JPH08140683A - 新規な白血球活性化因子 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 配列表の配列番号１〜５に示されるアミノ酸
配列をその順番で有する、ヒト由来の他のタンパク質を
実質的に含有しないヒトＬＥＣＴ２ａポリペプチド、並
びに配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有す
る、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含有しないヒ
トＬＥＣＴ２ｂポリペプチド、およびそれをコードする
ＤＮＡ。 【効果】 本発明の物質は、免疫細胞に関与する新しい
サイトカイン／インターロイキンであり、腫瘍免疫とし
ての治療、診断はもちろん、癌予知および癌予後の免疫
反応の検出などに利用できる。また、腫瘍の治療への応
用の可能性も充分考えられる。さらに、慢性炎症にも深
くかかわっていることが推定されるので、これら疾病の
診断、治療をはじめ、サイトカインネットワーク機能異
常、免疫不全を検出する新しい基礎研究に道を開くこと
ができる。
配列をその順番で有する、ヒト由来の他のタンパク質を
実質的に含有しないヒトＬＥＣＴ２ａポリペプチド、並
びに配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有す
る、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含有しないヒ
トＬＥＣＴ２ｂポリペプチド、およびそれをコードする
ＤＮＡ。 【効果】 本発明の物質は、免疫細胞に関与する新しい
サイトカイン／インターロイキンであり、腫瘍免疫とし
ての治療、診断はもちろん、癌予知および癌予後の免疫
反応の検出などに利用できる。また、腫瘍の治療への応
用の可能性も充分考えられる。さらに、慢性炎症にも深
くかかわっていることが推定されるので、これら疾病の
診断、治療をはじめ、サイトカインネットワーク機能異
常、免疫不全を検出する新しい基礎研究に道を開くこと
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な構造を有するヒ
ト由来白血球活性化タンパク質因子およびそれをコード
する遺伝子ＤＮＡに関する。本発明は、上記遺伝子ＤＮ
Ａを有する組換えプラスミド、およびそれを用いて形質
転換した形質転換体にも関する。
ト由来白血球活性化タンパク質因子およびそれをコード
する遺伝子ＤＮＡに関する。本発明は、上記遺伝子ＤＮ
Ａを有する組換えプラスミド、およびそれを用いて形質
転換した形質転換体にも関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】好中
球が、マクロファージ、リンパ球などに加えて癌細胞破
壊反応へ関与することが示唆されている。また、多くの
癌組織の病理標本で好中球の癌細胞周辺への浸潤像が観
察されている。これらのことは、好中球が癌細胞の分泌
する走化性因子に応答した結果であると考えられる。
球が、マクロファージ、リンパ球などに加えて癌細胞破
壊反応へ関与することが示唆されている。また、多くの
癌組織の病理標本で好中球の癌細胞周辺への浸潤像が観
察されている。これらのことは、好中球が癌細胞の分泌
する走化性因子に応答した結果であると考えられる。
【０００３】したがって、好中球、マクロファージ、リ
ンパ球などを活性化することによって、癌細胞破壊反応
の亢進やインターロイキン類の分泌の促進等が誘導さ
れ、自然免疫能が高められるので、白血球活性化因子を
簡便に大量に安定的に調製することができれば、腫瘍免
疫としての治療、診断、予後の判定などはもちろん、好
中球、リンパ球、マクロファージの基礎研究分野での活
性化機構解明の研究にも利用することができる。
ンパ球などを活性化することによって、癌細胞破壊反応
の亢進やインターロイキン類の分泌の促進等が誘導さ
れ、自然免疫能が高められるので、白血球活性化因子を
簡便に大量に安定的に調製することができれば、腫瘍免
疫としての治療、診断、予後の判定などはもちろん、好
中球、リンパ球、マクロファージの基礎研究分野での活
性化機構解明の研究にも利用することができる。
【０００４】これまでに我々は、白血球浸潤が認められ
る組織像を示すヒト肺巨細胞癌より樹立した細胞を用い
て、この細胞が放出する好中球走化性因子インターロイ
キン８（ＬＵＣＴ／ＩＬ−８）を発見、精製分離し、そ
の遺伝子をクローニングしてきた。ＩＬ−８は、分子量
約８kDa の単純タンパク質で等電点は１０．３と高く、
７７アミノ酸残基のものと７２アミノ酸残基からなるも
のの２種類が主なＩＬ−８で、双方とも同等の活性があ
る。ＩＬ−８は炎症性のサイトカインであることから、
慢性炎症において血中に放出されることも知られてい
る。
る組織像を示すヒト肺巨細胞癌より樹立した細胞を用い
て、この細胞が放出する好中球走化性因子インターロイ
キン８（ＬＵＣＴ／ＩＬ−８）を発見、精製分離し、そ
の遺伝子をクローニングしてきた。ＩＬ−８は、分子量
約８kDa の単純タンパク質で等電点は１０．３と高く、
７７アミノ酸残基のものと７２アミノ酸残基からなるも
のの２種類が主なＩＬ−８で、双方とも同等の活性があ
る。ＩＬ−８は炎症性のサイトカインであることから、
慢性炎症において血中に放出されることも知られてい
る。
【０００５】しかしながら、ＩＬ−８とは異なる好中球
走化性因子が好中球と癌細胞との相互作用のメディエー
ターとして関与している可能性が考えられたので、新し
い走化性因子を検索することが必要であった。
走化性因子が好中球と癌細胞との相互作用のメディエー
ターとして関与している可能性が考えられたので、新し
い走化性因子を検索することが必要であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】今回、我々は、新規な白
血球走化性因子を検索するに際し、白血球走化活性を指
標にして各種ヒト造血器系腫瘍細胞株９７種の細胞培養
液をスクリーニングした結果、Ｔ細胞白血病細胞ＳＫＷ
−３の培養液中に走化性をもつタンパク質性因子を検出
した。この因子を精製分離したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによる分子量は約１６kDa とＩＬ−８の２倍の大きさ
であった。そこでアミノ酸配列を決定した結果、新しい
走化性因子であることが判明し、ＬＥＣＴ２（Leukocyt
e-derived chemotaxin 2) 、特にＬＥＣＴ２ａと命名し
た。さらにＬＥＣＴ２ａのｃＤＮＡのクローニングを試
みた。部分アミノ酸配列をもとに合成したプライマーを
用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりＬＥＣＴ２ａのｃＤＮＡの
一部と考えられるｃＤＮＡ断片を増幅し、ほぼ完全長と
考えられるｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列を決定
したところ、完全にＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列とは一
致せず高ホモロジーを示すタンパク（ＬＥＣＴ２ｂと命
名）をコードすることがわかった。
血球走化性因子を検索するに際し、白血球走化活性を指
標にして各種ヒト造血器系腫瘍細胞株９７種の細胞培養
液をスクリーニングした結果、Ｔ細胞白血病細胞ＳＫＷ
−３の培養液中に走化性をもつタンパク質性因子を検出
した。この因子を精製分離したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによる分子量は約１６kDa とＩＬ−８の２倍の大きさ
であった。そこでアミノ酸配列を決定した結果、新しい
走化性因子であることが判明し、ＬＥＣＴ２（Leukocyt
e-derived chemotaxin 2) 、特にＬＥＣＴ２ａと命名し
た。さらにＬＥＣＴ２ａのｃＤＮＡのクローニングを試
みた。部分アミノ酸配列をもとに合成したプライマーを
用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりＬＥＣＴ２ａのｃＤＮＡの
一部と考えられるｃＤＮＡ断片を増幅し、ほぼ完全長と
考えられるｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列を決定
したところ、完全にＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列とは一
致せず高ホモロジーを示すタンパク（ＬＥＣＴ２ｂと命
名）をコードすることがわかった。
