DE69534738T2

DE69534738T2 - Leukocyten-aktivierender Faktor

Info

Publication number: DE69534738T2
Application number: DE69534738T
Authority: DE
Inventors: Kazuo Isumi-gun Suzuki; Satoshi Kashiwa-shi Yamagoe; Yoshio Minaminagareyama Nagareyama-Shi Yamakawa; Satoshi Funabashi-Shi Mizuno
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-11-28
Filing date: 1995-11-27
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2015-11-28
Also published as: EP0723016B1; CA2163805A1; CA2163805C; JP3637087B2; DE69534738D1; JPH08140683A; ATE315646T1; EP0723016A3; US5929224A; EP0723016A2

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Strukturen von neuen humane Leukozyten aktivierenden Proteinen und das Protein codierende DNA. Die Erfindung betrifft ebenfalls rekombinante Plasmide und die Transformanten.
2. Stand der Technik
Neutrophile wandern in Antwort auf zunehmende Konzentrationen von chemotaktischen Faktoren, die von entzündlichen Stellen freigesetzt werden. Aktivierte Neutrophile werden aus dem Blut durch die Gefäßwand zu der infizierten Stelle gelockt und phagozytieren eindringende Bakterien oder Viren. Die Phagosomen verschmelzen mit Lysosomen, und die lysosomalen Enzyme und aktiven Sauerstoffradikale töten die Eindringlinge ab. Somit spielen die aus entzündlichen Stellen freigesetzten chemotaktischen Faktoren eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Neutrophilen-Funktionen. Nach der Reaktion durch Neutrophile bei einer akuten Entzündung sind Monozyten und Lymphozyten an der Immunreaktion beteiligt. Zusätzlich zu anderen Immunzellen einschließlich von zytotoxischen Lymphozyten, NK-Zellen und Makrophagen zeigen Neutrophile eine zytotoxische Aktivität gegenüber Tumorzellen in vitro. In ihrer tumoriziden Wirkungsweise wandern Immunzellen auch zu Tumor-Wachstums-Stellen, was nahe legt, dass Tumorzellen auch einen chemotaktischen Faktor für die Immunzellen bilden. In dieser Hinsicht wurde nachgewiesen, dass neoplastische, aus der Maus und dem Menschen stammende Zellen chemotaktische Faktoren bilden, welche die Makrophagen-Infiltration in Tumorgeweben vermitteln. Dann identifizierten wir auch LUCT/IL-8, das konstitutiv von der Karzinom-Zelllinie LU65C sezerniert wurde (K. Suzuki et al., J. Exp. Med., 169, 1895-1901, 1989). Die Zellen wurden aus humanem Lungenkarzinomgewebe, das von zahlreichen Neutrophilen infiltriert war, gewonnen. Die Myeloid-Leukämie-Zelllinie ML-1 und Gliom-Zellen bilden ebenfalls konstitutiv LUCT/IL-8 (K. Suzuki et al., Immunol. Lett. 36, 71-82, 1993). Die Kulturflüssigkeiten von 97 humanen Leukämie-Zelllinien wurden gescreent, um nach einem neuen chemotaktischen Protein zu suchen. Danach wurde diese Erfindung bewerkstelligt.
Neutrophile scheinen, zusätzlich zu Makrophagen und Lymphozyten, Krebszellen zu schädigen. Darüber hinaus werden einige histologische Gewebe von Krebsgeweben mit Neutrophilen infiltriert. Von diesen wird angenommen, dass Neutrophile auf chemotaktische Faktoren, die von Zellen in diesen Geweben sezerniert werden, reagieren.
Die Sekretion von Interleukinen und die Beschädigung von Tumorzellen werden durch die Aktivierung von Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten induziert. Mithin werden sowohl natürliche als auch erworbene Immunitäten verstärkt. Wenn die Leukozyten-aktivierenden Faktoren mit großtechnischen und einfachen Verfahrensweisen gereinigt werden, werden jene für Diagnose, Therapie und Bestimmung nach einer Behandlung verwendet. Weiterhin sind diese auch nützlich für die Grundlagenforschung bei Aktivierungsmechanismen von Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten.
Wir fanden einen Neutrophilen-chemotaktischen Faktor, Interleukin 8 (LUCT/IL-8), aus einer Kulturflüssigkeit von Zellen, die aus humanen Riesenkarzinomzellen gewonnen worden waren. Danach reinigten wir den Faktor (Protein) und klonierten das Gen. IL-8 ist ein etwa 8 kDa großes pures Protein mit einem pl von 10,3. Zwei Arten von Protein, 77-Aminosäure-Protein und 72-Aminosäure-Protein, werden in IL-8 klassifiziert und besitzen die chemotaktischen Aktivitäten mit der gleichen spezifischen Aktivität. Darüber hinaus ist IL-8 ein Entzündungs-Cytokin und wird im Serum von Patienten mit chronischer Entzündung nachgewiesen.
