DE69620596T2 - Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat-primer-reihen - Google Patents

Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat-primer-reihen

Info

Publication number
DE69620596T2
DE69620596T2 DE69620596T DE69620596T DE69620596T2 DE 69620596 T2 DE69620596 T2 DE 69620596T2 DE 69620596 T DE69620596 T DE 69620596T DE 69620596 T DE69620596 T DE 69620596T DE 69620596 T2 DE69620596 T2 DE 69620596T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
sequence
primer set
target
nucleic acid
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69620596T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69620596D1 (de
Inventor
R. Bouma
A. Solomon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott Laboratories
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Application granted granted Critical
Publication of DE69620596D1 publication Critical patent/DE69620596D1/de
Publication of DE69620596T2 publication Critical patent/DE69620596T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

    Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Amplifikation und Detektion einer Nukleinsäuresequenz, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann, und sie betrifft insbesondere Verfahren zur quantitativen Detektion einer Nukleinsäuresequenz, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Verfahren zur Amplifikation einer Targetnukleinsäuresequenz, die in einer Testprobe vorhanden sein kann, sind inzwischen auf dem Fachgebiet gut bekannt. Derartige Verfahren umfassen die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), welche in den US-Patenten 4.683.195 und 4.683.202 beschrieben worden ist, die Ligase- Ketten-Reaktion (LCR), die in EP-A-320 308 beschrieben ist, die Gap-LCR (GLCR), die in der Europäischen Patentanmeldung EP-A- 439 182 beschrieben ist, die Multiplex-LCR, die in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 93/20227 beschrieben ist, und dergleichen. Diese Verfahren haben verbreitete Anwendung gefunden nicht nur auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik, sondern auch auf den Gebieten Genetik, Molekularbiologie und Biochemie. Bedauerlicherweise ist ein Nachteil von Nukleinsäure- Amplifikationsreaktionen der, dass sie hauptsächlich qualitativ sind.
  • Die. Natur von Amplifikationsreaktionen macht es schwierig, dass sie verwendet werden, um quantitativ die Anwesenheit einer Targetsequenz zu detektieren, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann. Entsprechend können traditionelle Amplifikationsreaktionen im Allgemeinen nicht eingesetzt werden, um die Menge einer Targetsequenz in einer Testprobe zu bestimmen, wenn auch traditionelle Amplifikationsreaktionen nützlich sind, um die Anwesenheit einer kleinen Menge einer Targetsequenz in einer Testprobe zu detektieren. Jedoch sind Variationen von traditionellen Amplifikationsreaktionen entwickelt worden, welche die quantitative Amplifikationsreaktionsanalyse ermöglichen.
  • Eine quantitative Amplifikationsreaktion wird als "kompetitive Amplifikation" bezeichnet. Dieses Verfahren wird für gewöhnlich auf PCR angewendet. Gemäß kompetitiver Amplifikationsreaktionen konkurriert eine Standardnukleinsäuresequenz mit einer Targetsequenz während der Amplifikationsreaktion. Im Allgemeinen werden die Standardsequenz und eine Probe, von der vermutet wird, dass sie eine Targetsequenz enthält, in einer Verdünnungsreihe kombiniert, in welcher die Menge der Standardsequenz in allen Glieder der Reihe konstant ist. Alternativ werden die Standardsequenz und die Probensequenz in einer Verdünnungsreihe kombiniert, in welcher die Menge der Standardsequenz zwischen den Gliedern der Verdünnungsreihe unterschiedlich ist. In jedem Fall ist die Konzentration der Standardsequenz in den Gliedern der Verdünnungsreihe bekannt. PCR wird dann an allen Gliedern der Verdünnungsreihe durchgeführt und führt zu der Bildung einer Mischung von zwei Nukleinsäuresequenzspezies. Eine Spezies, die von der Standardsequenz abgeleitet ist, und eine Spezies, die von der Probensequenz abgeleitet ist. Die Konzentration jeder Spezies in einer einzelnen Verdünnung ist abhängig von der Zahl der Kopien der Standard- und der Probensequenz in der Verdünnung vor der Amplifikation. Während der Amplifikationsreaktion werden typischerweise detektierbare Gruppen in beide Arten von Sequenzen eingeführt. Nach der Amplifikation werden die beiden Spezies getrennt, und die Menge der detektierbaren Gruppe, die in jede Spezies eingelagert ist, wird bestimmt. Dieses Detektionsverfahren wird für jedes Glied der Verdünnungsreihe durchgeführt. Eine Kompetitionskurve kann dann erzeugt werden, und die Menge der Probensequenz kann auf der Grundlage der bekannten Mengen der Standardsequenz extrapoliert werden.
  • Verfahren der kompetitiven Amplifikation sind beschrieben worden in US-Patent Nr. 5.219.727; Kinoshita T., et al., Analytical Biochemistry, 206: 231-235 (1992) und Jalava T. et al., BioTechniques 15: (1), 134-205 (1993). Obwohl diese kompetitiven Amplifikationsverfahren Nützlichkeit gezeigt haben, benötigen sie beträchtliche Mengen an Probenvorbereitung sowie Technikerinteraktion und haben ein Begleitrisiko der Probenkontaminierung. Zusätzlich wird durch die Verwendung einer Standardsequenz ein weiteres Reagenz hinzugefügt, das nicht allgemein ein Erfordernis traditioneller Amplifikationsreaktionen ist. Darüber hinaus erfordert die Durchführung einer Amplifikation an Gliedern einer Verdünnungsreihe mehr Reagenzien als die Durchführung einer Amplifikation an einer Einzelprobe. All diese Faktoren erhöhen die Kosten zur Durchführung kompetitiver Amplifikationsreaktionen.
  • Eine weitere quantitative Amplifikationsreaktion ist die "kinetische Amplifikationsanalyse". Dieses Verfahren nutzt die Fähigkeit eines Farbstoffes, Doppelstrang-Nukleinsäuresequenzen zu binden. Zum Beispiel produziert PCR im Allgemeinen Doppelstrang-Nukleinsäuresequenzen. In Anwesenheit eines Farbstoffes wie Ethidiumbromid, welches Doppelstrang- Nukleinsäuresequenzen bindet, wird eine Zunahme der Fluoreszenz bei aufeinanderfolgenden PCR-Amplifikationsrunden beobachtet. Je größer die Menge an Targetnukleinsäuresequenz in einer Testprobe, um so früher wird ein Anstieg der Fluoreszenz beobachtet.
  • Kinetische Amplifikationsanalyse ist beschrieben worden in Higuchi R., et al., Bio/Technology 11: 1026-1030 (1993). Bedauerlicherweise kann die Effizienz einer Amplifikationsreaktion von Probe zu Probe schwanken. Daher können unterschiedliche Fluoreszenzgeschwindigkeiten für zwei Proben in einer kinetischen Amplifikationsanalyse erhalten werden, obwohl die beiden Proben äquivalente Targetsequenzkonzentrationen enthalten können. Entsprechend ist dieses Verfahren in einem klinischen Rahmen wegen der großen Vielfalt an Proben, welche untersucht werden müssen, nicht immer nützlich.
  • Folglich gibt es einen Bedarf für ein Verfahren zur quantitativen Durchführung einer Amplifikationsreaktion, welches nicht übermäßig viele Eingriffe eines Technikers oder zu viele Reagenzien erfordert, und das in einer klinischen Laborumgebung eingesetzt werden kann.
  • Okamoto, M. et al., in J. Med. Virol. (1993) 41, S. 6-10 "Detection of Hepatitis C virus genome in human serum by multitargeted polymerase chain reaction" offenbart eine Multi- Targeted-PCR auf der Basis der Koamplifikation und simultanen Detektion unterschiedlicher genomischer Regionen des HCV-Genoms. Ein Set von Primerpaaren, abgeleitet von der 5'-nicht codierenden Region und dem Nichtstrukturprotein 3, wird in einer PCR-Amplifikationsreaktion verwendet. Produkte wurden durch Elektrophorese analysiert und durch Ethidiumbromid und UV-Licht visualisiert. Die unterschiedliche Sensitivität der Primer wurde unter Verwendung unterschiedlicher Verdünnung der Probe bewertet. Bei einer 10&sup5;-fachen Verdünnung der Probe war das 5'NC- abgeleitete Band immer noch detektierbar, während das NS3- abgeleitete Band in einer 10&sup4;-fach verdünnten Probe kaum detektiert werden konnte.
  • In Mol. Biotechnology (1995) 3, S. 55-71, offenbaren Reischl Udo et al. quantitative PCR-basierte Amplifikationsverfahren. Die Geeignetheit herkömmlicher Laboramplifikationsverfahren und die Prinzipien fortschrittlicher Festphasen-vermittelter Strategien zur Bestimmung von Amplifikationsprodukten werden mit Hilfe von ausgewählten Beispielen umrissen.
  • In Analytical Biochemistry (1993) 211(1), S. 170-172, verweisen Takuji Sugimoto et al. darauf, dass die gleichzeitige Verwendung von zwei Primersets in PCR ein empfindliches Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses der angewandten Matrizenmischungen ist. Die Autoren untersuchten, wie das Produktverhältnis der Koamplifikation von zwei Matrizen durch die Primer und die PCR- Bedingungen geändert wurde. Die Autoren fanden heraus, dass das Produktverhältnis der Koamplifikation eng der thermischen Stabilität des Doppelstrangs aus Primer und Matrize gleichkam.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Detektion der relativen oder ungefähren Menge einer Targetsequenz in einer Testprobe, welches nicht die Herstellung einer Verdünnungsreihe erfordert, und deshalb keine großen Mengen an Reagenzien und Technikerinteraktion erfordert. Allgemein umfasst das Verfahren In-Kontakt-bringen einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie eine Targetnukleinsäuresequenz enthält, mit einer Nukleinsäure- Amplifikationsreaktionsmischung, die ein erstes Primerset, das in der Lage ist, mit einer ersten Sub-Target-Region der Targetnukleinsäuresequenz zu hybridisieren, und ein zweites Primerset umfasst, das in der Lage ist, mit einer zweiten Targetnukleinsäuresequenz zu hybridisieren. Die erste und zweite Sub-Target-Region der Targetsequenz sind unterschiedlich; und das erste und das zweite Primerset sind so gewählt, dass das erste Primerset in der Lage ist, ein detektierbares Amplikon im Wesentlichen nur bei oder über einer ersten Schwellenkonzentration der Targetnukleinsäuresequenz zu erzeugen, und das zweite Primerset in der Lage ist, ein detektierbares Amplikon im Wesentlichen nur bei oder über einer zweiten Schwellenkonzentration der Targetnukleinsäuresequenz zu erzeugen. Schwellenkonzentrationen, bei denen die Primersets in der Lage sind, ein detektierbares Amplikon zu erzeugen, unterscheiden sich ebenfalls voneinander.
  • Nachdem die Targetsequenz und die Reaktionsmischung in Kontakt gebracht worden sind, wird die resultierende Mischung Amplifikationsbedingungen unterworfen, die ausreichend sind, um ein detektierbares Amplikon von mindestens einem der Primersets zu produzieren, wenn die Testprobe eine Konzentration an Targetnukleinsäuresequenz enthält, welche bei oder über der Schwellenkonzentration liegt, bei welcher das Primerset in der Lage ist, ein detektierbares Amplikon zu produzieren. Ein Amplikon von mindestens einem Primerset wird dann, sofern es produziert wurde, in der Reaktionsmischung detektiert, um zu bestimmen, ob die Testprobe eine Konzentration an Targetnukleinsäuresequenz im Wesentlichen bei oder über der Schwellenkonzentration enthielt, die diesem Primerset entspricht.
  • Die Primersets können mit verschiedenen Amplifikationsreaktionsprotokollen eingesetzt werden, aber sie werden vorzugsweise gemäß LCR- oder PCR-Protokollen eingesetzt. Des weiteren können Glieder der einzelnen Primersets eine Markierung tragen, um die Detektion aller Sub-Target-Sequenz- Kopien zu erleichtern, welche produziert werden können.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 veranschaulicht einen immunchromatographischen Streifen, welcher verwendet werden kann, um amplifizierte Nukleinsäuresequenzen zu detektieren.
  • Fig. 2a-2b veranschaulichen einen hypothetischen immunchromatographischen Streifen, bevor und nachdem er mit einer Amplifikationsreaktionsmischung und den Reagenzien in Kontakt gebracht worden ist, die notwendig sind, um amplifizierte Nukleinsäuresequenzen zu detektieren.
