DE69701577T2

DE69701577T2 - Verfahren zum Biomolekularinteraktionsnachweis

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Publication number: DE69701577T2
Application number: DE69701577T
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Valneva Austria GmbH
Priority date: 1997-12-05
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2000-11-23
Anticipated expiration: 2017-12-06
Also published as: EP0922957B1; ATE191276T1; DE69701577D1; EP0922957A1

Description

Die kombinatorische Chemie (vgl. 99), bei welcher eine diverse Bibliothek von im Labor konstruierten Molekülen auf Strukturen gescreent wird, die Eigenschaften aufweisen, an welchen ein Interesse besteht, ist eine relativ neue und potentiell wirkungsvolle Technik, die in drei Hauptgebieten eine nützliche Anwendung verspricht. Erstens kann die kombinatorische Chemie zur Identifizierung von Molekülen mit hochspezifischen adhäsiven oder enzymatischen Aktivitäten, die in der Biomolekularforschung, klinischen Therapie oder Diagnostik nützlich sind, verwendet werden (z. B. 7, 12 und 51). Zweitens, durch Screenen einer Bibliothek auf Moleküle, die spezifisch mit einer bekannten Verbindung, an welcher man sehr interessiert ist, in Wechselwirkung treten, kann die kombinatorische Chemie bei der Identifizierung der nativen Wechselwirkungspartner der bekannten Verbindung behilflich sein (z. B. 138 und 179). Drittens kann die kombinatorische Chemie zur Epitop-Kartierung verwendet werden, wobei sie zur Ermittlung der Oberfläche der strukturellen Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen, an welchen ein Interesse besteht, dient (z. B. 32, 51 und 138).
Es hat sich gezeigt, dass die derzeitige kombinatorische Chemie von Proteinen, wie wirkungsvoll sie auch sein mag, zwei deutliche Einschränkungen aufweist. In vielen Bibliotheken sind die diversen Proteine auf einer Plattform präsentiert, die nicht viel strukturelle Integrität verleiht; infolgedessen können die Proteine zu plastisch sein, um eine stabile Form und gleichbleibende Eigenschaften aufzuweisen. (Dieser Nachteil vieler derzeitiger Protein-Bibliotheken ist in der Literatur veranschaulicht und besprochen (8, 83).) Gleichermaßen wichtig ist, daß der Screening-Vorgang arbeitsintensiv sein kann, und andere Faktoren als jene, dass ein Protein die Eigenschaften aufweist, an welchen man interessiert ist, oft seine Isolierung durch ein Screenen beeinflussen. Dies ist bei den meisten Screens, von welchen in der Literatur berichtet ist, der Fall (z. B. 138, 147 und 170). Eine verwandte Technik, das Zwei-Hybrid-System, erwies sich in den beiden letzteren der oben erwähnten Gebiete als nützlich, nämlich bei Untersuchungen der Wechselwirkung (60, 102, 116) und bei der Epitop-Kartierung (77, 138). Zwei-Hybrid- Systeme setzen jedoch den Arten der Wechselwirkung, die untersucht werden können, sehr strikte Grenzen: beide Wechselwirkungskomponenten müssen Proteine sein, und sie müssen leicht in den Kern transportierbar sein.
Es war ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren der kombinatorischen Polypeptid-Chemie vorzusehen, mit welchem viele der Schwierigkeiten, auf die andere Techniken stoßen, gelöst oder umfangen werden. (Der Ausdruck Polypeptid ist hierin so verwendet, dass er Proteine, Glykoproteine und Proteoglykane umfasst.) Bei dieser Erfindung wird eine Bibliothek exogener Polypeptide (d. h. Proteine, Glykoproteine oder Proteoglykane) in einer oder mehreren extrazellulären Domänen eines Außenmembran- Polypeptids, das von einer Zellpopulation exprimiert wird, gezeigt. Selektive Drücke, die von toxischen Agenzien ausgeübt werden, eliminieren jene Zellen, deren exogene Polypeptidsequenzen nicht mit hoher Affinität an eine vorgewählte Zielverbindung binden. So werden von einer Zellpopulation, die eine große Vielfalt exogener Polypeptidsequenzen aufweist, Klone, deren exogene Sequenzen die Zielverbindung binden, ausgewählt und durch Wachstum amplifiziert. Wir verweisen auf das Verfahren der Randomisierung einer extrazellulären Domäne gefolgt von der Selektion auf Klone, die spezifische Eigenschaften als "Prägung" ("imprinting") aufweisen.
Mit dieser Erfindung kann eine große Vielfalt prokaryontischer und eukaryontischer Polypeptide geprägt werden, was jedem der drei oben genannten Anwendungsgebiete dient, nämlich der Schaffung oder Entdeckung von Polypeptidsequenzen mit hoher Affinität für eine vorbestimmte Zielverbindung ("target"), Wechselwirkungsuntersuchungen oder Epitop-Kartierung. Bei höher entwickelten Ausführungsformen der Erfindung können Polypeptide geprägt werden, um die folgenden spezifischen Eigenschaften aufzuweisen: multivalente Bindung an eine vorbestimmte Zielverbindung; hohe Affinität für eine Zielverbindung und geringe Affinität für ein oder mehrere Moleküle, die mit der Zielverbindung eng verwandt sind; inhibitorische Aktivität bei einem biologischen Reaktionsablauf (Antagonismus); exzitatorische Aktivität bei einem biologischen Reaktionsablauf (Agonismus); oder enzymatische Aktivität.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

i. EINLEITUNG

Diese Erfindung ist das Produkt der Konvergenz dreier unterschiedlicher Forschungsgebiete: i. der Untersuchung prokaryontischer und eukaryontischer Zellmembranen und ihrer komplexen Bestandteile; ii. der Untersuchung der Evolution mikrobieller Populationen unter den Selektionsdrücken von Toxinen, Bakteriozinen oder viralen Parasiten; und iii. dem Design und Screenen von kombinatorischen Polypeptid-Bibliotheken. Einen umfassenden Überblick über diese drei Forschungsgebiete zu geben geht über den Rahmen dieses Hintergrunds hinaus. Statt dessen soll der Hintergrund ein fundamentales Verständnis jedes Forschungsgebiets, das dieser Erfindung zu Grunde liegt, geben, wobei auch eine genaue Liste von Literaturstellen geboten wird und spezielle Details und Beispiele behandelt werden, wenn sie mit spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung direkt in Bezug stehen oder daran beteiligt sind.

ii. DIE KOMPLEXEN BESTANDTEILE DER ZELLOBERFLÄCHE

Die Membran, die jede prokaryontische oder eukaryontische Zelle begrenzt, welche hier als Außenmembran bezeichnet ist, präsentiert der extrazellulären Umgebung eine extrem komplexe Oberfläche. Die Komplexität dieser Oberfläche geht großteils auf Proteine, Glykoproteine und der Außenmembran zugeordnete Proteoglykane zurück. Diese Moleküle - welche hier als Außenmembran- Polypeptide bezeichnet werden - weisen einen großen Bereich unterschiedlicher Konformations-, chemischer und elektrischer Eigenschaften auf. Nachdem an anderer Stelle genauer auf sie eingegangen wird (24, 139), werden die Außenmembran-Polypeptide hier in mehrere Struktur-Familien kategorisiert. Die Konformations- und Funktionsunterschiede zwischen diesen Familien sind für diese Erfindung relevant, weil Außenmembran-Polypeptide die Basis-Strukturen bilden, die von unserem Verfahren adaptiert werden, so dass sie spezifische Eigenschaften aufweisen. Außerdem macht sich diese Erfindung oft die intrinsischen Eigenschaften von Außenmembran-Polypeptiden zunutze, indem sie sie so prägt, dass sie Eigenschaften aufweisen oder Funktionen erfüllen, die ihren natürlichen ähnlich sind. Schließlich sollte die hier vorgelegte Darstellung der Struktur-Familien auch ein Profil des breiten Spektrums von Eigenschaften bieten, die Polypeptide an der Zelloberfläche aufweisen, weil es zum Teil dieses Spektrum ist, das die Möglichkeiten dieser Erfindung so umfangreich macht.

