JPH08509960A

JPH08509960A - 骨原性成長オリゴペプチドおよびそれを含む医薬組成物

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Publication number: JPH08509960A
Application number: JP6519721A
Authority: JP
Inventors: バブ、イタイ; マールラッド、アンドラス; チョレブ、マイケル; シュテヤー、アリエ; グリーンバーグ、ズビ; マンシュール、ナラ
Original assignee: イッサム・リサーチ・デベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヒーブリュー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム; ゴールディン、ダグラス・マイケル
Priority date: 1993-03-04
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 1996-10-22
Anticipated expiration: 2020-02-16
Also published as: DK0687270T3; EP0687270B1; JP3621099B2; ATE193305T1; AU6146794A; DE69424657T2; CA2157506A1; US5814610A; DE69424657D1; IL104954A; PT687270E; IL104954A0; ES2149258T3; CA2157506C; GR3034218T3; WO1994020529A1; EP0687270A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する刺激活性を持ち、２００〜２０００の分子量を有する生化学的に純粋なオリゴペプチドに関する。本発明の好ましいオリゴペプチドは、アミノ酸配列Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇly（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２）およびＧly-Ｐhe-Ｇly-Ｇly（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３）を含んでなる。本発明はさらに、骨芽細胞または線維芽細胞形成の刺激、オステオペニア症状、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充および促進された骨形成が要求される他の状態における骨形成の剌激のための薬剤組成物であって、治療有効量の本発明のオリゴペプチドを含んでなる薬剤組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】骨原性成長オリゴペプチドおよびそれを含む医薬組成物発明の分野本発明は、骨芽細胞および線維芽細胞に対する剌激活性を有する骨原性成長オリゴペプチドに関する。発明の背景再生性骨髄は、遠い骨核部位における骨原性応答を誘起し、この活性は治癒組織による循環へ遊離される因子により媒介されることが分かっている［バブ（Ba b，I.）ら（１９８５）Calcif．Tissue Int．３７：５５１；フォルデス（Folde s，J.）ら（１９８９）J．Bone Min．Res．４：６４３；アインホーン（Einhorn ，T.A.）ら（１９９０）J.Bone Joint Surg．Am．７２：１３７４；ガツィット（Gazit D.）ら（１９９０）Endocrinology１２６：２６０７；ミュラー（Muell er，M.）ら（１９９１）J．Bone Min．Res．６：４０１］。これら因子の１つである１４−アミノ酸骨原性成長ポリペプチド（ヒストンＨ４のＣ−末端と同一）は、最近同定された［バブら（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１：１８６７；ヨーロッパ特許出願８９２０１６０８.０および９０３０１８６２.０］。式Ｔyr-Ｇl y-Ｐhe-Ｇly-ＧlyのヒストンＨ４フラグメントは、カルチェンコ（Kharchenko， E.P.）ら（１９８９）Vopr．Med．Khim．３５（２）：１０６−９およびカルチェンコら（１９８７）Biu1l．Eksp．Biol．Med．１０３（４）：４１８−２０に開示されている。このペプチドは、鎮痛およびオピオイド活性を示した。合成１４−マー骨原性成長ポリペプチド（ｓＯＧＰ）（天然分子と同じ構造）は、イン・ビトロでの骨芽細胞および線維芽細胞の増殖の強力な刺激剤であることが分かっている。この合成ポリペプチドは、骨芽細胞アルカリホスファターゼ活性も刺激する。ラットにイン・ビボ注射した場合、非常に少ない投与量で、合成骨原性成長ポリペプチドは、骨形成および小柱骨マスを増加させる。他のポリペプチド成長調節物質、例えば成長ホルモンおよびインシュリン様成長因子の場合の様に［ヒンツ（Hintz，R.L.）（１９９０）Horm．Res．３３：１０５］、骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質（ＯＧＰＢＰ）は、蛋白質分解劣化から骨原性成長ポリペプチドを保護することができる［バブら（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１：１８６７］。骨原性成長ポリペプチドのＣ−末端変性類縁体、例えば［Ｃys¹⁵（ＮＥＭ）］ＯＧＰ-ＮＨ₂は、ＯＧＰＢＰに結合する。