【０００７】その結果、本発明の白血球活性化因子ＬＥ
ＣＴ２には、生物学的活性が白血球の活性化の点で共通
しており、アミノ酸配列が異なる少なくとも２種類のタ
ンパク質、すなわち、ＬＥＣＴ２ａおよびＬＥＣＴ２ｂ
が存在することがわかった。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配
列と、ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸
配列との比較から、これらのタンパク質のアミノ酸レベ
ルでの相同性は約９０％であることがわかっている。Ｌ
ＥＣＴ２ａのアミノ酸配列は、Ｎ末端に近い方から順に
配列表の配列番号１〜５に示されている。ＬＥＣＴ２ｂ
の推定アミノ酸配列は配列番号６に示されている。配列
番号７には、ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配
列および推定アミノ酸配列を示す。配列番号６および７
において、アミノ酸番号５８のＶａｌは、場合によりＩ
ｌｅであることもあり、これは個体の遺伝的バックグラ
ウンドによる多型と思われる。また、配列番号８は、Ｌ
ＥＣＴ２ａとＬＥＣＴ２ｂのアミノ酸配列を並記して比
較するものである。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列の空白
部分は、分子量がＬＥＣＴ２ａ、ＬＥＣＴ２ｂ共約１６
kDa であること、アミノ酸組成が両者で非常に似ている
ことから、ＬＥＣＴ２ｂと高ホモロジーを示すと考えら
れる。
ＣＴ２には、生物学的活性が白血球の活性化の点で共通
しており、アミノ酸配列が異なる少なくとも２種類のタ
ンパク質、すなわち、ＬＥＣＴ２ａおよびＬＥＣＴ２ｂ
が存在することがわかった。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配
列と、ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸
配列との比較から、これらのタンパク質のアミノ酸レベ
ルでの相同性は約９０％であることがわかっている。Ｌ
ＥＣＴ２ａのアミノ酸配列は、Ｎ末端に近い方から順に
配列表の配列番号１〜５に示されている。ＬＥＣＴ２ｂ
の推定アミノ酸配列は配列番号６に示されている。配列
番号７には、ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配
列および推定アミノ酸配列を示す。配列番号６および７
において、アミノ酸番号５８のＶａｌは、場合によりＩ
ｌｅであることもあり、これは個体の遺伝的バックグラ
ウンドによる多型と思われる。また、配列番号８は、Ｌ
ＥＣＴ２ａとＬＥＣＴ２ｂのアミノ酸配列を並記して比
較するものである。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列の空白
部分は、分子量がＬＥＣＴ２ａ、ＬＥＣＴ２ｂ共約１６
kDa であること、アミノ酸組成が両者で非常に似ている
ことから、ＬＥＣＴ２ｂと高ホモロジーを示すと考えら
れる。
【０００８】すなわち、本発明の白血球活性化因子は、
配列表の配列番号１〜５の配列、または配列番号６の配
列を有するヒトＬＥＣＴ２ポリペプチドである。さらに
詳しくは、配列表の配列番号１〜５に示されるアミノ酸
配列をその順番で有する、ヒト由来の他のタンパク質を
実質的に含有しないヒトＬＥＣＴ２ａポリペプチド、お
よび配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有す
る、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含有しないヒ
トＬＥＣＴ２ｂポリペプチドである。
配列表の配列番号１〜５の配列、または配列番号６の配
列を有するヒトＬＥＣＴ２ポリペプチドである。さらに
詳しくは、配列表の配列番号１〜５に示されるアミノ酸
配列をその順番で有する、ヒト由来の他のタンパク質を
実質的に含有しないヒトＬＥＣＴ２ａポリペプチド、お
よび配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有す
る、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含有しないヒ
トＬＥＣＴ２ｂポリペプチドである。
【０００９】本発明は、配列表の配列番号６に示される
アミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺
伝子ＤＮＡにも関し、特に、ヌクレオチド配列が、配列
表の配列番号７に示される配列であるヒトＬＥＣＴ２ｂ
遺伝子ＤＮＡにも関する。
アミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺
伝子ＤＮＡにも関し、特に、ヌクレオチド配列が、配列
表の配列番号７に示される配列であるヒトＬＥＣＴ２ｂ
遺伝子ＤＮＡにも関する。
【００１０】本発明はさらに、配列表の配列番号６に示
されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコード
する遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドにも関する。
さらに詳しくは、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子
ＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下にマルトース結
合タンパク質との融合タンパク質の形態で、マルトース
結合タンパク質とＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＴＥＶプ
ロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることがで
きるプラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂに関す
る。プラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂは、E.
coliＪＭ１０９株から得ることができる。また、本発明
は、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡが、ＳＲαプ
ロモーターの制御下にある、ＬＥＣＴ２ｂを高発現する
ことが可能な組換えプラスミドにも関する。本発明は、
ベクターとしてｐＧＥＸ−３Ｘを用いて得られる、ヒト
ＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡを、ｔａｃプロ
モーターの制御下にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼとの融合タンパク質の形態で、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼとＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＸａ
プロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることが
できるプラスミドｐＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣＴ２ｂにも関
する。
されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコード
する遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドにも関する。
さらに詳しくは、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子
ＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下にマルトース結
合タンパク質との融合タンパク質の形態で、マルトース
結合タンパク質とＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＴＥＶプ
ロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることがで
きるプラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂに関す
る。プラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂは、E.