a) Bitopische Proteintypen Ia,Ib und II

Einzeln durchtretende transmembrane Polypeptide (vgl. 24, 139 und 153), die von Blobel (17) auch bitopische Polypeptide genannt werden, haben eine intra- und eine extra-zelluläre Domäne und einen Mittelabschnitt, der durch die Membran hindurchgeht. Die terminalen Domänen falten sich zu tertiären Strukturen, während der transmembrane Abschnitt oft eine hydropathische α-Helix bildet, in welcher nicht mehr als 2 der 20 transmembranen Reste ionisch sein können. Singer (153) teilt die bitopischen Polypeptide in die Typen Ia, Ib und II ein (Fig. 1). Die Typen Ia und Ib weisen den Amino-Terminus an der extrazellulären Seite der Außenmembran auf. Was den Typ Ia unterscheidet, ist eine Amino-terminale Signalsequenz, die den Export zur Membran lenkt und vor der endgültigen Membran-Insertion geschnitten wird. Die Polypeptide vom Typ Ia sind allgegenwärtig, und bei Eukaryonten sind sie der vorherrschende Typ. Weil die Transmembransequenz der Polypeptide vom Typ Ia typischerweise dem Carboxyl-Terminus näher liegt, ist die extrazelluläre Domäne oft groß. Folglich sind die Polypeptide vom Typ Ia kompetent für Funktionen mit Hochaffinitäts-Adhäsion oder hoch-spezifischer Bindung an extrazelluläre Zielverbindungen. Unter den Polypeptiden des Typs Ia befinden sich Rezeptoren für Wachstumsfaktoren (46) und für Peptidhormone (56); Immunsystem-Antigen-Erkennungsmoleküle (103, 140); und Moleküle, die für die Zelladhäsion verantwortlich sind (156, 157). Die Neigung zur Adhäsion oder hochspezifischen Bindung machen die Polypeptide des Typs Ia für die Verwendung bei vielen Ausführungsformen dieser Erfindung geeignet.
Die Polypeptide vom Typ Ib haben keine abspaltbare Signalsequenz. Der transmembrane Abschnitt befindet sich typischerweise nahe dem Amino-Terminus, und daher gibt es wenige extrazelluläre Reste (153). Dies macht die Polypeptide vom Typ Ib für komplexe zytoplasmatische Funktionen zweckmäßig, aber schlecht geeignet für die Verwendung bei Ausführungsformen dieser Erfindung.
Die bitopischen Polypeptide vom Typ II sind so ausgerichtet, dass ihr Carboxyl-Terminus an der Außenseite der Membran liegt (Fig. 1). Wie bei den bitopischen Polypeptiden vom Typ Ia ist der Großteil der Moleküle vom Typ II gewöhnlich an der Außenseite der Zelle. Die Polypeptide vom Typ II sind typischerweise Enzyme mit extrazellulären aktiven Stellen, wie Glykosyltransferasen (107), oder hochspezifischen extrazellulären Rezeptoren, wie dem Asialoglykoproteinrezeptor (151). Die Kompetenz für extrazelluläre enzymatische oder Rezeptor-Aktivität macht die bitopischen Polypeptide vom Typ II für die Verwendung bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung geeignet.
b) Polytopisches Polypeptid vom Typ III und β-Fässer ("β- Barrels")
Mehrfach durchtretende transmembrane Polypeptide (vgl. 24, 139 und 153), die auch polytopische Polypeptide (17) genannt werden, durchqueren die Lipid-Doppelschicht in zwei bis fünfzehn oder mehr Durchtritten. Wie Faden, der in Stoff genäht wird, beginnt das Polypeptid an einer Seite der Membran, tritt durch sie hindurch, schlingt in den Raum an der anderen Seite der Membran, durchquert dann wiederum die Membran, um entweder sein Ende freizulegen, oder noch eine Schlinge ("loop") zu bilden, was zu mehreren transmembranen Durchtritten führt (Fig. 1). Obwohl sie hier als "eine Schlinge" ("loop") bezeichnet und oft als solche veranschaulicht ist, weist jeder freiliegende Bereich eines mehrfach durchtretenden Polypeptids nicht nur eine unike Aminosäuresequenz auf, sondern auch eine unterschiedliche tertiäre Struktur. Wie transmembrane Polypeptide mit einfachem Durchtritt sind solche mit mehrfachem Durchtritt in der Lipid- Doppelschicht durch die Hydrophobität der transmembranen Stränge suspendiert. Bei mehrfach durchtretenden Polypeptiden sind diese Stränge jedoch nicht beständig zu α-Helices gedreht, weil sie, wenn mehrere Stränge einander benachbart sind, eine alternative Strategie zur Wasserstoff-Bindung zwischen Peptidbindungen befolgen können: wenn jeder Strang die sekundäre Struktur eines β-Stranges annimmt, können sich diese Stränge zu einem geschlossenen Zylinder zusammenringeln, wobei ermöglicht wird, dass sich Wasserstoffbindungen zwischen den Peptidbindungen an separaten Strängen bilden. Die resultierende tertiäre Struktur wird β-Fass genannt (Fig. 1). Sie ist extrem stabil und kann von der Außenmembran freigesetzt werden, ohne die tertiäre Struktur zu de naturieren. Bei mehreren bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird das extrem stabile, polytopische β-Fass OmpA geprägt, so dass es an verschiedene Zielverbindungen bindet.
Polytopische Polypeptide die die Membran in α-Helix-Konformation durchqueren, fungieren oft als spezifische Rezeptoren für Messenger oder Hormone, wie Hefe-Paarungs- Pheromon (88) und viele andere (129). Diese und andere polytopische α-Helix- Rezeptoren sind von Singer (153) als Polypeptide vom Typ III kategorisiert. Ihre Fähigkeit, Zielmoleküle spezifisch und manchmal multivalent zu binden, macht polytopische α-Helix- Rezeptoren ideal zur Verwendung bei vielen Ausführungsformen dieser Erfindung. Außerdem sind CISTEMs am leichtesten zu konstruieren, wenn die Polypeptide, die zu adaptieren sind, polytopisch sind.

c) Glykolipid-verankerte Polypeptide

Viele prokaryontische und eukaryontische Zelloberflächen- Polypeptide sind an der Lipid-Doppelschicht nicht durch einen hydrophoben transmembranen Strang fixiert, sondern durch einen Glykolipid-Anker (z. B. 180, vgl. 54 und 113) (Fig. 1). Ein Anker besteht aus einem Lipidmolekül, wie Dimyristyl-Glyzerin oder Alkylacyl-Glyzerin, mit einem aus mehreren Resten bestehenden Zuckerkomplex, welcher wiederum kovalent an das Außenmembran- Polypeptid gebunden ist. Bei Eukaryonten steuern zwei Signalelemente eines Proteins die Addition eines Glykolipid-Ankers: eine gut definierte Amino-terminale Signalsequenz, die den Transport in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums ermöglicht, und eine Carboxy-terminale Glykolipid-Additionssequenz, die nicht genau definiert ist, jedoch im Allgemeinen aus einer kurzen, hydrophoben Domäne besteht, die 10-12-Reste Carboxy-terminal zu einem Paar kleiner Reste (125) liegt. Sobald der Glykolipid-Anker am Carboxy-Terminus eines Proteins angehängt ist, kann er selbst die Polypeptid-Insertion in eine Zielregion der Außenmembran leiten (112).
Da ihnen eine intrazelluläre Domäne fehlt, können die Glykolipid-verankerten Außenmembran-Proteine keine zytosolischen oder periplasmatischen Funktionen durchführen. Statt dessen bieten sie einen Schutz vor der extrazellulären Umgebung oder fungieren als Enzyme oder Adhäsine, die ausschließlich extrazelluläre Substrate erkennen. Mindestens sechs Leukozyten-Oberflächen proteine, viele andere eukaryontische Proteine, die zur Immunglobulin-Superfamilie (54) gehören, und das Trypanosom-Glykoprotein mit variabler Oberfläche (das Schutzprotein, das das Trypanosom sequenziell verändert, um eine Entdeckung durch das Wirtsimmunsystem zu vermeiden (113), sind durch Glykolipide verankert. Diese Beispiele veranschaulichen die Charakteristika von Glykolipid-verankerten Proteinen, die für deren Verwendung bei den Ausführungsformen dieser Erfindung wichtig sind: die Kapazität für hoch-spezifische Adhäsion und Plastizität, die eine Variation des verankerten Proteins ermöglicht, ohne ein robustes System für den Export und die Insertion in die Außenmembran zu stören.