変性類縁体は、細胞増殖のＯＧＰ刺激に関与せず、ある種のアンチ−ＯＧＰ抗体と反応しない［イスラエル特許第１０１７４７号］。これらポリペプチド類縁体は、ＯＧＰＢＰとの複合体からＯＧＰを放出させるのに使用することができる。もし競合反応が予め細胞を培養した組織培養培地中またはペプチド活性をもつ生物学的液体で起こるなら、放出されたＯＧＰは、該ペプチダーゼ活性に起因する蛋白質分解劣化を受けることになる。しかしながら、蛋白質分解劣化により生じる短鎖ペプチドがＯＧＰ活性を保持している可能性はある。ＯＧＰ分子は、効果的な経口投与には大きすぎるので、ＯＧＰ生物学的活性を保持する６個またはそれ以下のアミノ酸残基のオリゴペプチドを発見することは治療上有用である。このような短鎖オリゴペプチドは、種々の病的状態、特に骨組織の喪失を伴う症状の経口または他の全身処置に適している安定な薬剤へ変性することができるかもしれない。加えて、そのようなオリゴペプチドの同定は、なおＯＧＰ活性を保持する最小アミノ酸配列の決定に向けての必須のステップであり、これにより、更なる医薬設計への基礎が提供されるであろう。本発明は、そのような天然または合成の骨原性活性オリゴペプチドに関する。本明細書において、以下の略語を使用する：ＯＧＰ：骨原性成長ポリペプチドＯＧＰＢＰ：骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質 irＯＧＰ：免疫反応性ＯＧＰ sＯＧＰ：合成ＯＧＰ発明の概要本発明は、骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する剌激活性を持ち、２００〜２０００の分子量を有する生化学的に純粋なオリゴペプチドに関する。好ましい本発明のオリゴペプチドは、アミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇ lyまたはアミノ酸配列：Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを含む。特に好ましいのは、５つのＣ−末端アミノ酸残基が該アミノ酸配列の５つまたは４つのアミノ酸残基であるオリゴペプチドである。また本発明は、生物学的試料から骨芽細胞または線維芽細胞に対する刺激活性を持つ生化学的に純粋なオリゴペプチドを単離する方法であって、（ａ）該生物学的試料から、分子量３０００未満のペプチドを除き；（ｂ）工程（ａ）で得た媒体を、骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質と結合するが骨原性成長ポリペプチドに対する抗体とは結合しないポリペプチドと共に、プロテアーゼ阻害剤の存在下に培養して、該骨原性成長ポリペプチド結合蛋白質との複合体から該骨原性成長ポリペプチドを競争的に分離させ；（ｃ）工程（ｂ）により得られた反応媒体から、免疫反応性骨原性成長ペプチドをクロマトグラフ法により分離する方法、およびこの方法により調製された骨芽細胞または線維芽細胞に対して刺激活性を持つ生化学的に純粋なペプチドに関する。更に、本発明は、骨芽細胞または線維芽細胞の形成およびその後の骨形成を刺激する薬理組成物であって、治療有効量の本発明のオリゴペプチドおよび薬理的に許容される担体を含んでなる薬理組成物に関する。図面の簡単な説明図１は、ＲＯＳ１７／２.８およびＭＣ３Ｔ３Ｅ１骨芽細胞ならびにＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞による定常および全irＯＧＰの産生を示す。測定期間中、細胞は、４％ＢＳＡを含む化学的に規定された培地中で成長された。irＯＧＰ決定の為の培地部分は、ＢＳＡ含有培地を添加した直後（「０」時間）および指示した時間後に採取する。定常および全irＯＧＰは、先に記載した通り［バブら、ＥＭＢＯＪ．１１：１８６７；イスラエル特許第１０１７４７号］決定した。図２は、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞を用い上記図１について記載したように調製した２４時間組織培養培地からのirＯＧＰの精製方法を示すフローチャートである。分子量３０００未満のペプチドは、希釈／遠心サイクルを３回繰り返して分離した。次に保持物を［Ｃys¹⁵（ＮＥＭ）］ＯＧＰ−ＮＨ₂と共に培養し、遠心した。濾液を採取し、irＯＧＰを［Ｃys¹⁵（ＮＥＭ）］ＯＧＰ−ＮＨ₂から逆相ＨＰＬＣを用いて分離し、さらに図３に示したように精製した。図３に見られるピーク中の精製irＯＧＰは、自動化エダム分裂によるアミノ酸配列決定に付し、図４に示す増殖活性試験に付した。図３は、逆相バイダックＣ４カラムを用いたirＯＧＰおよび［Ｃys¹⁵（ＮＥＭ）］ＯＧＰ−ＮＨ₂のＨＰＬＣ分離（Ａ）；並びにメルクＣ１８逆相カラムを用いた２つのirＯＧＰピークのＨＰＬＣ分離を示す。破線および実線は、それぞれ弱吸収および免疫活性を示す。図４は、ＯＧＰ（１０−１４）（Ａ）およびＯＧＰ（１０−１４）Ｈis¹³（Ｂ）（それぞれ図３のＢ−１およびＢ−２ピークから回収）の、インビトロにおける骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３Ｅ１に対する効果を示す。破線−正sＯＧＰコントロールの効果。データは、３培地の平均±ＳＥＭである。図５は、合成ＯＧＰ（１０−１４）（○---○---○）およびＯＧＰ（１０−１４）Ｈis¹³（▲−▲−▲）の、インビトロにおける骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３Ｅ１（Ａ）および線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（Ｂ）に対する効果を示す。