coliＪＭ１０９株から得ることができる。また、本発明
は、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡが、ＳＲαプ
ロモーターの制御下にある、ＬＥＣＴ２ｂを高発現する
ことが可能な組換えプラスミドにも関する。本発明は、
ベクターとしてｐＧＥＸ−３Ｘを用いて得られる、ヒト
ＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡを、ｔａｃプロ
モーターの制御下にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼとの融合タンパク質の形態で、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼとＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＸａ
プロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることが
できるプラスミドｐＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣＴ２ｂにも関
する。
【００１１】本発明は、さらに、配列表の配列番号６に
示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコー
ドするＤＮＡを含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた宿主細胞、特にチャイニーズハムスターＣＨＯ細
胞、サルＣＶＩ細胞、サルＣＶＩ／２９３細胞、マウス
線維芽細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、
マウスＬ−９２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞およびヒトＳ
ＫＷ−３細胞にも関する。
示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコー
ドするＤＮＡを含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた宿主細胞、特にチャイニーズハムスターＣＨＯ細
胞、サルＣＶＩ細胞、サルＣＶＩ／２９３細胞、マウス
線維芽細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、
マウスＬ−９２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞およびヒトＳ
ＫＷ−３細胞にも関する。
【００１２】白血球活性化とは、好中球、単球（マクロ
ファージ）、リンパ球の機能の活性化をいう。具体的に
は、好中球および単球（マクロファージ）においては、
粘着能、遊走能（走化性）、貪食能、活性酸素産生能、
ライソゾーム酵素放出（脱顆粒）能、細胞障害作用（が
ん細胞破壊作用を含む）および各種サイトカイン産生・
分泌、また、リンパ球においては、抗体産生、各種サイ
トカイン産生・分泌、レセプターの発現である。
ファージ）、リンパ球の機能の活性化をいう。具体的に
は、好中球および単球（マクロファージ）においては、
粘着能、遊走能（走化性）、貪食能、活性酸素産生能、
ライソゾーム酵素放出（脱顆粒）能、細胞障害作用（が
ん細胞破壊作用を含む）および各種サイトカイン産生・
分泌、また、リンパ球においては、抗体産生、各種サイ
トカイン産生・分泌、レセプターの発現である。
【００１３】本発明の白血球活性化因子は、白血病細胞
のような細胞の培養上清からタンパク質をＣＭ−セファ
ロースで濃縮し、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ−セフ
ァロース、ＨＰＬＣによるハイドロキシアパタイト、逆
相クロマトグラフィにかけることにより単品として精製
することができる。例えば、培養したＳＫＷ−３などの
白血病細胞をＰＨＡ−Ｐにより刺激して培養上清中に本
発明の白血球活性化因子を放出させ、この上清から、カ
ラムクロマトグラフィなどの手法を用いて本発明の白血
球活性化因子を精製することができる。
のような細胞の培養上清からタンパク質をＣＭ−セファ
ロースで濃縮し、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ−セフ
ァロース、ＨＰＬＣによるハイドロキシアパタイト、逆
相クロマトグラフィにかけることにより単品として精製
することができる。例えば、培養したＳＫＷ−３などの
白血病細胞をＰＨＡ−Ｐにより刺激して培養上清中に本
発明の白血球活性化因子を放出させ、この上清から、カ
ラムクロマトグラフィなどの手法を用いて本発明の白血
球活性化因子を精製することができる。
【００１４】また、本発明の白血球活性化因子は、本発
明の組換えプラスミドを用いて作製した形質転換体に産
生させてもよい。本発明の組換えプラスミドは、例えば
ｐＭＡＬTM−Ｃ（Biolab Inc.)、またはｐＧＥＸ−３Ｘ
（Pharmacia Inc.) をベクターとして用いて作製するこ
とができる。宿主細胞としては、従来公知の細菌（大腸
菌など）、酵母および動物細胞を用いることができる。
例えば、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＶ
Ｉ細胞、サルＣＶＩ／２９３細胞、マウス線維芽細胞、
マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ−９
２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞およびヒトＳＫＷ−３細胞
などが挙げられる。細胞の培養、培養上清からの本発明
のタンパク質の精製、組換えプラスミドの作製、形質転
換の方法、さらに形質転換体からの本発明のタンパク質
の採取は、当業者に公知の標準的手法を用いて実施する
ことができる。
明の組換えプラスミドを用いて作製した形質転換体に産
生させてもよい。本発明の組換えプラスミドは、例えば
ｐＭＡＬTM−Ｃ（Biolab Inc.)、またはｐＧＥＸ−３Ｘ
（Pharmacia Inc.) をベクターとして用いて作製するこ
とができる。宿主細胞としては、従来公知の細菌（大腸
菌など）、酵母および動物細胞を用いることができる。
例えば、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＶ
Ｉ細胞、サルＣＶＩ／２９３細胞、マウス線維芽細胞、
マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ−９
２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞およびヒトＳＫＷ−３細胞
などが挙げられる。細胞の培養、培養上清からの本発明
のタンパク質の精製、組換えプラスミドの作製、形質転
換の方法、さらに形質転換体からの本発明のタンパク質
の採取は、当業者に公知の標準的手法を用いて実施する
ことができる。
【００１５】本発明を以下の実施例によりさらに詳しく
説明する。
説明する。
【００１６】
【実施例】１．ＬＥＣＴ２ａの精製 試薬として、以下のものを用いた。 １）１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＤＷ ２）×５Ｒ緩衝液（２５０mM リン酸ナトリウム緩衝
液、pH７．４） Ｒ緩衝液は、５０mM ＮａＰＢ、pH７．４である。 ３）Ｒ５緩衝液（０．００５％ＢＳＡを含む５０mM リ
ン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４） Ｒ１緩衝液（０．００１％ＢＳＡを含む５０mM リン酸
ナトリウム緩衝液、pH７．４） ４）ＣＭ溶出緩衝液（０．７M ＮａＣｌを含むＲ１緩衝
液）
液、pH７．４） Ｒ緩衝液は、５０mM ＮａＰＢ、pH７．４である。 ３）Ｒ５緩衝液（０．００５％ＢＳＡを含む５０mM リ
ン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４） Ｒ１緩衝液（０．００１％ＢＳＡを含む５０mM リン酸
ナトリウム緩衝液、pH７．４） ４）ＣＭ溶出緩衝液（０．７M ＮａＣｌを含むＲ１緩衝
液）
【００１７】方法 １）ＳＫＷ−３細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培養液に刺激剤としてＰＨＡ−Ｐ（DIFC
O 社製）５μg/mlになるよう加えた中で、３７℃で２４
時間、５％ＣＯ2 を含む大気中でインキュベートした。
この培養上清７L を遠心により採取し、−２０℃にて凍
結した。 ２）上記で得られた凍結サンプル７L を、２０L の蒸留
水にいれ、解凍した。 これを用いて以下の手順により本発明の白血球活性化因
子を精製した。
ＭＩ−１６４０培養液に刺激剤としてＰＨＡ−Ｐ（DIFC
O 社製）５μg/mlになるよう加えた中で、３７℃で２４
時間、５％ＣＯ2 を含む大気中でインキュベートした。
この培養上清７L を遠心により採取し、−２０℃にて凍
結した。 ２）上記で得られた凍結サンプル７L を、２０L の蒸留
水にいれ、解凍した。 これを用いて以下の手順により本発明の白血球活性化因
子を精製した。
【００１８】部分精製 １）解凍サンプルに２００mlのＣＭ−セファロースＣＬ
−６Ｂ（Ｒ緩衝液に懸濁したもの）を加えた。 ２）４℃で４時間撹拌した。 ３）キリヤマロートで（フィルター５Ｂ ３シート）濾
過した。 ４）冷蒸留水５００mlで洗浄した。 ５）さらに、１００mlのＲ５緩衝液で２回洗浄した。 ６）次に、３００mlの溶出緩衝液で溶出した。 ７）３L のＲ緩衝液に対して２回透析を行った。 ８）２５mlのＤＥＡＥ−セファロース懸濁液を加えた。 ９）４℃で２時間撹拌した。 １０）キリヤマロートで（フィルター５Ｂ ３シート）