  • Fig. 3 und Fig. 4 sind photografische Darstellungen von Gelen, die verwendet wurden, um die Produkte von Amplifikationsreaktionen unter Verwendung eines Paars von PCR- Primersets zur Amplifikation von zwei verschiedenen Targetsequenzen, welche in einem einzelnen Reaktionskessel enthalten waren, zu detektieren. Die Konzentrationen der Primersets und der Targetsequenzen werden ausführlicher in Beispiel 2 unten erklärt.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Das vorliegende Verfahren benötigt keine wesentliche Probenhandhabung oder -vorbereitung. Zum Beispiel erfordert das Verfahren nicht die Herstellung einer Verdünnungsreihe. Noch erfordert das Verfahren die Durchführung von mehreren Amplifikationsreaktionen, um die relative Menge einer Targetsequenz zu bestimmen, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann. Entsprechend kann das Verfahren in einem einzigen Kessel ausgeführt werden, was folglich Kontaminationsprobleme, die mit intensiver Probenhandhabung verbunden sind, vermindert. Des weiteren werden weniger Reagenzien benötigt, um das vorliegende Verfahren durchzuführen. Aus diesen und, anderen Gründen, welche noch offensichtlich werden, ist das Verfahren, das hier bereitgestellt wird, ohne weiteres automatisiertem Betrieb zugänglich.
  • Das Verfahren, das hier bereitgestellt wird, ist anwendbar auf Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen (im folgenden "Amplifikationsreaktionen"), welche Primersets (wechselnd als "Sondensets" bezeichnet) einsetzen, um eine Targetnukleinsäuresequenz zu amplifizieren. Kurz gesamt, das Verfahren verwendet eine "Aggregat-Primer-Reihe", welche mindestens zwei Primersets umfasst, in einer Amplifikationsreaktion, um die relative Konzentration einer Targetsequenz zu detektieren, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann. Das Verfahren umfasst allgemein In-Kontaktbringen einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie eine Targetsequenz enthält, mit einer Nukleinsäure- Amplifikationsreaktionsmischung, die eine Aggregat-Primer-Reihe und andere Reagenzien umfasst, die zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion geeignet sind. Die Reaktionsmischung kann dann Amplifikationsbedingungen unterworfen werden, um Gliedern der Aggregat-Primer-Reihe zu erlauben, mit allen "Sub-Target- Sequenzen", welche Regionen der Targetsequenz sind, zu hybridisieren und diese zu verstärken. Die Anwesenheit von allen amplifizierten Sub-Target-Sequenzen kann dann detektiert werden. Zusammen werden die amplifizierten Sub-Target-Sequenzen, die durch ein einzelnes Primerset erzeugt werden, als ein "Amplikon" bezeichnet. Auf der Basis einer qualitativen Detektion der Amplikons, die durch einzelne Primersets erzeugt wurden, welche die Aggregat-Primer-Reihe bilden, kann die ungefähre Menge der Targetsequenz bestimmt werden. Ausdrücklicher weist ein detektierbares Signal von einem einzelnen Primerset darauf hin, dass mindestens soviel Targetsequenz wie die Schwellenkonzentration dieses Primersets in der Testprobe vorhanden ist, da ein einzelnes Primerset, wie hier verwendet, ein detektierbares Amplikon bei Anwesenheit einer "Schwellenkonzentration" der Targetsequenz ergibt. Andererseits kann, falls kein detektierbares Amplikon durch ein einzelnes Primerset produziert wird, bestimmt werden, dass die Targetsequenz nicht in einer Konzentration vorhanden ist, die im Wesentlichen bei oder über der Schwellenkonzentration dieses Primersets liegt.
  • Das Verfahren wird jetzt ausführlicher erklärt. Eine Testprobe ist typischerweise jede Substanz, von der vermutet wird, daß sie eine Targetsequenz enthält. Testproben können vorbereitet werden unter Verwendung von Methodologien, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, wie z. B. durch Nehmen einer Probe von einem Patienten und, falls notwendig, Zerstören aller Zellen, die darin enthalten sind, um Nukleinsäuren freizusetzen. Es versteht sich, dass die einzelnen Primersets, die eine Aggregat-Primer- Reihe bilden, in Kontakt gebracht werden können mit einer Testprobe, die in mehreren einzelnen Kesseln enthalten ist. Vorzugsweise wird die Aggregat-Primer-Reihe mit einer Testprobe in Kontakt gebracht, die in einem einzigen Kessel enthalten ist. Eine Targetsequenz ist im Allgemeinen eine Nukleinsäuresequenz (z. B. RNA oder DNA), die mindestens zwei Sub-Target-Sequenzen umfasst, an welche Glieder der Aggregat-Primer-Reihe hybridisieren. Sub-Target-Sequenzen sind charakteristische Subsets der Targetsequenz in dem Sinne, dass Sub-Target- Sequenzen charakteristischerweise in einem Gen oder Organismus gefunden werden, deren relative Menge gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden kann. Typischerweise ist die Sub- Target-Sequenz in der Targetsequenz in einer konsistenten Kopiezahl vorhanden, vorzugsweise ist die Sub-Target-Sequenz in der Targetsequenz in einem 1-zu-1-Verhältnis vorhanden. Folglich kann eine Targetsequenz jede Sequenz umfassen, von der vermutet wird, dass sie charakteristische Sub-Target-Sequenzen oder Regionen enthält.
  • Die Targetsequenz kann einzelsträngig, doppelsträngig, kontinuierlich oder fragmentiert sein, so lange Abschnitte von ihr ausreichend kontinuierlich sind, damit die einzelnen Primersets hybridisieren und etwaige Sub-Target-Sequenzen amplifizieren können, welche zum Beispiel ein Gen, ein Genfragment oder eine extrachromosomale Nukleinsäuresequenz sein können. Auch wenn die Sequenz der gesamten Targetsequenz möglicherweise nicht bekannt ist, ist es im Allgemeinen der Fall, dass mindestens ein Abschnitt der Sub-Target-Sequenzen bekannt ist. Zum Beispiel sind in dem Fall, wo PCR eingesetzt wird, die Enden der Sub-Target-Sequenzen bekannt, und in Fällen, wo LCR eingesetzt wird, ist die gesamte Sub-Target-Sequenz bekannt.
  • Das vorliegende Verfahren findet besondere Nützlichkeit bei der Bestimmung der ungefähren Menge einer Targetsequenz mit typischerweise mindestens 1 Kb, wie zum Beispiel ein bakterielles oder virales Genom. Zum Beispiel kann die Targetsequenz das Genom eines Organismus wie Chlamydia trachomatis umfassen, wo die Sub-Target-Sequenzen Regionen des MOMP-Gens, des LPS-Gens und/oder des kryptischen Plasmids umfassen könnten. Alternativ könnten alle Sub-Target-Sequenzen innerhalb einer der drei genannten Regionen gefunden werden. Des weiteren könnte ein virales Genom eine Targetsequenz umfassen, und die Sub-Target-Sequenzen könnten Sequenzen umfassen, die charakteristischerweise in diesem viralen Genom vorhanden sind. Zum Beispiel könnten Sub-Target-Sequenzen des HIV-Genoms Regionen des Gens, das für das P24-Antigen codiert, und des pol- Gens umfassen. Ähnlich wie oben könnten alle Sub-Target- Sequenzen entweder in dem Gen, das für das P24-Antigen codiert, oder in dem pol-Gen gefunden werden.
  • Eine Aggregat-Primer-Reihe umfasst mindestens zwei Primersets, welche für bestimmte Sub-Target-Sequenzen spezifisch sind. Zusätzlich sind die Sensitivitäten der einzelnen Primersets typischerweise bekannt, und die Sensitivitäten von mindestens zwei der einzelnen Primersets sind unterschiedlich oder voneinander unterscheidbar. Wenn eine Lösung, die eine Aggregat- Primer-Reihe, eine Targetsequenz sowie andere Reagenzien umfasst, die zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion geeignet sind, Amplifikationsbedingungen ausgesetzt wird, amplifizieren die Primersets ihre jeweiligen Sub-Target- Sequenzen. Da die jeweiligen Sub-Target-Sequenzen charakteristische Subsets der Targetsequenz sind, sind die Sensitivitäten der einzelnen Primersets letzten Endes abhängig von der Konzentration der Targetsequenz. Eine Targetsequenzkonzentration, bei der ein einzelnes Primerset beginnt, ein detektierbares Amplikon zu erzeugen, wird als die Schwellenkonzentration dieses Primersets bezeichnet. Bei Anwesenheit seiner Schwellenkonzentration wird ein Primerset ein Amplikon erzeugen in einer Menge, die detektiert werden kann. Andererseits kann bei Fehlen seiner Schwellenkonzentration die Menge an Amplikon, die von einem einzelnen Primerset erzeugt wird, nicht detektiert werden. Auf diese Weise kann die Erzeugung oder Nichterzeugung eines detektierbaren Amplikons von einem Primerset mit der Menge an Targetsequenz in einer Testprobe korreliert werden, und durch Verwendung von zwei oder mehr Primersets mit unterschiedlichen Schwellenkonzentrationen wird ein semiquantitatives Detektionsverfahren erlangt.
  • Die Sensitivitäten, oder Schwellenkonzentrationen, von mindestens zwei Primersets können ohne weiteres bestimmt werden durch Ausführen einer Amplifikationsreaktion mit den Primersets bei Anwesenheit einer gegebenen Konzentration der Targetsequenz. Die Amplikons, sofern vorhanden, können dann detektiert werden, um zu bestimmen, ob die Targetsequenzkonzentration groß genug war, um die Produktion eines detektierbaren Amplikons zu ermöglichen. Zum Beispiel können ein "Primerset A" und ein "Primerset B" mit einer Testprobe in Kontakt gebracht werden, die 10.000 Moleküle einer Targetsequenz enthält, die Sub-Target- Sequenzen umfasst, für welche Primerset A und Primerset B spezifisch sind. Die resultierende Mischung kann dann unter Amplifikationsbedingungen gesetzt werden, und alle Amplikons können detektiert werden. Für den Fall, dass Primer A genügend Amplikon erzeugt, um detektiert zu werden, und Primer B das nicht tut, könnte bestimmt werden, dass die Sensitivitäten der Primersets unterscheidbar sind, und dass die Schwellenkonzentration von Primerset A bei 10.000 Targetmolekülen erreicht worden ist oder überschritten wurde. Entsprechend wären bei den eingesetzten Primerkonzentrationen die Sensitivitäten dieser Primersets "von Natur aus" unterscheidbar. Eine genauere Schwellenkonzentration für Primerset A könnte durch Wiederholen der Amplifikationsreaktion bei annehmenden Targetkonzentrationen bestimmt werden. Die Schwellenkonzentration für Primerset B könnte durch Ausführen weiterer Amplifikationsreaktionen bei zunehmenden Konzentrationen der Targetsequenz bestimmt werden. Die Targetsequenzkonzentration, bei der Primerset B zuerst ein detektierbares Amplikon erzeugte, wäre die Schwellenkonzentration für Primerset B. Obwohl es vorzuziehen ist, die Sensitivitäten mehrerer Primersets durch deren Einsatz in der gleichen Amplifikationsreaktion zu bestimmen, versteht es sich, dass die Sensitivitäten mehrerer Primersets durch deren Einsatz in getrennten Amplifikationsreaktionen einzeln bestimmt werden können.
  • Eine Sensitivität, die wie oben bestimmt wird, wird als "inhärente Sensitivität" eines Primersets bezeichnet, und eine derartige Sensitivität ist im Allgemeinen den Bedingungen inhärent, unter welchen die Sensitivität bestimmt wurde. Folglich kann sich die Sensitivität des Primersets ändern, falls das Primerset in einer Amplifikationsreaktion mit einer unterschiedlichen Anzahl von Amplifikationszyklen eingesetzt wurde. Falls zum Beispiel die Anzahl der Amplifikationszyklen verringert wurde, kann die Schwellenkonzentration des Primersets abnehmen. Umgekehrt, falls die Anzahl der Amplifikationszyklen erhöht wurde, kann die Schwellenkonzentration des Primersets zunehmen. Dem Fachmann wird offensichtlich sein, dass die Sensitivität oder Schwellenkonzentration eines Primersets nicht absolut ist, und dass geringe Abweichungen von der genauen Schwellenkonzentration von Amplifikationsreaktion zu Amplifikationsreaktion gezeigt werden können, ohne vom Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Somit wird es vom Fachmann verstanden werden, dass ein Primerset ein detektierbares Amplikon im Wesentlichen nur bei oder über seiner Schwellenkonzentration erzeugt.