細胞培養物は、図１および４と同様にセットされ、攻撃された。正sＯＧＰコントロール（□− □−□）参照。データは、処理物のＢＳＡのみのコントロールに対する比、Ｔ／Ｃ比として示され、３培地の平均±ＳＥＭである。図６は、合成Ａc-Ｍef⁰ＯＧＰ（１０−１４）の、インビトロにおける骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３Ｅ１（Ａ）および線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（Ｂ）に対する効果を示す。細胞培養物は、図１および４と同様にセットされ、攻撃された。破線−正 SＯＧＰコントロールの効果。データは、ＢＳＡのみのコントロールに対する比（Ｔ／Ｃ比）として示され、３培地の平均±ＳＥＭである。発明の詳細な説明ＯＧＰは、イン・ビトロにおいて骨芽細胞および線維芽細胞の増殖およびアルカリホスファターゼ活性を刺激し、イン・ビボでラットに投与された場合骨形成と小柱骨マスを増加させることが示された、再生性骨髄から単離される１４−残基ポリペプチドである。ＯＧＰのアミノ酸配列は、以下の通りである：Ａla-Ｌeu-Ｌys-Ａrg-Ｇln-Ｇly-Ａrg-Ｔhr-Ｌeu-Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇly 合成ＯＧＰは、同じアミノ酸配列および生物学的活性を有し、標準的な固相法により調製される。先に記載したように、異なる生物学的液体中で、ＯＧＰはＯＧＰＢＰと複合体を形成すること、およびＣ−末端領域で変性されたsＯＧＰ類縁体は、ＯＧＰ−ＯＧＰＢＰ複合体から全irＯＧＰを競争的に遊離させるのに使用することができることが見い出されてた。本発明者らは、もし競合反応が予め細胞を培養した組織培養培地中またはペプチド活性をもつ生物学的液体で起こるなら、ＯＧＰ−ＯＧＰＢＰから放出されたＯＧＰは、該ペプチダーゼ活性による蛋白質分解劣化を受けることになることを見い出した。驚くべきことに、本発明者らは、該競合反応培地中に存在することが見い出された短いオリゴペプチドが、骨芽および線維芽細胞に対する刺激活性、従って骨形成に対する刺激活性を保持していることを見い出した。従って、本発明は、骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する刺激活性を持ち、２００〜２０００、好ましくは２００〜１０００の分子量を有する生化学的に純粋なオリゴペプチドに関する。特に例示できるオリゴペプチドには、６個またはそれ以上のアミノ酸、好ましくは６〜１０のアミノ酸を有するオリゴペプチドが包含される。特に例示できる他のオリゴペプチドは、３個または４個のアミノ酸を有するオリゴペプチド、およびペンタマーＴyr-Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを除く５個のアミノ酸を有するオリゴペプチドである。本発明の好ましいオリゴペプチドは、アミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇ lyを含んでなる。特に好ましいのは、５個のＣ−末端アミノ酸残基が該アミノ酸配列の５個アミノ酸残基であるオリゴペプチドである。最も好ましいのは、式：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇlyを有するペンタペプチドである。他の好ましいオリゴペプチドは、テトラペプチドＧly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyである。本発明はまた、生物学的試料から骨芽細胞または線維芽細胞に対する刺激活性を持つ生化学的に純粋なオリゴペプチドを単離する方法であって、（ａ）該生物学的試料から、分子量３０００未満のペプチドを除き；（ｂ）工程（ａ）で得た媒体を、骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質と結合するが骨原性成長ポリペプチドに対する抗体とは結合しないポリペプチドと共に、プロテアーゼ阻害剤の存在下に培養して、該骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質との複合体から該骨原性成長ポリペプチドを競争的に分離させ；（ｃ）工程（ｂ）により得られた反応媒体から、免疫反応性骨原性成長ペプチドをクロマトグラフ法により分離する方法に関する。分子量３０００未満のペプチドは、例えば３０００ＭＷのカットオフを持つ限外濾過により除去することができる。プロテアーゼ阻害剤は、市販されている阻害剤、例えばＥ−６４、ロイペプチド（Leupeptide）またはこれらの混合物などであってよい。免疫反応性骨原性成長ペプチドの工程（ｃ）での分離は、使用可能なＨＰＬＣ法により行うことができる。本発明の特定の態様は、実施例に記載されている。本発明の方法により調製された骨芽細胞または線維芽細胞に対する刺激活性を有する生化学的に純粋なペプチドも本発明の範囲の内にある。好ましいそのようなペプチドは、アミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyまたはアミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇlyを含んでなる生化学的に純粋なペプチドである。また本発明の範囲に含まれるのは、式：Ａc-Ｍet-Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇly を持つヘキサペプチドおよび式：Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを持つテトラペプチドである。