濾過した。 １１）２５mlのＲ５緩衝液で２回洗浄した。 １２）ＣＭーセファロースカラム（３mlパック）にかけ
た。 １３）Ｒ１緩衝液３mlで２回洗浄した。 １４）１０mlのＲ１緩衝液と１０mlの０．７M ＮａＣｌ
／Ｒ１緩衝液を用いる直線グラジエントで溶出した。 １５）フラクション８〜１１を部分精製品として採取し
た。
−６Ｂ（Ｒ緩衝液に懸濁したもの）を加えた。 ２）４℃で４時間撹拌した。 ３）キリヤマロートで（フィルター５Ｂ ３シート）濾
過した。 ４）冷蒸留水５００mlで洗浄した。 ５）さらに、１００mlのＲ５緩衝液で２回洗浄した。 ６）次に、３００mlの溶出緩衝液で溶出した。 ７）３L のＲ緩衝液に対して２回透析を行った。 ８）２５mlのＤＥＡＥ−セファロース懸濁液を加えた。 ９）４℃で２時間撹拌した。 １０）キリヤマロートで（フィルター５Ｂ ３シート）
濾過した。 １１）２５mlのＲ５緩衝液で２回洗浄した。 １２）ＣＭーセファロースカラム（３mlパック）にかけ
た。 １３）Ｒ１緩衝液３mlで２回洗浄した。 １４）１０mlのＲ１緩衝液と１０mlの０．７M ＮａＣｌ
／Ｒ１緩衝液を用いる直線グラジエントで溶出した。 １５）フラクション８〜１１を部分精製品として採取し
た。
【００１９】ＨＰＬＣによる完全精製 １）部分精製２回分をまとめた。 ２）サンプル２．５ml（１．２ O.D. ）をＨＰＬＣのＲ
Ｐカラム５ＴＭＳ−３００（Ｆ３９００１）（４．６×
２５０mm）にかけた。 ３）グラジエント：３０〜８０％Ｂ／６０分で溶出させ
た。〔Ａ液：０．１％テトラフロロ酢酸（ＴＦＡ）；Ｂ
液：０．１％ＴＦＡを含む７５％アセトニトリル〕 ４）フラクション２〜７（１６．５ml）を集めた。 ５）サンプルをＶｙｄａｃ Ｃ４カラム ３０４−２１
５１（６×１５０mm）にかけた。 ６）グラジエント：３０〜８０％Ｂ／６０分で溶出させ
た。 ７）４L の２５mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４で
２回透析した。 ８）サンプルは−８０℃に保存した。 以上の手順により精製した際のＬＥＣＴ２ａの精製を表
１に示す。
Ｐカラム５ＴＭＳ−３００（Ｆ３９００１）（４．６×
２５０mm）にかけた。 ３）グラジエント：３０〜８０％Ｂ／６０分で溶出させ
た。〔Ａ液：０．１％テトラフロロ酢酸（ＴＦＡ）；Ｂ
液：０．１％ＴＦＡを含む７５％アセトニトリル〕 ４）フラクション２〜７（１６．５ml）を集めた。 ５）サンプルをＶｙｄａｃ Ｃ４カラム ３０４−２１
５１（６×１５０mm）にかけた。 ６）グラジエント：３０〜８０％Ｂ／６０分で溶出させ
た。 ７）４L の２５mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４で
２回透析した。 ８）サンプルは−８０℃に保存した。 以上の手順により精製した際のＬＥＣＴ２ａの精製を表
１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】分子量の決定 上記のようにして得たサンプル中のＬＥＣＴ２ａの分子
量を、トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）（１６．５％モノアクリルアミド／ビ
スアクリルアミド；３％ビス／モノアクリルアミド＋ビ
ス）により決定した。結果を図１に示す。この結果か
ら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したＬＥＣＴ２ａの分
子量は約１６kDa であることがわかる。
量を、トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）（１６．５％モノアクリルアミド／ビ
スアクリルアミド；３％ビス／モノアクリルアミド＋ビ
ス）により決定した。結果を図１に示す。この結果か
ら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したＬＥＣＴ２ａの分
子量は約１６kDa であることがわかる。
【００２２】活性の検定 １．好中球活性化 以下において、ＨＢＳＳとは、ハンクス溶液（１L 中、
０．４g ＫＣｌ、８gＮａＣｌ、０．１５g ＫＨ2 ＰＯ4
、０．２９g Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１．１g Ｄ
−グルコース）である。 １）好中球走化活性 好中球走化活性測定のためのサンプルを１％ＢＳＡ、
０．４％重炭酸ナトリウムを含むＨＢＳＳに溶かし、３
μm のポアサイズのミリポアフィルターで仕切ったボイ
デンチャンバーの下室に２００μl 入れ、次いで、ＨＢ
ＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中
球（２００μl ）を上室に入れ、５％ＣＯ2 インキュベ
ーター中で、３７℃、３５分間培養し、エタノールで固
定後、ヘマトキシリン溶液で染色し、好中球の移動距離
を顕微鏡で測定した。その結果、５０％活性を示す濃度
は４０nMであった。
０．４g ＫＣｌ、８gＮａＣｌ、０．１５g ＫＨ2 ＰＯ4
、０．２９g Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１．１g Ｄ
−グルコース）である。 １）好中球走化活性 好中球走化活性測定のためのサンプルを１％ＢＳＡ、
０．４％重炭酸ナトリウムを含むＨＢＳＳに溶かし、３
μm のポアサイズのミリポアフィルターで仕切ったボイ
デンチャンバーの下室に２００μl 入れ、次いで、ＨＢ
ＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中
球（２００μl ）を上室に入れ、５％ＣＯ2 インキュベ
ーター中で、３７℃、３５分間培養し、エタノールで固
定後、ヘマトキシリン溶液で染色し、好中球の移動距離
を顕微鏡で測定した。その結果、５０％活性を示す濃度
は４０nMであった。
【００２３】２）好中球ライソゾーム酵素放出活性 ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト
好中球（３７．５μl）にサンプル１０μl を加え、場
合によってサイトカラシンＢ（５μg/ml）、fMet-Leu-P
he（１０-5〜１０-11M）を加え、総量７５μl とし、３
７℃で、１０分間インキュベートした。遠心（１，５０
０rpm 、５min ）により細胞外液と細胞に分け、細胞は
０．１％トリトンＸ−１００／ＨＢＳＳを加えて混合
し、破砕した。細胞外液と細胞破砕液中のライソゾーム
酵素ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、β−グルクロ
ニダーゼ（ＢＧＬ）、ラクトフェリンを以下のように測
定した。
好中球（３７．５μl）にサンプル１０μl を加え、場
合によってサイトカラシンＢ（５μg/ml）、fMet-Leu-P
he（１０-5〜１０-11M）を加え、総量７５μl とし、３
７℃で、１０分間インキュベートした。遠心（１，５０
０rpm 、５min ）により細胞外液と細胞に分け、細胞は
０．１％トリトンＸ−１００／ＨＢＳＳを加えて混合
し、破砕した。細胞外液と細胞破砕液中のライソゾーム
酵素ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、β−グルクロ
ニダーゼ（ＢＧＬ）、ラクトフェリンを以下のように測
定した。
【００２４】ａ）ＭＰＯ活性測定 基質として３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジ
ンを用い、マルチウエル用オートマチックアナライザー
で６５５nmにおける吸光度の増加率より定量した。１un
itは６５５nmの吸光度が１mlあたり１．０とした。 ｂ）ＢＧＬ活性測定 ４−メチルウンベリフェリルβ−グルクロニドを基質と
してマルチウエル用オートマチックアナライザーで３６
０nm励起（excitation）、４５０nm発光（emission）の
蛍光の増加率より定量した。１unitは１mlあたり１分間
に１pmolの４−メチルウンベリフェロン遊離とした。 ｃ）ラクトフェリン測定 抗ヒトラクトフェリンヤギＩｇＧ（ＮＯＲ社、ＧＡＨｕ
／Ｌｆｒ）を１，０００倍希釈したもの１００μl を９
６ウエルプレートにまき、洗浄後、好中球からの放出外
液と細胞破砕液１００μl を入れ、１時間室温でインキ
ュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウ
サギＩｇＧ（ＣＰＬ ３６１２−００８１）を１，００
０倍希釈したもの１００μl を９６ウエルプレートにま
き、１時間室温でインキュベートした。ペルオキシダー
ゼ基質と反応させ、４９２nmの吸光度を測定し、標準品
より、ラクトフェリンを定量した。 以上のａ）〜ｃ）の結果を表２に示す。
ンを用い、マルチウエル用オートマチックアナライザー
で６５５nmにおける吸光度の増加率より定量した。１un
itは６５５nmの吸光度が１mlあたり１．０とした。 ｂ）ＢＧＬ活性測定 ４−メチルウンベリフェリルβ−グルクロニドを基質と
してマルチウエル用オートマチックアナライザーで３６
０nm励起（excitation）、４５０nm発光（emission）の
蛍光の増加率より定量した。１unitは１mlあたり１分間
に１pmolの４−メチルウンベリフェロン遊離とした。 ｃ）ラクトフェリン測定 抗ヒトラクトフェリンヤギＩｇＧ（ＮＯＲ社、ＧＡＨｕ
／Ｌｆｒ）を１，０００倍希釈したもの１００μl を９
６ウエルプレートにまき、洗浄後、好中球からの放出外
液と細胞破砕液１００μl を入れ、１時間室温でインキ
ュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウ
サギＩｇＧ（ＣＰＬ ３６１２−００８１）を１，００
