DE69426596T2

DE69426596T2 - Verfahren zur herstellung eines virus aerosols

Info

Publication number: DE69426596T2
Application number: DE69426596T
Authority: DE
Inventors: Didier Lamy; Claude Sene
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1993-10-26
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 2001-05-31
Anticipated expiration: 2014-10-27
Also published as: US20020106349A1; DK0680315T3; ATE198704T1; JPH08505405A; CA2152505A1; US5952220A; AU8063994A; GR3035541T3; EP0680315A1; DE69426596D1; EP0680315B1; AU683954B2; CA2152505C; FR2711523B1; US6344194B1; JP4110329B2; FR2711523A1; ES2152993T3; PT680315E; WO1995011664A1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Aerosols, umfassend ein Virus, und die Verwendung eines solchen Aerosols zur Herstellung eines Medikaments.
Die Aerosol-Formulierung verschiedener Substanzen, insbesondere von medikamentösen Substanzen, ist seit langem bekannt. Die Stabilität und die vernachlässigbare Abfallgeschwindigkeit stellen die wesentlichen Eigenschaften eines Aerosols dar. Aus diesem Grund muß die Dosierung einerseits einer bestimmten Anzahl von spezifischen Bedingungen genügen, um zu vermeiden, daß die Partikel untereinander aggregieren oder eine zu hohe Abfallgeschwindigkeit zeigen, Eigenschaften, die mit einer guten Wirksamkeit inkompatibel sind, wobei insbesondere verschiedene Umweltparameter von Bedeutung sind wie der Feuchtigkeitsgrad und die Temperatur, und andererseits muß die Formulierung eine bestimmte Anzahl von Schwierigkeiten berücksichtigen, die im wesentlichen mit der Wirksamkeit der Verteidigung des Respirationstrakts gegen Kontaminanten zusammenhängen (Reinigungsmechanismen), der eine Tendenz zum schnellen Abbau der inhalierten aktiven Wirkstoffe zeigt.
Insbesondere ist für den Fall, daß der aktive Wirkstoff von einem Virus gebildet wird, die Unversehrtheit der viralen Partikel für die Infektion und die Penetration in die Zellen des Pulmonarepithels notwendig, was sehr spezifische Herstellungsbedingungen für das Aerosol erfordert.
In allgemeiner Weise kann während einer Aerosolbildung ein Virus aufgrund von drei Hauptursachen inaktiviert werden. Zunächst kann der Verlust der Infektionskraft aus Schäden resultieren, die das Virus während des Vernebelungsverfahrens (Pulverisierung in den Atemwegen) erleidet, er kann genauso im Aerosol durch Dehydratation inaktiviert werden, und schließlich kann er in der potentiell feindlichen Umgebung abgebaut werden, die der Schleim darstellt, welcher die Gesamtheit des Respirationstrakts bedeckt und eine große Anzahl an Enzymen (proteolytische und andere) enthält.
Man hat mittlerweise gezeigt, daß die virale Inaktivierung beschränkt und in vernünftigen Grenzen gehalten werden kann, indem für die Herstellung des Aerosols das erfindungsgemäße Verfahren angewendet wird, bei dem bestimmte Bedingungen der Vernebelung und der Konditionierung angewendet werden. Dieses Verfahren ermöglicht darüber hinaus die effiziente Zuführung des Virus in geeigneter Menge in die Lunge, insbesondere im Bereich des Tracheo- Bronchialtrakts.
Daher ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines viralen Aerosols, dadurch charakterisiert, daß man eine verdünnte virale Suspension herstellt, entsprechend einer Verdünnung einer viralen Suspension, die 10&sup4; bis 10¹³ Plaque-bildende Einheiten (ufp) eines Virus in einer wäßrigen Lösung enthält, enthaltend mindestens 6 bis 12 g/Liter eines Salzes eines monovalenten Kations oder 50 bis 100 g/Liter einer Hexose.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist für eine sehr große Anzahl an Viren anwendbar, die auf dem Aerosol-Weg verabreichbar sind, insbesondere die Viren, die ausgewählt werden aus der aus Poxvirus, Retrovirus, Herpesvirus, mit Adenoviren zusammenhängendem Virus, Rhinovirus, Influenzavirus und Adenovirus bestehenden Gruppe.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Virus" ein natürliches Virus, wie es in der Natur vorkommt, und genauso ein modifiziertes Virus, dessen Genom Modifikationen im Vergleich zu dem des Stammvirus umfaßt, von dem es stammt. Es kann sich um ein abgeschwächtes Virus handeln, das die ganze oder einen Teil seiner pathogenen Kraft im Vergleich zum natürlichen Virus verloren hat, aus dem es erhalten wurde. Sein Genom wird in vivo im Verlauf von aufeinanderfolgenden Passagen in Zellkulturen oder in einem lebenden Organismus modifiziert.