  • In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die inhärente Sensitivität eines Primersets zu ändern, wie zum Beispiel, wenn die Sensitivitäten von zwei oder mehreren Primersets, die eine Aggregat-Primer-Reihe bilden, nicht von Natur aus unterscheidbar sind. In solchen Fällen kann die Sensitivität von einem oder mehreren Primersets eingestellt werden. Einstellen einer Primersets schließt im Allgemeinen Ändern der Sensitivität eines Primersets ein, so dass es ein detektierbares Amplikon bei Anwesenheit einer Schwellenkonzentration produziert, die von der Schwellenkonzentration eines anderen Primersets unterscheidbar ist. Daher wird ein "Ungleichgewicht" zwischen den Primersets erzeugt, wodurch die einzelnen Primersets, die in einer Amplifikationsreaktion eingesetzt werden, detektierbare Amplikons bei verschiedenen Schwellenkonzentrationen erzeugen. Folglich wird, wenn die Sensitivitäten von zwei oder mehreren Primersets, die eine Aggregat-Primer-Reihe bilden, nicht von Natur aus unterscheidbar sind, mindestens eines der einzelnen Primersets so eingestellt, dass es ein detektierbares Amplikon bei Anwesenheit einer Schwellenkonzentration produziert, die sich von den anderen Primersets unterscheidet.
  • Das Verfahren, das zum Einstellen einzelner Primersets eingesetzt wird, ist eine Sache der Wahl. Ein bevorzugtes Verfahren zum Einstellen der Sensitivität eines Primersets ist durch Anpassen der Konzentration des Primersets, das in einer Amplifikationsreaktion eingesetzt wird. Es ist unmöglich, die Konzentration eines Primersets, bei der es ein detektierbares Amplikon bei Anwesenheit einer gewählten Schwellenkonzentration erzeugt, genau vorherzusagen. Diese Bestimmung kann jedoch ohne weiteres empirisch durch einfache Experimente ermittelt werden. Es ist allgemein der Fall gewesen, dass für eine gegebene Anzahl von Amplifikationszyklen die Erhöhung der Konzentration eines Primersets, das in einer Amplifikationsreaktion eingesetzt wird, die Sensitivität des Primersets erhöht. Wenn zum Beispiel nach 25 Amplifikationszyklen eine Konzentration eines Primersets von 10 nM nicht ein detektierbares Amplikon bei 10.000 Kopien der Targetsequenz produziert, kann die Sensitivität dieses Primersets im Allgemeinen durch Erhöhen seiner Konzentration in der Amplifikationsreaktion gesteigert werden. Zum Beispiel kann die Verwendung einer Konzentration dieses Primersets von 100 nM ein detektierbares Amplikon bei Anwesenheit von 10.000 Targetsequenzen nach 25 Amplifikationszyklen produzieren. Umgekehrt, falls nach 25 Amplifikationszyklen eine Konzentration eines Primersets von 10 nM ein detektierbares Amplikon bei 10.000 Kopien der Targetsequenz produziert, kann die Sensitivität dieses Primersets im Allgemeinen durch Erniedrigen seiner Konzentration in der Amplifikationsreaktion verringert werden. Zum Beispiel können 100.000 Targetsequenzen erforderlich sein, um die Produktion eines detektierbaren Amplikons unter Verwendung einer Konzentration dieses Primersets von 1 nM nach 25 Amplifikationszyklen zu ermöglichen.
  • Verwendung von unvollständig komplementären Primern (wechselnd als "Primer mit einer Fehlpaarung" bezeichnet) könnte auch eingesetzt werden, um die Sensitivität eines Primersets einzustellen. Wenn zum Beispiel nach einer gegebenen Anzahl von Amplifikationszyklen ein Primerset ein detektierbares Amplikon bei Anwesenheit von 100 Kopien einer Targetsequenz produzierte, könnte die Sensitivität dieses Primersets erniedrigt werden durch Einführen von Nucleotiden in das Primerset, die nicht mit der Sub-Target-Sequenz zusammenpassen, für welche das Primerset spezifisch ist. Somit wäre das eingestellte Primerset nicht vollständig komplementär zu seinem Target. Da die Bindungswirksamkeit eines derartig eingestellten Primersets für sein Target erniedrigt wäre, könnte eine größere Zahl von Targetsequenzen erforderlich sein, um ein detektierbares Amplikon nach einer gegebenen Anzahl von Amplifikationszyklen zu produzieren. Entsprechend könnte das eingestellte Primerset eine Schwellenkonzentration von 1.000 Targetsequenzen haben.
  • Eine Targetsequenz kann mehrere Kopien einer Sub-Target-Sequenz umfassen. In einem solchen Fall kann die Schwellenkonzentration eines einzelnen Primersets, welches für die Mehrfachkopie- Sequenz spezifisch ist, niedriger sein als diejenige, die für ein Primerset erwartet wird, welches für eine Sub-Target-Sequenz spezifisch ist, welche eine einzige Kopie innerhalb der Targetsequenz aufweist. Natürlich können mehrere Kopien einer Sub-Target-Sequenz während des Vorgangs zum Einstellen eines Primersets, das für eine solche Sequenz spezifisch ist, berücksichtigt werden. Zum Beispiel kann ein Primerset, das für eine Mehrfachkopie-Sub-Target-Sequenz spezifisch ist, bei einer niedrigeren Konzentration eingesetzt werden, um seine gewünschte Schwellenkonzentration beizubehalten.
  • Es wird auch verstanden werden, dass die Anzahl der Amplifikationszyklen, die zum Bestimmen der Schwellenkonzentration eines Primersets verwendet wird, annähernd äquivalent sein sollte zu der Anzahl der Amplifikationszyklen, die in einer Amplifikationsreaktion, welche dieses Primerset verwendet, eingesetzt wird. Zusätzlich zeigen Sensitivitäten von Detektionssystemen oft Schwankungen. Entsprechend sollte das gleiche Detektionssystem, das verwendet wurde, um Primer einzustellen, oder um deren Sensitivitäten anders zu bestimmen, eingesetzt werden, um das hier bereitgestellte Verfahren auszuführen.
  • Die Anzahl der Primersets, die eine Aggregat-Primer-Reihe umfassen, ist größtenteils eine Sache der Wahl für einen Fachmann, welche sich stützen kann auf die sinnvollen Bereiche, in welche eine Targetsequenz kategorisiert werden kann. Falls zum Beispiel die Zahl der Viruspartikel in einer Probe verwendet werden kann, um mehrere unterschiedliche Stadien einer Krankheit anzuzeigen, können mehr als zwei Primersets erwünscht sein. Wenn die Anzahl der sinnvollen Bereiche, in welche eine Targetsequenz kategorisiert werden könnte, n + 1 ist, könnten folglich n Primersets eingesetzt werden, um derartige Bereiche aufzudecken. Zum Beispiel könnten 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primersets gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Auf diese Art und Weise kann die relative Zahl von Targetsequenzen, in diesem Fall des viralen Genoms, bestimmt und mit verschiedenen Gehalten des Virus in der Testprobe korreliert werden. Es wird vom Fachmann verstanden werden, dass das vorliegende Verfahren einen ungefähren Wert für die Zahl der Targetsequenzen in einer Testprobe bereitstellen wird. Ausdrücklicher liefert die Verwendung eines Aggregat-Primers Bereiche von Werten, in welche die Zahl der Targetsequenzen angeordnet werden kann.
  • Je genauer jedoch die Sensitivitäten der Primersets eingestellt werden können, umso enger wird der numerische Bereich für die relative Konzentration der Targetsequenz in der Testprobe sein. Wenn zum Beispiel die Sensitivitäten von zwei Primersets so eingestellt wurden, dass ein eingestelltes Primerset eine Schwellenkonzentration von 1.000 oder mehr Targetsequenzen aufweist, und das andere eingestellte Primerset eine Schwellenkonzentration von 10.000 oder mehr Targetsequenzen aufweist, könnte man folglich bestimmen, ob weniger als 1.000 Targetsequenzen, zwischen 1.000 und 10.000 Targetsequenzen, oder mehr als 10.000 Targetsequenzen in der Testprobe vorhanden wären. Wenn jedoch das gleiche Paar an Primersets auf Schwellenkonzentrationen von 10 und 100 Targetsequenzen eingestellt ist, könnte bestimmt werden, ob weniger als 10, zwischen 10 und 100, oder mehr als 100 Targetsequenzen in der Testprobe vorhanden wären. Somit soll "ungefähr", wie es hier verwendet wird, bedeuten, dass die Zahl der Targetsequenzen in einer Testprobe innerhalb einer Werteklammer angeordnet ist, aber die Werte, die eine solche Klammer bilden, können nah genug sein, um eine genaue Zahl von Targetsequenzen zu ergeben. Eine Aggregat-Primer-Reihe kann in einer einzigen Amplifikationsreaktion eingesetzt werden, um die relative Menge einer Targetsequenz in einer Testprobe zu bestimmen. Amplifikationsreaktionen wie zum Beispiel LCR, GLCR und PCR sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Diese Reaktionen verwenden typischerweise Primer, um wiederholt Kopien einer Targetnukleinsäuresequenz zu erzeugen, welche normalerweise eine kleine Region einer viel größeren Nukleinsäuresequenz ist. Primer und Sonden sind selbst Nukleinsäuresequenzen, die komplementär zu Regionen einer Targetsequenz sind und unter Amplifikationenbedingungen an die komplementären Regionen der Targetsequenz hybridisieren oder binden. Kopien der Targetsequenz werden typischerweise erzeugt durch das Verfahren Primerverlängerung und/oder Ligation, welche Enzyme mit Polymerase- oder Ligaseaktivität, getrennt oder in Kombination, verwenden, um Nukleotide an die hybridisierten Primer anzulagern und/oder benachbarte Primerpaare zu ligieren. Während enzymatische Verfahren der Polymerisation und Ligation vorherrschend sind, sind andere Verfahren, wie zum Beispiel chemische Polymerisation und Ligation, gleich geeignet für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Nukleotide, die an die Primer oder Sonden angelagert werden, als Monomere oder vorgeformte Oligomere, sind ebenfalls komplementär zu der Targetsequenz. Sobald die Primer oder Sonden ausreichend verlängert und/oder ligiert worden sind, werden sie von der Targetsequenz getrennt, zum Beispiel durch Erhitzen der Reaktionsmischung auf eine "Schmelztemperatur", welches eine Temperatur ist, bei der komplementäre Nukleinsäurestränge sich aufspalten. Folglich wird eine Sequenz gebildet, die zu der Targetsequenz komplementär ist.
  • Ein neuer Amplifikationszyklus kann dann stattfinden, um die Zahl der Targetsequenzen weiter zu amplifizieren, indem alle doppelsträngigen Sequenzen getrennt werden, wodurch ermöglicht wird, dass Primer an ihre entsprechenden Targets hybridisieren, verlängert werden und/oder die hybridisierten Primer ligiert und wieder getrennt werden. Die komplementären Sequenzen, die durch Amplifikationszyklen erzeugt werden, können als Matrizen für Primer- oder Sondenverlängerung dienen, um die Zahl der Targetsequenzen weiter zu amplifizieren. Daher werden viele Kopien der Targetsequenz und ihrer komplementären Sequenz gebildet. Folglich wird unter Amplifikationsbedingungen eine Aggregat-Primer-Reihe Sub-Target-Regionen der Targetsequenz amplifizieren, wenn diese vorhanden ist.
  • Allgemein werden zwei Primer, welche zu einem Abschnitt eines Targetstrangs und dessen Komplement komplementär sind, in PCR eingesetzt. Für LCR werden allgemein vier Primer eingesetzt, von denen zwei komplementär zu einer Targetsequenz und zwei ähnlich komplementär zu dem Komplement des Targets sind. Zusätzlich zu den Primersets und Enzymen, die vorher erwähnt wurden, kann eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionsmischung auch andere Reagenzien umfassen, welche gut bekannt sind und einschließen, aber nicht beschränkt sind auf: Enzymcofaktoren wie Magnesium; Salze; Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD); und Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) wie zum Beispiel Desoxyadenintriphosphat, Desoxyguanintriphosphat, Desoxycytosintriphosphat und Desoxythymintriphosphat.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen enzymatischen thermischen Amplifikationen könnten ebenso isotherme enzymatische Amplifikationsreaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zum Beispiel sind "3SR" (Self-Sustained Sequence Replication), beschrieben in Fahy, E., et al., PCR Methods and Applications, 1: 25-33 (1991) und "SDA" (Strand Displacement Amplification), beschrieben in Walker, G. T., et al., PNAS 89: 392-396 (1992), Amplifikationsreaktionen, welche ähnlich sind wie PCR und mit geringen Modifikationen in dem vorliegenden Verfahren eingesetzt werden könnten. Derartige Modifikationen sind in der Literatur ausführlich beschrieben und dem Fachmann gut bekannt. Zum Beispiel können die Verwendung von Avian-Myeloblastosis-Virus(AMV)-reverser Transkriptase (RT), E. coli RNASE H und T7 RNA-Polymerase sowie Ribonucleotidtriphosphate (rNTPs) eingesetzt werden für 3SR anstelle des Enzyms und der dNTPs, die in PCR eingesetzt werden. Ähnlich kann E. coli-DNA-Polymerase I (Exo-Klenow-Polymerase) anstelle von, zum Beispiel, Taq-Polymerase und ein Restriktionsenzym wie HincII plus Desoxyadenosin-5'-[a- thio]triphosphat in SDA eingesetzt werden.