０倍希釈したもの１００μl を９６ウエルプレートにま
き、１時間室温でインキュベートした。ペルオキシダー
ゼ基質と反応させ、４９２nmの吸光度を測定し、標準品
より、ラクトフェリンを定量した。 以上のａ）〜ｃ）の結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】３）好中球活性酸素産生活性 ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト
好中球（１００μl ）にフェリシトクロームｃ（１．３
２mM）を１０μl 、サンプルの１０μl を加え、場合に
よってサイトカラシンＢ（５μg/ml）、fMet-Leu-Phe
（１０-5〜１０-11M）を加え、総量２００μl とし、３
７℃でインキュベートし、５５０nmの吸光度の時間あた
りの変化量より活性酸素産生量を算出した。結果を表２
に示す。
好中球（１００μl ）にフェリシトクロームｃ（１．３
２mM）を１０μl 、サンプルの１０μl を加え、場合に
よってサイトカラシンＢ（５μg/ml）、fMet-Leu-Phe
（１０-5〜１０-11M）を加え、総量２００μl とし、３
７℃でインキュベートし、５５０nmの吸光度の時間あた
りの変化量より活性酸素産生量を算出した。結果を表２
に示す。
【００２７】４）好中球粘着活性 ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト
好中球（１００μl ）をスライドチャンバーにいれ、サ
ンプルの１０μl を加え、場合によってfMet-Leu-Phe
（１０-5〜１０-11M）を加え、総量１５０μl とし、５
％ＣＯ2 インキュベーター中で、３７℃、１５分間培養
し、粘着しなかった細胞を吸い取り、細胞数を測定し
た。また、スライドチャンバーはエタノールで固定後、
サフラニン染色し、細胞の粘着を測定した。結果を表２
に示す。
好中球（１００μl ）をスライドチャンバーにいれ、サ
ンプルの１０μl を加え、場合によってfMet-Leu-Phe
（１０-5〜１０-11M）を加え、総量１５０μl とし、５
％ＣＯ2 インキュベーター中で、３７℃、１５分間培養
し、粘着しなかった細胞を吸い取り、細胞数を測定し
た。また、スライドチャンバーはエタノールで固定後、
サフラニン染色し、細胞の粘着を測定した。結果を表２
に示す。
【００２８】５）好中球膜流動性 蛍光色素ＦＩＴＣ標識のコンカナバリンＡ（ＦＳ−Ｃｏ
ｎＡ）と好中球を予め０℃で１０分間静置後、ＨＢＳＳ
を加えて遠心し、ＨＢＳＳ中に２×１０6 cell/ml の濃
度に調製したＦＳ−ＣｏｎＡ標識ヒト好中球（１００μ
l ）をスライドチャンバーにいれ、サンプルの１０μl
を加え、場合によってfMet-Leu-Phe（１０-8M ）を加
え、総量１５０μl とし、３７℃でインキュベートしな
がら、細胞上の蛍光の運動をニコン倒立顕微鏡に接続し
た画像解析装置（ＩＭＲＡＳ）にて撮像および解析し
た。
ｎＡ）と好中球を予め０℃で１０分間静置後、ＨＢＳＳ
を加えて遠心し、ＨＢＳＳ中に２×１０6 cell/ml の濃
度に調製したＦＳ−ＣｏｎＡ標識ヒト好中球（１００μ
l ）をスライドチャンバーにいれ、サンプルの１０μl
を加え、場合によってfMet-Leu-Phe（１０-8M ）を加
え、総量１５０μl とし、３７℃でインキュベートしな
がら、細胞上の蛍光の運動をニコン倒立顕微鏡に接続し
た画像解析装置（ＩＭＲＡＳ）にて撮像および解析し
た。
【００２９】２）単球、リンパ球の走化活性 １）の好中球走化活性とほぼ同様に行った。ただし、ミ
リポアフィルターは５μm のポアサイズのものを用い、
７５分間インキュベートした。５０％活性を示す濃度
は、単球については２２０nMで、リンパ球については４
３０nMであった。
リポアフィルターは５μm のポアサイズのものを用い、
７５分間インキュベートした。５０％活性を示す濃度
は、単球については２２０nMで、リンパ球については４
３０nMであった。
【００３０】２．精製されたタンパク質ＬＥＣＴ２ａの
アミノ酸配列 上記のように精製したタンパク質ＬＥＣＴ２ａのアミノ
酸配列は、エドマン法でアプライドバイオシステムズ社
製モデルＡＢＩにより決定した。得られた配列を配列表
の配列番号１〜５に示す。
アミノ酸配列 上記のように精製したタンパク質ＬＥＣＴ２ａのアミノ
酸配列は、エドマン法でアプライドバイオシステムズ社
製モデルＡＢＩにより決定した。得られた配列を配列表
の配列番号１〜５に示す。
【００３１】３．ＬＥＣＴ２ｂのクローニングおよびク
ローニングされたＬＥＣＴ２ｂのヌクレオ チド配列の決
定 ＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡのクローニングは次のようにし
て行った。５０μg/mlのＰＨＡ−ＰでＳＫＷ−３を処理
しｐｏｌｙＡ+ ＲＮＡを調製した。５μg のｐｏｌｙＡ
+ ＲＮＡを用い、ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーにして
ファーストストランドｃＤＮＡ（１ｓｔ ｃＤＮＡ）を
合成した。次に、決定したＬＥＣＴ２ａの部分アミノ酸
配列を基にＰＣＲのプライマーを合成した。アミノ酸配
列ＷＡＩＩＣＡより６種類のオリゴヌクレオチドを演繹
して５´のプライマーとし、ＨＩＥＮＣＤより４種類の
オリゴヌクレオチドを演繹して３´のプライマーとし
た。ＰＣＲ法により、１ｓｔ ｃＤＮＡを鋳型とし上記
プライマーの組み合わせである２４種類の反応にてＤＮ
Ａ断片の増幅を行った。アミノ酸配列ＤＶＬＣＳＤＧＳ
ＴＶＹＡＰＦを基にＤＮＡプローブ（GATGTC/GCTA/GTGC
TCT/CGATGGC/GTCT/CACT/AGTC/GTATGCT/CCCT/CTT ）を使
い、増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離し、
サザンブロットにより解析した。その結果、約３７０bp
のＤＮＡ断片が検出され、それをｐＵＣ１９にクローニ
ングした。
ローニングされたＬＥＣＴ２ｂのヌクレオ チド配列の決
定 ＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡのクローニングは次のようにし
て行った。５０μg/mlのＰＨＡ−ＰでＳＫＷ−３を処理
しｐｏｌｙＡ+ ＲＮＡを調製した。５μg のｐｏｌｙＡ
+ ＲＮＡを用い、ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーにして
ファーストストランドｃＤＮＡ（１ｓｔ ｃＤＮＡ）を
合成した。次に、決定したＬＥＣＴ２ａの部分アミノ酸
配列を基にＰＣＲのプライマーを合成した。アミノ酸配
列ＷＡＩＩＣＡより６種類のオリゴヌクレオチドを演繹
して５´のプライマーとし、ＨＩＥＮＣＤより４種類の
オリゴヌクレオチドを演繹して３´のプライマーとし
た。ＰＣＲ法により、１ｓｔ ｃＤＮＡを鋳型とし上記
プライマーの組み合わせである２４種類の反応にてＤＮ
Ａ断片の増幅を行った。アミノ酸配列ＤＶＬＣＳＤＧＳ
ＴＶＹＡＰＦを基にＤＮＡプローブ（GATGTC/GCTA/GTGC
TCT/CGATGGC/GTCT/CACT/AGTC/GTATGCT/CCCT/CTT ）を使
い、増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離し、
サザンブロットにより解析した。その結果、約３７０bp
のＤＮＡ断片が検出され、それをｐＵＣ１９にクローニ
ングした。
【００３２】デオキシ法にて塩基配列を決定したとこ
ろ、ＬＥＣＴ２ａに約９０％のホモロジーを持つペプチ
ドをコードすることが判明した。ヒト肝臓ｃＤＮＡライ
ブラリーを、クローニングされたｃＤＮＡ断片をプロー
ブとしてスクリーニングした。１３０万個のクローン中
１２クローンの陽性クローンを得た。それぞれのクロー
ンはすべて、制限酵素の解析により２種類に分けられる
ことがわかり、それぞれのグループの一番長いｃＤＮＡ
断片のクローンの塩基配列の決定をした。その結果、２
種類のｃＤＮＡは同一の遺伝子由来で３´側に存在する
２種類のｐｏｌｙＡシグナルにより生じることが推定さ
れた。また、コードされたタンパク質のアミノ酸配列よ
りＬＥＣＴ２ａの決定されたアミノ酸配列に約９０％の
ホモロジーを有することが判明し、このコードされると
考えられるタンパク質をＬＥＣＴ２ｂと命名した。
ろ、ＬＥＣＴ２ａに約９０％のホモロジーを持つペプチ
ドをコードすることが判明した。ヒト肝臓ｃＤＮＡライ
ブラリーを、クローニングされたｃＤＮＡ断片をプロー
ブとしてスクリーニングした。１３０万個のクローン中
１２クローンの陽性クローンを得た。それぞれのクロー
ンはすべて、制限酵素の解析により２種類に分けられる
ことがわかり、それぞれのグループの一番長いｃＤＮＡ
断片のクローンの塩基配列の決定をした。その結果、２
種類のｃＤＮＡは同一の遺伝子由来で３´側に存在する
２種類のｐｏｌｙＡシグナルにより生じることが推定さ
れた。また、コードされたタンパク質のアミノ酸配列よ
りＬＥＣＴ２ａの決定されたアミノ酸配列に約９０％の
ホモロジーを有することが判明し、このコードされると
考えられるタンパク質をＬＥＣＴ２ｂと命名した。
【００３３】４．ＬＥＣＴ２ｂ遺伝子を含む組換えプラ
スミドの構築 クローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡをもとに、
５′側のプライマーとしてGGCGAATTCGAAAACCTGTATTTTCA
GGGGCCCTGGGCTAATATATG 、３′側のプライマートしてCG
CAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAGをそれぞれ用い、熱変性：９
４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長反