後記実施例に示すように、本発明のオリゴペプチドは、単離法により得られたものであれ合成されたものであれ、骨芽細胞および線維芽細胞に対する刺激活性を持ち、従って、非常に大きい治療価値を有する。そこで、本発明は、骨芽細胞または線維芽細胞の形成を刺激する薬理組成物であって、骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する剌激活性を持つ、２００〜２０００の分子量を有する生化学的に純粋なオリゴペプチドおよび薬理的に許容される担体を含んでなる薬理組成物に関する。本発明の好ましい薬理組成物は、アミノ酸配列Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇly、Ｔ yr-Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇly、Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyまたはそれらの混合物を含んでなるオリゴペプチドの治療有効量、および薬理学的に許容される担体を含んでなる。本発明の薬理組成物は、骨芽細胞および／または線維芽細胞の刺激、ならびに種々の病的状態、例えばオステオポローシス（またはあらゆる病因のオステオペニア）、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充、または促進された骨形成が要求される他の状態における促進された骨形成に対して有用である。本発明のポリペプチドの治療投与量の大きさは、患者の群（年令、性別など）、処置されるべき症状および使用されるポリペプチドの性質、並びに投与経路にもちろん依存する。どのような場合でも、治療投与量は、関与する医師によって決定される。哺乳類、特にヒトに対して、本発明のポリペプチドの有効量を投与するために、適当な投与経路が採用され得る。静脈または経口投与が好ましい。本発明の薬理組成物は、投与単位形に調製することができる。投与形は、持続放出器具も包含する。組成物は、薬剤学の分野で周知のいかなる方法によっても調製することができる。本発明の薬理組成物は、活性成分として、本発明のオリゴペプチドまたはそのようなオリゴペプチドの混合物を、薬理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤、および必要により他の治療成分中に含んでいる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、採用された用量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝塩などの生理学的に許容される緩衝剤、より一般的にはこの技術分野で既知のすべての担体、賦形剤および安定剤を包含する。実施例組織培養培地からのペンタペプチドの精製およびキャラクタリゼーション物質組織培地成分は、バイオロジカル・インダストリーズ（Biological Industrie s）［イスラエル、ベイト・ヘメク（Beit Haemek）］から購入した。培養容器は、ヌンク（Nunk）［デンマーク、ロスキルデ（Roskilde）］から入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテアーゼ阻害剤およびＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）［ミズリー、セント・ルイス］から入手した（カタログ番号Ａ−７０３０）。セントリコン（Cent ricon）−３マイクロコンセントレイターは、アミコン社（Amicon Inc.）［マサチューセッツ、ビバリー（Beverly）］から購入した。t-Ｂoc-ＧlyＯＣＨ₂-Ｐam 樹脂、Ｎ-Ｂox保護アミノ酸誘導体、Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢt）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）は、アプライド・バイオシテムズ社（Applied Biosystems Inc.）［カリフォルニア、フォスター・シティ（Foster City）から入手した。フッ化水素（ＨＦ）は、マセソン（Mathesohn ）［ニュジャジー、セカクス（Secacus）］から購入した。Ｂoc-３-Ｉ-Ｔyr（ＢＺ１）-ＯＨは、バケム（Bachem）［カリフォルニア、トランス（Torrance）］から、ｐ−クレゾールは、アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical Co.）［ウイスコンシン、ミルオーキー（Milwaukee）］から、およびセファデックス（Sephadex）Ｇ１５Ｆは、ファルマシア［スウェーデン、ウプサラ（Uppsala）］から入手した。Ｃ１８逆相カラムおよびアセトニトリルは、メルク社（E．Mer k）［ドイツ、ダルムシュタット（Darmstadt）］から購入した。Ｃ４逆相カラムは、ザ・セパレイション・グループ（The Separation Group）（カリフォルニア、ヘスパリア（Hesparia）］から購入した。方法組織培養培地中でのirＯＧＰの蓄積の測定ＲＯＳ１７／２.８またはＭＣ３Ｔ３Ｅ１骨芽細胞またはＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を添加したα−ミニマル・エッセンシャル・メディアム（Minimal Essential Medium）に保持し、週に２回継代培養した。実験用の細胞は、集密での維持培地から誘導した。実験のため、細胞を１×１０⁴細胞／cm²で２５cm³組織培養フラスコに接種した。培地をＣＯ₂空気中３７℃で培養した。最初の４６時間、培地に、１０％ＦＣＳおよび０.２％ヌクレオシド／リボヌクレオシドを補充し、続いて、血清不存在条件での１２時間の飢餓期間を設けた。続いて、血清不含有培地を、４％ＢＳＡ含有培地８mlに替えた。irＯＧＰ決定の為の培地部分０.５mlを、ＢＳＡ含有培地添加直後（「０」時間）、並びにそれから１２、２４、３６および４８時間後に採取した。これら培地部分について、従来の上記方法［バブら（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１：１８６７；イスラエル特許第１０１７４７号］により、定常状態および全irＯＧＰを決定した。 irＯＧＰおよびＯＧＰＢＰの分離図２は、irＯＧＰおよびＯＧＰＢＰの分離方法を図式的に示す図である。飢餓期間から２４時間後に採取した培地サンプル３.７５mlを、等量のリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）により希釈した（１：１）。希釈した培地を、マルチプルセントリコン−３マイクロコンセントレイター［アミコン社、マサチューセッツ、ビバリー］おり、５０００×ｇで１.５時間遠心した。分子量３０００より小さいポリペプチドは、希釈剤としてｐＨ７.０の１６５nＭ酢酸アンモニウム中の１mＭナトリウムアジドを用いて希釈／遠心サイクルを３回繰り返すことにより、保持物さら洗い去った。各マイクロコンセントレイターにおいて許容される最小保持容積は２５０μｌであった。ＯＧＰ−ＯＧＰＢＰ複合体からirＯＧＰを遊離させる為、１：１希釈保持物を、先に記載［イスラエル特許第１０１７４７号］の通りに調製した４５０nmol／ml［Ｃys¹⁵（ＮＥＭ）］ＯＧＰ−ＮＨ₂を用いて、５０μ ＭＥ−６４、５０μＭロイペプチンおよび５００μＭＰＭＳＦを含む１６５nＭ酢酸アンモニウム中、３７℃で３０分間培養し、再遠心した。 irＯＧＰおよび［Ｃys¹⁵（ＮＥＭ）］ＯＧＰ−ＮＨ₂の分離マイクロコンセントレイション工程により得た濾液を、最終容積６００μｌまで部分的に蒸発した。濾液のirＯＧＰ含有量は０.３１nmolであった。濾液を３つの等しい部分に分けた。これら試料液体それぞれの中のirＯＧＰを、逆相バイダック（Vydac）プロテインＣ４カラムを用いたＨＰＬＣにより、流速１ml／min .においてアセトニトリル傾斜ラン：３ml１２％アセトニトリル；および３０ml １２〜１９％アセトニトリルを用いて、［Ｃys¹⁵（ＮＥＭ）］ＯＧＰ−ＮＨ²から分離した。２つのirＯＧＰピークの分離Ｃ４カラムから回収された主irＯＧＰピークを含む０.５mlフラクションをプールし、最終容積４００μｌまで部分的に蒸発した。このピークのirＯＧＰ含有量は０.２６nmolであった。濾液を２つの等しい部分に分けた。各部分のirＯＧＰを、流速１ml／min．においてアセトニトリル傾斜ラン：３ml１４％アセトニトリルおよび３０ml１４〜１９％アセトニトリルを用いた逆相Ｃ１８カラムでのＨＰＬＣに付した。アミノ酸配列の決定Ｃ１８カラムから回収された２つのirＯＧＰピーク中の蛋白質を、アプライド・バイオシステムズから提供されたプログラムおよび試薬を用いた同社の４７０Ａシークエンサーによる自動化ペプチド配列分析に付した。遊離されたアミノ酸誘導体を、オンラインＨＰＬＳシステムにより同定した。結果図１は、実験した３つの細胞系全てにおいて、飢餓および化学的に規定した培地への暴露から２４時間後に、全irＯＧＰがピークに達していることを示している。この時間は、培地の集密状態に一致する。次の２４時間では、全irＯＧＰが約５０％減少した。定常状態irＯＧＰは、全検出期間中、ほぼ直線的に増加した。これらの結果は、間質細胞がirＯＧＰおよびＯＧＰＢＰを産生することを示している。irＯＧＰおよび／またはＯＧＰＢＰの合成速度は、培地が集密状態に達した時から減少する。ＭＣＴ３Ｅ１細胞からの２４時間培養培地を、繰り返し希釈／遠心サイクルにかけて、未結合irＯＧＰおよび分子量３０００未満の他の蛋白質を除いた（図２）。このようにすると、全irＯＧＰのたった０.９６％しか捨てられなかった。残部のirＯＧＰは、ＯＧＰ−ＯＧＰＢＰ複合体の形で残り、その高分子量の故に保持物中に含まれていた（表Ａ）。［Ｃys¹⁵（ＮＥＭ）］ＯＧＰ−ＮＨ₂のＨＰＬＣ分離により、３つの主要弱吸収ピークができた。［Ｃys¹⁵（ＮＥＭ）］ＯＧＰ−ＮＨ₂ の位置と同様の位置において１９.５〜２３.５分の保持時間で溶出されるこれらピークのより大きいものは、同じ条件下で別個に流出した。このピークは、ＯＧＰ免疫活性を示さなかった。他のピークは共に、相互にごく部分的に別れており、高いirＯＧＰ含有量を示し（図１Ａ）、培養培地中に存在する全irＯＧＰの１１.５％であった（表Ａ）。irＯＧＰにおけるこの減少のほとんどは、ペプチダーゼ阻害剤の存在にも拘わらず、置換反応中のペプチダーゼ活性に起因している。これらirＯＧＰピークの分離を促進する為、それぞれのフラクション（保持時間１１〜１２.５分）をプールし、第２のＨＰＬＣ工程に付した。その結果、２つのはっきり別れた弱吸収ピークが現れ、両者は高いirＯＧＰ含有量を示した（図１Ｂ）。これらピークを、Ｂ−１およびＢ−２と呼ぶ。保持時間２３.５〜２４分および２５〜２５.５分で溶出されたそれそれのフラクションをプールした。プールしたフラクションの一部を、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞アッセイにおける増殖効果を試験する為に用いた。