Der Begriff "Virus" kann auch ein rekombinantes Virus bezeichnen, dessen Genom in vitro durch gentechnische Methoden modifiziert wird. Die Modifikation kann beispielsweise die Inaktivierung von mindestens einem für die virale Replikation wesentlichen Gen (was das Virus für die Replikation unvollständig macht) und/oder die Insertion eines DNA-Fragments ermöglichen, das für ein heterologes Protein kodiert (das normalerweise im natürlichen Virus nicht kodiert wird). Die Insertion findet in einer geeigneten Region des viralen Genoms statt, so daß die Expression des heterologen DNA-Fragments in einer Wirtszelle ermöglicht wird. Eine Wirtszelle wird von jeder durch das Virus infizierbaren eukaryotischen Zelle gebildet, vorteilhafterweise eine menschliche Zelle und bevorzugt eine Epithelzelle des Tracheo- Bronchialtrakts.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das heterologe DNA-Fragment aus einem eukaryothischen Organismus oder aus einem Virus stammen, das von dem verschieden ist, in das es insertiert wird. Es kann durch jede im Stand der Technik übliche Technik isoliert werden, beispielsweise durch Klonierung, PCR (Polymerase Chain Reaction) oder chemische Synthese. Es kann sich um ein DNA-Fragment vom genomischen Typ (umfassend einen Teil oder die Gesamtheit der Introns des natürlichen Gens), vom Typ Komplementär-DNA (cDNA; frei von Introns) oder vom Typ Minigen handeln, d. h. gemischt (umfassend mindestens ein ganzes oder ein Teil eines Introns).
In Übereinstimmung mit den von der vorliegenden Erfindung verfolgten Zielen kann das heterologe DNA-Fragment unter Kontrolle von notwendigen Kontrollelementen für die Expression gestellt werden. Unter "notwendigen Elementen" versteht man die Gesamtheit der Elemente, die die Transkription des DNA-Fragments in Messenger-RNA (mRNA) oder die Translation der RNA zum Protein ermöglichen.
Das heterologe DNA-Fragment kann kodieren für (i) ein intracelluläres Protein, (ii) ein Membranprotein, das auf der Oberfläche der Wirtszelle vorhanden ist, oder (iii) für ein Protein, das in das externe Medium sezerniert wird. Es kann daher eine Signalsequenz umfassen, die die Sezernierung des Proteins zur Membran oder aus der Wirtszelle hinaus ermöglicht.
Zahlreiche rekombinante Viren, die von einer Gabe auf dem Aerosol-Weg Nutzen ziehen können, sind im Stand der Technik beschrieben. Ihre Konstruktion und Vermehrung sind dem Fachmann bekannt. Als Beispiele können angegeben werden Ad-α-1AT (Rosenfeld et al., 1991, Science, 252, 431 bis 434), in dessen Genom das Human-Gen insertiert ist, das für α-1- Antitrypsin (alpha1AT) kodiert, und Ad-CFTR (Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68, 143 bis 155), in dessen Genom das Human-Gen insertiert ist, das für das Protein CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, auf Englisch) kodiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet die Herstellung einer verdünnten viralen Suspension. Diese verdünnte virale Suspension entspricht einer Verdünnung einer viralen Suspension, enthaltend 10&sup4; bis 10¹³ upf Virus in einer wäßrigen Lösung, enthaltend mindestens 6 bis 12 g/Liter eines Salzes eines monovalenten Kations oder 50 bis 100 g/Liter einer Hexose.
In diesem Schritt wird die zu verdünnende Suspension allgemein aus Viren gebildet, die in ein gepuffertes Medium gegeben werden, welches gegebenenfalls ein bivalentes Kation wie Magnesium, Calcium oder Mangan enthält. Dieser Typ Suspension ist genauso für die Lagerung verwendbar. Für eine Lagerung in gefrorener Form ist es bequem, die Suspension mit einem Stabilisierungsmittel wie Glycerin in einer Konzentration von mindestens 10% oder Saccharose mit einer Konzentration von ungefähr 1M zu versetzen.
Die zu verdünnende Suspension viraler Partikel kann gegebenenfalls weitere Substanzen umfassen, insbesondere Human-Serum-Albumin (HSA), Harnstoff, Natriumglutamat, Glycin und Inositol.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es notwendig, daß die virale Suspension 10&sup4; bis 10¹³, vorteilhafterweise 10&sup6; bis 10¹² und bevorzugt 10 g bis 10¹¹ upf eines Virus umfaßt, wobei die Aktivität dieser Suspension insbesondere vom verwendeten Virus abhängen kann.
Diese zu verdünnende Suspension wird anschließend mit einer wäßrigen Lösung nach einem Volumenverhältnis Suspensionlwäßrige Lösung von 1/5 bis 1/20, vorteilhafterweise von 1/10 bis 1/20, bevorzugt von 1/12 bis 1/18 und auf besonders bevorzugte Weise ungefähr 1/16 verdünnt.
Die wäßrige Lösung umfaßt bevorzugt 6 bis 12 g eines Salzes eines monovalenten Kations, bevorzugt ein Salz von Natrium oder ein Salz von Kalium und auf besonders bevorzugte Weise Kaliumchlorid, Natriumlactat und/oder Natriumchlorid. Man bevorzugt eine Salzkonzentration eines monovalenten Kations von 6 bis 10 g/Liter, besonders bevorzugt ungefähr 9 g/Liter.
Wenn die wäßrige Lösung 50 bis 100 g einer Hexose und bevorzugt ungefähr 50 g/Liter umfaßt, handelt es sich insbesondere um Glucose und Mannose.