応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にてＬ
ＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させた。
ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII での処理後、この断片をｐＭ
ＡＬTM−Ｃ (Biolab Inc.) のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄII
I 部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、
ｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂと命名した。この発現
ベクターは、ＩＰＴＧ存在下で、ｔａｃプロモーターの
制御下マルトース結合タンパク質（maltose-binding-pr
otein ）とＬＥＣＴ２ｂの融合タンパク質を産生させる
ことができ、その連結部分にＴＥＶプロテアーゼ（Taba
cco Etch Virus由来）の切断部位が入っているので特異
的な切断ができることが特徴である。
スミドの構築 クローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡをもとに、
５′側のプライマーとしてGGCGAATTCGAAAACCTGTATTTTCA
GGGGCCCTGGGCTAATATATG 、３′側のプライマートしてCG
CAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAGをそれぞれ用い、熱変性：９
４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長反
応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にてＬ
ＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させた。
ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII での処理後、この断片をｐＭ
ＡＬTM−Ｃ (Biolab Inc.) のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄII
I 部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、
ｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂと命名した。この発現
ベクターは、ＩＰＴＧ存在下で、ｔａｃプロモーターの
制御下マルトース結合タンパク質（maltose-binding-pr
otein ）とＬＥＣＴ２ｂの融合タンパク質を産生させる
ことができ、その連結部分にＴＥＶプロテアーゼ（Taba
cco Etch Virus由来）の切断部位が入っているので特異
的な切断ができることが特徴である。
【００３４】また、クローニングされたＬＥＣＴ２ｂ
ｃＤＮＡをもとに、５´側のプライマーとして GCGGGAT
CCCCGGGCCATGGGCTAATAT 、３´側のプライマーとして C
GCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG をそれぞれ用い、熱変性：
９４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長
反応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にて
ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させ
た。ＢａｍＨＩで処理後、この断片をｐＧＥＸ−３Ｘ
（Pharmacia Inc.) のＢａｍＨＩ部位にクローニングし
た。この組換えプラスミドを、ｐＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣ
Ｔ２ｂと命名した。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ存在
下で、ｔａｃプロモーターの制御下グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼとＬＥＣＴ２ｂの融合タンパク質を
産生させることができ、その連結部分にＸａプロテアー
ゼの切断部位が入っているので特異的な切断ができるこ
とが特徴である。
ｃＤＮＡをもとに、５´側のプライマーとして GCGGGAT
CCCCGGGCCATGGGCTAATAT 、３´側のプライマーとして C
GCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG をそれぞれ用い、熱変性：
９４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長
反応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にて
ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させ
た。ＢａｍＨＩで処理後、この断片をｐＧＥＸ−３Ｘ
（Pharmacia Inc.) のＢａｍＨＩ部位にクローニングし
た。この組換えプラスミドを、ｐＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣ
Ｔ２ｂと命名した。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ存在
下で、ｔａｃプロモーターの制御下グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼとＬＥＣＴ２ｂの融合タンパク質を
産生させることができ、その連結部分にＸａプロテアー
ゼの切断部位が入っているので特異的な切断ができるこ
とが特徴である。
【００３５】５．ＬＥＣＴ２ｂ遺伝子を含む組換えプラ
スミドによる大腸菌の形質転換 上記のようにして得られた組換えプラスミドｐＭＡＬ−
ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換後、得られた大腸菌クローンを、デオキシ法によ
り期待された塩基配列を有するものに関してスクリーニ
ングし、期待されるＤＮＡ断片を持つ大腸菌クローンＭ
ａｌ−ＬＥＣＴ２ｂ（寄託番号ＦＥＲＭＰ−１４６６
９）を得た。
スミドによる大腸菌の形質転換 上記のようにして得られた組換えプラスミドｐＭＡＬ−
ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換後、得られた大腸菌クローンを、デオキシ法によ
り期待された塩基配列を有するものに関してスクリーニ
ングし、期待されるＤＮＡ断片を持つ大腸菌クローンＭ
ａｌ−ＬＥＣＴ２ｂ（寄託番号ＦＥＲＭＰ−１４６６
９）を得た。
【００３６】６．動物細胞によるＬＥＣＴ２ｂの産生 ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位にＨｉｎｄIII からＥｃｏ
ＲＩの方向でクローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮ
Ａの５′側をエキソヌクレアーゼIII により−１４の塩
基配列まで欠失させ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端にした後、ＰｓｔＩリンカーをライゲーションし、
ＰｓｔＩとＢｇｌIIで切断し、発現ベクターｐｃＤＬ−
ＳＲα２９４のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニン
グした。この組換え発現ベクターをチャイニーズハムス
ターＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、ＬＥＣＴ２
ｂを高発現する株１株（Ｃ１Ｄ８−１）（寄託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４６６８）を得た。分子量の決定 リコンビナントＬＥＣＴ２ｂ（動物細胞発現）は、35Ｓ
−メチオニンによってメタボリックラベルし、ＣＨＯ細
胞の培養上清をＳＤＳゲル電気泳動にかけることにより
検出した。その結果、分子量が約１４kDa と１６kDa の
２本のバンド（１６kDa が主要であり、２つのバンドは
プロセッシングの違いにより生じると考えられる）が得
られ、リコンビナントＬＥＣＴ２ｂの分子量はほぼＬＥ
ＣＴ２ａの分子量約１６kDa と一致した。活性の検定 ＬＥＣＴ２ａについて既に記載したのと同様にして、リ
コンビナントＬＥＣＴ２ｂの白血球活性化活性を評価し
た。その結果の一部を表３に示す。
ＲＩの方向でクローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮ
Ａの５′側をエキソヌクレアーゼIII により−１４の塩
基配列まで欠失させ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端にした後、ＰｓｔＩリンカーをライゲーションし、
ＰｓｔＩとＢｇｌIIで切断し、発現ベクターｐｃＤＬ−
ＳＲα２９４のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニン
グした。この組換え発現ベクターをチャイニーズハムス
ターＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、ＬＥＣＴ２