Jedoch dachte man, dass von IL-8 verschiedener Neutrophilen-chemotaktischer Faktor mit der Wechselwirkung zwischen Neutrophilen und Krebszellen zusammenhängt.
Die Erfinder berichteten zuvor von der Reinigung eines Chemotaxins (T) aus humaner Leukämie-Zellkulturflüssigkeit (YAMAGOE ET AL, September 1993, Journal of Interferon Research, Bd. 13, Suppl. Nr. 1).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Kulturflüssigkeiten von 97 humanen Leukämie-Zelllinien wurden gescreent, um nach einem neuen chemotaktischen Protein zu suchen. Das Neutrophilen-chemotaktische Protein wurde in einer Kulturflüssigkeit der PHA-aktivierten humanen T-Zell-Leukämiezelllinie SKW-3 nachgewiesen. Das Protein wurde gereinigt, und seine Molekülgröße wurde mit Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PA-GE) als 16 kDa bestimmt, was die doppelte Größe im Vergleich mit derjenigen von IL-8 ist. Die Aminosäuresquenz-Analyse ergab, dass das chemotaktische Protein ein neues Protein ist, welches als LECT2a bezeichnet wird (von Leukozytenzellen abgeleitetes Chemotaxin 2a). Außerdem wurde das Klonieren von LECT2a-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf Basis der teilweisen Aminosäuresequenzen durchgeführt. Danach wurde die cDNA, codierend ein Protein, welches eine höhere Homologie mit LECT2a hatte, isoliert. Das codierte Protein wurde als LECT2b bezeichnet.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Neutrophilen-aktivierende Faktor LECT2 zwei Arten von Proteinen, LECT2a und LECT2b, beinhaltet, welche bezüglich der Leukozytenaktivierung identisch sind, aber eine untereinander unterschiedliche Aminosäuresequenz aufweisen. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von LECT2a mit derjenigen, die von LECT2b codierender cDNA abgeleitet wurde, zeigt eine 86 % homologe Sequenz. Die Aminosäuresequenzen von LECT2a sind in der Sequenz ID Nr. 1 bis 5 in der Orientierung vom N-Terminus ausgehend gezeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von LECT2b wird in der Sequenz ID Nr. 6 in der Orientierung vom N-Terminus aus gezeigt. Die Sequenz ID Nr. 7 zeigt sowohl die cDNA-Nukleotidsequenz als auch die abgeleitete Aminosäuresequenz von LECT2b. Aminosäure Nummer 58 Val in den Sequenz ID Nrn. 6 und 7 kann durch Ile ersetzt sein. Dann ist CTC in der Nukleotidsequenz ID Nr. 372-374 ATC. Dies scheint auf einen Polymorphismus zwischen Individuen zurückzuführen zu sein. Beim Vergleich von Aminosäuresequenzen von LECT2a und LECT2b miteinander gibt es signifikante Überlappungen zwischen diesen. Es wird angenommen, dass die reine Sequenz von LECT2a eine höhere Homologie mit jener von LECT2b aufweist, weil die Molekülgröße von 16 kDa und die Aminosäurekomponente nahezu identisch sind.
Die Erfindung betrifft humanes LECT2b-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, wie sie als Sequenz ID Nr. 6 im Sequenzprotokoll gezeigt ist.
Diese Erfindung betrifft auch genomische DNA, welche humanes LECT2b mit der Aminosäuresequenz in der Sequenz ID Nr. 6 in dem Sequenzprotokoll codiert. Es wird auch eine Nukleotidsequenz der Erfindung beschrieben, wobei die genomische DNA-Sequenz in der Sequenz ID Nr. 7 im Sequenzprotokoll gezeigt wird.
Diese Erfindung betrifft auch das rekombinante Plasmid, das humanes LECT2b mit der Aminosäuresequenz in der Sequenz ID Nr. 6 im Sequenzprotokoll codiert. Die Erfindung betrifft auch das Plasmid pMAL-TEV-LECT2b, das Fusionsprotein produziert. Die für das LECT2b-Protein codierende Nukleotidsequenz wurde stromabwärts der Maltose-Bindungs-Protein-Region im pMAL-c-Vektor ligiert. Danach kann das fusionierte Protein durch Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert werden.
Dieses Konstrukt weist eine TEV-Protease-Erkennungsstelle auf, welche sich zwischen Maltose-bindendem Protein und LECT2b befindet. Das Plasmid pMAL-TEV-LECT2b kann von dem E. coli Mal-LECT2b-Stamm erhalten werden (hinterlegt am NATIONAL INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND HUMAN-TECHNOLOGY, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, unter FERM P-14669, und übertragen zur internationalen Hinterlegung unter FERM BP-5302 am 24. November 1995 gemäß des Budapester Abkommens). Die für das LECT2b-Protein codierende Nukleotidsequenz wurde stromabwärts einer Glutathion-S-Transferase-Region im pGEX-3X-Vektor ligiert. Die Bildung des Fusionsproteins kann durch IPTG-Behandlung induziert werden. Dieses Konstrukt weist eine Xa-Protease-Erkennungsstelle auf, welche sich zwischen Glutathion-S-transferase und LECT2b befindet. Des Weiteren betrifft die Erfindung auch rekombinante Plasmid-DNA, die mit dem SRalpha-Promotor reguliertes humanes LECT2b codiert, welcher LECT2b stark exprimieren kann.
Die Erfindung betrifft auch transformierte Zellen, die insbesondere durch Transformation in E. coli, Hefe, Insektenzellen, Tierzellen, wie Chinesischer-Hamster-CHO-Zellen, Affen-CVI-Zellen, Affen-CVI/293-Zellen, Mausfibroblasten-Zellen, Maus-C127-Zellen, Maus-3T3-Zellen, Maus-L-929-Zellen, humane HeLa-Zellen und humane SKW-3-Zellen erhalten wurden, welche das rekombinante Plasmid exprimieren können, welches humanes LECT2b mit der Aminosäuresequenz in der Sequenz ID Nr. 6 im Sequenzprotokoll codiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Die 1 zeigt die Bestimmung der Molekülgröße von LECT2a, und die Molekülgröße von LECT2a wurde durch Tricin-SDS-PAGE mit 16,5 % Monoacrylamid-Bisacrylamid 3 % Bis-/Bis-haltiges Monoacrylamid bestimmt.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Die Leukozytenaktivierung zeigt die Funktionen von Neutrophilen, Monozyten (Makrophagen), Lymphozyten wie folgt an. Die Funktionen von Neutrophilen und Monozyten (Makrophagen) sind wie folgt: Adhäsion, Migration (Chemotaxis), Phagozytose, Superoxidbildung, Freisetzung von lysosomalen Proteinen/Enzymen (Degranulation), Zellabtötung verbunden mit tumorizider Aktivität und Erzeugung verschiedener Zytokine. Die Funktionen von Lymphozyten sind wie folgt: Sekretion von Immunoglobulinen, verschiedenen Cytokinen und Expression verschiedener Rezeptoren.
Das Neutrophilen-aktivierende Protein kann aus einer Kulturflüssigkeit von Leukämiezellen durch Konzentrierung mit CM-Sepharose (Handelsname, erhältlich von Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) und DEAE-Sepharose (Handelsname, erhältlich von Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), CM-Sepharose-Säulenchromatographie, Hydroxylapatitchromatographie auf Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) und Umkehrphasen-Säulenchromatographie auf HPLC gereinigt werden. Zum Beispiel wurden SKW-3-Zellen in RPMI-1640-Medium (Handelsname, erhältlich von GIBCO BRL, Grand Island, NY), ergänzt mit 10 % fötalem Kalbserum (FCS) (erhältlich von GIBCO BRL), gehalten. SKW-3-Zellen und andere Leukämiezellen wurden mit PHA-P (Handelsname, erhältlich von DIFCO Laboratories, Detroit, MI) stimuliert und der in der Erfindung beschriebene Leukozyten aktivierende Faktor kann aus dieser Kulturflüssigkeit mit Hilfe von Säulenchromatographie etc. gereinigt werden.
Außerdem kann der Neutrophilen-aktivierende Faktor durch die Transformante mit dem rekombinanten Plasmid des Faktors hergestellt werden. Das rekombinante Plasmid kann mit einem Vektor, zum Beispiel pMAL-c (Handelsname, erhältlich von Biolab Inc.) oder pGEX-3X (Handelsname, erhältlich von Pharmacia Inc.) konstruiert werden. Tierzellen, Hefe und Bakterien können als transformierte Zellen verwendet werden, zum Beispiel Chinesischer-Hamster-CHO-Zellen, Affen-CVI-Zellen, Affen-CVI/293-Zellen, Mausfibroblasten-Zellen, Maus-C127-Zellen, Maus-3T3-Zellen, Maus-L-929-Zellen, humane HeLa-Zellen und humane SKW-3-Zellen. Die Zellkultur, Reinigung dieser aktivierenden Proteine, Konstruktion rekombinanter Plasmide, Transformation und die Reinigung des Proteins aus der Transformante werden durch gebräuchliche Verfahrensweisen durchgeführt.
Beispiele
Eine Erläuterung praktischer Beispiele wird nachstehend gezeigt:
1. Verfahrensweisen zur Reinigung von LECT2a
Materialien wurden wie folgt vennrendet:

1) 1 % Rinderserumalbumin (BSA, erhältlich von Diagnostics, Kankakee, IL) in entionisiertem und destilliertem Wasser (DDW).
2) R-Puffer: 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4
3) R5-Puffer: R-Puffer, enthaltend 0,005 % BSA. R1-Puffer: R-Puffer, enthaltend 0,001 % BSA.
4) CM-Elutionspuffer: R1-Puffer, enthaltend 0,7 M NaCl

1) SKW-3-Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37°C in einem 5%-CO₂-Inkubator in einer 500-ml-Glas-Rollkulturflasche (erhältlich von GIBCO BRL) in Gegenwart von PHA-P in einer Konzentration von 5 μg/ml kultiviert. Die Kulturflüssigkeit wurde durch Zentrifugieren bei 400 x g während 15 min bei 4°C gewonnen. Der Überstand (7 Liter) der Kulturflüssigkeit wurde in 500-ml-Aliquots aufgeteilt und bei –80°C gelagert.
2) Kaltes DDW (20 Liter) wurde in den gefrorenen Überstand (7 Liter) zum Auftauen der Probe gegeben. Die Probe wurde zur Reinigung des in der Erfindung beschriebenen, Leukozyten-aktivierenden Faktors verwendet.

Teilweise Reinigung von LECT2a

1) Nachdem die Kulturflüssigkeit aufgetaut war, wurde sie mit 200 ml CM-Sepharose CL-6B (erhältlich von Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), welche mit R1 äquilibriert worden war, (100 ml Füllvolumen) vermischt.
2) Die Mischung wurde 4 Stunden lang bei 4°C gerührt.
3) Diese wurde durch einen "KIRIYAMAROHTO SU-95"-Trichter (Handelsname, erhältlich von Kiriyama, Tokyo, Japan) mit 3 Blättern Filterpapier Nr. 5B (95 mm Durchmesser; erhältlich von Kiriyama) filtriert.
4) CM-Sepharose-Gel wurde aufeinanderfolgend mit 500 ml kaltem DDW gewaschen.
5) Danach wurde es zweimal mit 100 ml R5 gewaschen.
6) Das Gel wurde langsam mit 50 ml R5, ergänzt mit 0,7 M NaCl, eluiert.
7) Diese Elution wurde 6 Mal wiederholt.
8) Das vereinigte Eluat wurde dialysiert gegen R unter Verwendung von Spectra/Por 3 (Handelsname, erhältlich von Spectrum, Houston, TX), das mit R5 gespült worden war.
9) Eine DEAE-Sepharose (Handelsname, erhältlich von Pharmacia Biotech)-Suspension (12 ml Füllvolumen), äquilibriert mit R5, wurde dem Dialysat zugegeben. 10) Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 4°C gerührt.
11) Und anschließend wurde diese durch einen "KIRIYAMAROHTO SU-95"-Trichter mit 3 Blättern R5-gespültem Filterpapier Nr. 5B (95 mm Durchmesser) filtriert.
12) Das Gel wurde mit 25 ml kaltem R5 gewaschen.
13) Die Durchlauf-Fraktion der DEAE-Sepharose wurde erneut auf die zweite CM-Sepharose-Säule, äquilibriert mit R5, aufgetragen (3 ml Füllvolumen in einer Econo-Säule, Handelsname, erhältlich von Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan).
14) Die Säule wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 ml R1-Puffer und 10 ml R1-Puffer, enthaltend 0,7 M NaCl bei 4°C bei einer Fließrate von 10 ml/Stunde, eluiert.
15) Fraktionen, die chemotaktische Aktivität enthielten, (Nrn. 8-11) wurden als der teilweise gereinigte Hauptbestandteil verwendet.

Vollständige Reinigung mit Säulenchromatographie auf HPLC

1) Die gereinigten Proben, die zweimal wiederholt wurden, wurden vereinigt.
2) Die vereinigte Probe (2,5 ml, 1,2 O.D.), die Neutrophilen-chemotaktische Aktivität enthielt, wurde auf eine Umkehrphasensäule (Handelsname, erhältlich von Vydac, C4-Säule 304-2151, 4,5 × 250 mm) auf HPLC aufgebracht.
3) Die Säule wurde mit 22,5 % bis 60 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % Tetrafluoressigsäure (TFA), mit einer Strömungsrate von 0,5 ml/min eluiert.
4) Schließlich wurden die aktiven Fraktionen erneut mit der gleichen Umkehrphasensäule in dem gleichen Acetonitril-Gradienten, welcher 0,05 % Hexafluorbuttersäure an Stelle von 0,1 % TFA enthielt, chromatographiert.
5) Das Eluat wurde vereinigt und zweimal gegen 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4, dialysiert.
6) Das Eluat wurde bei –80°C aufbewahrt.

Die Reinigung von LECT2a ist in der Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1. Reinigung von LECT2a aus SKW-3

^* Dieser Schritt repräsentiert die Resultate von zwei Chromatografien unter verschiedenen Bedingungen.

Bestimmung der Molekülgröße von LECT2a
Die Molekülgröße von LECT2a wurde durch Tricin-SDS-PAGE mit 16,5 % Monoacrylamid-Bisacrylamid : 3 % Bis-/Bis-haltiges Monoacrylamid bestimmt. Das Ergebnis ist in 1 gezeigt. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Molekülgröße von LECT2a etwa 16 kDa beträgt.
1. Neutrophilen-Aktivierung

Hank's balancierte Salzlösung (HBSS) enthielt 0,4 g KCl, 8 g NaCl, 0,15 g KH₂PO₄, 0,29 g Na₂HPO₄-7H₂O und 1 g Glucose in 1 Liter DDW.

1) Chemotaktische Aktivität für Neutrophile
Die Probe für den Assay wurde in das untere Abteil einer Boyden-Kammer eingebracht und es wurde ein 3,0-μm-Filter (Millipore, Handelsname, erhältlich von Bedford, MA) darauf gelegt. Dann wurden humane Neutrophile, die in Medium suspendiert waren (2 × 10⁶ Zellen/ml), für den Chemotaxis-Assay auf den Filter im oberen Abteil gegeben. Die Kammern wurden dann 35 min lang bei 37°C in einer befeuchteten 5%igen CO₂-Atmosphäre inkubiert. Der Vorderkantenabstand der Zellen von der Oberfläche des Filters war der Mittelwert der fünf mikroskopischen Felder. Die chemotaktische Einheit (CTU) wurde durch drei Parameter berechnet; die fMet-Leu-Phe (FMLP, 10 nM)stimulierte maximale Migration (FM), die minimale Migration ohne den chemotaktischen Faktor, bezeichnet als Zufallsmigration (RM), und die durch die Probe induzierte Migration (SM). CTU wurde als 100 × (SM-RM)/(FM-RM) definiert. Bei der Proteinreinigung von LECT2a wurde die Gesamt-CTU in jedem Reinigungsschritt durch Multiplizieren der Verdünnung der Probe für 50 CTU in der Verdünnung-Aktivität-Kurve berechnet. Der Wert von ED₅₀ steht für die Konzentration des chemotaktischen Proteins bei der Halb-Maximum-Aktivität in der Dosis-Antwort-Kurve.
2) Freisetzung von lysosomalen Proteinen (Enzymen)
Nach einer Vorinkubierung bei einer Konzentration von 2 × 10⁶ Neutrophilen/ml HBSS während 10 min bei 37°C wurden Neutrophile mit einer Lösung gemischt, die LECT2a mit 0,005 % BSA in Gegenwart oder Abwesenheit von Cytochalasin B (5 μg/ml) und FMLP (100 nM) enthielt.
a) Messung der MPO-Aktivität
Die MPO-Aktivität wurde wie folgt analysiert. Die Reaktionsmischung bestand aus einem Neutrophilen-Überstand oder Zellhomogenat, 1,7 mM Tetramethylbenzidin (TMB), 0,39 mM Wasserstoffperoxid, 84,2 mM Natriumcitratpuffer (pH-Wert 5,4), 7,2 % N,N'-Dimethylformamid, Phosphat-gepufterter Salzlösung ohne Calcium und Magnesium (PBS(-)) und HBSS in einem Gesamtvolumen von 200 μl pro Vertiefung einer 96-Vertiefungs-F-Platte (#2-69620, erhältlich von Nunc, Dänemark). Die Zunahme der Absorption bei 650 nm in der Reaktionsmischung bei 37°C wurde mit einem automatischen Analysengerät LFA-096 (Handelsname, erhältlich von Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan) im 30-Sekunden-Intervall gemessen. Eine Einheit wurde als die Aktivität definiert, die eine Zunahme von 1,0 in der Absorption bei 650 nm/min/ml ursprüngliches MPO-Präparat erzeugt.
b) Messung der β-Glucuronidase-(BGL-)Aktivität
Die BGL-Aktivität im Überstand und Zellhomogenat wurde wie folgt geassayt. Die Reaktionsmischung bestand aus einem Neutrophilen-Überstand oder -Zellhomogenat, 1 mM 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid, 0,05 % Triton X-100 und 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 3,5) in einem Gesamtvolumen von 40 μl in einer 96-Vertiefungs-F-Platte und wurde 30 min lang bei 37°C inkubiert. Ein Abbruchpuffer (50 mM Natriumglycinpuffer (pH-Wert 10,4), welcher 5 mM EDTA-Dinatrium enthielt) wurde zugegeben. Die Fluoreszenzstärke wurde durch ein automatisches Fluoreszenz-Analysengerät LFA-96F (Handelsname, erhältlich von Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan) mit Wellenlängen bei 365 nm für die Anregung und 405 nm für die Emission gemessen. Eine Einheit der BGL-Aktivität wurde als die Aktivität definiert, welche 1 pmol 4-Methylumbelliferon/min/ml des ursprünglichen BGL-Präparats freisetzt.
c) Bestimmung von Lactoferrin (LF)
LF-Protein im Überstand und Zellhomogenat wurde wie nachstehend gemessen. 100 μl an 0,05 % Ziegen-Antiserum gegen humanen LF-Antikörper, verdünnt mit Reagens-Verdünnungspufter, 0,1 % BSA in PBS(-) (pH-Wert 7,4), wurden in eine 96-Vertiefungs- F-Platte über Nacht bei 4°C übertragen. Nachdem die Platte dreimal mit PBS(-), das 0,05 % Tween-20-Waschpuffer enthielt, gewaschen wurde, wurden 100 μl verdünnter Überstand oder Zellhomogenat der Platte zugegeben. Nachdem die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten wurde, wurde sie mit dem Waschpuffer dreimal gewaschen, danach wurden 100 μl 0,1%iges Kaninchen-Antiserum gegen humanes LF der Platte zugegeben. Nachdem die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten worden war, wurde sie dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen und mit 100 μl eines 0,025 % Peroxidase-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG behandelt. Die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen und mit 200 μl Enzymsubstrat in 0,05 M Citratpufter (pH-Wert 5,0), der 0,025 Wasserstoffperoxid und 0,04 % o-Phenylendiamiddihydrochlorid enthielt, etwa 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunklen behandelt. Dann wurden 50 μl 2,5 N Schwefelsäure der Platte zugegeben, um die Reaktion abzubrechen, anschließend wurde die Absorption bei 490 nm mit einem automatischen Analysengerät LFA-096 gemessen, und es wurde der LF-Gehalt im Überstand oder Zellhomogenat ermittelt.
3) Superoxidbildung von Neutrophilen
Die Superoxidbildung wurde wie folgt gemessen. Neutrophilen-Suspension (2 × 10⁶ Zellen/ml, 100 μl) und 0,066 mM Ferricytochrom c wurden in einer 96-Vertiefungs-F-Platte gemischt und ungefähr 2 Minuten lang dort behalten. Eine Probe, Cytochalasin B (5 μg/ml) und FMLP (1000 nM) wurden anschließend der Suspension zugegeben und ungefähr 30 Sekunden lang bei 37°C stehen gelassen. Die Superoxidbildung wurde durch Messen der Zunahme der Absorption bei 546 nm im 0,269-min-Intervall mit Hilfe eines automatischen Analysengeräts LFA-096 bestimmt.
4) Adhäsion von Neutrophilen
Die Neutrophilen-Adhäsion wurde wie folgt gemessen. Eine Neutrophilen-Suspension (2 × 10⁶ Zellen/ml, 100 μl) wurde in eine Glas-Gummi-Kammer angeimpft. Die LECT2a enthaltende Probe (10 μl) und FMLP (10^–11 bis 10^–5) wurden in die Kammer in einem Gesamtvolumen von 150 μl gegeben. Die Kammer wurde 15 min lang bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurden nicht anhaftende Zellen ab gesaugt, und die Zellkonzentration wurde ausgezählt. Anschließend wurde die Objektträgerkammer mit Ethanol fixiert und mit Safulanin angefärbt.
5) Membran-Fluidität von Neutrophilen
Nachdem Neutrophile und FITC-markiertes Succinyl-Concanavalin-A (FS-ConA) 10 min lang bei 37°C inkubiert worden waren, wurde PBS(-) der Mischung zugegeben. Die FS-ConA-markierten Neutrophilen wurden mit HBSS in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml präpariert und danach in eine Objektträgerkammer plattiert. Eine Lösung des Leukozyten aktivierenden Faktors (10 μl) und von FMLP (10 nM) wurde der Zellsuspension in einem Gesamtvolumen von 150 μl zugegeben. Die Zellsuspension wurde durch einen mit einem Nikon-Umkehrmikroskop verbundenen Bild-Analysator (IMRAS) beobachtet. Die Membran-Fluidität wurde mit einem IMRAS-Prozessor analysiert.
Fünf Aktivitäten von Neutrophilen, die in den obigen Prozeduren ermittelt wurden, sind in der Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2 Zusammenfassung der Neutrophilen-Aktivierung mit LECT2a

^* % Freisetzung = 100 × S/(S + H).

S

= extrazelluläre Enzymaktivität (oder Proteingehalt).

H

= intrazelluläre verbliebene Enzymaktivität (oder Proteingehalt).

2. Chemotaktische Aktivität von Monozyten und Lymphozyten
Die Verfahrensweisen waren nahezu identisch mit jenen für Neutrophile, mit Ausnahme eines 5-μm-Millipore-Filters, an Stelle von 3 μm, und mit Ausnahme einer 75-min-Inkubation an Stelle einer 35-min-Inkubation. Die Konzentration von LECT2a, angegeben als ED₅₀, betrug 220 nM in Monozyten bzw. 430 nM in Lymphozyten.
2. Aminosäure-Sequenzierung von gereinigtem LECT2a
Zehn Mikrogramm Pyridyl-ethyliertes LECT2a wurden mit TPCK-Trypsin (Handelsname, erhältlich von Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) (E/S = 1:50, w/w) in 1,5 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, enthaltend 1 mM CaCl₂, bei 37°C 8 Stunden lang verdaut. Peptide aus dem proteolytischen Verdau wurden durch Umkehrphasen-HPLC auf einer weitporigen ODS-Säule (0,46 × 25 cm) (Handelsname, erhältlich von J.T. Baker Research Products, Phillipsburg, NJ) mit einem Acetonitril-Gradienten in 0,1 % TFA getrennt. Eine automatische Aminosäuresequenz-Analyse wurde mit einem Gasphasen-Aminosäuren-Sequenzierer, Modell 477A (Handelsname, erhältlich von Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt.
3. Klonieren von LECT2b und Bestimmen der Nukleotidsequenz des klonierten LECT2b
Polyadenylierte [Poly(A)⁺]-RNA wurde hergestellt. Für die Klonierung wurde Poly(A)⁺-RNA (5 μg) aus SKW-3, welche mit PHA-P (50 μg/ml) behandelt worden waren, als Matrize für die Synthese von einzelsträngiger cDNA unter Verwendung von SuperScript^TM-Reverser-Transkriptase (Handelsname, erhältlich von BRL, Grand Island, NY) verwendet. Sechs 17-Mer-Oligonukleotide für die Aminosäuresequenzen WAIICA (5'-Oligonukleotid) wurden synthetisiert, und es wurden vier für HIENCD (3'-Oligonukleotid) synthetisiert. Die 5'- und 3'-Oligonukleotid-Sätze wurden jeweils zum Primen der Amplifikation von 45 ng SKW-3-cDNA durch PCR verwendet, die für 40 Zyklen bei 94°C 1 min lang, bei 55°C 2 min lang und bei 72°C 1 min in einem 50-μl-Reaktionspuffer durchgeführt wurde. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel getrennt, auf eine Hybond-N⁺-Nylonmembran (Handelsname, erhältlich von Amersham, Buckinghamshire, England) geblottet und einer Hybridisierung mit einer internen Nukle otid-Sonde GATGTC/GCTA/GTGCTCT/CGATGGC/GTCT/CACT/AGC/GTATGCT/CTT unterzogen, was der Aminosäuresequenz DVLCSDGSTVYAP entspricht. Das durch Southern-Hybridisierung nachgewiesene PCR-Produkt wurde in pUC19 kloniert.
Das PCR-Produkt wurde einer Nukleotidsequenz-Analyse durch das Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren (erhältlich von United States Biochemicals, Cleveland, OH) unterzogen. Eine λgt10-Bibliothek wurde aus Leber-mRNA erstellt und 1,3 × 10⁶ unabhängige Klone wurden gescreent. Zwölf positive Klone wurden isoliert und in zwei Typen durch Restriktionsendonuklease-Analyse klassifiziert. Die Sequenzanalyse der längsten Klone jedes Typs legte nahe, dass die zwei Klon-Typen von einem identischen Gen abgeleitet werden, welches zwei Poly(A)⁺-Signale aufweist. Die Nukleotidsequenz-Analyse ergab, dass die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zu 86 % zu der LECT2a-Aminosäuresequenz homolog waren.
4. Konstruktion des ein LECT2b-Fusionsprotein exprimierenden Plasmids