d) Glykosylierte Proteine

Unter den eukaryontischen Zellen weist die unterschiedliche Anordnung der Oberflächen-exponierten Proteine noch eine weitere Reihe komplexer Moleküle mit spezifischen Eigenschaften auf, nämlich die Saccharide (Struktur und Funktion, vgl. 61 und 111, Laboranalyse und relevante Techniken vgl. 62). Die Oligosaccharide, welche an Glykoproteinen zu finden sind, bestehen im Allgemeinen aus weniger als 15 Resten. Aufgrund der Unterschiedlichkeit der Reste und kovalenter Bindungen, die eine Anordnung in sowohl verzweigten als auch in linearen Strukturen ermöglichen, weisen Oligosaccharide Tausende unterschiedliche Strukturen auf. Die Polysaccharide integraler Membran-Proteoglykane sind größer als Oligosaccharide und können Dutzende von Resten enthalten.
Das in einem Polypeptid an einer bestimmten Stelle hängende Oligo- oder Polysaccharidmolekül ist nicht eine einfache Funktion der örtlichen Aminosäuresequenz. Dieselbe Polypeptidsequenz erhält unterschiedliche Saccharidketten, wenn sie in verschiedenen Zellen exprimiert wird, und separate Kopien eines Polypeptids, das in einer einzigen Zellart exprimiert wird, können verschiedene Zucker an einer gegebenen Stelle angehängt haben. Weil Zuckerreste sequenziell angehängt werden, und zwar jeder von einem bestimmten Enzym, dem das Protein im Laufe der Prozesse der Translation, Faltung und Export an die Außenmembran ausgesetzt ist, ist die Glykosylierung an einer Stelle größtenteils ein Produkt von Ausmaß und Dauer der Einwirkung jedes Enzyms auf diese Stelle. Die Einwirkung auf eine Stelle wird wiederum von der Art, in welcher ein Protein gefaltet ist, und der Geschwindigkeit, mit welcher es die Schritte von der Translation zur Insertion durchläuft, beeinflusst. Folglich kann die Glykosylierung an einer Stelle durch Änderungen der örtlichen Sequenz oder der Sequenz an anderer Stelle im Polypeptid auf unvorhersehbare Weisen geändert werden (61, 111).
Die Unterschiedlichkeit der Molekularstruktur und die relativ vollständige Einwirkung der extrazellulären Umgebung machen die an Proteinen angehängten Saccharide zu wirksamen Rezeptoren für spezifische Substrate außerhalb der Zelle. Glykoproteine und Proteoglykane sind an der interzellulären Erkennung und Adhäsion beteiligt, die den Spermium-Ei-Wechselwirkungen, der Blutgerinnung und der Entzündung zu Grunde liegen (111, 137). Die Rollen, die sie über die Adhäsion bei diesen wichtigen Prozessen spielen, machen die Glykoproteine und Proteoglykane ideal zur Verwendung bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung.

iii. MECHANISMUS UND VERFAHREN DER MEMBRAN-POLYPEPTID- INSERTION

Es ist für einige Ausführungsformen dieser Erfindung wichtig, dass die Insertion von Polypeptiden in die Außenmembran und die Translokation sezernierter Polypeptide über die Außenmembran vom selben Zellmechanismus durchgeführt werden (153). Bei Eukaryonten haben integrale Membran-Polypeptide, die in das endoplasmatische Retikulum (ER) insertiert sind, dieselben spaltbaren oder nicht-spaltbaren Amino-terminalen Signalsequenzen wie vollständig translozierte Polypeptide. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass die Insertion und Sekretion vom selben zytoplasmatischen Signal-Erkennungsprotein (signal recognition protein, SRP) abhängen, welches sowohl insertierte als auch sezernierte Polypeptide zum SRP-Rezeptor an der ER- Membran transferiert. Auf ähnliche Weise scheint bei Bakterien die Membran-Insertion und -Translokation dieselben Gen-Produkte, nämlich secA und secY, zu erfordern (5, 6, 145). Bei Prokaryonten und Eukaryonten gibt es gleichermaßen viele Beispiele für sezernierte und Membran-gebundene Polypeptid-Isoformen. Oft ist der einzige Unterschied zwischen den Isoformen das Vorliegen eines hydrophoben Abschnitts von Resten oder einer Glykolipid- Befestigungsstelle in der Nähe des Carboxy-Terminus des Membrangebundenen Polypeptids (79, 128).
Das Verfahren der Interkalation Von Polypeptiden des Typs III in die Außenmembran hat auch Folgen, die für diese Erfindung von Bedeutung sind. Der Zellmechanismus, welcher bitopische Polypeptide insertiert und sezernierte transloziert, ist auch für die Interkalation von mehrfach durchtretenden Polypeptiden mit α-Helix in die Außenmembran verantwortlich. Dies geht aus Untersuchungen deutlich hervor, die zeigen, dass i) die Polypeptide vom Typ III manchmal die selben Signalsequenzen wie bitopische und sezernierte Polypeptide aufweisen, und ii) die Membran-Interkalation von Polypeptiden des Typs III die selben Gen-Produkte erfordern wie die Insertion bitopischer Polypeptide. Mehrere experimentelle Wege, einschließlich Genfusion, die nachstehend besprochen wird (III iv.a) zeigten, dass der Zellmechanismus für die Insertion von Polypeptiden in die Außenmembran die meisten Polypeptide vom Typ III interkaliert, indem hydrophile extrazelluläre Schlingen einzeln transloziert werden. Das Polypeptid wird somit als Reihe von einzeln insertierten Segmenten interkaliert (5, 6, 117, 153, 172, 173).

iv. GENTECHNISCHE HERSTELLUNG VON KOMPONENTEN DER AUSSENMEMBRAN

a) Insertion exogener Sequenzen in extrazelluläre Polypeptid-Domänen

Für alle Ausführungsformen dieser Erfindung ist eine topologische Karte der geprägten Polypeptide und eine Technik zur Einführung neuer Sequenzen in bestimmte extrazelluläre Domänen des geprägten Polypeptids notwendig. Beide Erfordernisse werden von Genfusionstechniken erfüllt.
Die meisten der in den vorgehenden Abschnitten (III.ii.a-d) besprochenen Polypeptide wurden unter Verwendung von Genfusionstechniken bereits topologisch kartiert. Bei diesen Untersuchungen wurde das Gen für ein Membran-Polypeptid mit einem Gen verbunden, das für einen "Reporter" codiert, ein Protein, das funktionell nur dann aktiv ist, wenn es sich auf einer bestimmten Seite der Zellmembran befindet. Dieses genetische Konstrukt codierte für ein Hybrid-Polypeptid, bei welchem das Membran-Polypeptid den Reporter-Teil als Insertion inmitten der Sequenz oder als C-terminale Verlängerung trug. Vorausgesetzt, dass der Fremdteil weder das Sortieren des Polypeptids an die entsprechende Membran, noch die Insertion des Polypeptids in die Membran unterbrach, wurde der Reporter auf dieselbe Weise lokalisiert, wie die unmittelbar angrenzende Region des Membran- Polypeptids. Der Ort dieser Region an der Außenseite oder Innenseite der Membran wurde dann aus der Aktivität oder fehlenden Aktivität des Reporters gefolgert. Die Topologie des gesamten Polypeptids wurde aus der Untersuchung der Reporter- Aktivität in einem Satz von Hybrid-Polypeptiden abgeleitet, von welchen jedes den Reporter an einer anderen Stelle in der Sequenz des Membran-Polypeptids trug (ein Überblick und eine Beschreibung dieser Genfusions-Kartierungstechniken findet sich in 21, 22, 23). Diese Vorgangsweise hat nicht nur Topologie- Karten für die meisten der im vorigen Abschnitt beschriebenen Polypeptide geliefert; sie kann auch zur Bestimmung der Topologie jedes Membran-Polypeptids, das noch nicht kartiert wurde, aber ein Anwärter für eine Prägung mittels dieser Erfindung ist, verwendet werden.
Zusätzlich zu einer Topologie-Karte des geprägten Polypeptids erfordert jede Ausführungsform dieser Erfindung auch eine Technik für die Insertion exogener Peptid-Sequenzen in eine oder mehrere extrazelluläre Stelle(n) im geprägten Polypeptid. Alternativ können exogene Peptidsequenzen Abschnitte der extrazellulären Domänen der Membran-Proteine ersetzen, die an der Zelloberfläche freiliegen und somit für eine Zielverbindung zugänglich sind.
Da bei Genfusions-Topologie-Untersuchungen ein Satz von Hybrid-Polypeptiden verwendet wurde, von welchen jedes den Reporter in einer Region trug, deren Ort in Bezug auf die Membran kartiert werden sollte, wurden mehrere Techniken entwickelt, um die Insertion des Reporter-Gens an genau angepeilten Stellen im Membran-Protein-Gen zu ermöglichen. Diese Techniken umfassen die folgenden: i. die Verwendung von Vektoren mit Restriktionsstellen, die an uniken Orten im Membran-Protein-Gen vorkommen (beschrieben in 28, 141); ii. ein Mutagenese-Verfahren mit Oligonukleotid-geleiteter ("directed") Deletion (in 21 beschrieben); und iii. Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (in 22 beschrieben). Jede dieser Techniken kann bei dieser Erfindung verwendet werden, um exogene Sequenzen an einer Zielstelle im geprägten Polypeptid zu insertieren; eine Erweiterung dieser Techniken, die in dieser Erfindung zur Einführung einer neuen Variation in extrazelluläre Domänen verwendet wird, ist nachstehend beschrieben (V.iv.c).
Abgesehen von der Schaffung topologischer Karten und Techniken für die Insertion von exogenen Peptid-Sequenzen zeigten Genfusionsuntersuchungen insgesamt, dass die Einführung einer exogenen Sequenz von Peptiden in eine extrazelluläre Domäne eines Membran-Polypeptids das Zuordnen des Polypeptids zu seiner entsprechenden Membran oder die normale Insertion des Polypeptids in die Membran nicht stört. Diese Fähigkeit der extrazellulären Domänen, Fremd-Oligopeptide aufzunehmen, ist für die Konstruktion kombinatorischer Bibliotheken exogener Oligopeptide in den extrazellulären Domänen von Membran-Polypeptiden von kritischer Bedeutung. Diese Fähigkeit ist daher auch für alle Ausführungsformen dieser Erfindung von kritischer Bedeutung. Sie wurde bei verschiedenen Bakterien-, Hefe- und Säuger-Polypeptiden, einschließlich den folgenden Beispielen, beobachtet.
Es zeigte sich, dass eine extrazelluläre Domäne von lamB, ein Außenmembran-Porin von E. coli (in 38 und 39 gründlich charakterisiert), exogene Polypeptide mit einer Länge von bis zu 165 Aminosäuren annimmt, ohne die normale Zuordnung oder Insertion des Proteins zu stören (28, 38, 39). Fremdsequenzen wurden ebenfalls in extrazelluläre Domänen von E. coli, PhoE (Phosphatbegrenzungs-induzierbare Außenmembran-Pore, in 4 beschrieben) und FhuA (Ferrichrom-Aufnahmerezeptor, in 105 beschrieben), insertiert, und die Insertionen hatten keine Auswirkung auf die Protein-Sortierung oder -Insertion. Im spezifischen Fall von E. coli OmpA, einem der zahlreichsten Polypeptide der Bakterien-Außenmembran (in 14 und 42 sequenziert, Überblick über Struktur und Funktion in 115, 127 und 141), wurden Oligonukleotide, die reich an Restriktions- Endonukleasestellen waren, in das ompA-Gen an Stellen insertiert, die den Protein-Loops II und IV entsprachen, und das veränderte Protein wurde normal exprimiert und präsentiert (76). In der Folge wurden Influenza-Haemagglutinin, beta-Galaktosidase, Maul- und Klauenseuche-Virusprotein 1 (foot and mouth disease viral protein 1, FMDV-VP1), Malaria-Antigene und mehrere andere antigene Polypeptide mit einer Länge von bis zu 56 Aminosäuren erfolgreich in OmpA-Loops III und IV gezeigt (96, 144). Weiters zeigten zwei Linien der Beweisführung, dass diese exogenen Polypeptide stabile, gefaltete Strukturen annahmen. Erstens zeigte sich, dass virale Antigene aufweisende ompA- Fusionsproteine bei Kaninchen eine starke Virus-spezifische Immunantwort hervorrufen (144). Zweitens hydrolysierte Cex- Exoglukanase, die auf einer extrazellulären Domäne von OmpA präsentiert war, Zellulose so wirksam wie herkömmlich immobilisierte Enzyme (70, 71).
Bei Hefe nehmen die extrazellulären Domänen aller, der Argininpermease (87), Uracilpermease (152), ste2-Protein und HMG-CoA-Reduktase (23), exogene Peptidsequenzen an, ohne dass sich eine Störung der normalen Sortierung und Insertion zeigt. Höhere eukaryontische Membran-Polypeptide zeigten auch die Fähigkeit, Fremd-Inserte an extrazellulären Domänen anzunehmen; Wenn ein Polypeptid in eukaryontischen Zellen exprimiert wird, können in Genfusions-Untersuchungen gesonderte Glykosylierungsstellen insertiert werden, damit diese als Reporter fungieren: nur Polypeptid-Domänen an der luminalen Seite des ERs werden glykosylierenden Enzymen ausgesetzt, und die luminalen Domänen werden extrazelluläre Domänen. Gesonderte Glykosylierungsstellen wurden in extramembranöse Bereiche eines Mäusemuskel-Nikotinsäureacetylcholin-Rezeptors insertiert: die insertierten Stellen unterbrachen das normale Sortieren oder die Insertion des Außenmembran-Polypeptids nicht; und Stellen, die in extrazelluläre Rezeptor-Domänen insertiert waren, wurden tatsächlich glykosyliert (41).
Insgesamt tragen die Genfusions-Kartierungstechniken auf viererlei Weise zu dieser Erfindung bei: Erstens wurden diese Techniken weitgehend verwendet, um die Topologie zahlloser Außenmembran-Polypeptide zu bestimmen, von welchen viele im vorherigen Abschnitt (III.ii.a-d) beschrieben sind, und die durch diese Erfindung geprägt werden können. Zweitens können diese Techniken verwendet werden, um topologische Karten für Polypeptide zu schaffen, die noch nicht kartiert worden sind, die jedoch Anwärter für die Prägung durch diese Erfindung sein können. Drittens stellen Genfusionstechniken dieser Erfindung allgemein praktizierte Verfahren zur Insertion von exogenen Peptidsequenzen in eine Zielregion eines Membran-Polypeptids zur Verfügung; die Verwendung dieser Techniken bei der Erfindung sowie die direkte Ausweitung, die die Insertion variabler Sequenzen ermöglicht, sind nachstehend beschrieben (V.iv.b). Viertens zeigten Genfusions-Topologieuntersuchungen, dass die Einführung einer exogenen Sequenz in eine extrazelluläre Domäne vieler kartierter Polypeptide den Export oder die Insertion der Polypeptide in die Membran nicht stört.

b) Änderung der Art der Befestigung

Bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung spielt eine Änderung der Art der Befestigung des Polypeptids an der Außenmembran eine Rolle. Da die Insertion in die Membran und die Translokation über die Membran vom selben Zellmechanismus (III. iii) bewerkstelligt werden, sind sezernierte, transmembrane und Glykolipid-verankerte isomorphe Formen eines einzigen Polypeptids oft untereinander austauschbar. Außerdem können sezernierte und Membran-gebundene isomorphe Formen die selbe Amino- terminale Signalsequenz benützen, und daher ist in vielen Fällen die einzige Änderung, die für eine Umwandlung eines Polypeptids in seine isomorphe Form notwendig ist, eine Veränderung am Carboxy-Terminus des Polypeptids. Die Befestigung einer hydrophoben Sequenz mit 20 Resten am Carboxy-Terminus eines sezernierten Polypeptides reicht oft aus, um ein isomorphes Polypeptid zu konstruieren, das durch einen transmembranen Abschnitt verankert ist; diese Technik zur Überführung eines sezernierten Polypeptids in ein Membran-gebundenes wird ausführlich in der Literatur beschrieben (Beispiele für isomorphe Membran-gebundene und sezernierte Formen von Polypeptiden und Techniken zu ihrer Umwandlung untereinander sind in 79, 128, 142, 149 beschrieben). Alternativ können transmembrane oder sezernierte Polypeptide durch Zugabe von Carboxy-terminalen Signalsequenzen aus den Vorläufern von Glykolipid-verankerten Polypeptiden in Glykolipid-verankerte Varianten übergeführt werden; diese Technik ist ebenfalls in der Literatur beschrieben (Zugabe von Glykolipid- Ankern beschrieben in 36, 37, 53, 164). In einigen Fällen befestigt ein Glykolipid-Anker nicht nur ein exogenes Polypeptid an einer Zellmembran, sondern lenkt auch das Sortieren des verankerten Fremd-Polypeptids (112). In solchen Fällen ist lediglich eine einzige Glykolipid-Ankersequenz nötig, um ein exogenes Polypeptid zur Membran zu lenken, es zu translozieren und zu verankern.

c) Fusion von Membran-Polypeptiden

Bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung werden zwei oder mehrere Außenmembran-Polypeptide fusioniert, um ein chimäres mehrfach durchtretendes Polypeptid zu konstruieren, das extrazelluläre Domänen der beiden Polypeptide aufweist, die dieses bilden. Diese Manipulation wurde bei einer Vielfalt prokaryontischer und eukaryontischer Polypeptide erfolgreich durchgeführt. Beispielsweise wird im chimären E. coli ompF-ompC- Protein 3601 (69) die Region ompF, die die extrazellulären Loops 1 bis 5 aufweist, mit der Region von ompC, die die extrazellulären Loops 6 und 7 aufweist, verschmolzen. Bei Expression in E. coli SM1005 (F&supmin;ΔlacU169rpsLrelAthiAfibBgyrAompCompF) ist dieses chimäre Polypeptid in der Außenmembran korrekt insertiert (69). In einem eindrucksvollen Beispiel für die Konstruktion eukaryontischer chimärer Polypeptide wurden neue transmembrane Polypeptide wie folgt geschaffen. Eine Region des humanen Asialoglykoprotein-Rezeptors H1, welche die transmembrane Domäne des Polypeptids mit umfasste (20 hydrophobe Reste, 40-61 im Wildtyp- Protein), wurde tandemweise zwei, drei oder viermal wiederholt. In jedem Fall wurden die H1-Repeats durch relativ hydrophile Linker, wie das Hexapeptid HRPSLG, verbunden. Diese Konstrukte wurden normal in die Membran insertiert, und luminale Domänen wurden normal glykosyliert (172).
Das allgemeine Prinzip, das oft die Fusion von Außenmembran- Proteinen möglich macht, wurde bereits skizziert: die obige Beschreibung des Prozesses der Membran-Protein-Insertion betont, dass transmembrane α-Helix-Stränge polytopischer Membran-Proteine sequenziell und unabhängig voneinander insertiert werden. Eine Folgerung dieses Mechanismus der Interkalation transmembraner Stränge ist, dass fast jedes chimäre Polypeptid, das aus einer Amino-terminalen Signalsequenz gefolgt von mehrfachen -20 Reste langen hydrophoben Abschnitten, die mit Abschnitten hydrophilerer Reste abwechseln, konstruiert ist, normal insertiert werden kann, vorausgesetzt, dass jeder hydrophobe Abschnitt unabhängig voneinander in der Membran stabil ist (172).

v. Toxische Mittel

Viele der Polypeptide der Außenmembran sind Adhäsionsstellen für eine Reihe toxischer Agenzien, insbesondere pathogene Agenzien, die die Zellen, in die sie eindringen, töten oder ihre Vermehrung verzögern. Die folgenden Abschnitte geben einen Überblick über die Erfordernisse für eine Adhäsion und die Art der pathogenen Wirkung von drei unterschiedlichen Kategorien toxischer Agenzien. Erstens sollten jedoch drei allgemeine Konzepte eingeführt werden: die Adhäsionsdomäne; Resistenz; und Immunität. Diese Konzepte sind wichtig um zu verstehen, wie diese Erfindung seltene Zellen, die spezifische Polypeptide aufweisen, aus einer hoch-variablen Zellpopulation selektiert. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "toxisches Agens" jegliches Agens, das das Wachstum von Zellen schädigt oder hemmt, insbesondere ein pathogenes Agens.
Viele toxische Agenzien erkennen eine bestimmte Region (die Adhäsionsdomäne) eines bestimmten Polypeptids (des Rezeptors) an der Oberfläche einer bestimmte Zellart (des Wirts). Die Bindung durch das Agens an die Adhäsionsdomäne ist der erste Schritt in einem Prozess, der in der Zelllyse oder in der Hemmung des Zellwachstums und der Vermehrung gipfelt. Wenn dieser erste Schritt durch Mutationen in der Adhäsionsdomäne durch eine Repression des Rezeptors oder durch Störung eines Inhibitors, der die Adhäsionsdomäne okkludiert, behindert wird, wird die Invasion eines toxischen Agens in die Zelle blockiert. Wenn alle der möglichen Rezeptormoleküle eines Agens auf einer Zelle aus welchem Grund auch immer für das Eintreten eines Agens unzugänglich oder funktionsuntüchtig sind, wird die Zelle immun gemacht. Wenn einige, jedoch nicht alle Rezeptoren unzugänglich oder funktionsuntüchtig sind, kann die Zelle resistent, aber nicht immun werden: die Verringerung der Anzahl der Rezeptoren kann das Eindringen von Agenzien verlangsamen und somit die Schnelligkeit oder Intensität der schädlichen Wirkungen des Agens verringern.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung kann ein toxisches, insbesondere ein pathogenes Agens verwendet werden, welches so verändert wurde, dass es sich vom entsprechenden natürlich vorkommenden Agens hinsichtlich der Spezifität und der Wirkungsweise auf die Zelle unterscheidet. Beispielsweise können pathogene Agenzien, wie Bakteriozine und Bakteriophagen, so verändert werden, dass sie ihre Präferenz für eine spezifische Adhäsionsdomäne ändern. Somit ist es möglich, Strategien zu entwickeln, die Pathogene veranlassen, an einer großen Vielfalt von Adhäsionsdomänen anzuhaften.