  • Amplifikationsreaktionen, einschließlich derjenigen, die oben veranschaulicht wurden, ohne darauf begrenzt zu sein, können in dem vorliegenden Verfahren eingesetzt werden. Vorzugsweise wird eine Reaktionsmischung zwischen ungefähr 15 und ungefähr 100 Mal, besser zwischen ungefähr 25 und ungefähr 60 Mal wechselbeansprucht. Es sollte auch beachtet werden, dass die Konzentrationen von zum Beispiel den Nucleotidtriphosphaten, Enzymen und Cofaktoren, die in dem vorliegenden Verfahren eingesetzt werden, höher sein können als diejenigen, die normalerweise in einer typischen Amplifikationsreaktion verwendet werden.
  • Nachdem eine Aggregat-Primer-Reihe in einer Amplifikationsreaktion eingesetzt wurde, können die produzierten Amplikons, sofern es welche gibt, detektiert werden. Da eine Vielfalt von Amplikons produziert werden kann, kann es wünschenswert sein, die Amplikons räumlich zu trennen. Es wird verstanden werden, dass das räumliche Trennen von Amplikons allgemein eine Sache der Wahl für den Fachmann ist, welche größtenteils auf dem Typ des eingesetzten Detektionsverfahrens beruht.
  • Für den Fall, dass Amplikontrennung erwünscht ist, ist Trennung nur soweit erforderlich, dass die Amplikons voneinander unterschieden werden können. Vielfache Amplikons können aufgrund der Position oder Stelle eines Signals räumlich getrennt werden. Eine solche räumliche Unterscheidung kann erreicht werden durch Größe, relative Molekülmasse, Ladungsdichte, magnetische Eigenschaften, spezifische Bindungseigenschaften und dergleichen. Allgemein kann ein Amplikon oder können Amplikons getrennt werden unter Verwendung von Bindungsgliedern, Gelelektrophorese, Chromatographie oder jedem anderen Verfahren, das in der Lage ist, die Amplikons räumlich zu trennen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein immunchromatographischer Streifen eingesetzt, um vielfache Amplikons, die unter Verwendung einer Aggregat-Primer-Reihe produziert wurden, räumlich zu trennen und zu detektieren. Eine solche Detektionskonfiguration ist zuvor beschrieben worden in US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/302.646, eingereicht am 6. September 1994. Im Allgemeinen besteht der Streifen aus einem porösen Material, das zum Transportieren von Flüssigkeiten durch Kapillarwirkung geeignet ist. Mindestens zwei eindeutige Einfangreagenzien werden auf dem Streifen immobilisiert, so dass diskrete Flecken von jedem Einfangreagenz an einem Ende des Streifens gebildet werden, welches als eine Kontaktstelle für eine Flüssigkeit verwendet wird, welche die Amplikons enthalten kann. Die Einfangreagenzien sind vorzugsweise sowohl in horizontaler als auch in vertikaler Richtung voneinander räumlich getrennt, so dass eine diagonale Linie von Flecken gebildet wird. Fig. 1 zeigt einen immunchromatographischen Streifen, der wie oben erklärt gestaltet ist. Wie in Fig. 1 gezeigt, wird ein poröses Material 1 mit Einfangreagenz betüpfelt, um einen diagonalen Bereich von Einfangflecken 2 zu bilden.
  • Einfangreagenzien umfassen typischerweise "spezifische Bindungsglieder", welche direkt oder indirekt ein spezifisches Bindungspaar mit den Amplikons bilden. Wie hier verwendet, bedeutet spezifisches Bindungsglied ein Glied eines Bindungspaars, d. h. von zwei unterschiedlichen Molekülen, wobei eines der Moleküle durch zum Beispiel chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das andere Molekül bindet. Neben Antigen- und Antikörper-spezifischen Bindungspaaren umfassen andere spezifische Bindungspaare, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Avidin und Biotin; Haptene wie Adamantan und Carbazol, welche beschrieben sind in US-Patentanmeldung Serien- Nr. 08/049.888, eingereicht am 21. April 1993, bzw. US- Patentanmeldung Serien-Nr. 08/084.495, eingereicht am 1. Juli 1993, und Antikörper, die für Haptene spezifisch sind; komplementäre Nucleotidsequenzen; Enzymcofaktoren oder Substrate und Enzyme; und dergleichen. Gemäß der Ausführungsform, die in Zusammenhang mit Fig. 1 beschrieben wird, ist jeder Einfangreagenzfleck typischerweise spezifisch für ein unterschiedliches Amplikon. Folglich können einzelne Amplikons räumlich getrennt werden.
  • Nach einer Amplifikationsreaktion wird die Vorderkante 3 des immunchromatographischen Streifens, der oben beschrieben und in Fig. 1 dargestellt ist, in Kontakt gebracht mit einer Reaktionsmischung, welche vielfache Amplikons enthalten kann. Die Reaktionsmischung und jedes Amplikon, das darin enthalten ist, wird dann entlang des Streifens transportiert und gelangt durch die Einfangreagenzflecken. Falls ein Amplikon, welches ein Bindungspaar mit einem Bindungsglied bildet, das an einer Einfangstelle vorliegt, vorhanden ist, wird es an einem bestimmten Einfangfleck auf dem Streifen immobilisiert. Die Anwesenheit des Amplikons auf dem Streifen kann dann unter Verwendung einer "Markierung" detektiert werden.
  • Der Ausdruck "Markierung" bezeichnet ein Molekül oder eine Komponente mit einer Eigenschaft oder einem Merkmal, welches zur Detektion in der Lage ist. Eine Markierung kann direkt detektierbar sein wie mit, zum Beispiel, Radioisotopen, Fluorophoren, Chemiluminophoren, Enzymen, Kolloidalteilchen, fluoreszenten Mikropartikeln und dergleichen; oder eine Markierung kann indirekt detektierbar sein wie mit, zum Beispiel, spezifischen Bindungsgliedern. Es wird verstanden werden, dass direkte Markierungen zusätzliche Komponenten wie zum Beispiel Substrate, Auslösereagenzien, Licht und dergleichen benötigen, um die Detektion der Markierung zu ermöglichen. Wenn indirekte Markierungen zur Detektion verwendet werden, werden sie typischerweise in Kombination mit einem "Konjugat" verwendet. Ein Konjugat ist typischerweise ein spezifisches Bindungsglied, welches an eine direkt detektierbare Markierung angelagert oder gekoppelt worden ist. Kopplungsverfahren zur synthetischen Herstellung eines Konjugats sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können zum Beispiel jedes chemische Mittel und/oder physikalische Mittel einschließen, das die spezifische Bindungseigenschaft des spezifischen Bindungsglieds oder die detektierbare Eigenschaft der Markierung nicht zerstört.
  • Daher kann in Fällen, in denen ein Amplikon, welches auf einem Streifen immobilisiert ist, eine direkt detektierbare Markierung trägt, das immobilisierte Amplikon direkt detektiert werden. In Fällen, in denen ein Amplikon eine indirekt detektierbare Markierung trägt, kann ein Konjugat, das ein Bindungsglied umfasst, welches für die indirekte Markierung spezifisch ist, eingesetzt werden, um die Anwesenheit des Amplikons auf dem Streifen zu detektieren.
  • Im Allgemeinen können Amplikons unter Verwendung anderer Verfahren detektiert werden, die gewöhnlich eingesetzt werden, um heterogene Immunoassays durchzuführen. Zum Beispiel können nach einer Amplifikationsreaktion die vielfachen Amplikons, die dabei produziert wurden, sofern es welche gibt, mit einem "Festphasenreagenz" in Kontakt gebracht werden und dadurch darauf immobilisiert werden. Festphasenreagenzien können ein spezifisches Bindungsglied umfassen, das an eine "feste Phase" angelagert oder gekoppelt ist. Spezifische Bindungsglieder, die zuvor erwähnt wurden, können ebenfalls eingesetzt werden, um ein Festphasenreagenz herzustellen.
  • Feste Phase bezieht sich auf jedes Material, welches unlöslich ist, oder durch eine nachfolgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Die feste Phase kann gewählt werden für ihre innere Fähigkeit, ein Bindungsglied anzuziehen und zu immobilisieren, um ein Festphasenreagenz zu bilden. Alternativ kann die feste Phase einen weiteren Rezeptor zurückhalten, welcher die Fähigkeit hat, ein Bindungsglied anzuziehen und zu immobilisieren, um ein Festphasenreagenz zu bilden. Der zusätzliche Rezeptor kann eine geladene Substanz einschließen, die in Bezug auf ein Bindungsglied oder eine geladene Substanz, die an ein Bindungsglied konjugiert ist, entgegengesetzt geladen ist. Als noch eine andere Alternative kann das Rezeptormolekül jedes spezifische Bindungsglied sein, welches auf der festen Phase immobilisiert ist (an der festen Phase angelagert ist), und welches die Fähigkeit hat, ein anderes Bindungsglied durch eine spezifische Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Rezeptormolekül ermöglicht die indirekte Bindung eines Bindungsglieds an ein Festphasenmaterial vor der Durchführung des Assays oder während der Durchführung des Assays. Die feste Phase können somit zum Beispiel Latex, Kunststoff, derivatisierter Kunststoff, magnetisches oder nicht magnetisches Metall, Glas- oder Siliciumoberfläche oder Oberflächen von Reagenzgläsern, Mikrotitervertiefungen, Folien, Kügelchen, Mikropartikel, Splitter oder andere Konfigurationen sein, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Es wird erwägt und liegt innerhalb des Rahmens der Erfindung, dass die feste Phase auch jedes geeignete poröse Material mit ausreichender Porosität umfassen kann, um, wenn notwendig, Zugang über ein Konjugat zu ermöglichen. Mikroporöse Strukturen werden allgemein bevorzugt, aber Materialien mit Gelstruktur im hydratisierten Zustand können ebenso verwendet werden. Wie zuvor veranschaulicht, hat die poröse Struktur von Nitrozellulose hervorragende Absorptions- und Adsorptionseigenschaften für eine breite Vielfalt von Reagenzien einschließlich Bindungsgliedern. Nylon besitzt auch ähnliche Merkmale und ist ebenfalls geeignet. Derartige Materialien können in geeigneten Formen wie Folien, Bögen oder Platten verwendet werden, oder sie können auf geeignete inerte Träger wie Papier, Glas, Kunststofffolien oder Stoffe aufgeschichtet, darauf gebunden oder laminiert werden.
  • Es gibt viele Arten, wie Amplikons auf einem Festphasenreagenz immobilisiert werden können. Zum Beispiel kann das Festphasenreagenz überzogen werden mit Polynucleotiden, welche Bindungspaare mit den Amplikons bilden. Alternativ können die Amplikons mit indirekten Markierungen markiert werden, welche spezifische Bindungspaare bilden mit einem Bindungsglied, das an die feste Phase gekoppelt ist. Es wird verstanden werden, dass das spezifische Bindungsglied, dass das Festphasenreagenz umfasst, Bindungspaare bilden kann mit all den Amplikons, die in einer Amplifikationsreaktion produziert werden, oder vielfache spezifische Bindungspaare, die das Festphasenreagenz umfasst, können spezifisch sein für einzelne Amplikons. Der Fachmann wird ebenfalls erkennen, dass verschiedene Verfahren existieren und eingesetzt werden können, um eine Markierung in ein Amplikon einzulagern.