ｂを高発現する株１株（Ｃ１Ｄ８−１）（寄託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４６６８）を得た。分子量の決定 リコンビナントＬＥＣＴ２ｂ（動物細胞発現）は、35Ｓ
−メチオニンによってメタボリックラベルし、ＣＨＯ細
胞の培養上清をＳＤＳゲル電気泳動にかけることにより
検出した。その結果、分子量が約１４kDa と１６kDa の
２本のバンド（１６kDa が主要であり、２つのバンドは
プロセッシングの違いにより生じると考えられる）が得
られ、リコンビナントＬＥＣＴ２ｂの分子量はほぼＬＥ
ＣＴ２ａの分子量約１６kDa と一致した。活性の検定 ＬＥＣＴ２ａについて既に記載したのと同様にして、リ
コンビナントＬＥＣＴ２ｂの白血球活性化活性を評価し
た。その結果の一部を表３に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】
【発明の効果】本発明の物質は、免疫細胞に関与する新
しいサイトカイン／インターロイキンであるところか
ら、腫瘍免疫としての治療、診断はもちろん、癌予知お
よび癌予後の免疫反応の検出などに利用できる。また、
腫瘍の治療への応用の可能性も充分考えられる。さら
に、好中球をはじめとする炎症細胞に関与することか
ら、慢性炎症にも深くかかわっていることが推定される
ので、これら疾病の診断、治療をはじめ、サイトカイン
ネットワーク機能異常、免疫不全を検出する新しい基礎
研究に道を開くことができる。
しいサイトカイン／インターロイキンであるところか
ら、腫瘍免疫としての治療、診断はもちろん、癌予知お
よび癌予後の免疫反応の検出などに利用できる。また、
腫瘍の治療への応用の可能性も充分考えられる。さら
に、好中球をはじめとする炎症細胞に関与することか
ら、慢性炎症にも深くかかわっていることが推定される
ので、これら疾病の診断、治療をはじめ、サイトカイン
ネットワーク機能異常、免疫不全を検出する新しい基礎
研究に道を開くことができる。
【００３９】
配列番号：１ 配列の長さ：５４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ−末端フラグメント 起源：ヒト 細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞 セルライン：ＳＫＷ−３ 配列 Gly Pro Trp Ala Ile Ile Cys Ala Gly Lys Ser Ser Asn Glu Ile Arg 1 5 10 15 Thr Cys Asp Gly His Gly Cys Gly Gln Tyr Thr Ala Gln Arg Asn Gln 20 25 30 Lys Leu His Gln Gly Val Asp Val Leu Cys Ser Asp Gly Ser Thr Val 35 40 45 Tyr Ala Pro Phe Thr Gly 50
【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ヒト 細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞 セルライン：ＳＫＷ−３
【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ヒト 細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞 セルライン：ＳＫＷ−３
【００４２】配列番号：４ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ヒト 細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞 セルライン：ＳＫＷ−３
【００４３】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ヒト 細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞 セルライン：ＳＫＷ−３ 配列 Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser His Ile His Ile Glu Asn Cys Asp Leu 1 5 10 15 Ser Asp Pro Thr 20
【００４４】配列番号：６ 配列の長さ：１５１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Phe Ser Thr Lys Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ile Ser Thr Ala 1 5 10 15 Leu Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ile Cys Ala Gly Lys Ser Ser Asn Glu 20 25 30 Ile Arg Thr Cys Asp Arg His Gly Cys Gly Gln Tyr Ser Ala Gln Arg 35 40 45 Ser Gln Arg Pro His Gln Gly Val Asp Val*Leu Cys Ser Ala Gly Ser 50 55 60 Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Met Ile Val Gly Gln Glu Lys Pro 65 70 75 80 Tyr Gln Asn Lys Asn Ala Ile Asn Asn Gly Val Arg Ile Ser Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Cys Val Lys Met Phe Tyr Ile Lys Pro Ile Lys Tyr Lys Gly 100 105 110 Pro Ile Lys Lys Gly Glu Lys Leu Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys 115 120 125 Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser His Val His Ile Glu Asn Cys Asp Ser 130 135 140 Ser Asp Pro Thr Ala Tyr Leu 145 150 備考：アミノ酸番号５８のVal*はIle であってもよい。
【００４５】配列番号：７ 配列の長さ：１０９２ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源：ヒト 組織の種類：肝臓 配列の特徴 特徴を表す記号：５’ＵＴＲ 存在位置：１…２００ 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：３’ＵＴＲ 存在位置：６５７…１０９２ 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２０１…６５６ 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：ｒｅｐｌａｃｅ（３７２，”ａ”） ｒｅｐｌａｃｅ（７４８，”ｇ”） ｒｅｐｌａｃｅ（９６１，”ｃ”） ｒｅｐｌａｃｅ（９６７，”ｃ”） 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｐｏｌｙＡ ｓｉｇｎａｌ 存在位置：６８４…６８９ １０６０…１０６５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAATCAAATA GCTATCCATG GAATATTAGA ACTTGACTTG CTCCATCCTC TTAAACTTTT 60 TGTGTCTCAC ACTAAAGAAA TGAGAGATGC AGAATTCTAA GGCTAAATAG CTAGGAAGTA 120 TTCATTCAAA CTTGAATATC TTCAAAGAGA GTGTGGGGGC AACTCTAATC AGAGGAAGAA 180 ACTAAAGGAA GTAAAACCAG ATG TTT TCC ACC AAA GCC CTC CTT TTG 227 Met Phe Ser Thr Lys Ala Leu Leu Leu 1 5 GCT GGT CTG ATT TCT ACC GCA CTG GCA GGG CCA TGG GCT AAT ATA TGT 275 Ala Gly Leu Ile Ser Thr Ala Leu Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ile Cys 10 15 20 25 GCT GGC AAG TCT TCC AAT GAG ATC CGG ACG TGT GAC CGC CAT GGC TGT 323 Ala Gly Lys Ser Ser Asn Glu Ile Arg Thr Cys Asp Arg His Gly Cys 30 35 40 GGA CAG TAC TCT GCT CAA AGA AGT CAG AGG CCT CAC CAG GGT GTG GAC 371 Gly Gln Tyr Ser Ala Gln Arg Ser Gln Arg Pro His Gln Gly Val Asp 45 50 55 GTC TTG TGC TCT GCT GGA TCT ACT GTG TAC GCA CCA TTC ACT GGA ATG 419 Val*Leu Cys Ser Ala Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Met 60 65 70 ATT GTG GGC CAG GAG AAA CCT TAT CAA AAC AAG AAT GCT ATC AAT