Darüber hinaus kann die wäßrige Lösung weitere Verbindungen umfassen, wie ein Calciumsalz, beispielsweise Calciumchlorid.
Die so verdünnte Suspension ermöglicht die Erzeugung eines Aerosols, dessen besondere Stabilität im Respirationstrakt ausreicht, um die Passage des Virus zu ermöglichen. Selbstverständlich ist es möglich, eine entsprechende virale Suspension durch eine andere Schrittfolge zu erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders adaptiert für die Herstellung eines Aerosols für therapeutische Zwecke, zur Zuführung einer optimalen Menge von viralen Partikeln in die Tracheo-Bronchialwege des Respirationstrakts.
Auf allgemeine Weise ist bei Menschen der Respirationstrakt aus drei unterschiedlichen Regionen aufgebaut;
- der obere Teil, der sich von der Nase bis zum oberen Ende der Luftröhre erstreckt;
- die Tracheo-Bronchialwege, die vom oberen Ende der Luftröhre bis zu den terminalen Bronchiolen reichen; und
- die alveoläre Region, die sich von den Bronchiolen bis zu den Alveolen erstreckt.
Von den Krankheiten, die durch Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens behandelt werden können, kann man die pulmonaren Erkrankungen angeben, die die Tracheo- Bronchialwege befallen und insbesondere die Mucoviscodose; Lungenemphysem, Asthma und Lungenkrebs.
In diesem Zusammenhang sind die erfindungsgemäßen Viren bevorzugt rekombinante Viren, deren Genom ein DNA-Fragment umfaßt, das für ein heterologes Protein kodiert, welches insbesondere zur Inhibierung oder Verlangsamung des Fortschreitens einer Lungenkrankheit oder zur Verhinderung ihrer Entstehung fähig ist. Von den heterologen Proteinen können diejenigen angegeben werden, die fähig sind:
- zur direkten oder indirekten Beteiligung am Jonentransport durch die cellulären Membranen, und genauer gesagt beim Transport von Chloridionen (C1&supmin;) oder Natriumionen (Na&spplus;), wie das Protein CFTR (Riordan et al., Science, 245, 1066 bis 1073);
- zur Verminderung der Aktivität der Proteasen, die in den Lungen vorhanden sind, insbesondere unter entzündeten Bedingungen, wie natives α1AT (Long et al., 1984, Biochemistry, 23, 4828 bis 4837) oder modifiziertes α1AT (Jallat et al., 1986, Protein Engineering, 1, 29 bis 35); und
- zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen durch Verstärkung der Zellimmunität wie Interleukine (IL), Interferone (IFN) oder Tumornekrosefaktoren (TNF), und die eine Tumorunterdrückende Aktivität aufweisen wie Protein p53 (Baker et al., 1989, Science, 244, 217 bis 212) oder Rb (Friend et all, 1986, Nature, 323, 643 bis 646).
Diese Liste ist nicht beschränkend für die Fragmente. DNA-Fragmente, die für andere in der Literatur wegen ihrer antitumoralen Wirkung oder ihrer inhibitorischen Wirkung im Hinblick auf die Zerstörung von Lungengeweben beschriebene Proteine kodieren, können verwendet werden.
So betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines viralen Aerosols, das erhalten werden kann durch das oben beschriebene Verfahren, für die Herstellung eines Medikaments, das durch Vernebelung dieser verdünnten viralen Suspension mit einem Gasdruck von 0,5 bis 3,5 bar oder einer Ultraschallfrequenz von 2 bis 5 MHz gegeben wird.
Die Vernebelung der verdünnten Suspension kann durch Gasdruck oder durch Ultraschall erfolgen. Die Bedingungen dieser Vernebelung stellen ebenfalls kritische Parameter der Verfahrensdurchführung dar. Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die verdünnte Suspension einem Gasdruck von 0,5 bis 3,5 bar und in besonders bevorzugter Weise 2 bis 3,5 bar ausgesetzt. Auf alternative Weise kann sie auch einer Ultraschallfrequenz von 2 bis 5 MHz und bevorzugt ungefähr 2 bis 3 MHz unterworfen werden.
Der Gasdruck genauso wie die Ultraschallfrequenz können mit Hilfe eines Vernebelers angewendet werden.
Allgemein ist ein Vernebeler ein Apparat, der die Verabreichung von Aerosolen ermöglicht. Die Vernebeler können jedes Typs sein, und ihre Strukturen sind dem Fachmann bekannt, und diese Apparate sind kommerziell erhältlich.
Wenn es sich um die Anwendung eines Gasdrucks handelt, wendet man bevorzugt einen Vernebeler vom pneumatischen Typ an, der mit einer Quelle von komprimiertem Gas verbunden ist, wie Luft oder medizinischer Sauerstoff, oder mit einer pneumatischen Pumpe. Falls es sich um die Vernebelung einer verdünnten viralen Suspension mit einer Ultraschallfrequenz handelt, wird die Verwendung eines Vernebelers vom Ultraschall-Typ bevorzugt, der mit einem Quarz versehen ist, welcher mit hoher Frequenz vibriert.
Die Inhalation kann mit einer einmaligen oder wiederholten Dosis stattfinden, einmal oder mehrere Male nach einem bestimmten Verzögerungsintervall.
Die Erfindung wird vollständig mit Hilfe der folgenden Beispiele beschrieben:

Beispiel I

Herstellung eines Aerosols, ausgehend von einer viralen Suspension, die in Gegenwart von 10% Glycerin gelagert wird und mit einer Lösung eines monovalenten Kations verdünnt wird.
Eine virale Suspension wird gebildet ausgehend von einem rekombinanten Adenovirus, in dessen Genom das Human-Gen insertiert wird, das für das Protein CFTR (Ad-CFTR) kodiert, so wie in Rosenfeld et al. beschrieben (1992, supra).
Kurz gesagt, stammt er vom Adenovirus-Typ 5, dessen Genom einerseits vom Gen E1A befreit wird, das für ein transaktivierendes für die Replikation des Adenovirus wesentliches Protein kodiert, und andererseits vom nicht wesentlichen E3. Das Gen CFTR wird anstelle des Gens EIA insertiert.
Ad-CFTR wird mit Hilfe der Linie 293 von Human-Embrio-Nierenzellen verwendet (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36, 59 bis 72), die die Funktion E1 in konstitutiver Weise exprimieren. Diese Linie ist beim ATCC verfügbar (CRL 1573). Die Zellen 293 werden entsprechend den Empfehlungen des Lieferanten kultiviert.
Die kultivierten Zellen werden vor der Konfluenz mit einer Anfangsanimpfung des Ad- CFTR-Virus und mit einer Vielzahl von Infektionen (m.o.i.) von 2 bis 10 infiziert. Man inkubiert sie bei 37ºC, und wenn man cytopathische Effekte beobachtet, normalerweise nach 4 bis 10 Kulturtagen, werden die Viren nach dem folgenden Verfahren geerntet.
Man zentrifugiert die celluläre Suspension mit niedriger Geschwindigkeit während 10 Minuten. Der Zellkuchen wird in ungefähr 10 ml GMEM-Medium (Glasgow Modified Eagle Medium, Gibco BRL, Cergy-Pontoise) mit Zusatz von 2% fetalem Kalberserum resuspendiert. Die Viren werden von den Zellen durch mehrere Cyclen Einfrieren/Auftauen in einem Ethanol- Trockeneis/Wasserbad bei 37ºC abgetrennt. Nach dem letzten Cyclus entfernt man den Zellabfall durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit während 5 bis 10 Minuten.
Man reinigt die Viren ausgehend von der überstehenden Flüssigkeit der Zentrifugation durch Fraktionieren mit einem Cäsiumchlorid-Gradienten in zwei Dichtestufen 1,40 bzw. 1,25 g/ml. Man zentrifugiert bei 100000 g während einigen Stunden bei Raumtemperatur. Die Viren erscheinen in Form einer weißen Bande, die an der Grenzfläche der beiden Stufen angeordnet ist, und werden mit Hilfe einer Spritze entnommen. Sie werden einer zweiten Reinigung mit einem selbstgebildeten Cäsiumchlorid-Gradienten unterzogen, der mit Hilfe einer Lösung von 1,33 g/ml hergestellt wurde. Die Viren werden ebenfalls durch Punktieren des Röhrchens mit einer Spritze entnommen, und 1/10 des Volumens an Glycerin wird zugegeben.
Man entfernt das Cäsiumchlorid durch Dialyse gegen einen Puffer, der Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl&sub2; 1 mM und Glycerin 10% enthält.
Der Titer der so erhaltenen viralen Suspension wird präzise nach der Agar- Titrationsmethode oder der 30 h-Titrationsmethode bestimmt (Graham und Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, 7, 109 bis 128, Herausgeber E.J. Murray, The Human Press Inc. Clinton, NJ). Die Suspension wird in Aliquots von 100 ul in die Röhrchen verteilt (Nung oder Nalgene), so daß jedes 5 · 10&sup9; bis 5 · 10¹&sup0; upf enthält. Diese Röhrchen, die den Vorrat der viralen Suspension darstellen, werden bis zu ihrer Verwendung bei -60ºC gelagert.
Im Moment ihrer Verwendung fügt man zu 100 ul der Suspension von Ad-CFTR (mit einer Konzentration von 10&sup7;, 10&sup8; oder 10&sup9; upf) 1,5 ml einer Natriumchlorid-Lösung mit 9 g/Liter (Meram, Melun) zu. Die durchgeführten Kontrollen zeigen, daß der Titer der so erhaltenen verdünnten viralen Suspension bei Raumtemperatur mehrere Stunden stabil ist.
Eine beschleunigte Untersuchung der Stabilität wurde ebenfalls bei 37ºC durchgeführt. Nach Verdünnung der viralen Suspension auf verschiedene Konzentrationen (10&sup9;, 10&sup7;, 10&sup5; ufp/ml) in der vorstehenden Natriumchlorid-Lösung wurde eine Probe jeder Verdünnung in regelmäßigen Intervallen (t = 0 h, 2 h, 4 h und 24 h) entnommen und der Titer der viralen Infektivität durch die Agar-Technik oder 30 h-Technik bestimmt. Man stellt eine Stabilität der verdünnten viralen Suspension bei 37ºC während mehr als 3 Stunden fest, insbesondere bei großer Konzentration (10&sup9; und 10&sup7; ufp/ml).
Man erzeugt ein Aerosol, indem die verdünnte virale Suspension in den Behälter eines Vernebelers Optineb 709 (Air Liquide, Paris) gegeben wird. Es handelt sich um ein Gerät zur pneumatischen Erzeugung, das unter hohem Druck arbeitet und die Auswahl des Gasträgers ermöglicht. Es ist mit einer Quelle für Preßluft verbunden, und man kann einen variablen Druck an medizinischer Luft anwenden. Man führt Aerosolbildungs Versuche durch, um die optimalen Bedingungen für die Anwendung bei Patienten mit Mucoviscidose zu beurteilen. Insbesondere untersucht man die Wirkung des Drucks (von 1 bis 3,5 bar) und des Atemrythmus. Dieser definiert eine Anzahl von Atmungen pro Minute und kann durch die Regelung des Geräts vorherbestimmt werden. In dieser Hinsicht entspricht eine Regelung in Position 7 einem Atemrythmus eines Kindes, während Position 9 dem eines Erwachsenen entspricht.
Die Aerosolbildung wird in drei Schritten durchgeführt (verdünnte virale Suspension, gefolgt von zwei Spülungen des Behälters mit einer verdünnenden Natriumchlorid-Lösung. Optineb wird selbsttrennend geregelt und ist verbunden mit einer Falle oder einem Sammler, beispielsweise dem Collectron MD8 (Sartorius, Palaiseau, Frankreich), an dessen Ende man eine filtrierende Gelatinemembran anbringt, die die Isolierung der viralen Partikel nach der Vernebelung ermöglicht. Diese wird anschließend bei 37ºC in einem Puffer Tris-HCl 10 mM pH 7,4, MgCl&sub2; 1 mM und Glycerin 10% gelöst, und man titriert die Infektivität des rückisolierten Virus mit der Technik 30 h und Agar. Diese Messung ermöglicht die Beurteilung der Menge an aktiven Viren, die in die Atemwege eines Patienten eindringen können. Unter verschiedenen getesteten Bedingungen in relativ wiederholter Weise bilden die abgefangenen infektiösen Viren 15 bis 40% der Anfangszahl der Viren. Obwohl Fluktuationen beobachtet werden, werden die besten Ausbeuten der Wiedergewinnung bei hohem Druck erhalten (3,5 bar), und dies in beiden Regelungspositionen. Als Hinweis ist die Ausbeute der Wiedergewinnung von durch Aerosolbildung angewendeten Medikamenten üblicherweise ungefähr 10%. Diese Ergebnisse ermöglichen das In-Betracht-ziehen der Verwendung der Aerosolbildung von rekombinanten Adenoviren Ad-CFTR für die Behandlung von Patienten mit Mucuviscidose.

Beispiel 2: Herstellung eines Aerosols ausgehend von einer viralen Suspension, die in Gegenwart von 1M Saccharose gelagert wurde und in einer Lösung eines monovalenten Kations verdünnt wird.

Beispiel 1 wird wiederholt mit der folgenden Abweichung:
Nach Isolierung der Viren nach dem zweiten Cäsiumchlorid-Gradienten werden diese gegen einen Puffer Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl&sub2; 1 mM und Saccharose 1M dialysiert. Die Versuche zur Aerosolbildung werden durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben mit einem Druck von 3,5 bar und einer Regelung des Optineb in Position 9. Man erhält eine Wiederisolierungsausbeute der aktiven viralen Partikel von 27%.

Beispiel 3: Herstellung eines Aerosols ausgehend von einer verdünnten viralen Suspension in einer Glucoselösung.

Beispiel 1 wird wiederholt mit der folgenden Abweichung:
Man stellt eine verdünnte virale Suspension her, indem 100 ul der viralen Suspension zu 1,6 ml einer Glucose-Lösung mit 50 g/Liter gegeben werden (Laboratoire Chaix du Marais Lavoisier, Paris).
Wenn man die verdünnte virale Suspension einer beschleunigten Stabilitätsstudiu bei 37ºC unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 definiert unterzieht mit der Ausnahme, daß die Verdünnung mit einer Glucose-Lösung durchgeführt wird, stellt man fest, daß die virale Aktivität mehr als 2 Stunden stabil ist.

Beispiel 4: Herstellung eines Aersols durch Ultraschall-Vibration Beispiel 1 wird wiederholt mit der folgenden Abweichung:

Man erzeugt ein Aerosol, indem ein Ultraschall-Vernebeler SAM LS (System Assistance Medical, Le Ledat, Frankreich) nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird. Die nach Beispiel 1 erhaltene verdünnte virale Suspension wird in die Kammer des Vernebelers gegeben und man unterzieht sie einer Ultraschallvibration, die durch einen mit einer Frequenz von 2,4 MHz vibrierenden Quarz erzeugt wird. Unter diesen Bedingungen ist die Ausbeute der Wiedergewinnung in der Größenordnung von 10%.

Beispiel 5: Vorklinische Versuche bei Primaten.

Das Ziel dieser Versuche ist der Nachweis, daß die Aerosol-Bildung von rekombinanten Adenoviren den Transfer des Gen CFTR in vivo in pulmonare Zellen ermöglicht, und die Beurteilung der Toxizität der Behandlung.

A. Durchführung

Das Experiment schließt 5 Rhesus-Affen (Macaca mulatta) (TNO Center for Animal Research, Reichswall, Niederlande) ein. Die ausgewählten Tiere sind bei guter Gesundheit und wiegen 5 bis 10 kg. Sie wurden in drei Gruppen aufgeteilt:
- Gruppe 1 wird von 2 Affen gebildet, denen man eine einzelne Dosis Ad-CFTR (am Tag J = 0), eine erhöhte Dosis (7,5 · 10&sup9; ufp) (erster) und eine schwache Dosis (1,5 · 10&sup7; ufp) (zweiter) gibt. Sie werden am Tag J + 10 getötet.
- Die Gruppe 2 wird ebenfalls von 2 Affen gebildet, die zwei Gaben mit 10 Tagen Abstand erhalten (J = 0 und J + 10) mit äquivalenten Dosen von Ad-CFTR (jeweils 7,5 · 10&sup9; ufp und 1,5 · 10&sup7; ufp). Diese werden am Tag J + 13 getötet.
- Die Kontrollgruppe umfaßt einen Affen, der mit einer Kontrollflüssigkeit behandelt wird (Tris-HCl 10 mM pH 7,4, MgCl&sub2; 1 mM und Glycerin 10%) nach dem bei Gruppe 2 angewendeten Verfahren (2 aufeinanderfolgende Gaben bei J = 0 und J + 10, bevor er bei J + 13 getötet wird).
100 ul der auf die oben angegebenen Konzentration eingestellten Ad-CFTR-Lösung (Gruppe 1 und 2) oder 100 ul der Kontroll-Lösung (Gruppe 3) werden zu 1,5 ml einer verdünnenden Natriumchlorid-Lösung mit 9 g/Liter gegeben und in die Kammer eines Geräts Optineb gegeben. Die Vernebelung wird mit den anesthätisierten Affen durch Zwischenschalten eines Schlauchs durchgeführt, der in die Luftröhre eingeführt wird und mit dem Vernebeler verbunden ist. Die Verfahrensbedingungen sind wie folgt: Regelung in Position 7, Druck von medizinischer Luft von 3,5 bar und Vernebelung in zwei Schritten (Gabe der verdünnten viralen Lösung, anschließend Spülen mit 800 ul verdünnender Lösung).

8. Analyse der Ausbreitungskraft der Viren

Der Stuhl jedes Tieres wird regelmäßig gesammelt und auf permissiven Zellen 293 oder HepG2 kultiviert, um jeweils die Anwesenheit von rekombinanten viralen Partikeln oder fremden viralen Partikeln zu untersuchen. Nach ungefähr 3 oder 7 Kulturtagen werden diese durch indirekte Immunofluoreszenz mit Hilfe eines spezifischen monoklonalen Antikörpers nachgewiesen, beispielsweise eines Antikörpers, der das Hüllenprotein des Adenovirus 5 erkennt (Bio-Science 012070). Diese Analysen sind erwiesenermaßen bei allen Affen des Experiments negativ, was bedeutet, daß das Risiko der Ausbreitung des Virus in die Umwelt schwach oder sogar null ist.

C. Analyse des Transfers des Gens CFTR in vivo

Die durchgeführte Methode ist beschrieben in Bout et al. (1994, Hum. Gene Therapy, 5, 3 bis 10). Kurz gesagt entnimmt man den getöteten Tieren die wesentlichen Organe (Leber, Testikel... usw.) genauso wie Gewebeproben verteilt entlang den Atemwegen. Nach Extraktion der DNA sucht man die adenoviralen Sequenzen durch PCR mit Hilfe von spezifischen Ad- CFTR-Primern, die an der Verbindung der Expressionskassette von CFTR und des adenoviralen Vektors angeordnet sind, jeweils OTG3042 (SEQ ID NO: 1, Hybridisieren mit derselben Frequenz CFTR) und OTG4347 (SEQ ID NO: 2, der die Sequenz des Adenovirus vom Typ 5 erkennt). Nach 30 Amplifikationscyclen werden die PCR-Produkte durch Elektrophorese auf Agarosegel abgetrennt und auf einer Hybond N + -Membran (Amersham) übertragen, bevor sie mit einer spezifischen Sonde hybridisiert werden (SEQ ID NO: 3), die durch Phosphorylierung mit ³²P markiert wurde. Man erhält ein spezifisches Signal nur in der Luftröhre und den Lungen von Affen der Gruppen 1 und 2, die mit einer erhöhten viralen Dosis behandelt wurden (7,5 · 10&sup9; ufp). Es ist interessant festzustellen, daß alle anderen getesteten Organe negativ sind.
Es ist notwendig, die Empfindlichkeit der Technik zum Nachweis der Gegenwart von adenoviralen Sequenzen bei den Affen nachzuweisen, die die virale Dosis von 1,5 · 10&sup7; ufp erhalten haben. Zu diesem Zweck werden nach den 30 ersten Cyclen der PCR 30 zusätzliche Cyclen durchgeführt, indem OTG3042 und ein interner Primer OTG4908 (SEQ ID NO: 4) angewendet werden. Anschließend werden die PCR-Produkte, wie zuvor angegeben, behandelt. Ein Signal wird in ungefähr der Hälfte der entnommenen Proben der Atemwege erhalten. Es scheint daher, daß die Gabe des Virus durch Aerosol in die Lungen dosisabhängig ist. Selbstverständlich ist die Hybridisierung negativ für den Kontroll-Affen.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, daß Ad-CFTR im Zielorgan enthalten bleibt, nämlich den Atemwegen.

D. Expression des CFTR-Gens in vivo

Die Expression des humanen CFTR-Gens wird in Proben untersucht, die aus den Atemwegen entnommen wurden, durch die Technik der reversen RNA-Transkription gefolgt von einer PCR (Shouldiner et al., 1993, in Methods in Molecular Biology, 15, 169 bis 176, Herausgeber: White, Human Press Inc., Totowa, NJ). Diese Technik, die den Vorteil der hohen Spezifität aufweist, ermöglicht den Nachweis der Gegenwart von mRNA, die für das Human- CFTR kodiert. Die RNA wird aus Proben durch übliche Techniken isoliert. 1 ug Gesamt-RNA wird revers transkribiert in Gegenwart der reversen Transkriptase aus MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus), indem ein Primer verwendet wird, der an seinem 5'-Ende eine einzige Markierungs(tag)-Sequenz aufweist. Genauer gesagt umfaßt diese (OTG5987, SEQ ID NO: 5) 30 Nukleotide der Markierungs-Sequenz und 17 Nukleotide, die dem Polyadenylierungs-Signal entsprechen und die Reassoziierung mit mRNA-CFTR ermöglicht, die aus der Transkription von Ad-CFTR stammt. Die PCR wird anschließend direkt mit der vorstehenden Reaktionsmischung durchgeführt, indem die Primer OTG5988 (SEQ ID NO: 6) und OTG5999 (SEQ ID NO: 7, entsprechend der Markierungs-Sequenz von OTG5987) für die ersten 30 Amplifikationscyclen und anschließend OTG5988 und OTG4748 (SEQ ID NO: 8) für die 30 zusätzlichen Gyclen eingesetzt werden. Die Amplifizierungsprodukte werden wie zuvor beschrieben untersucht.
Die Human-CFTR-RNAs werden in den Proben der Lungenflügel der Affen nachgewiesen, denen man eine oder zwei virale Dosen von 7,5 · 10&sup9; ufp gegeben hat. Im Gegensatz dazu wird kein Signal bei den Proben nachgewiesen, die aus dem Kontroll-Affen und aus den Affen stammen, die die schwache virale Dosis erhalten haben.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Vernebelung von adäquaten Dosen von Ad-CFTR in einer Expression des funktionellen CFTR-Gens in den Lungenzellen resultiert und sind besonders ermutigend im Hinblick auf die Behandlung von Mucoviscodose durch Gen-Therapie.

E. Pathologie

Allgemein ist die Vernebelung von Ad-CFTR nicht von Gewichtsverlusten, anormalem Verhalten der Affen oder signifikanten Störungen der biochemischen und hämatologischen Serumparameter begleitet.
Zur präziseren Beurteilung der Lungenfunktionen werden histopathologische postmortem-Analysen mit Gewebeschnitten durchgeführt, die aus verschiedenen Orten der Atemwege entnommen wurden, nach der von Bout et al. (1994, supra) beschriebenen Methode.
Diese Schnitte werden im Hinblick auf das Auffinden von Entzündungszeichen und Lasionen im Pulmonarepithel untersucht. Die Ergebnisse sind die folgenden. Bei allen Affen ist die pulmonare Architektur intakt. Man beobachtet unbedeutende Entzündungszeichen und squamöse Metaplasien ohne Korrelation mit der Gabe von Ad-CFTR, da sie auch im Kontrollaffen vorhanden sind.
Zusätzliche Läsionen mit schwacher Intensität (perivaskuläre und peribronchiale lymphocytäre Infiltrationen und interstitielle Pneumonie) wurden bei den beiden Affen beobachtet, die eine erhöhte virale Dosis erhalten hatten, ohne daß ein signifikanter Unterschied zwischen den Tieren der Gruppe 1 (Vernebelung einer Dosis von 7,5 · 10&sup9; ufp) und denen der Gruppe 2 (Vernebelung von 2 Dosen von 7,5 · 10&sup9; ufp) besteht.
Als Schlußfolgerung wird die Gabe von Ad-CFTR durch Aerosol gut von der Gesamtheit der behandelten Tiere toleriert. Diese Studien ermöglichten den Nachweis, daß das rekombinante Ad-CFTR-Virus in der Lunge bleibt und sich nicht im Organismus ausbreitet. Obwohl pulmonäre Läsionen im Anschluß an die Gabe von erhöhten viralen Dosen beobachtet werden, scheint es nicht, daß diese zu schweren pathologischen Schäden führen. Diese präklinischen Versuche ermöglichen den Schluß, daß die Behandlung bei Menschen möglich ist.

Liste der Sequenzen

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder:
(A) Name: Transgene S.A.
(B) Straße: 11 rue de Molsheim
(C) Stadt: Strasbourg
(E) Land: Frankreich
(F) Postleitzahl: 67082
(G) Telefon: (33) 88 27 91 00
(H) Telefax: (33) 88 22 58 07
(ii) Titel der Erfindung: Verfahren zur Herstellung eines viralen Aerosols.
(iii) Anzahl der Sequenzen: 8
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Trägertyp: Band
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) Information zu SEQ ID NO: 1:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Zahl der Stränge: einzeln
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: nein
(iii) Antisense: nein
(vi) Ursprung:
(A) Organismus: cDNA CFTR Human
(C) Isoliertes Individuum: synthetisches Oligonukleotid
(vii) Quelle:
(B) Klon: OTG3042
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 1:
GCAGTTGATG TGCTTGGCTA GAT 23
(2) Information zu SEQ ID NO: 2:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 21 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Zahl der Stränge: einzeln
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iii) Antisense: ja
(vi) Ursprung:
(A) Organismus: Adenovirus vom Typ 5
(C) Isoliertes Individuum: synthetisches Oligonukleotid
(vii) Quelle:
(B) Klon: OTG4347
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 2:
CAGCTCCTCG GTCACATCCA G 21
(2) Information zu SEQ ID NO: 3:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Zahl der Stränge: einzeln
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: nein
(iii) Antisense: ja
(vi) Ursprung:
(A) Organismus: cDNA CFTR Human
(C) Isoliertes Individuum: synthetisches Oligonukleotid
(vii) Quelle:
(B) Klon: OTG4905
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 3:
TGCTGCTCTC TAAAGCCTTG TATC 24
(2) Information zu SEQ ID NO: 4:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Zahl der Stränge: einzeln
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iii) Antisense: ja
(vi) Ursprung:
(A) Organismus: Adenovirus vom Typ 5
(C) Isoliertes Individuum: synthetisches Oligonukleotid
(vii) Quelle
(B) Klon: OTG4908
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 4:
TCGTACCTCA GCACCTTCCA GATC 24
(2) Information zu SEQ ID NO: 5:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 47 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Zahl der Stränge: einzeln
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: cDNA für mRNA
(iii) Hypothetisch: nein
(iii) Antisense: ja
(vi) Ursprung:
(C) Isoliertes Individuum: synthetisches Oligonukleotid
(vii) Quelle:
(B) Klon: OTG5987
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 5:
CTTATACGGA TATCCTGGCA ATTCGGACTT ATTTGTGATG CTATTGC 47
(2) Information zu SEQ ID NO: 6:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Zahl der Stränge: einzeln
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: nein
(iii) Antisense: nein
(vi) Ursprung:
(A) Organismus: cDNA CFTR Human
(C) Isoliertes Individuum: synthetisches Oligonukleotid
(vii) Quelle:
(B) Klon: OTG5988
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 6:
AAGCAGTTGA TGTGCTTGGC TAGATCTGTT 30
(2) Information zu SEQ ID NO: 7:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Zahl der Stränge: einzeln
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: nein
(iii) Antisense: ja
(vi) Ursprung:
(C) Isoliertes Individuum: synthetisches Oligonukleotid
(vii) Quelle:
(B) Klon: OTG5999
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 7:
CTTATACGGA TATCCTGGCA ATTCGGACTT 30
(2) Information zu SEQ ID NO: 8:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 25 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Zahl der Stränge: einzeln
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iii) Antisense: ja
(vi) Ursprung:
(A) Organismus: Macacen-Rhesus Polyoma-Virus (SV40)
(C) Isoliertes Individuum: synthetisches Oligonukleotid
(vii) Quelle:
(B) Klon: OTG4741
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 8:
GTAACCATTA TAAGCTGCAA TAAAC 25

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines viralen Aerosols, dadurch charakterisiert, daß man eine verdünnte virale Suspension herstellt, die der Verdünnung einer viralen Suspension entspricht, welche 10&sup4; bis 10¹³ ufp (plaquebildende Einheiten) des Virus in einer wäßrigen Lösung enthält, enthaltend mindestens 6 bis 12 g/l eines Salzes eines monovalenten Kations oder 50 bis 100 g/l einer Hexose.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, daß die virale Suspension eine Suspension eines Virus ist, der mit Adenoviren zusammenhängt, oder eines rekombinanten Adenovirus.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch charakterisiert, daß die Verdünnung nach einem Volumenverhältnis virale Suspensionlwäßrige Lösung von 1/5 bis 1/20 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch charakterisiert, daß die Verdünnung nach einem Volumenverhältnis virale Suspension/wäßrige Lösung von 1/10 bis 1/20 durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch charakterisiert, daß die Verdünnung nach einem Volumenverhältnis virale Suspensionlwäßrige Lösung von 1/12 bis 1/18 durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch charakterisiert, daß man eine virale Suspension in einer wäßrigen Lösung verdünnt, die 6 bis 12 g/l eines Salzes eines monovalenten Kations umfaßt, welches ausgewählt wird aus Natriumchlorid und Kaliumchlorid.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch charakterisiert, daß man eine virale Suspension in einer wäßrigen Lösung verdünnt, die ungefähr 9 g/l eines Salzes eines monovalenten Kations umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch charakterisiert, daß man eine virale Suspension in einer wäßrigen Lösung verdünnt, die 50 bis 100 g/l einer Hexose umfaßt, die aus Glucose und Mannose ausgewählt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch charakterisiert, daß man eine virale Suspension in einer wäßrigen Lösung verdünnt, die 50 g/l Glucose umfaßt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch charakterisiert, daß die virale Suspension eine Suspension eines rekombinanten Virus ist, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für ein heterologes Protein dieses Virus kodiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch charakterisiert, daß die virale Suspension eine Suspension eines rekombinanten Virus ist, in dessen Genom ein DNA-Fragment insertiert ist, das für das Protein CFTR kodiert.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch charakterisiert, daß die virale Suspension 10&sup6; bis 10¹² ufp des Virus umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch charakterisiert, daß die virale Suspension 10&sup8; bis 10¹¹ ufp des Virus umfaßt.

14. Verwendung eines viralen Aerosols, erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, zur Herstellung eines Medikaments, das durch Vernebelung dieser verdünnten viralen Suspension mit einem Gasdruck von 0,5 bis 3,5 bar oder einer Ultraschall- Frequenz von 2 bis 5 MHz gegeben wird.

15. Verwendung eines viralen Aerosols nach Anspruch 14, dadurch charakterisiert, daß der Gasdruck zwischen 2 und 3,5 bar liegt.

16. Verwendung eines viralen Aerosols nach Anspruch 14, dadurch charakterisiert, daß die Ultraschall-Frequenz zwischen 2 und 3 MHz liegt.

17. Verwendung eines viralen Aerosols nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung einer Lungenkrankheit bestimmt ist.

18. Verwendung nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung von Mucoviscidose, Lungenemphysem, Asthma oder Lungenkrebs bestimmt ist.

19. Virales Aerosol, erhältlich durch Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13.