  • Nachdem Amplikons, sofern vorhanden, auf einem Festphasenreagenz immobilisiert sind, kann ihre Anwesenheit darauf detektiert werden auf eine Art und Weise, die der ähnelt, die zuvor erklärt worden ist. Ausdrücklicher können Markierungen eingesetzt werden, um die verschiedenen Amplikons zu detektieren. In Fällen, in denen die Markierungen nicht aufgrund einer räumlichen Trennung unterschieden werden, können die Markierungen auf andere Arten unterschieden werden, wie Markieren jedes Amplikons mit unterscheidbaren Markierungen. Zum Beispiel kann jedes Amplikon, direkt oder indirekt, mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert werden, welche Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren. Alternativ könnte jedes Amplikon mit einem unterschiedlichen Enzym markiert werden, das jeweils ein Signal bei Anwesenheit eines unterschiedlichen fluorogenen Substrats emittiert. Als eine weitere Alternative können die Amplikons mit Fluorophoren und Enzymen markiert werden, und das Signal kann unterschieden werden aufgrund der vorgegebenen Zeitfolge, in der die Markierungen ein Signal erzeugen. Ausdrücklicher kann das Signal von einem Fluorophor und Enzym unterschieden werden, indem ein konstantes Signal von dem Fluorophor gelesen wird und ein Geschwindigkeitssignal von dem Emzym gelesen wird, wobei das konstante Signal, sofern vorhanden, ein Grundliniensignal bildet, von dem aus das Geschwindigkeitssignal beginnt. Ein derartiges Detektionsverfahren ist beschrieben worden in der im Miteigentum befindlichen, mit angemeldeten US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/362.036, eingereicht am 22. Dezember 1994.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die relative Menge eines Virus, das in einer Testprobe vorhanden sein kann, unter Verwendung des viralen Genoms als eine Targetsequenz bestimmt werden. Zum Beispiel kann eine Aggregat-Primer-Reihe für PCR drei Primersets umfassen. Die Sensitivitäten von drei Primersets können bestimmt oder so eingestellt werden, dass das eingestellte Primerset 1 (APS-1) eine Schwellenkonzentration von 100 Targetsequenzen pro 100 ul Probe nach 40 Amplifikationszyklen aufweist, das eingestellte Primerset 2 (APS-2) eine Schwellenkonzentration von 1.000 Targetsequenzen pro 100 ul Probe nach 40 Amplifikationszyklen aufweist, und das eingestellte Primerset 3 (APS-3) eine Schwellenkonzentration von 10.000 Targetsequenzen pro 100 ul Probe nach 40 Amplifikationszyklen aufweist. Die Sensitivitäten der Primer können bestimmt oder anders eingestellt werden durch, zum Beispiel, Herstellen einer Verdünnungsreihe der einzelnen Primersets und Durchführen von Amplifikationsreaktionen mit jedem Glied der Verdünnungsreihe in Anwesenheit einer gewählten Konzentration (Schwellenkonzentration) der Targetsequenz. Produkte aus den verschiedenen Reaktionen können dann detektiert werden. Die Verdünnung, welche die niedrigste Primerkonzentration enthält, welche ein detektierbares Amplikon produziert, kann dann mit dieser Konzentration in der Aggregat- Primer-Reihe eingesetzt werden.
  • Zusätzlich kann ein Glied jedes Primersets mit einem gewöhnlich Bindungsglied wie Biotin markiert werden, und der verbleibende Primer des Primersets kann mit unterschiedlichen Markierungen markiert werden. Zum Beispiel kann der verbleibende Primer von APS-1 mit Carbazol markiert werden, der verbleibende Primer von APS-2 kann mit Adamantan markiert werden, und der verbleibende Primer von APS-3 kann mit Fluorescein markiert werden.
  • Eine Reaktionsmischung, die die Aggregat-Primer-Reihe umfasst, kann dann mit einer geeignet behandelten 100-ul-Testprobe, von welcher vermutet wird, dass sie die Targetsequenz enthält, in Kontakt gebracht werden. Die resultierende Mischung kann dann 40 Mal wechselbeansprucht werden, und ein aliquoter Teil der wechselbeanspruchten Reaktionsmischung kann dann mit einem Anti- Biotin-Konjugat kombiniert werden, das zum Beispiel ein Bindungsglied umfasst, das für Biotin, das an kolloidale Selenpartikel gebunden ist, spezifisch ist. Die Anwesenheit von verschiedenen Amplikons, falls welche vorhanden sind, kann dann detektiert werden. Die Detektion kann mit einem Nitrozellulosestreifen durchgeführt werden, der ähnlich gestaltet ist wie der, der in Fig. 1 dargestellt ist. Jedoch wären in diesem Fall drei Einfangflecken für die Detektion ausreichend. Ein Einfangfleck könnte Anti-Carbazol-Antikörper umfassen, ein anderer Einfangfleck könnte Anti-Adamantan- Antikörper umfassen, und ein dritter Einfangfleck könnte Anti- Fluorescein-Antikörper umfassen. Fig. 2a stellt eine solche Nitrozellulosestreifenkonfiguration dar, wobei Fleck 4 der Carbazol-Einfangfleck ist, Fleck 5 der Adamantan-Einfangfleck ist, und Fleck 6 der Fluorescein-Einfangfleck ist. Die Vorderkante 7 des Nitrozellulosestreifens kann mit der Reaktionsmischung in Kontakt gebracht werden, wodurch die Reaktionsmischung an den Einfangflecken vorbei transportiert wird. Die Einfangflecken werden die verschiedenen Amplikons, sofern welche vorhanden sind, auf dem Nitrozellulosestreifen an spezifischen Stellen immobilisieren. Zum Beispiel würde ein Amplikon, das APS-1 umfasst, an Fleck 4 immobilisiert werden, ein Amplikon, das APS-2 umfasst, würde an Fleck 5 immobilisiert werden, und ein Amplikon, das APS-3 umfasst, würde an Fleck 6 immobilisiert werden.
  • Falls eine ausreichende Menge Amplikon während der Amplifikation erzeugt wurde, würde genug Konjugat (angelagert an das Amplikon) bei den Einfangflecken angehäuft werden, um ein sichtbares Signal zu erzeugen. Ein sichtbares Signal bei einem einzelnen Einfangfleck wäre ein Hinweis, dass die Schwellenkonzentration des eingestellten Primersets in der Testprobe vorhanden wäre. Da die Targetsequenz das virale Genom umfasste, folgt dann, dass das Virus bei einer Konzentration von mindestens der eingestellten Schwellenkonzentration des Primersets vorhanden wäre.
  • Zum Beispiel angenommen, dass es zwischen 1.000 und 10.000 Viruspartikel in der Testprobe gäbe, würde es, nachdem der Nitrozellulosestreifen mit der Reaktionsmischung und dem Konjugat in Kontakt gebracht wurde, erscheinen, wie in Fig. 2b gezeigt, wo das Amplikon, das APS-1 umfasst, an Fleck 4 immobilisiert ist, und das Amplikon, das APS-2 umfasst, an Fleck 5 immobilisiert ist. Jedoch würde kein Signal bei Fleck 6 detektiert werden, da die Schwellenkonzentration von APS-3 nicht in der Testprobe vorhanden wäre. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse, die von einer derartigen Konfiguration erhalten werden, wobei eine positive Detektion von Amplikon mit einem positiven Vorzeichen (+) und kein detektierbares Amplikon mit einem negativen Vorzeichen (-) angezeigt wird. Tabelle 1 PRIMERSET
  • Basierend auf dem Nitrozellulosestreifen und den gleichen Ergebnissen, die in Tabellenform in Tabelle 1 dargestellt sind, könnte bestimmt werden, dass mehr als 100 und mehr als 1.000 Targetsequenzkopien in der Testprobe vorhanden wären, weil ein positives Ergebnis für APS-1 und APS-2 erhalten wurde. Zusätzlich könnte, weil APS-3 kein detektierbares Amplikon erbrachte, bestimmt werden, dass weniger als 10.000 Targetsequenzkopien in der Testprobe vorhanden wären. Folglich wären zwischen 1.000 und 10.000 Targetsequenzen in der Testprobe. Entsprechend wären zwischen 1.000 und 10.000 Viruspartikel in der Testprobe.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform kann eine Kontrollsequenz eingesetzt werden, um sicherzustellen, dass die Amplifikationsreaktion selbst wirksam war. Zum Beispiel können zwei PCR-Primersets APS-1 und APS-2 eingestellt werden, Schwellenkonzentrationen von 1.000 Targetsequenzen pro 100 ul Probe nach 40 Amplifikationszyklen aufzuweisen, bzw. 10.000 Targetsequenzen pro 100 ul Probe nach 40 Amplifikationszyklen aufzuweisen. Eine bekannte Nukleinsäuresequenz kann als Kontrollsequenz verwendet werden.
  • Primer für die Kontrollsequenz werden im Allgemeinen nicht eingestellt, aber in einigen Fällen kann es wünschenswert sein, sie einzustellen. Alles, was von den Kontrollprimern verlangt wird, ist, dass sie in der Lage sind, ein detektierbares Amplikon nach der Zahl der Amplifikationszyklen zu produzieren, die für die Reaktion, in welcher sie verwendet werden sollen, erwartet wird.
  • Eine Nukleinsäure-Amplifikationsmischung, die APS-1, APS-2, die Kontrollsequenz sowie die Kontrollprimer umfasst, wird dann mit einer entsprechend behandelten 100-ul-Testprobe in Kontakt gebracht. Die so gebildete Reaktionsmischung wird dann 40 Mal wechselbeansprucht. Detektierbare Amplikons, sofern vorhanden, können dann auf eine ähnliche Art und Weise detektiert werden, wie die, die zuvor besprochen wurde. Zum Beispiel könnten die verschiedenen Amplikons mit einer direkt detektierbaren Markierung wie ein Fluorophor durch dessen Einlagerung in ein Glied von jedem Primerset verknüpft werden. Das andere Glied von den Primersets könnte mit unterschiedlichen Bindungsgliedern wie oben markiert sein. Ein Nitrozellulosestreifen könnte mit Einfangregionen ausgestattet werden, welche das Kontrollamplikon und die zwei Primerset-Amplikons immobilisieren würden. Nachdem ein solcher Nitrozellulosestreifen mit einem aliquoten Teil der Reaktionsmischung in Kontakt gebracht worden ist, könnten alle immobilisierten Amplikons dann durch Bestimmen der Anwesenheit eines fluoreszenten Signals detektiert werden. Wie oben würden Signale in den Einfangregionen die Anwesenheit der Schwellenkonzentration eines bestimmten Primersets anzeigen. Jedoch würde ein Signal in der Region, die zum Einfangen des Kontrollamplikons verwendet wird, anzeigen, dass die Amplifikation wirksam war. Ein Fehlen eines solchen Signals würde anzeigen, dass die Amplifikation nicht wirksam war, und deshalb könnte man sich nicht auf die Ergebnisse verlassen.
  • Angenommen, die Targetsequenz wäre ein virales Genom, dann würde ein positives Signal in den Kontrolleinfangregionen und keine detekierbaren Signale in den übrigen Einfangregionen anzeigen, dass (i) die Amplifikation wirksam wäre und (ii) weniger als 1.000 virale Partikel in der Testprobe vorhanden wären. Wenn jedoch kein detektierbares Signal weder in der Kontrolleinfangregion noch in den eingestellten Primerset- Einfangregionen erhalten würde, könnte bestimmt werden, dass die Amplifikationsreaktion nicht wirksam wäre, und deshalb könnte man sich nicht auf derartige Ergebnisse verlassen.
  • Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, und sind nicht dazu bestimmt, die Erfindung zu begrenzen.
    • Beispiele
  • Innerhalb der Beispiele haben die folgenden Abkürzungen die angegebenen Bedeutungen.
  • - BSA steht für Rinderserumalbumin.
  • - EPPS steht für N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-(3- propansulfonsäure).
  • - NAD steht für Nicotinamid-adenin-dinucleotid.
  • - TRIS® steht für Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan.
  • - TTP steht für Thymidintrisphosphat.
    • Beispiel 1 Sondensetkonzentrationseinstellung und simultane LCR- Amplifikation von kleinen b-Globin- und HIV-Taraetsequenzen
  • In diesem Beispiel wird ein Verfahren zum Einstellen und Bestimmen der Schwellenkonzentration eines Primersets dargestellt. Zwei kleine Targetsequenzen mit sehr unterschiedlichen Konzentrationen wurden koamplifiziert unter Verwendung von LCR, und die Auswirkungen von Änderung der Konzentration eines Primersets auf die Sensitivität dieses Primersets werden dargestellt.
  • Eine kleine Targetsequenz (Sequenzidentifikationsnummer 1) wird der Einfachheit halber als ein Einzelstrang dargestellt, wurde aber tatsächlich in doppelsträngiger Form verwendet. Sequenzidentifikationsnummer 1 entspricht Kartenposition 62252 bis 62288 des Human-b-Globin-Gens, wie offenbart in GenBank, Zugriffs-Nr. J00179, NCBI Sequenzidentifikationsnummer: 183807.