AAT 467 Ile Val Gly Gln Glu Lys Pro Tyr Gln Asn Lys Asn Ala Ile Asn Asn 75 80 85 GGT GTT CGA ATA TCT GGA AGA GGT TTT TGT GTC AAA ATG TTC TAC ATT 515 Gly Val Arg Ile Ser Gly Arg Gly Phe Cys Val Lys Met Phe Tyr Ile 90 95 100 105 AAG CCA ATT AAG TAT AAA GGT CCT ATT AAG AAG GGA GAA AAA CTT GGA 563 Lys Pro Ile Lys Tyr Lys Gly Pro Ile Lys Lys Gly Glu Lys Leu Gly 110 115 120 ACT CTA TTG CCC TTG CAG AAA GTT TAT CCT GGC ATA CAA TCG CAT GTG 611 Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser His Val 125 130 135 CAC ATT GAA AAC TGT GAC TCG AGT GAC CCT ACT GCA TAC CTG 653 His Ile Glu Asn Cys Asp Ser Ser Asp Pro Thr Ala Tyr Leu 140 145 150 TAAATCGAAG GCCAATGGTC AGATCTTCAA AATAAAAAGT CATCTTAAAA ACCTGGATGC 713 ATACCCTTCT CTTCAAGAAA TTTGTGTTCA CAAAAGAAAA ATGCATGAAG GGATGGATAC 773 CCCATTTTCC ATGACATGAT TATTACACAT TGCATGCCTG TATCAAAACA TCTCACGTAC 833 CTCATAAACA TATACACCTA TGTACCCACA AAAATTTTTT AATTAAAAAA AGGAAATTTG 893 AGTTTAAATA GAAACATGAT AAATGCAAGA AAGAAAACAT TTTGATTTTA ACTCATTGTC 953 ACTCTGATGT TCATGTGAAC TGGTTGCTTC GGGCTCTTTG ATCTGTCACC TATGGAATCT 1013 GAGTGGTTTT ATTTTTTAGA TTTCTCAGTC CCAAAGATCT AAGATAAATA AACAAGAGAA 1073 CTTAAAAAAA AAAAAAAAA 1092 備考：アミノ酸番号５８のVal*はIle の場合もあり、その場合、ヌクレオチド番 号３７２〜３７４のGTC はATC である。
【００４６】 配列番号：８ （ＬＥＣＴ２ａとＬＥＣＴ２ｂの比較） 1 5 10 15 LECT2b Met Phe Ser Thr Lys Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ile Ser Thr LECT2a 20 25 30 LECT2b Ala Leu Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ile Cys Ala Gly Lys Ser Ser LECT2a Gly Pro Trp Ala Ile Ile Cys Ala Gly Lys Ser Ser 35 40 45 LECT2b Asn Glu Ile Arg Thr Cys Asp Arg His Gly Cys Gly Gln Tyr Ser LECT2a Asn Glu Ile Arg Thr Cys Asp Gly His Gly Cys Gly Gln Tyr Thr 50 55 60 LECT2b Ala Gln Arg Ser Gln Arg Pro His Gln Gly Val Asp Val Leu Cys LECT2a Ala Gln Arg Asn Gln Lys Leu His Gln Gly Val Asp Val Leu Cys 65 70 75 LECT2b Ser Ala Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Met Ile Val LECT2a Ser Asp Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Ile Met 80 85 90 LECT2b Gly Gln Glu Lys Pro Tyr Gln Asn Lys Asn Ala Ile Asn Asn Gly LECT2a Gly Gln Glu Lys Pro Tyr Lys Asn 95 100 105 LECT2b Val Arg Ile Ser Gly Arg Gly Phe Cys Val Lys Met Phe Tyr Ile LECT2a Ile Ser Gly Gly Gly Phe Cys Ile Lys 110 115 120 LECT2b Lys Pro Ile Lys Tyr Lys Gly Pro Ile Lys Lys Gly Glu Lys Leu LECT2a Tyr Lys Gly Ser Ile 125 130 135 LECT2b Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gln Lys Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser LECT2a Val Tyr Pro Gly Ile Gln Ser 140 145 150 LECT2b His Val His Ile Glu Asn Cys Asp Ser Ser Asp Pro Thr Ala Tyr LECT2a His Ile His Ile Glu Asn Cys Asp Leu Ser Asp Pro Thr 151 LECT2b Leu LECT2a
【図１】ＬＥＣＴ２ａのＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ
Claims (10)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１〜５に示されるアミ
ノ酸配列をその順番で有する、ヒト由来の他のタンパク
質を実質的に含有しないヒトＬＥＣＴ２ａポリペプチ
ド。 - 【請求項２】 配列表の配列番号６に示されるアミノ酸
配列を有する、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含
有しないヒトＬＥＣＴ２ｂポリペプチド。 - 【請求項３】 配列表の配列番号６に示されるアミノ酸
配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡ。 - 【請求項４】 ヌクレオチド配列が、配列表の配列番号
７に示される配列である、請求項３記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列表の配列番号６に示されるアミノ酸
配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡを含
む組換えプラスミド。 - 【請求項６】 組換えプラスミドが、ヒトＬＥＣＴ２ｂ
をコードするＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下に
マルトース結合タンパク質との融合タンパク質の形態
で、マルトース結合タンパク質とＬＥＣＴ２ｂとの連結
部位にＴＥＶプロテアーゼの切断部位を入れた形で発現
させることができるプラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥ
ＣＴ２ｂである、請求項５記載の組換えプラスミド。 - 【請求項７】 ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡ
が、ＳＲαプロモーターの制御下にある、請求項５記載
の組換えプラスミド。 - 【請求項８】 組換えプラスミドが、ヒトＬＥＣＴ２ｂ
をコードするＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下に
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパ
ク質の形態で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
とＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＸａプロテアーゼの切断
部位を入れた形で発現させることができるプラスミドｐ
ＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣＴ２ｂである、請求項５記載の組
換えプラスミド。 - 【請求項９】 配列表の配列番号６に示されるアミノ酸
配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡを含
む組換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞。 - 【請求項１０】 宿主細胞が、チャイニーズハムスター
ＣＨＯ細胞、サルＣＶＩ細胞、サルＣＶＩ／２９３細
胞、マウス線維芽細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス３
Ｔ３細胞、マウスＬ−９２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、
またはヒトＳＫＷ−３細胞である、請求項９記載の宿主
細胞。
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