アミノ酸配列決定により、ピークＢ−１は、ＯＧＰのＣ−末端領域（残基１０〜１４）と同一のペンタペプチドを含んでいることが分かった。ピークＢ−２は、ＯＧＰのＧly¹³がＨisにより置換された類似のペンタペプチドを含んでいた（表Ｂ）。ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞アッセイ中のそれぞれのピークの増殖活性は、１０^-13Ｍにピークを持つポジティブsＯＧＰのピークと同一であった（図４）。実施例２−合成ペンタペプチドの活性ペプチド合成本発明の合成ペプチドを、メリフィールド（Merifield）の固相法［メリフィールド（１９６９）Adv．Enzymol．３２：２２１］により、アプライド・バイオシテムズモデル４３０Ａ自動化ペプチドシンセサイザー（アプライド・バイオシテムズ社。カリフォルニア、フォスター・シティ）を用いて調製した。ペプチド遊離酸の場合、合成は、０.５mmolt-ＢＯＣ−Ｇly-ＰＡＭ樹脂（１％架橋。０. ６１ミリ当量／ｇ）について行った。アミド化テトラペプチドについては、t-ＢＯＣ−Ｇly-ＭＢＨＡ樹脂（１％架橋。０．６６ミリ当量／ｇ）を用いた。アミノ酸誘導体は、α−アミノ官能基において、t-ブチルオキシカルボニル（Ｂoc）基により保護した。チロシン側鎖の保護は、Ｚによる。アミノ酸誘導体を、ヘイジメア（Hagemaier，H.）およびフランク（Frank，H.）のＤＣＣ−メディエイテッド・パーフォームド・シンメトリカル・アンハイドライド（ＤＣＣ−mediated performed symmetrical anhydride）法によりカップリングした［ホップ−ザイラーズ（Hoppe-Seyler's）Ｚ．（１９７２）Physiol．Chem．３５３：１９７３］。各アミノ酸残基のカップリングを２回繰り返した。ブロックされたアミノ末端の脱保護は、ＤＣＭ中の２５％ＴＦＡにより処理して行った。アニソール４ml および液体ＨＦ３６mlの混合物を０℃で７５分間使用するＨＦ法により、側鎖を脱保護し、ペプチドを開裂した。粗合成ペプチドは、ウォターズμボンドパーク（Waters μ Bond Park，登録商標）Ｃ１８カラム（１.９×１５.０cm）を備えたメルク−ヒタチ（Merk-Hitachi）６５５Ａ−１１ＨＰＬ装置により精製した。カートリッジには、流速６.０ml/min.で、ＴＦＡを含む直線傾斜のアセトニトリル（表Ｃ）をポンプで送った。ＢＨ−ＯＧＰ（１１−１４）（ＢＨ＝ボルトン−ハンタ（Bolton-Hunter））は、ミシェロット（Michelot，R.）らの方法［ミシェロットら（１９８０）Bioc hem．Biophys．Res．Comm．９５：４９１−４９８］により、３−（３−ヨード −４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルを精製ＯＧＰ（１１−１４）と反応させて得た。表Ｄに、本明細書で使用した名称とペプチドのアミノ酸配列の対応を示す。結果ＭＣ３Ｔ３Ｅ１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞アッセイにおける各ペンタペプチドの増殖効果は、sＯＧＰ正コントロールと同様であった。それぞれのピーク活性は、ペプチド濃度１０^-13および１０^-11〜１０^-10Ｍにあった（図５）。実施例３−ヘキサペプチドの増殖効果Ａc-Ｍet°［ＯＧＰ（１０−１４）］のヘキサペプチドを、代謝および結合研究にＡc-［³⁵Ｓ］Ｍet［ＯＧＰ（１０−１４）］を用いることの可能性を試験する為に、調製した。結果Ａc-Ｍet°［ＯＧＰ（１０−１４）］は、sＯＧＰ正コントロールの場合と非常に類似し、それぞれペプチド濃度１０^-13および１０^-11Ｍにおいてピークを持つように、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を刺激した（図６）。実施例４−テトラー、トリーおよびジ−ペプチドの増殖効果５種のテトラペプチド全ては、それぞれ１０^-13および１０^-11Ｍのペプチド濃度にピークを持って、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する用量依存性を有していた。各細胞系におけるＢＨ−ＯＧＰ（１１−１４）ピーク効果の強さは、最高であり、sＯＧＰ正コントロールの強さと同等であった。ＯＧＰ（１１−１４）、ＯＧＰ（１０−１３）およびＯＧＰ（１０−１２）のピーク活性は、中間的な値を示した。ＯＧＰ（１１−１４）ＮＨ₂は、最も低いピーク効果を示した。ＯＧＰ（１２−１４）、ＯＧＰ（１１−１３）、ＯＧＰ（１３−１４）およびＯＧＰ（１１−１２）は、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して影響を与えなかった（表Ｅ）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年４月２１日【補正内容】請求の範囲１．骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する刺激活性を持ち、２００〜１０００の分子量を有する生化学的に純粋なオリゴペプチド。２．３、４または５個のアミノ酸を含んでなり、配列Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇ lyを有するペンタマーではない、骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する刺激活性を持つオリゴペプチド。３．アミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇlyを含んでなる請求の範囲１または２に記載のオリゴペプチド。４．５つのＣ−末端アミノ酸残基が、規定されたアミノ酸配列の５つのアミノ酸残基である請求の範囲３に記載のオリゴペプチド。５．式Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇlyを有する請求の範囲４に記載のペンタペプチド。６．アミノ酸配列：Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを含む請求の範囲１または２に記載のオリゴペプチド。７．４つのＣ−末端アミノ酸残基が、規定されたアミノ酸配列の４つのアミノ酸残基である請求の範囲６に記載のオリゴペプチド。８．式Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを含む請求の範囲７に記載のオリゴペプチド。９．Ｎ−末端において配列Ａc-Ｍet-Ｔyrで延伸され、式Ａc-Ｍet-Ｔyr-Ｇly- Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを有する請求の範囲６に記載のペプチド。１０．生物学的試料から、請求の範囲１〜９のいずれかに記載の骨芽細胞または線維芽細胞に対する刺激活性を持つ生化学的に純粋なオリゴペプチドを単離する方法であって、（ａ）該生物学的試料から、分子量３０００未満のペプチドを除き；媒体を残し、（ｂ）工程（ａ）で得た媒体を、骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質と結合するが骨原性成長ポリペプチドに対する抗体とは結合しないポリペプチドと共に、プロテアーゼ阻害剤の存在下に培養して、該骨原性成長ポリペプチド結合蛋白質との複合体から該骨原性成長ポリペプチドを競争的に分離させ；（ｃ）工程（ｂ）により得られた反応媒体から、免疫反応性骨原性成長ペプチドをクロマトグラフ法により分離する方法。１１．工程（ａ）において、分子量３０００未満のペプチドを、３０００ＭＷのカットオフを持つ限外濾過により除く請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．該プロテアーゼ阻害剤が、Ｅ−６４、ロイペプチンまたはＰＭＳＦ、もしくはそれらの混合物である請求の範囲１０または１１記載の方法。１３．工程（ｃ）において、免疫活性骨原性成長ペプチドをＨＰＬＣにより分離する請求の範囲１０〜１２のいずれかに記載の方法。１４．請求の範囲１０〜１３のいずれかに記載の方法により調製された骨芽細胞または線維芽細胞に対して剌激活性を持つ生化学的に純粋なペプチド。１５．アミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを含んでなる請求の範囲１４に記載の生化学的に純粋なペプチド。１６．アミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇlyを含んでなる請求の範囲１４に記載の生化学的に純粋なペプチド。１７．アミノ酸配列：Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを含んでなる請求の範囲１４に記載の生化学的に純粋なペプチド。１８．請求の範囲１〜９および１４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチドおよび薬理的に許容される担体を含んでなる薬理組成物。１９．請求の範囲１〜９および１４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチドおよび薬理的に許容される担体を処方することを含んでなる薬理組成物の調製方法。２０．ヒトまたは動物の体の手術、治療または検査による処置の方法において使用するための、請求の範囲１〜８および１４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチド。２１．処置方法が、骨芽細胞または線維芽細胞形成の剌激、オステオペニア症状、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充および促進された骨形成が要求される他の状態における骨形成の刺激のためである請求の範囲２０に記載のオリゴペプチド。２２．骨芽細胞または線維芽細胞形成の剌激、オステオペニア症状、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充および促進された骨形成が要求される他の状態における骨形成の剌激のための薬剤の製造における、請求の範囲１〜９および１４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチドの使用。２３．骨芽細胞または線維芽細胞形成の剌激、オステオペニア症状、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充および促進された骨形成が要求される他の状態における骨形成の刺激のためのヒトまたは動物患者の治療方法であって、ヒトまたは動物患者に、請求の範囲１〜９および1４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチドの治療有効量を投与することを含んでなる治療方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バブ、イタイイスラエル国エム・ピー・アヤロン、カーメイ・ヨゼフ、ハテーナ・ストリート 26番 (72)発明者マールラッド、アンドラスイスラエル国エルサレム、ネブ・シャーナン・ストリート 29／エー番 (72)発明者チョレブ、マイケルイスラエル国エルサレム、ファインスタイン・ストリート 135／４番 (72)発明者シュテヤー、アリエイスラエル国ムバセレット・ジオン、ハーラジン・ストリート 37番 (72)発明者グリーンバーグ、ズビイスラエル国ジバット・ジーブ、ヨシュア・ベン―ナン・ストリート 19番 (72)発明者マンシュール、ナライスラエル国 72462 ラムラ、ジボレイ・イスラエル・ストリート３／24番