  • Die andere kleine Targetsequenz (Sequenzidentifikationsnummer 2), welche ebenfalls der Einfachheit halber als ein Einzelstrang dargestellt wird, wurde auch in ihrer doppelsträngigen Form eingesetzt. Sequenzidentifikationsnummer 2 entspricht Kartenposition 3554 bis 3601 des HIV-pol-Gens, wie offenbart in Sanchez-Pescador R., et al., Science 277: 484-492 (1985). Beide Sequenzen sind unten in Tabelle 2 in einer 5'-3'-Richtung aufgeführt. Tabelle 2
  • Target-spezifische Sonden (hier auch bezeichnet als "Amplifikationssonden") wurden darauf angelegt, die obigen Targetsequenzen durch LCR zu amplifizieren und zu detektieren. Das erste Amplifikationssondenset war spezifisch für Sequenzidentifikationsnummer 1 (die "b-Globin-Sequenz") und ihren komplementären Strang. Zwei Sonden (Sequenzidentifikationsnummer 3 und Sequenzidentifikationsnummer 4) aus diesem Set waren hapteniert mit Biotin, welches als "Bt" bezeichnet wird. Eine der verbleibenden Sonden (Sequenzidentifikationsnummer 6) war hapteniert mit Adamantan, welches als "Ad" bezeichnet wird. Die 5'-Enden von Sequenzidentifikationsnummer 4 und Sequenzidentifikationsnummer 5 waren funktionsfähig mit einer Phosphatgruppe, welche als "p" bezeichnet wird, um Ligation von Sequenzidentifikationsnummer 3 an Sequenzidentifikationsnummer 5 und Ligation von Sequenzidentifikationsnummer 4 an Sequenzidentifikationsnummer 6 zu erlauben. Sequenzidentifikationsnummer 4 und Sequenzidentifikationsnummer 6 waren komplementär zu Sequenzidentifikationsnummer 1, und Sequenzidentifikationsnummer 3 und Sequenzidentifikationsnummer 5 waren komplementär zum komplementären Strang von Sequenzidentifikationsnummer 1. Das Sondenset, das eingesetzt wurde, um die b-Globin-Sequenz zu amplifizieren und zu detektieren, ist unten in Tabelle 3 dargestellt, wo einzelne Sonden in einer 5'-3'-Richtung aufgeführt sind. Tabelle 3
  • Das andere Amplifikationssondenset war darauf angelegt, Sequenzidentifikationsnummer 2 (die "HIV-Sequenz") und deren komplementären Strang zu amplifizieren und zu detektieren. Zwei der Sonden (Sequenzidentifikationsnummer 7 und Sequenzidentifikationsnummer 8) waren hapteniert mit Fluorescein, bezeichnet als "F1", und die anderen zwei Sonden (Sequenzidentifikationsnummer 9 und Sequenzidentifikationsnummer 10) waren hapteniert mit Biotin. Sequenzidentifikationsnummer 8 und Sequenzidentifikationsnummer 10 hybridisieren mit Sequenzidentifikationsnummer 2, und Sequenzidentifikationsnummer 7 und Sequenzidentifikationsnummer 9 hybridisieren mit dem komplementären Strang von Sequenzidentifikationsnummer 2. Wie oben bezeichnet "p" eine Phosphatgruppe. Das Sondenset, das eingesetzt wurde, um die HIV-Sequenz zu amplifizieren und zu detektieren, ist unten in Tabelle 4 dargestellt, wo einzelne Sonden in einer 5'-3'-Richtung aufgeführt sind. Tabelle 4
  • Die Sondensets, die oben beschrieben wurden, wurden bei verschiedenen Konzentrationen verwendet, um die kleinen Targetsequenzen gemäß GLCR, im Wesentlichen wie in EP-A-439 182 beschrieben, zu koamplifizieren. Die Reaktionskomponenten zur Durchführung jeder Reaktion waren: 50 mM EPPS-Puffer, pH 7,8; 20 mM K&spplus;; 30 mM MgCl&sub2;; 10 uM NAD; 1,7 uM TTP; 90 U/ul Ligase (Molecular Biology Resources; Milwaukee, WI), 0,01 U/ul Taq- Polymerase (Perkin-Elmer; Norwalk, CT) und Sonden in Konzentrationen, wie in Tabelle 5 unten dargestellt. Jede Reaktionmischung wies 100 ul Endvolumen auf. Die obigen Komponenten wurden mit einer 2-fachen Konzentration hergestellt und als Aliquote in Kapillarröhrchen eingefüllt. Die Targetsequenzen (wie in Tabelle 5 gezeigt) waren ebenfalls mit 2-facher Konzentration, aber wurden bei 100ºC 3 Minuten erhitzt und dann gekühlt, bevor sie zu den Kapillarröhrchen hinzugegeben wurden.
  • Thermische Wechselbeanspruchung wurde in einem kapillaren Thermocycler durchgeführt, welcher beschrieben ist in US- Patentanmeldung Serien-Nr. 08/140.731, eingereicht am 21. Oktober 1993. Fünfzig der folgenden Zyklen wurden unter Verwendung des kapillaren Thermocyclers durchgeführt: 88ºC 10 Sekunden lang und 53ºC 60 Sekunden lang.
  • Die Sondensetkonzentrationen und die Menge der jeweiligen kleinen Targetsequenzen pro Reaktion sind unten in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5
  • GLCR-Amplifikationsprodukte wurden unter Verwendung eines immunchromatographischen Streifens detektiert, welcher wie folgt gestaltet war: 7 mm · 40 mm-Streifen aus Nitrozellulose (erhältlich von Schleicher & Schuell; Keene, NH) wurden mit 4 Antikörperflecken (Anti-Adamantan, Anti-Quinolin, Anti-Dansyl und Anti-Fluorescein) von unten links nach oben rechts bespritzt, um einen diagonalen Bereich von Einfangflecken zu bilden. Jeder Einfangfleck wurde mit 6,49 · 10&supmin;¹&sup0; ul der Antikörperlösung bespritzt. Die Anti-Quinolin-, Anti-Dansyl- und Anti-Fluorescein-Antikörper waren bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml; und der Anti-Adamantan-Antikörper war bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml. Alle Antikörperlösungen wurden hergestellt mit TBS (TRIS®-gepufferter Salzlösung), mit 0,1% BSA und einem Körnchen Phenolrot.
  • Nach der Amplifikation wurde eine 5-ul-Probe des Reaktionsproduktes zu 25 ul eines blauen Latex-Konjugats, mit 0,05% Feststoff, und 20 ul 3%igem Casein in TBS hinzugegeben. Das blaue Latex-Konjugat wurde durch Verwirbeln blauer Latexmikropartikel (0,4% Feststoff, erhältlich von Bangs Laboratories; Carmel, IN) mit einer 10-ug/ml-Lösung von Kaninchen-Antibiotin-Antikörper für 30 Sekunden hergestellt. Das Konjugat wurde mit 0,05% Casein in 10 mM TRIS®-Puffer geblockt. Die Konjugat/Reaktionsprobenlösung wurde gemischt, und die Biotin-haptenierten Enden der Amplikons bildeten dadurch mit dem Anti-Biotin-blauem Latex-Konjugat Komplexe.
  • Die Lösung wurde dann in Kontakt gebracht mit dem immunchromatographischen Streifen, der wie oben gestaltet war. Die Lösung wanderte den Streifen hoch und die Antikörperflecken fingen alle spezifischen Haptene ein. Amplikons, die während der Amplifikationsreaktion produziert wurden, wurden auf dem immunchromatographischen Streifen eingefangen, was die Konzentration von blauem Latex an entsprechenden Einfangflecken zur Folge hatte. Die Anwesenheit von blauem Latex, sofern es welches gab, an den verschiedenen Einfangflecken wurde detektiert durch Einscannen der chromatographischen Streifen in eine TIFF-Datei mit einem Flachbettscanner ScanJet C (Hewlett- Packard; Palo Alto, CA). Die TIFF-Datei wurde importiert in NIH ImageTM 1.55 (erhältlich in der Public Domain von den National Institutes of Health, Research Services Brach, NIMH), und die Bilder der entwickelten Flecken wurden unter Verwendung der Gelanalysemakros auf ihre Peakfläche analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6
  • Wie erwartet und durch alle Streifen nachgewiesen (Daten nicht dargestellt) wurde kein Signal bei den Quinolin- und Dansyl- Einfangflecken beobachtet. Jedoch wurden sich ändernde Signalwerte bei den Fluorescein- und Adamantan-Einfangflecken beobachtet. Wie durch die Daten in Tabelle 6 gezeigt, nahm die Signalintensität bei diesen Flecken mit zunehmender Sondenkonzentration zu. Folglich erhöhte sich die Sensitivität des Sondensets mit einer Zunahme seiner Konzentration in der Amplifikationsreaktion. Somit kann durch Ändern der Konzentration des Sondensets dessen Sensitivität gesteuert werden. Zusätzlich waren die Schwellenkonzentrationen für die Sondensets unterschiedlich, obwohl die Sonden gegen unterschiedliche Targets gerichtet waren (das b-Globin-Set erkennt 1 · 10&sup5; Targets bei einer ähnlichen Signalintensität wie das HIV-Set, welches 10-100 Kopien HIV erkennt).
    • Beispiel 2 Primersetkonzentrationseinstellung und simultane PCR- Amplifikation von zwei Hepatitis-B-Virus(HBV)-Targetsequenzen
  • In diesem Beispiel wird eine simultane PCR von zwei getrennten Sub-Target-Regionen einer HBV-Targetsequenz unter Verwendung von zwei Primersets durchgeführt, welche sehr unterschiedliche Sensitivitäten aufweisen.
  • Die erste Sub-Target-Sequenz entspricht Kartenposition 236 bis 712 von HBV, wie offenbart in Ono Y, et al., Nucleic Acids Res., 11: (6), 1747-1757 (1983), und Okamoto H., et al., J. Gen. Virol., 69: 2575-2583 (1988). Die vollständige Sequenz ist unten in Tabelle 7 als Sequenzidentifikationsnummer 11 in einer einzelsträngigen Form für eine Einfachheit der Erklärung aufgeführt. Diese Sequenz wird nachfolgend als das "lange HBV- Target" bezeichnet. Die andere Sub-Target-Sequenz, die in diesem Beispiel eingesetzt wird, entspricht Kartenposition 1863 bis 1934 von HBV, wie offenbart in Okamoto H., et al., J. Gen. Virol., 69: 2575-2583 (1988). Diese Sequenz (Sequenzidentifikationsnummer 12) wird gleichartig unten in Tabelle 7 als eine einzelsträngige Sequenz aufgeführt und wird nachfolgend als das "kurze HBV-Target" bezeichnet. Beide Sub- Targets sind in Tabelle 7 in der 5'-3'-Richtung aufgeführt. Tabelle 7
  • Die PCR-Sonden, die eingesetzt wurden, um die obigen Sub-Target- Sequenzen zu amplifizieren und zu detektieren, sind unten in Tabelle 8 aufgeführt. Sequenzidentifikationsnummer 13 passt mit einem Abschnitt der oben aufgeführten langen HBV-Sequenz zusammen und hybridisiert an deren komplementären Strang. Sequenzidentifikationsnummer 14 hybridisiert an die lange HBV- Sequenz, die oben aufgeführt ist. Zusammen werden Sequenzidentifikationsnummer 13 und Sequenzidentifikationsnummer 14 nachfolgend als die "langen Sequenzsonden" bezeichnet. Sequenzidentifikationsnummer 15 passt mit einem Abschnitt der oben aufgeführten kurzen HBV-Sequenz zusammen und hybridisiert an deren komplementären Strang. Sequenzidentifikationsnummer 16 hybridisiert an die oben aufgeführte kurze HBV-Targetsequenz. Zusammen werden Sequenzidentifikationsnummer 15 und Sequenzidentifikationsnummer 16 nachfolgend als die "kurzen Sequenzsonden" bezeichnet. Nach PCR ergeben die langen Sequenzsonden ungefähr ein 477-Basenprodukt, und die kurzen Sequenzsonden ergeben ungefähr ein 72-Basenprodukt. All diese Sonden sind unten aufgeführt und sind in der 5'-3'-Richtung. Entsprechend sind Sequenzidentifikationsnummer 13 und Sequenzidentifikationsnummer 15 in der Vorwärtsrichtung, und Sequenzidentifikationsnummer 14 und Sequenzidentifikationsnummer 16 sind in der entgegengesetzten Richtung. Tabelle 8
  • Die Sonden, die oben in Tabelle 8 aufgeführt sind, wurden in PCR, im Wesentlichen wie in US-Patent Nr. 4.683.195 und US- Patent Nr. 4.683.202 beschrieben, verwendet. PCR wurde in dünnwandigen 0,65-ml-Gene-Amp-Reaktionsröhrchen (von Perkin- Elmer; Norwalk, CT) in 25 ul Volumen durchgeführt, das die folgenden Komponenten enthielt: 1 · PCR-Puffer (10 mM TRIS®-HCl, pH 8,3, 40 mM KCl, 0,001% Masse/Volumen Gelatine), 3 mM MgCl&sub2;, 200 uM von jedem dNTP, 2,5 U AmplitaqTM (alles von Perkin-Elmer; Norwalk, CT), 0,55 ug TaqStartTM Antikörper (Clontech; Palo Alto, CA), Primer mit 200 nM für die langen Sequenzsonden, und 1 uM für die kurzen Sequenzsonden. Jedes Röhrchen wies einen Tropfen Mineralöl auf.