Die cDNA-Fragmente von LECT2b, die eine EcoRI-Stelle am 5'-Ende und eine Hindlll-Stelle am 3'-Ende enthielten, wurden durch PCR mit dem 5'-Primer GGCGAATTCGA-AAACCTGTATTTTCAGGGGCCCTGGGCTAATATATG und dem 3'-Primer CGCAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAG für 25 Zyklen bei 94°C 1 min lang, bei 55°C 2 min lang und bei 72°C 3 min lang amplifiziert. Die mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Hindlll verdauten LECT2b-cDNAs wurden in die EcoRI/Hindlll-Stelle des Expressionsvektors pMAL^TM-c (Handelsname, erhältlich von Biolab Inc.) ligiert. Dieses Plasmid wurde als pMAL-TEV-LECT2b bezeichnet. Wichtige Merkmale dieses Plasmids sind, dass das rekombinante Fusionsprotein durch IPTG-Behandlung induzierbar ist und die Erkennungsstelle von TEV-Protease (abgeleitet von Tabak-"Etch"-Virus) zwischen Maltose-bindendem Protein und LECT2b-Protein aufweist.
Induktion von pGEX-Xa-LECT2b
Die cDNA-Fragmente von LECT2b, die eine BamHl-Stelle am 5'-Ende und am 3'-Ende enthielten, wurden durch PCR mit dem 5'-Primer GCGGGATCCCCGGGCCATGGGC-TAATAT und dem 3'-Primer CGCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG für 25 Zyklen bei 94°C 1 min lang, bei 55°C 2 min lang und bei 72°C 3 min lang amplifiziert. Die mit BamHl-Restriktionsendonukleasen verdauten LECT2b-cDNAs wurden in die BamHl-Stelle des Expressionsvektors pGEX-3X (Handelsname, erhältlich von Pharmacia Inc.) ligiert. Dieses Plasmid wurde als pGEX-Xa-LECT2b bezeichnet. Wichtige Merkmale dieses Plasmids sind, dass das rekombinante Fusionsprotein durch IPTG-Behandlung induzierbar ist und die Erkennungsstelle von Xa-Protease zwischen Glutathion-S-transferase und LECT2b-Protein aufweist.
5. Transformation von E. coli durch den rekombinantes LECT2b exprimierenden Vektor
E. coli JM109 wurden durch pMAL-TEV-LECT2b transformiert, und die erhaltenen Transformanten wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Der Mal-LECT2b-Stamm (hinterlegt am NATIONAL INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND HUMAN-TECHNOLOGY, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, unter FERM P-14669, und übertragen zur internationalen Hinterlegung unter FERM BP-5302 am 24. November 1995 gemäß dem Budapester Abkommen), welcher das Expressionsplasmid aufwies, welches die präzise LECT2b-Proteinsequenz codiert, wurde ausgewählt.
Expression von LECT2b-Protein in tierischen Zellen
Das pOLECT2b-Plasmid wurde mit Bglll verdaut und durch Selbstligation ausgetragen. Die 5'-Seite der cDNA im resultierenden Plasmid wurde bis zu 5 by von dem vorhergesagten ATG durch Exonuklease III deletiert. Die deletierte DNA wurde mit Klenow-Fragment behandelt und wurde mit PstI-Linkern ligiert. Dieses deletierte Plasmid wurde mit PstI und Bglll verdaut und das PstI-BgIII-Fragment von LECT2b wurde in die PstI/BamHl-Stelle von pcDSRα296 kloniert. Dieser Expressionsvektor (pSRαLECT2b) wurde in CHO-Zellen, die bis zu etwa 50 % Konfluenz gezüchtet worden waren, transfiziert. Dann wurden stabile Transformantenzellen (C1D8-1) (hinterlegt am NATIONAL INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND HUMAN-TECHNOLOGY, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, unter FERM P-14668, und übertragen zur internationalen Hinterlegung unter FERM BP-5301 am 24. November 1995 gemäß dem Budapester Abkommen), die in hohem Maße LECT2b erzeugen, erhalten.
Bestimmung der Molekülgröße von LECT2b
Das in CHO-Zellen exprimierte rekombinante LECT2b-Protein wurde metabolisch mit ³⁵S-Methionin markiert und die Proteine wurden durch SDS-PAGE nachgewiesen. Die Banden von LECT2b wurden an der Position von etwa 16 kDa nachgewiesen. Diese Resultate zeigen an, dass die Molekülgröße von LECT2b mit derjenigen von LECT2a identisch war.
Bestimmung der Aktivität
Die Aktivität des Leukozyten-aktivierenden Faktors LECT2b wurde durch die gleichen Verfahrensweisen wie jenen, die für LECT2a beschrieben wurden, bestimmt. Einige Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Zusammenfassung der Neutrophilen-Aktivierung mit LECT2b

^* % Freisetzung = 100 × S/(S + H).

S

= extrazelluläre MPO-Aktivität.

H

= intrazelluläre verbliebene MPO-Aktivität.

Die Proteine LECT2a und LECT2b werden als neues Zytokin/Interleukin klassifiziert, welches Immunzellen aktiviert. Dies zeigt, dass diese Proteine für die Diagnose, Thera pie und Vorhersage von Krebs durch ihre Immunreaktion nützlich sind. Weiterhin werden diese Proteine für die Krebstherapie verwendet werden. Andererseits steht die Aktivierung von Neutrophilen und anderen Entzündungszellen durch diese Proteine in Zusammenhang mit chronischen Erkrankungen, was nahe legt, dass diese Proteine in breitem Umfang für die Diagnose, Therapie und den Nachweis von Störungen des Cytokin-Netzwerks eingesetzt werden.
ROHSEQUENZ-AUFLISTUNG PATENTANMELDUNG
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Humanes LECT2b-Polypeptid, das eine im Sequenzprotokoll als Sequenz ID NR:6 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
DNA, welche die im Sequenzprotokoll als Sequenz ID NR:6 gezeigte LECT2b-Aminosäuresequenz aufweist.
DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA die im Sequenzprotokoll als Sequenz ID NR:7 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist.
Rekombinantes Plasmid, das eine DNA enthält, welche das humane LECT2b-Polypeptid codiert, das die im Sequenzprotokoll als Sequenz ID NR:6 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 4, wobei das Plasmid das Plasmid pMAL-TEV-LECT2b ist, das am NATIONAL INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND HUMAN TECHNOLOGY unter FERM BP-5302 hinterlegt ist.
Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 4, wobei das Plasmid die für das LECT2b-Protein codierende Nukleotidsequenz stromabwärts einer Glutathion-S-Transferase-Region im pGEX-3X-Vektor aufweist, wodurch die Induktion eines Fusionsproteins durch IPTG-Behandlung ermöglicht wird, wobei das Fusionsprotein eine Erkennungsstelle für die Xa-Protease aufweist, die sich zwischen der Glutathion-S-Transferase und LECT2b befindet.
Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 4, wobei die für das humane LECT2b codierende Nukleotidsequenz mittels eines SRα-Promotors reguliert wird.
Transformierte Zelle, die mit einem Plasmidkonstrukt transfiziert wurde, das das humane LECT2b-Gen enthält, welches die im Sequenzprotokoll als Sequenz ID NR:6 gezeigte Aminosäuresequenz codiert.
Transformierte Zelle nach Anspruch 8, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E. coli Hefe, Insektenzellen, Chinesischer Hamster CHO-Zellen, Affen-CVI-Zellen, Affen-CVI/293-Zellen, Mausfibroblasten, Maus-C127-Zellen, Maus-3T3-Zellen, Maus-L-929-Zellen, humanen HeLa-Zellen und humanen SKW-3-Zellen.