Claims

【特許請求の範囲】１．骨芽細胞および／または線維芽細胞に対する剌激活性を持ち、２００〜２０００の分子量を有する生化学的に純粋なオリゴペプチド。２．２００〜１０００の分子量を有する請求の範囲１に記載のオリゴペプチド。３．アミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇlyを含んでなる請求の範囲１に記載のオリゴペプチド。４．５つのＣ−末端アミノ酸残基が、規定されたアミノ酸配列の５つのアミノ酸残基である請求の範囲３に記載のオリゴペプチド。５．式Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇlyを有する請求の範囲４に記載のペンタペプチド。６．アミノ酸配列：Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを含む請求の範囲１に記載のオリゴペプチド。７．４つのＣ−末端アミノ酸残基が、規定されたアミノ酸配列の４つのアミノ酸残基である請求の範囲６に記載のオリゴペプチド。８．式Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを含む請求の範囲７に記載のオリゴペプチド。９．式：Ａc-Ｍet-Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを有する請求の範囲１に記載のヘキサペプチド。１０．生物学的試料から、骨芽細胞または線維芽細胞に対する剌激活性を持つ生化学的に純粋なオリゴペプチドを単離する方法であって、（ａ）該生物学的試料から、分子量３０００未満のペプチドを除き；媒体を残し、（ｂ）工程（ａ）で得た媒体を、骨原性成長ポリペプチド結合性蛋白質と結合するが骨原性成長ポリペプチドに対する抗体とは結合しないポリペプチドと共に、プロテアーゼ阻害剤の存在下に培養して、該骨原性成長ポリペプチド結合蛋白質との複合体から該骨原性成長ポリペプチドを競争的に分離させ；（ｃ）工程（ｂ）により得られた反応媒体から、免疫反応性骨原性成長ペプチドをクロマトグラフ法により分離する方法。１１．工程（ａ）において、分子量３０００未満のペプチドを、３０００ＭＷのカットオフを持つ限外濾過により除く請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．該プロテアーゼ阻害剤が、Ｅ−６４、ロイペプチンまたはＰＭＳＦ、もしくはそれらの混合物である請求の範囲１０または１１記載の方法。１３．工程（ｃ）において、免疫活性骨原性成長ペプチドをＨＰＬＣにより分離する請求の範囲１０〜１２のいずれかに記載の方法。１４．請求の範囲１０〜１３のいずれかに記載の方法により調製された骨芽細胞または線維芽細胞に対して剌激活性を持つ生化学的に純粋なペプチド。１５．アミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを含んでなる請求の範囲１４に記載の生化学的に純粋なペプチド。１６．アミノ酸配列：Ｔyr-Ｇly-Ｐhe-Ｈis-Ｇlyを含んでなる請求の範囲１４に記載の生化学的に純粋なペプチド。１７．アミノ酸配列：Ｇly-Ｐhe-Ｇly-Ｇlyを含んでなる請求の範囲１４に記載の生化学的に純粋なペプチド。１８．請求の範囲１〜９および１４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチドおよび薬理的に許容される担体を含んでなる薬理組成物。１９．請求の範囲１〜９および１４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチドおよび薬理的に許容される担体を処方することを含んでなる薬理組成物の調製方法。２０．ヒトまたは動物の体の手術、治療または検査による処置の方法において使用するための、請求の範囲１〜８および１４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチド。２１．処置方法が、骨芽細胞または線維芽細胞形成の剌激、オステオペニア症状、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充および促進された骨形成が要求される他の状態における骨形成の刺激のためである請求の範囲２０に記載のオリゴペプチド。２２．骨芽細胞または線維芽細胞形成の刺激、オステオペニア症状、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充および促進された骨形成が要求される他の状態における骨形成の剌激のための薬剤の製造における、請求の範囲１〜９および１４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチドの使用。２３．骨芽細胞または線維芽細胞形成の刺激、オステオペニア症状、骨折修復、傷の治療、骨内インプラントおよび骨補充および促進された骨形成が要求される他の状態における骨形成の剌激のためのヒトまたは動物患者の治療方法であって、ヒトまたは動物患者に、請求の範囲１〜９および１４〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチドの治療有効量を投与することを含んでなる治療方法。