  • PCR für beide Sub-Target-Sequenzen wurde doppelt durchgeführt, und die Sub-Target-Sequenzen wurden zu den Gene-Amp-Röhrchen hinzugegeben in Form von genomischer HBV-DNA, gereinigt von der Abbott HBV Assay-positiven Kontrolle (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Entsprechend wurde das HBV-Genom als eine Targetsequenz verwendet. Die Menge an Targetsequenz, die zu jedem zweifach vorhandenen Röhrchen hinzugegeben wurde, variierte und ist unten aufgeführt. Nachdem alle Reagenzien und Targets in die Röhrchen eingebracht waren, wurden sie 2 Minuten lang auf 94ºC erhitzt. Die Mischungen wurden dann 40 Zyklen programmierter Temperaturänderung unterworfen, wobei die Zyklen 94ºC für 30 Sekunden, 67ºC für 1 Minute waren. Nach Wechselbeanspruchung wurden die Röhrchen bei 4ºC aufbewahrt. Die thermische Wechselbeanspruchung wurde in einem PE480 Thermocycler durchgeführt, erhältlich von Perkin-Elmer, Norwalk, CT.
  • Nach der Wechselbeanspruchung wurden 10-ul-Aliquoten aus jedem Röhrchen entfernt, gemischt mit 3 ul Bromphenolblau, Xylencyanol, Phenanthridiniumtriamin (PTA - offenbart in US- Patentanmeldung Nr. 08/265.342, eingereicht am 23. Juni 1994) und Glycerol (Endkonzentrationen der Mischung war 7, 7 uM PTA, 7, 7% Glycerol, Spurenmengen von Bromphenolblau und Xylencyanol). Die resultierenden Mischungen wurden auf einem vorgefertigten Bio-Rad Ready Gel laufen gelassen (10% Acrylamid) (BioRad; Hercules, CA) (100 V, Bromphenolblau lief zum Boden des Gels). Das Gel wurde fotografiert und ist in Fig. 4 dargestellt.
  • Relative Molekülmasse-Markierungen wurden in der ersten Spur auf dem Gel, das in Fig. 4 gezeigt ist, laufen gelassen. Die Markierungen umfassten Promega PCR Markers 45694 (erhältlich von Promega; Madosin, WI) mit den folgenden Längen: 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 300 bp, 150 bp, 50 bp. PCR-Produkte, die von verschiedenen Targetsequenzkonzentrationen produziert wurden, wurden auf den übrigen Spuren des Gels laufen gelassen. Doppelte Röhrchen wurden für die verschiedenen Konzentrationen der Targetsequenz durchgeführt. Spur 2 und 3 waren Proben von Röhrchen, worin PCR-Koamplifikation an ungefähr 30.000 HBV-DNA- Molekülen durchgeführt wurde. Spur 4 und 5 waren Proben von Röhrchen, worin PCR-Koamplifikation an ungefähr 300 Moleküen HBV-DNA durchgeführt wurde. Spur 6 und 7 waren Proben von Röhrchen, worin PCR-Koamplifikation an ungefähr 30 Molekülen HBV-DNA durchgeführt wurde. Spur 8 und 9 waren Proben von Kontrollröhrchen, worin PCR-Koamplifikation ohne irgendeine HBV- DNA durchgeführt wurde.
  • Wie durch das Gel gezeigt wird, sind die Sensitivitäten der zwei Sets nahezu gleichwertig bei den unterschiedlichen Konzentrationen. Ausdrücklicher produzierten bei 30.000 und 300 Haupttargetsequenzen beide Sondensets detektierbare Amplikons nach PCR. Jedoch produzierten die zwei Sondensets keine detektierbaren Amplikons, wenn weniger als 300 Targetsequenzen in der Probe enthalten waren.
  • Die Sensitivitäten der Sondensets wurden dann durch Variieren der Konzentration von einem der Sondensets eingestellt, die in OCR eingesetzt wurden. In dieser Amplifikationsrunde waren alle Reagenzien und Wechselbeanspruchungsbedingungen die gleichen wie oben, mit der Ausnahme der Konzentration des langen Sondensets, welche 60 uM war.
  • Die Röhrchen wurden wie oben wechselbeansprucht, es wurden Proben genommen wie oben und auf einem Gel wie oben laufen gelassen. Tabelle 9 gibt die Spurnummern doppelter Röhrchen und die Menge an HBV-DNA an, die in die Röhrchen vor der Amplifikation gebracht wurden. Spur 11 war eine Nullspur, und Spur 10 und Spur 15 enthielten die relative Molekülmasse- Markierungen, die vorher beschrieben wurden.
    • Tabelle 9 Spuren HBV-DNA (Moleküle ungefähr)
  • 1 und 2 3 · 10&sup6;
  • 3 und 4 3 · 10&sup5;
  • 5 und 6 3 · 10&sup4;
  • 7 und 12 3000
  • 8 und 9 300
  • 13 und 14 kein Target
  • Wie nachgewiesen durch das Gel, das in Fig. 5 gezeigt wird, führte die Einstellung des langen Sondensets durch Verringern seiner Konzentration dazu, dass seine Sensitivität abnahm. Bei den verwendeten Sondensetkonzentrationen produzierte das lange Sondenset kein detektierbares Amplikon, bis die HBV- Konzentration bei 3 · 10&sup5; Molekülen lag. Folglich war unter den obigen Bedingungen die Schwellenkonzentration des kurzen Sondensets 3 · 10&sup5;. Andererseits war die Schwellenkonzentration des langen Sondensets kleiner als 300 HBV-Moleküle. Bei Verwendung der Sondensets unter den obigen Bedingungen und bei den obigen Konzentrationen konnte die relative Menge einer unbekannten Menge an HBV in einer Testprobe bestimmt werden. Ausdrücklicher konnte bestimmt werden, ob mindestens 300, zwischen 300 und 3 · 10&sup5;, oder mehr als 3 · 10&sup5; HBV-DNA- Genommoleküle in einer Testprobe vorhanden waren. Das konnte dann mit der Menge an HBV in einer Testprobe korreliert werden.
    • SEQUENZLISTE
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN
  • (i) ANMELDER: N. A. Solomon S. R. Bouma
  • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: NACHWEIS VON NUKLEINSÄURE MIT BREITEM DYNAMIKBEREICH UNTER VERWENDUNG VON AGGREGAT-PRIMER-REIHEN
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 16
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) EMPFÄNGER: Abbott Laboratories
  • (B) STRASSE: 100 Abbott Park Road
  • (C) STADT: Abbott Park
  • (D) STAAT: Illinois
  • (E) LAND: USA
  • (F) PLZ: 60064-3500
  • (v) COMPUTERLESBARE FORM
  • (A) MEDIUMTYP: Diskette
  • (B) COMPUTER: Macintosh
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: System 7.0.1
  • (D) SOFTWARE: Microsoft Word 5.1a
  • (vii) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
  • (A) ANMELDUNG NUMMER:
  • (B) DATUM DER EINREICHUNG:
  • (C) KLASSIFIZIERUNG:
  • (viii)ANWALT-/AGENTENINFORMATIONEN
  • (A) NAME: Paul D. Yasger
  • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 37.477
  • (C) VERZEICHNISNUMMER: 5692.US.01
  • (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:
  • (A) TELEFON: 708/937-2341
  • (B) TELEFAX: 708/938-2623
  • (C) TELEX:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 1:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 37 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 1:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 2:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 48 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (HIV) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 2:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 3:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'-Biotin
  • (B) LAGE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 3:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 4:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 17
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'-Phosphat
  • (B) LAGE: 1
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 3'-Biotin
  • (B) LAGE: 17
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 4:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 5:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'-Phosphat
  • (B) LAGE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 5:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 6
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 19 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'-Adamantan
  • (B) LAGE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 6:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 7:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 24 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'-Fluorescein
  • (B) LAGE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 7:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 8
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'-Phosphat
  • (B) LAGE: 1
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 3'-Fluorescein
  • (B) LAGE: 21 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 8
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQUENZ-ID-NR. 9
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'-Phosphat
  • (C) LAGE: 1
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 3'-Biotin
  • (B) LAGE: 21
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 9:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 10:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 24 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'-Biotin
  • (D) LAGE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 10:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 11:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 477 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (HBV) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 11:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 12:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 72 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (HBV)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 12:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 13
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 13:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 14:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 14:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 15
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 15:
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQENZ-ID-NR. 16:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 29 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-ID-NR. 16:

Claims (10)

1. Ein Verfahren zur Bestimmung einer ungefähren Menge einer Targetnukleinsäuresequenz in einer Testprobe, das folgende Schritte umfaßt:
(a) In-Kontakt-bringen der Testprobe mit einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktions-MisChung, die ein erstes Primerset, das in der Lage ist, mit einer ersten Sub-Target- Region der Targetnukleinsäuresequenz zu hybridisieren, und ein zweites Primerset umfaßt, das in der Lage ist, mit einer zweiten Sub-Target-Region der Targetnukleinsäuresequenz zu hybridisieren, wobei die erste und die zweite Sub-Target-Region unterschiedlich sind, und wobei das erste und das zweite Primerset so gewählt sind, daß
(i) das erste Primerset in der Lage ist, ein detektierbares Amplikon nur bei oder über einer ersten Schwellenkonzentration der Targetnukleinsäuresequenz zu erzeugen,
(ii) das zweite Primerset in der Lage ist, ein detektierbares Amplikon nur bei oder über einer zweiten Schwellenkonzentration der Targetnukleinsäuresequenz zu erzeugen, und
(iii) sich die erste und die zweite Schwellenkonzentration voeinander unterscheiden;
(b) die Reaktionsmischung Amplifikationsbedingungen unterwerfen, die ausreichend sind, um ein detektierbares Amplikon von mindestens einem dieser Primersets zu produzieren, wenn die Testprobe eine Konzentration an Targetnukleinsäuresequenz enthält, die bei oder über der Schwellenkonzentration liegt, bei welcher das Primerset in der Lage ist, ein detektierbares Amplikon zu produzieren; und
(c) Detektieren, ob ein Amplikon in der Reaktionsmischung von mindestens einem Primerset produziert wurde, um zu bestimmen, ob die Testprobe eine Konzentration an Targetnukleinsäuresequenz bei oder über der Schwellenkonzentration enthält, die dem mindestens einen Primerset entspricht.
2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Amplifikationsbedingungen eine zwischen 20- und 100-malige thermische Wechselbeanspruchung der Reaktionsmischung umfassen.
3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei mindestens ein Glied von jedem Primerset eine Markierung einschließt.
4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Detektieren, ob Amplikons produziert wurden, folgende Schritte umfaßt:
(a) In-Kontakt-bringen der Reaktionsmischung mit einem Festphasenreagenz, um Amplikon/Festphasenreagenz-Komplexe zu bilden;
(b) In-Kontakt-bringen der Amplikon/Festphasenreagenz- Komplexe mit einem Konjugat; und
(c) Detektieren eines Signals als eine Indikation für die Anwesenheit der Amplikons.
5. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Markierung direkt detektierbar ist.
6. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Detektieren, ob Amplikons produziert wurden, folgende Schritte umfaßt:
(a) In-Kontakt-bringen der Reaktionsmischung mit einem Festphasenreagenz, um Amplikon/Festphasenreagenz-Komplexe zu bilden; und
(b) Detektieren eines Signals als eine Indikation für die Anwesenheit der Amplikons.
7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Festphasenreagenz einen Nitrozellulosestreifen umfaßt, der mit Bindegliedern beschichtet ist.
8. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das das Anpassen der Sensitivität von mindestens einem Primerset umfaßt, wobei das Anpassen die Regulierung der Konzentration des mindestens einen Primersets umfaßt.
9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Sensitivität durch Konzentrationsanpassung angepaßt wird.
10. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Amplifikationsreaktionsmischung weiterhin ein drittes Primerset umfaßt, das in der Lage ist, mit einer dritten Sub-Target-Region der Targetnukleinsäuresequenz zu hybridisieren, wobei sich die dritte Sub-Target-Region von der ersten und der zweiten Sub- Target-Region unterscheidet, und wobei das dritte Primerset so gewählt ist, daß
(a) das dritte Primerset in der Lage ist, ein detektierbares Amplikon nur bei oder über einer dritten Schwellenkonzentration der Targetnukleinsäuresequenz zu erzeugen, und
(b) sich die dritte Schwellenkonzentration von der ersten und der zweiten Schwellenkonzentration unterscheidet.
DE69620596T 1995-05-19 1996-05-17 Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat-primer-reihen Expired - Fee Related DE69620596T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44461595A 1995-05-19 1995-05-19
PCT/US1996/007138 WO1996036736A2 (en) 1995-05-19 1996-05-17 Wide dynamic range nucleic acid detection using an aggregate primer series

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69620596D1 DE69620596D1 (de) 2002-05-16
DE69620596T2 true DE69620596T2 (de) 2002-11-21

Family

ID=23765635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69620596T Expired - Fee Related DE69620596T2 (de) 1995-05-19 1996-05-17 Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat-primer-reihen

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5858732A (de)
EP (1) EP0826069B1 (de)
JP (1) JPH11505126A (de)
AT (1) ATE215993T1 (de)
CA (1) CA2221454A1 (de)
DE (1) DE69620596T2 (de)
WO (1) WO1996036736A2 (de)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1059817A (ja) * 1996-08-20 1998-03-03 Shiseido Co Ltd 水中油型乳化化粧料
EP1164203B1 (de) 1996-11-06 2007-10-10 Sequenom, Inc. DNA-Diagnostik mittels Massenspektrometrie
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US20030027126A1 (en) * 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US7348181B2 (en) 1997-10-06 2008-03-25 Trustees Of Tufts College Self-encoding sensor with microspheres
US7115884B1 (en) 1997-10-06 2006-10-03 Trustees Of Tufts College Self-encoding fiber optic sensor
EP1090293B2 (de) 1998-06-24 2019-01-23 Illumina, Inc. Dekodierung von matrixartig-angeordneten Sensoren durch Mikropartikel
US6245511B1 (en) 1999-02-22 2001-06-12 Vialogy Corp Method and apparatus for exponentially convergent therapy effectiveness monitoring using DNA microarray based viral load measurements
US20040111219A1 (en) * 1999-02-22 2004-06-10 Sandeep Gulati Active interferometric signal analysis in software
US6235479B1 (en) * 1999-04-13 2001-05-22 Bio Merieux, Inc. Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample
US20060275782A1 (en) * 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6355431B1 (en) * 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
EP1190100B1 (de) 1999-05-20 2012-07-25 Illumina, Inc. Kombinatorische entschlüsselung von zufallsnukleinsäurearrays
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US8080380B2 (en) * 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
CA2382157C (en) 1999-08-18 2012-04-03 Illumina, Inc. Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions
US7361488B2 (en) * 2000-02-07 2008-04-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US6913884B2 (en) * 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
US8076063B2 (en) * 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7582420B2 (en) * 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
DK1259643T3 (da) * 2000-02-07 2009-02-23 Illumina Inc Fremgangsmåde til detektion af nukleinsyre ved anvendelse af universel priming
US7955794B2 (en) * 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US20050214825A1 (en) * 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
US7611869B2 (en) * 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
WO2001057268A2 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
AU2001239760B2 (en) * 2000-02-10 2005-11-24 Illumina, Inc. Array of individual arrays as substrate for bead-based simultaneous processing of samples and manufacturing method therefor
US6770441B2 (en) * 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
ATE412774T1 (de) 2000-02-16 2008-11-15 Illumina Inc Parallele genotypisierung mehrerer patientenproben
AU2001254670A1 (en) * 2000-03-02 2001-09-12 Akzo Nobel N.V. Detection of hepatitis b virus rna
US20040018491A1 (en) * 2000-10-26 2004-01-29 Kevin Gunderson Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
EP1440311B1 (de) * 2001-08-31 2009-01-07 Gen-Probe Incorporated Sonden mit affinitätsverschiebung zur quantifizierung von analytenpolynukleotiden
DE60238699D1 (de) * 2001-09-17 2011-02-03 Phadia Ab Mehrfachanalytassay-vorrichtung mit multi-spot-nachweiszone
SE0103072D0 (sv) * 2001-09-17 2001-09-17 Pharmacia Diagnostics Ab Multi-analyte assay device with multi-spot detection zone
AU2003215240A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Illumina, Inc. Automated information processing in randomly ordered arrays
ATE519861T1 (de) 2002-06-14 2011-08-15 Gen Probe Inc Zusammensetzungen zum nachweis von hepatitis-b- virus
US20030235827A1 (en) * 2002-06-25 2003-12-25 Orchid Biosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring primer extension and polymorphism detection reactions
CN100354298C (zh) * 2002-06-28 2007-12-12 兰华生物科技公司 使用单核苷酸多态性组分析受损样品的方法和组合物
US7238476B2 (en) * 2002-08-02 2007-07-03 Orchid Cellmark, Inc. Methods and compositions for genotyping
US7192700B2 (en) * 2002-12-20 2007-03-20 Orchid Cellmark Inc. Methods and compositions for conducting primer extension and polymorphism detection reactions
US20040259105A1 (en) * 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
WO2004065000A1 (en) * 2003-01-21 2004-08-05 Illumina Inc. Chemical reaction monitor
US6943768B2 (en) 2003-02-21 2005-09-13 Xtellus Inc. Thermal control system for liquid crystal cell
EP1737985B1 (de) * 2004-04-07 2015-12-30 Access Bio, Inc. System für den nachweis von nukleinsäuren
FR2869045A1 (fr) * 2004-04-16 2005-10-21 Bioalliance Pharma Sa Methode d'etude de la variabilite genetique et fonctionnelle du vih et kit pour sa mise en oeuvre
EP1792263A2 (de) * 2004-09-02 2007-06-06 Vialogy Corporation Erkennung von interessensereignissen unter verwendung von quantenresonanzinterferometrie
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US7624808B2 (en) * 2006-03-13 2009-12-01 Western Well Tool, Inc. Expandable ramp gripper
US20080274458A1 (en) * 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
EP3584324A1 (de) 2008-11-24 2019-12-25 Sequenom, Inc. Produkte und verfahren zur nukleinsäuresequenzierung
AU2010276236B2 (en) 2009-07-21 2014-03-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for quantitative detection of nucleic acid sequences over an extended dynamic range
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US12221653B2 (en) 2010-05-18 2025-02-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US12152275B2 (en) 2010-05-18 2024-11-26 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
WO2011146632A1 (en) 2010-05-18 2011-11-24 Gene Security Network Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
CN103608466B (zh) 2010-12-22 2020-09-18 纳特拉公司 非侵入性产前亲子鉴定方法
WO2012106385A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 Apprise Bio, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
RU2671980C2 (ru) 2011-02-09 2018-11-08 Натера, Инк. Способы неинвазивного пренатального установления плоидности
EP2882868B1 (de) 2012-08-08 2019-07-31 H. Hoffnabb-La Roche Ag Dynamikbereichssteigerung zur identifikation mehrerer epitope in zellen
US20140100126A1 (en) 2012-08-17 2014-04-10 Natera, Inc. Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data
CA2945962C (en) 2014-04-21 2023-08-29 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
US20180173846A1 (en) 2014-06-05 2018-06-21 Natera, Inc. Systems and Methods for Detection of Aneuploidy
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
EP3106876B1 (de) 2015-06-19 2022-12-07 F. Hoffmann-La Roche AG Feststoffabfallentsorgung
RU2760913C2 (ru) 2016-04-15 2021-12-01 Натера, Инк. Способы выявления рака легкого
WO2018067517A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
GB201618485D0 (en) 2016-11-02 2016-12-14 Ucl Business Plc Method of detecting tumour recurrence
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
US12084720B2 (en) 2017-12-14 2024-09-10 Natera, Inc. Assessing graft suitability for transplantation
US12024738B2 (en) 2018-04-14 2024-07-02 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring
US12234509B2 (en) 2018-07-03 2025-02-25 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
US12305235B2 (en) 2019-06-06 2025-05-20 Natera, Inc. Methods for detecting immune cell DNA and monitoring immune system

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1323293C (en) * 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5389512A (en) * 1988-10-07 1995-02-14 Hoffman-La Roche Inc. Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction
US5219727A (en) * 1989-08-21 1993-06-15 Hoffmann-Laroche Inc. Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction
US5213961A (en) * 1989-08-31 1993-05-25 Brigham And Women's Hospital Accurate quantitation of RNA and DNA by competetitive polymerase chain reaction
JPH04152899A (ja) * 1990-10-17 1992-05-26 Shionogi & Co Ltd ２段階ｐｃｒ法によるｈｉｖ―１ゲノムの検出法およびオリゴヌクレオチド
CA2065719A1 (en) * 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
DE69213112T2 (de) * 1991-06-20 1997-04-03 Hoffmann La Roche Verbesserte Methoden zur Nukleinsäure-Amplifizierung
AU4248193A (en) * 1992-05-15 1993-12-13 New England Deaconess Hospital Quantitation of viral rna by competitive polymerase chain reaction
US5340728A (en) * 1992-12-09 1994-08-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for amplification of targeted segments of nucleic acid using nested polymerase chain reaction
DE69431510T2 (de) * 1993-07-08 2003-02-27 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Verfahren zur Koamplifikation zweier unterschiedlicher Nukleinsäure-Sequenzen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion

Also Published As

Publication number Publication date
US5858732A (en) 1999-01-12
WO1996036736A3 (en) 1997-04-17
WO1996036736A2 (en) 1996-11-21
CA2221454A1 (en) 1996-11-21
JPH11505126A (ja) 1999-05-18
EP0826069A2 (de) 1998-03-04
EP0826069B1 (de) 2002-04-10
ATE215993T1 (de) 2002-04-15
DE69620596D1 (de) 2002-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69620596T2 (de) Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat-primer-reihen
DE69618460T2 (de) Verfahren zum nachweis von nukleinsäuresequenzen unter verwendung von kompetitiven amplifikation
DE69122457T2 (de) Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotides zur Verwendung bei Einzelprimeramplifikation
DE69028325T2 (de) Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung eines Einzelprimers
DE69528670T2 (de) Nachweis von nukleinsäuren durch nuklease-katalysierte produktbildung
DE69429626T2 (de) Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Chlamydia trachomatis
DE69620903T2 (de) Nachweiss von nukleinsäuren durch bildung von template abhängigen produkt
DE69329641T2 (de) Verfahren zur mehrfachen ligase-kettenreaktion
DE69935314T2 (de) Quantitatitative bestimmung von nucleinsäure-amplifizierungsprodukten
DE69231124T2 (de) Schnelle bestimmungsverfahren für amplifikationsprodukte
DE69936642T2 (de) Verfahren unter verwendung ungleicher primer-konzentrationen zur herstellung von nukleinsäure-amplifikaten
DE69232773T3 (de) Vorrichtung zum Nachweis von Nukleinsäure-Amplifikations-Reaktionen
DE69432419T2 (de) Ein elektrochemiluminescenter nachweis von nukleinsäuren auf basis der selbsttragenden sequenzreplikation
DE69736668T2 (de) Nukleinsaeure vervielfaeltigungsverfahren auf basis der ramifikations-extensions-amplifizierung (ram) und der in vitro transkription
DE69130501T2 (de) Polynukleotid-einfang-assay unter verwendung von in-vitro-amplifikation
DE3885422T2 (de) Verfahren zum Nachweis einer gezielten Nukleinsäure-Sequenz.
DE69829328T2 (de) Strangverdrängungsamplifikation von RNA
DE69018631T2 (de) Zielabhängige synthese einer replizierbaren rns.
DE69219727T2 (de) Nukleinsäure Zielerzeugung
DE69131596T2 (de) Dns-abhängige rns-polymerase-transkripte als reportermoleküle zur signalverstärkung in nukleinsäure-hybridisierungsuntersuchungen
DE60029961T2 (de) Verankerte strangverdrängungs-amplifizierung auf einem elektronisch adressierbaren mikrochip
DE69734576T2 (de) Methode zur vervielfältigung und zum nachweis eines gewünschten nukleinsäurefragments
DE69431510T2 (de) Verfahren zur Koamplifikation zweier unterschiedlicher Nukleinsäure-Sequenzen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion
DE60309817T2 (de) Mehrzweck-Primer und -Sonden für verbesserte Hybridisierungsassays durch Zerstörung von Sekundärstrukturen
DE69836395T2 (de) Primern zum Nachweis von HIV-1

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee