trotz des Vorhandenseins von Peptidase-Inhibitoren resultierte. Zur Förderung der Trennung dieser irOGP-Peaks wurden die jeweiligen Fraktionen (Rückhaltezeit 11- 12,5 Min.) gepoolt und einem zweiten HPLC-Schritt unterzogen, der zu zwei verschiedenen Lichtextinktions-Peaks führte, von denen beide einen hohen irOGP- Gehalt aufzeigten (Abb. 1B). Diese Peaks wurden mit B-1 und B-2 bezeichnet.

TABELLE A

RÜCKGEWINNUNG VON IMMUNREAKTIVEM OGP AUS DEN EINZELNEN REINIGUNGSSCHRITTEN

irOGP-Reinigungsschritt (Total-nMol bei Präparation) prozentuale Rückgewinnung
24 Std. nach Starvation des Mediums 270,0 100
Anfängliche Ultrafiltration 2,6 0,96
Ultrafiltration nach Verdrängung 31,0 11,5
Umkehrphasen-HPLC 12,6 4,7
Die jeweiligen Fraktionen, die bei Rückhaltezeiten von 23,5-24 Min. und 25-25,5 Min. eluierten, wurden gepoolt. Teilmengen der gepoolten Fraktionen wurden einem Test ihrer proliferativen Wirkung im MC3T3 E1-Zell-Assay zugeordnet. Die Aminosäure- Sequenzierung ergab, daß Peak B-1 ein Pentapeptid enthielt, das identisch zur Cterminalen Region (Reste 10-14) von OGP war. Peak B-2 enthielt ein ähnliches Pentapeptid, bei dem Gly¹³ des OGP durch His substituiert war (Tabelle B).

TABELLE B

AMINOSÄURESEQUENZEN DER PENTAPEPTIDE

Peak B-1* Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly
Peak B-2* Tyr-Gly-Phe-His-Gly
*Definiert in Abb. 3.
Die proliferative Aktivität jedes Peaks im MC3T3 E1-Zell-Assay war mit der der positiven sOGP-Kontrollen mit einem Peak von 10&supmin;¹³M (Abb. 4) identisch.

Beispiel 2 - Aktivität der synthetischen Pentapeptide

Peptidsynthese

Die synthetischen Peptide dieser Erfindung wurden mittels der Festphasen-Methode von Merrifield [Merrifield, (1969) Adv. Enzym. 32: 221] unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 430A Automated Peptide Synthesizer (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) präpariert. Im Falle Peptid-freier Säure wurde die Synthese auf einem 0,5 mMol t-Boc-Gly-PAM-Harz (1% vernetzt, 0,61 meq/g) durchgeführt. t-Boc-Gly-MBHA-Harz (1% vernetzt, 0,66 meq/g) wurde für das amidierte Tetrapeptid verwendet. Die Aminosäure-Derivate wurden an der α- Aminofunktion durch t-Butyloxycarbonyl-(Boc)-Gruppen geschützt. Der Schutz der Tyrosin-Seitenketten erfolgte durch Z. Die Aminsosäure-Derivate wurden über die DCC-vermittelte, vorgeformt symmetrische Anhydrid-Methode von Hagemaier, H. und Frank, H. [Hoppe-Seyler's Z. (1972) Physiol. Chem. 353: 1973] gekoppelt. Die Kopplung jeden Aminosäure-Rests wurde zweimal wiederholt. Die Schutzentfernung am blockierten Amino-Terminus erfolgte durch Behandlung mit 25% TFA in DCM. Die Seitenketten wurden entschützt und das Peptid vom Harz unter Verwendung des HF-Verfahrens gespalten, wobei das Gemisch aus 4 ml Anisol und 36 ml Flüssig-HF 75 Min. lang bei 0ºC angewendet wurde. Die rohen synthetischen Peptide wurden auf einem Merck-Hitachi 655A-11 HPLC-Instrument, ausgestattet mit einer Water u BondParkTM-C18-Säule (1,9 · 15,0 cm), gereinigt. Die Hülse wurde mit linearen Acetonitril-Gradienten, enthaltend TFA (Tabelle C) bei einer Flußrate von 6,0 ml/Min., bepumpt.
Das BH-OGP (11-14) (BH = Bolton-Hunter) wurde durch Umsetzen von 3-(3-Iod-4- hydroxyphenyl)propionsäure-N-hydroxysuccinimidylester mit gereinigtem OGP (11- 14) unter Anwendung der Methode von Michelot et al [Michelot R. et al (1980) Biochem. Biophys. Res. Comm. 95: 491-498] hergestellt. TABELLE C LINEARE ACETONITRIL-GRADIENTEN ZUR HPLC-REINIGUNG VON DI-, TRf-, TETRA-, PENTA- UND HEXA-OGP-VERBUNDENEN PEPTIDEN
*BH = Bolton-Hunter-Reagenz
In Tabelle D ist die Übertragung der hierin verwendeten Nomenklatur in die Aminosäuresequenz der Peptide gezeigt.

TABELLE D

AMINOSÄURE-ZUSAMMENSETZUNG DER SYNTHETISCHEN DI-, TRI-, TETRA-, PENTA- UND HEXA-OGP-VERBUNDENEN PEPTIDE

OGP(13-14) Gly-Gly
OGP(11-12) Gly-Phe
OGP(12-14) Phe-Gly-Gly
OGP(11-13) Gly-Phe-Gly
OGP(10-12) Tyr-Gly-Phe
OGP(11-14) Gly-Phe-Gly-Gly
BH*-OGP(11-14)
OGP (11-14)NH&sub2; Gly-Phe-Gly-Gly-NH&sub2;
OGP (10-13) Tyr-Gly-Phe-Gly
OGP (10-14) Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly
OGP (10-14)His Tyr-Gly-Phe-His-Gly
Ac-Met&sup0;[OGP(10-14) Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly
*BH = Bolton-Hunter-Reagenz

Ergebnisse

Die proliferative Wirkung beider Pentapeptide (OGP (10-14) (Formel (e)) oder OGP (10-14)His¹³ (Formel (a)) in den MC3T3 E1- und NIH 3T3-Zell-Assays war ähnlich der der positiven sOGP-Kontrollen. Ihre Peak-Aktivitäten lagen bei 10&supmin;¹³ bzw. 10&supmin;¹¹- 10&supmin;¹&sup0; M Peptidkonzentration (Abb. 5).

Beispiel 3 - Proliferative Wirkung von Hexapeptid

Das Hexapeptid von Ac-Met&sup0;[OGP(10-14)] wurde zum Testen der Verwendbarkeit von Ac-[³&sup5;S]Met[OGP(10-14)] für metabolische und Bindungsstudien präpariert.

Ergebnisse

Das Ac-Met&sup0;[OGP(10-14)] stimulierte die MC3T3 E1- und NIH 3T3-Zellzahl in sehr ähnlicher Weise wie bei der positiven sOGP-Kontrollen mit Peaks bei 10&supmin;¹³ bzw. 10&supmin;¹¹ M Peptidkonzentration (Abb. 6).

Beispiel 4 - Proliferative Wirkung von BH-OGP(11-14)- Tetra, -Tri- und -Di-Peptiden

Alle fünf Tetrapeptide zeigten eine Dosis-Wirkung auf die MC3T3 E1- und NIH 3T3- Zellzahl mit Peaks bei 10&supmin;¹³ bzw. 10&supmin;¹¹ M Peptidkonzentration. Die Größe der BH- OGP(11-14)-Peak-Wirkung war in beiden Zellsystemen am höchsten und war der der positiven sOGP-Kontrolle ähnlich. Die Peak-Aktivität des OGP(11-14), OGP(10- 13) und OGP(10-12) zeigte Zwischenwerte. Das OGP(11-14)NH&sub2; zeigte die geringste Peak-Wirkung. OGP(12-14), OGP(11-13), OGP(13-14) und OGP(11-12) beeinflußte die MC3T3 E1- und NIH 3T3-Zellzahl nicht (Tabelle E). TABELLE E PROLIFERATIVE AKTIVITÄT VON SYNTHETISCHEN DI-, TRI- UND TETRA-OGP-VERBUNDENEN PEPTIDEN {Prozentuale Aktivität des Peptids der vollen Länge [OGP(1-14)]}
*BH = Bolton-Hunter-Reagenz.

Claims

1. Biochemisch reines Oligopeptid mit stimulierender Wirkung auf osteoblastische und/oder fibroblastische Zellen, einem Molekulargewicht von 200 bis 1.000 und einer Formel, gewählt aus (a) Tyr-Gly-Phe-His-Gly; (b) Tyr-Gly-Phe-Gly; (c) Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly; und (d) Gly-Phe-Gly-Gly-NH&sub2;.

2. Verfahren zur Isolierung eines biochemisch reinen Oligopeptids nach Anspruch 1, Teil (a), oder zur Isolierung eines biochemisch reinen Oligopeptids mit stimulierender Wirkung auf osteoblastische oder fibroblastische Zellen und mit der Formel (e) Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly aus einer biologischen Probe, welches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Entfernen aus der biologischen Probe der Peptide mit einem Molekulargewicht von unter 3.000; zur Zurückbehaltung eines Mediums.

(b) Inkubieren des in Schritt (a) erhaltenen Mediums mit einem Polypeptid, das an ein osteogenes Wachstums-Polypeptid-bindendes Protein/e bindet und nicht an einen gegen das osteogene Wachstums-Polypeptid gerichteten Antikörper bindet, in Gegenwart eines Protease-Inhibitors, um das osteogene Wachstums- Polypeptid aus seinem Komplex mit dem osteogenen Wachstums-Polypeptid- bindenden Proteinen herauszukonkurrieren; und

(c) Abtrennen des immunreaktiven osteogenen Wachstumspeptids aus dem in Schritt (b) erhaltenen Reaktionsmedium mittels chromatographischer Methoden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei, in Schritt (a), die Peptide mit einem Molekulargewicht von unter 3.000 mittels Ultrafiltration bei einem Rückhaltevermögen von 3.000 MG entfernt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die Protease-Inhibitoren E-64, Leupeptid oder PMSF oder deren Gemische sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei, in Schritt (c), das immunreaktive osteogene Wachstumspeptid mittels HPLC abgetrennt wird.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Oligopeptid nach Anspruch 1, oder mit der Formel (f) Gly-Phe-Gly-Gly; und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.

7. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Formulieren eines Oligopeptids oder modifizierten Oligopeptids, wie in Anspruch 6 definiert, mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger.

8. Oligopeptid nach Anspruch 1, oder mit der Formel (f) Gly-Phe-Gly-Gly, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie, oder in der Diagnostik.

9. Oligopeptid nach Anspruch 8, wobei das Behandlungsverfahren zur Stimulierung der Bildung osteoblastischer oder fibroblastischer Zellen, einer vermehrten Knochenbildung bei osteopenisch pathologischen Zuständen, der Bruchheilung, der Wundheilung, von intraossalen Implantaten und der Knochensupplementation, und anderer Zustände, die eine vermehrte Knochenbildung erfordern, dient.

10. Verwendung eines Oligopeptids nach Anspruch 1, oder mit der Formel (e) Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, oder (f) Gly-Phe-Gly-Gly, bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Bildung osteoblastischer oder fibroblastischer Zellen, einer vermehrten Knochenbildung bei osteopenisch pathologischen Zuständen, der Bruchheilung, der Wundheilung, von intraossalen Implantaten und der Knochensupplementation, und anderer Zustände, die eine vermehrte Knochenbildung erfordern, dient.