a) Bakteriozine

Bakteriozine sind bakteriell erzeugte Proteine, die für die Stämme, von welchen sie exprimiert und sezerniert werden, harmlos, aber für andere, oft nahe verwandte Bakterien tödlich sind (ein Überblick über Bakteriozine findet sich in 106 und 135). Die am ausführlichsten untersuchten Bakteriozine sind die Colicine, die von E. coli exprimiert werden, und von Plasmiden codiert werden, welche auch für jene Proteine codieren, die den Colicin-erzeugenden Zellen eine Colicin-Immunität verleihen. Die Colicine bestehen aus drei Struktur-Domänen, von welchen jede für einen von drei aufeinanderfolgenden Schritten der Colicin- Aktivität verantwortlich ist: i. Erkennung einer Adhäsionsdomäne; ii. Translokation über die Zellmembran; und iii. Zellzerstörung (13, 135).
Die Colicine töten durch zwei Hauptmechanismen: i. die Bildung einer Pore in der zytoplasmatischen Membran, die zu einer Membran-Permeabilisierung und Energieabbau führt (Colicine E1, A, B, Ia, Ib und K); ii. enzymatische Spaltung der DNA oder 16S- ribosomalen RNA (Colicine E2 und E3) (106, 135). Die Kinetik des Zelltodes, wenn Bakterien Colicinen ausgesetzt werden, läßt darauf schließen, dass die toxischen Moleküle in die Zelle in diskreten, tödlichen Dosen eindringen, die lediglich ein einziges Molekül umfassen können oder auch aus einer Anzahl aktiver Moleküle bestehen können, die in einem konzertierten Schritt importiert werden (135). Der wichtige Punkt hier ist, dass eine Dosis die einzelne Zelle tötet.
Fast jedes größere Außenmembran-Protein von E. coli ist der Rezeptor für mindestens ein Colicin. Wenn mehrere Colicine einen einzigen Rezeptor erkennen, können ihre Adhäsionsdomänen einander teilweise überlappen. Zwei Colicine, die an OmpF anhaften, einem Haupt-Außenmembran-Porin, liefern ein Beispiel. Wie in Fig. 2 veranschaulicht, weist OmpF sieben extra-zelluläre Loops, L1 bis L7, auf, wobei L1 Amino-proximal und L7 Carboxy-proximal vorliegt. Die Adhäsionsdomäne von Colicin N umfaßt L1, L3, L4, L5 und L6, jedoch nicht L2 oder L7. Somit resultieren Änderungen in der Peptidsequenz von L1 in der vollständigen Immunität gegenüber Colicin N, wogegen Änderungen in L2 nicht einmal eine leichte Resistenz verleihen. Die Adhäsionsdomäne von Colicin A, einem anderen Colicin, das ompF erkennt, ist etwas unterschiedlich. Die Loops 1 bis 5 sind für Colicin A erforderlich, damit es seinen Rezeptor bindet, wogegen L6 und L7 überflüssig sind (69). Das chimäre ompF-ompC-Protein 3601, welches oben beschrieben wurde (III.iv.c), umfasst Loops 1-5 aus ompF und Loops 6 und 7 aus dem bestimmten ompC. Erwartungsgemäß sind E. coli SM1005, die 3601 exprimieren, für Colicin A vollständig empfänglich, jedoch gegen Colicin N vollständig immun.
Die Anzahl der Rezeptoren pro Zelle ist für die erfindungsgemäße Selektion spezifischer Zellen aus einer sehr variablen Population wichtig. Die funktionellen Rezeptoren von Colicinen sind allgemein auf der Oberfläche der Zelle zu Tausenden von Kopien vorhanden. Es ist jedoch für das Funktionieren dieser Erfindung wichtig, dass die Expressionsmenge der meisten Rezeptoren leicht manipulierbar ist; das für den Rezeptor codierende Gen wurde bereits in ein Plasmid mit einem induzierbaren heterologen Promotor kloniert oder kann leicht in diesen kloniert werden, was eine externe Regulierung der Expression ermöglicht. Protokolle für die Konstruktion und Manipulation von Plasmiden mit induzierbaren Promotoren, die eine Regulierung der Expression ermöglichen, sind in der Literatur beschrieben (74, 76, 29, 146).

b) Bakteriophagen

Bakteriophagen sind eine allgegenwärtige und außerordentlich diverse Gruppe viraler Parasiten von Bakterien. Es gibt zwölf Phagenfamilien, die 3500 verschiedene Isolate bekannter Morphologie umfassen und über 100 bakterielle Genera infizieren. Ihre große Vielfalt ist selbst auf Nukleinsäure-Ebene offensichtlich: je nach der Spezies, enthalten Phagen Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, Einzelstrang-RNA oder Doppelstrang-RNA. Ein weites Spektrum von Morphologien wird üblicherweise in vier Kategorien unterteilt: mit Schwanz; kubisch, filamentös und pleomorph. Umfassende Überblicke über die Morphologie, Genetik, Ökologie und den Lebenszyklus sind in der Literatur zu finden (3, 34).
Sehr ähnlich den Bakteriozinen binden Phagen an spezifische Adhäsionsdomänen von Rezeptoren an der Wirts-Oberfläche. Ein einziges Außenmembran-Protein kann der Rezeptor für mehrere Phagen-Spezies sein, deren Adhäsionsdomänen in unterschiedlichem Ausmaß einander überlappen. Fig. 3 zeigt die Adhäsionsdomänen verschiedener Phagen sowie eines der Colicine, die Außenmembran- Protein A von E. coli als ihren Rezeptor benützen. Die Figur zeigt auch die Rezeptor-Domänen, die offensichtlich nicht von den Phagen benützt werden: Änderungen an diesen Regionen des Rezeptors haben keinen Einfluss auf Phagen-Adsorption und verleihen somit der bakteriellen Zelle keine Phagen-Resistenz. Phagenrezeptoren, wie jene der Bakteriozine, sind oft in Hunderten bis Tausenden von Kopien pro Zelle vorhanden, doch kann diese Zahl durch die Verwendung eines Plasmid-codierten Rezeptors, der durch einen induzierbaren heterologen Promotor reguliert wird, manipuliert werden. Wie oben betont wurde, ist die Regulierung der Expressionsmenge des geprägten Polypeptids für diese Erfindung wichtig. Protokolle für die Konstruktion und Manipulation von Plasmiden mit induzierbaren Promotoren sind in der Literatur beschrieben (74, 76, 29, 146).
Nach der Bindung an den Rezeptor dringt die virale Nukleinsäure in den bakteriellen Wirt ein und die Phagenvermehrung beginnt. Die Strategien für die Vermehrung und die Auswirkungen der Vermehrung auf den Wirt sind über die Phagen-Spezies sehr verschieden. Unmittelbar nach der Infektion verleihen einige, jedoch nicht alle Phagen-Spezies eine Immunität gegenüber nachfolgenden Infektionen durch andere Individuen der selben Phagen- Spezies. Wenn der infizierende Phage ein virulenter ist, modifiziert er rasch normale bakterielle Synthesen, um sie seiner eigenen Vermehrung zuzuteilen und sie in den extrazellulären Raum freizusetzen. Bestimmte Strategien für die Freisetzung haben unterschiedliche Auswirkungen auf den Wirt. Die Inoviridae (eine Familie filamentöser Phagen) werden durch Extrusion freigesetzt: neue Phagen werden durch die Bakterienmembran sezerniert (122). Obgleich dieser Prozess für das Bakterium nicht tödlich ist, ist er stoffwechselmäßig belastend, und daher teilen sich infizierte Bakterien langsamer als nicht infizierte Bakterien (30). Die Übertragung erfolgt auch vertikal, da Tochterzellen die Infektion von ihren Stammzellen erben. Eine Strategie zur Freisetzung ähnlich der Extrusion zeigen die Plasmaviridae (eine Familie pleomorpher Phagen). Diese Phagen, die nur aus einem Doppelstrang-DNA-Molekül, umgeben von einer Lipoprotein-Hülle bestehen, werden vom Wirt durch Knospung aus der Zellmembran freigesetzt. Wiederum ist der Prozess nicht tödlich, verzögert aber die Vermehrung. Dagegen zerstört Lyse, ein Mittel zur Freisetzung mit Schwanz versehener und kubischer Phagen, den Wirt. Nachdem die intrazellulären Phagen sich auf Zahlen von 20-1000 vermehrt haben, schwächen sie die Bakterienzelle von innen her und bewirken, dass sie zerplatzt und die infektiösen Partikel freisetzt.
Die Bakteriophagen haben ein breites Wirkungsspektrum auf ihre Wirte, so dass selbst unter Phagen-Spezies, die denselben Rezeptor benützen, mehrere verschiedene Infektionsfolgen auftreten können. Außerdem können die Auswirkungen eines Phagen auf seinen Wirt manipuliert werden. Mutagenese, gefolgt von künstlicher Selektion auf Phagen-Virulenz oder -Benevolenz, kann die nachteilige Wirkung eines Phagen auf seinen Wirt verstärken oder abschwächen (31). Die Insertion oder Deletion von Phagen-Genen, einschließlich der Insertion von Genen, die infizierten Bakterien metabolische Fähigkeiten oder Antibiotika-Resistenz verleihen, sind allgemein praktizierte Mittel zur Manipulation der Auswirkung, die Phagen auf ihre bakteriellen Wirte haben. Ein anderer Weg, die Auswirkungen eines Phagen auf seinen Wirt zu modifizieren, ist, den Wirt zu ändern. Beispielsweise erzeugen bestimmte groEL-Mutationen in E. coli Bakterienstämme, die für T4, T5, lambda und 186-Phagen-Infektion empfänglich sind, jedoch den intrazellulären Zusammenbau reifer Phagenpartikel (177) nicht gestatten. Somit werden infizierte Bakterien retardiert oder sogar getötet, aber sie ergeben keine infektiösen Phagenpartikel; kurz gesagt, für die Phagen, durch die sie infiziert werden, sind diese Bakterien eine Einbahnstraße. Schließlich können die Auswirkungen des Phagen auf ihre Wirte durch die Herstellung von Geister-Phagen ("phage ghosts") (Phagen, welchen DNA fehlt) durch in der Literatur beschriebene Verfahren modifiziert werden (20, 174). Da sie kein Genom tragen, infizieren Geister-Phagen Zellen nicht. Sie haften jedoch an Zellen, durchstechen die zytoplasmatische Membran und bilden Ionenkanäle, die normalerweise zum Transport der Phagen-Genome dienen würden. Während normale Phagen diese Kanäle hinter sich schließen, lassen Geister-Phagen die Kanäle auf unbegrenzte Zeit offen. Die Geschwindigkeit des Ionenausflusses durch diese Kanäle steht in linearem Bezug zur Anzahl der Geister, die an die Zelle binden; allmählich depolarisiert der Ausfluss die Zelle, welche schließ lich stirbt.

c) Toxine und Viren eukaryontischer Zellen

Diese toxischen, insbesondere pathogenen Agenzien erkennen spezifische Adhäsionsdomänen ihrer Rezeptoren an eukaryontischen Zelloberflächen. Die Rezeptoren von mindestens dreißig verschiedenen Virus-Spezies eukaryontischer Zelllinien, die elf verschiedene Virus-Familien darstellen, sind in der Literatur beschrieben, und für die meisten dieser Pathogene wurden die Virus-Adhäsionsdomänen, die Oligosaccharide, glykosylierte Peptid- Sequenzen oder Sequenzen ohne Zucker umfassen können, charakterisiert (165). Die Rezeptoren eukaryontischer pathogener Agenzien werden, wie jene der Bakteriozine und Bakteriophagen, im Allgemeinen auf Vektoren kloniert und aus induzierbaren Promotoren exprimiert, was eine Manipulation der Anzahl an Rezeptoren, die pro Zelle exprimiert werden, ermöglicht (159, 146, 120, 67).
Eine große Gruppe humaner Rhinoviren ("human rhinoviruses", HRVs) sind ein Beispiel für pathogene Agenzien, die eukaryontische Zellen beeinflussen, und sie sind zur Verwendung bei dieser Erfindung geeignet. HRVs sind Mitglieder der Picornaviridae, kleiner, Protein-umhüllter Viren mit RNA-Genomen. Von 100 Serotypen des Rhinovirus, benützen 89 ein extrem gut charakterisiertes Glykoprotein, ICAM-1 (CD-54) als ihren Rezeptor (158, 52). HRV-Serotyp 14 ist gründlich untersucht, leicht im Labor vermehrbar und daher zur Verwendung bei dieser Erfindung geeignet (159, 52). Eine große Gruppe von HRVs wächst wirksam in vielen verschiedenen Human-Zellkulturlinien. Die am meisten verwendeten Gewebe sind diploide WI-38-Fibroblasten-, fötale Mandel-, MRC, HeLa- und COS-Zelllinien. Optimale Bedingungen und Protokolle für das Wachstum sind in der Literatur beschrieben (52). HRVs bilden Plaques auf Monoschichten einer Vielfalt von Zelllinien, die mittels einer der beschriebenen Techniken zur Einwirkung viraler Mittel diesen ausgesetzt werden. Infizierte Zellen ergeben nach 10 bis 12 Stunden Inkubation 10 bis 200 Plaque- bildende Einheiten pro Zelle (52).
Die Struktur von HRV14 wurde mittels Röntgen-Kristallographie (143) ermittelt. Das Capsid ist 30 nm im Durchmesser, weist eine ikosaedrische Symmetrie und einen Canyon, 120-300 nm (12-30Å) breit und 250 nm (25Å) tief, auf, welcher entlang der 5-fachen Achse verläuft und die Rezeptor-Bindungsstelle des Pathogens enthält. Der Rezeptor ist das genau charakterisierte Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, ICAM-1 (CD-54), ein 19 nm · 2-3 nm-Stab mit 532 Resten und 5 Immunglobulin-artigen Domänen, die entlang einer Linie angeordnet sind mit einer Verbindung zwischen den Domänen 2 und 3 (Fig. 4). Bei der Virus- Bindung spielt die Insertion der distalen Immunglobulin-Domäne (D1) in den Virus-Canyon eine Rolle. Diese Art der Wechselwirkung ist extrem anfällig für Störungen durch sterische Hemmung (159). So hemmt, obwohl die unteren drei Immunglobulin-artigen Domänen (D3-D5) nicht direkt an der Virusbindung beteiligt sind und Mutationen in diesen die Adhäsion nicht stören, ihre vollständige Deletion sehr wohl die Adhäsion, durch Verringerung der Zugänglichkeit von D1.
ICAM-1 trägt mehrere N-gebundene Oligosaccharide, und eine Variation in der Glykosylierung zwischen Zelltypen führt zur Heterogenität der Molekularmasse von ICAM-1 von 76 bis 114 kD. Es fungiert als Zelloberflächen-Ligand für Lymphozytenfunktion- assoziiertes Antigen 1 (LFA-1) und die Bindung zwischen ICAM-1 und LFA-1 trägt zur Leukozytenadhäsion bei mehreren immunologischen und entzündlichen Prozessen bei (50). Cytokine, die von T-Lymphozyten und Monozyten sezerniert werden, einschließlich IFN-γ, TNF-α und β und IL-α und β, induzieren die Expression von 3,5 · 10&sup6; Kopien pro Endothel-Zelle. Nichtinduzierte Zellen weisen jedoch viel geringere Mengen an ICAM-1 auf, und im CDM8- Expressionssystem kann ICAM-1 durch Steuerung eines induzierbaren Promotors (148, 159) exogen reguliert werden, was für die Funktion dieser Erfindung wichtig ist.

vi. Kombinatorische Chemie

Die kombinatorische Chemie besteht aus zwei oder drei Schritten, die oft in Wiederholungszyklen durchgeführt werden. Der erste Schritt ist die Erzeugung einer diversen Population von Molekülen, die sogenannte kombinatorische Bibliothek. Im zweiten Schritt werden die Moleküle in der kombinatorischen Bibliothek gemäß der von den Forschern gesuchten Eigenschaften, die sie aufweisen, unterteilt, wie Affinität für eine bestimmte Verbindung oder enzymatische Aktivität. In einem dritten Schritt, der bei einigen, jedoch nicht allen Ausführungsformen der kombinatorischen Chemie durchgeführt wird, werden die Moleküle, von welchen sich zeigt, dass sie die gewünschten Eigen schaften aufweisen, repliziert oder re-synthetisiert. Der Zyklus kann dann wiederholt werden, beginnend entweder mit dem ersten Schritt, mit der Einführung einer neuen Variation in die Molekülpopulation, oder mit dem zweiten Schritt, mit der Unterteilung der Population gemäß den gewünschten Eigenschaften, die sie aufweisen. Wenn ein kombinatorischer Weg erfolgreich ist, ergibt der Zyklus der Erzeugung molekularer Vielfalt, des Abbaus der Vielfalt zu Gunsten der wenigen Moleküle, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen, und in einigen Fällen, der Erhöhung der Anzahl der Moleküle zuletzt Moleküle, die die gewünschten spezifischen Wirkungen aufweisen.
Das Immunsystem ist im wesentlichen eine genetisch codierte kombinatorische Bibliothek, mit allen Schritten der Variation, Selektion und Replikation: Eine große Vielfalt an Antikörpern ist an der Oberfläche der B-Zellen gezeigt (Variation), und das spezifische Erkennen des Antigens durch irgendeine bestimmte Zelle löst die Vermehrung dieser Zelle aus (Teilung und Replikation). Es ist somit nicht überraschend, dass die ersten in vitro genetisch-codierten kombinatorischen Bibliotheken direkt vom Immunsystem abgeleitet sind: B-Zellen wurden durch Hybridisierung mit Maus-Myelom-Linien (175) immortalisiert. Später wurden, um die Schwierigkeiten der Hybridisierung zu umgehen und um einen größeren Teil des Antikörper-Repertoirs zu verwenden, E. coli so verändert, dass sie die variablen Ketten von Antikörpern exprimieren und sezernieren (98). Da jedoch sezernierte Antikörper nicht markiert ("untagged") waren (99), d. h. nicht physisch mit ihren genetischen Codes verbunden waren, mussten Screens auf Antikörper, die Antigen gebunden hatten, gemäß der Techniken durchgeführt werden, die es Forschern ermöglichten, die Spur von jedem ausgewählten Antikörper zu dem Gen, das für ihn codiert hat, zu verfolgen. Dies schränkte die Anzahl der Klone, für die ein Screenen machbar war, sehr ein (7, 98). Mit der Ankunft der Phagen-Display- oder "Fusions-Phagen"-Bibliotheken wurde es möglich, variable Proteine, die eine Markierung ("tag") hatten (99) und somit für eine unmittelbare Replikation kompetent waren, zu screenen.
Kombinatorische Bibliotheken von Fusions-Phagen (134, 147) sind aus filamentösen Bakteriophagen oder Phagemid zusammengesetzt, die so verändert wurden, so dass sie semi-randomisierte exogene Proteine als Sandwich-Fusionen nahe dem Ende des Adsorptionsproteins pIII tragen. Das Verfahren des Screenens dieser Bibliotheken auf Phagen, die eine Affinität für eine Zielverbindung aufweisen, ist als "Affinitätsreinigung" bekannt: die Zielverbindung wird auf einer festen Oberfläche oder Säule immobilisiert, über welche die Phagenbibliothek gewaschen wird; an die Zielverbindung gebundene Phagen werden eluiert, durch Züchtung in einer Bakterienkultur amplifiziert und danach noch einer weiteren Runde der Teilung unterzogen. Dieser Zyklus wird üblicherweise wiederholt, bis eine annehmbare Anzahl von Klonen isoliert ist. Phagenbibliotheken wurden sowohl für die Epitop- Kartierung (51, 138) verwendet, d. h. das Herausfinden jener Region eines größeren Proteins, die an der Bindung einer Zielverbindung, an der ein Interesse besteht, beteiligt ist, als auch für die Beschaffung neuer Liganden für Zielverbindungen. Ganze Einzelketten-Antikörper mit variierbaren Fragmenten ("single-chain variable-fragment antibodies", scFv's) wurden in Phagemid pIII insertiert (118), und Bibliotheken von scFv's oder semi-randomisierten Oligopeptiden wurden auf die Bindung an eine Vielfalt medizinisch wichtiger Polypeptide (8, 12), Nukleinsäuren (33) und Moleküle, von welchen vorher nicht bekannt war, dass sie an Proteine binden (58), gescreent.
Während jedoch die Fusionsphagentechnologie für große Fortschritte in der kombinatorischen Chemie verantwortlich war, wie die Erkenntnis, dass markierte ("tagged") Bibliotheken ein Screenen einer sehr viel größeren Anzahl von Sequenzen ermöglichen würde, waren für die Phagenbibliotheken selbst jedoch einige hartnäckige Schwierigkeiten unausweichlich. Erstens tragen bei der Affinitätsreinigung von Phagenbibliotheken beben der Affinität für die Zielverbindung andere Faktoren wesentlich zur Selektion jedes Klons bei. Beispielsweise kann die Sammlung von Klonen, die aus einer einzigen Bibliothek durch Affinitätsreinigung selektiert werden, drastisch variieren, je nachdem, welche Technik zur Elution von Phagen aus dem festen Substrat der Zielverbindung (170) verwendet wird. Zweitens kann es sein, dass das Phagenadsorptionsprotein, pIII, keine dargebotenen Proteine mit einer genügend stabilen Plattform liefert. Viele Polypeptide erhalten nur in bestimmten zwingenden Konformationen eine strukturelle Starrheit; andernfalls bleiben sie extrem plastisch (24, 83). Daher ist für viele Polypeptide eine andere Basis als pIII notwendig, damit sie funktionell aktive Strukturen sind (z. B. vgl. 7, 8).
Eine vielversprechende Lösung für Probleme mit der Plattform für die Darbietung von Polypeptiden wurde eingeführt, als eine kombinatorische Bibliothek von Proteinen in einer extrazellulären "loop" eines Bakterien-Außenmembranproteins gezeigt wurde (25). Um diese Bibliothek zu konstruieren, wurden zwischen 1 und 20 semi-randomisierte Oligonukleotide, jedes mit einer Länge von 33 Basen, in die genetische Stelle insertiert, die für eine extrazelluläre "loop" des Außenmembranporins LamB codiert. Wie viele Membranproteine, die Gegenstand von topologischen (21-23) und Antigen-Präsentations-(96, 144)-Untersuchungen waren (III.iv.a), interkaliert LamB die Außenmembran, selbst wenn exogene Polypeptidsequenzen in eine oder mehrere der extrazellulären Domänen des Proteins insertiert wurden (35, 36). Somit exprimiert, wenn lamB-Gene, die Insertionen tragen, zur Transformation von E, coli verwendet wurden, jede Transformante LamB, in welchem eine extrazelluläre Domäne ein semi-randomisiertes exogenes Oligopeptid mit einer Länge von 11 bis 220 Aminosäuren aufwies.
Um die Bibliothek auf Proteine zu screenen, die eine Affinität für die Zielverbindung, Eisenoxid, aufwies, wurde die E. coli-Population in eine Suspension von Eisenoxidteilchen gegeben, eine Bindung wurde stattfinden gelassen, und ein Magnet wurde verwendet, um Bakterien, die am Metall hafteten, zu gewinnen. Der selektierte Teil der Population wurde durch Bakterienwachstum amplifiziert, und der Teilungsprozess wurde wiederholt. Nach vier Zyklen der Selektion und Amplifikation wurde eine neue Variation gemäß einer Strategie eingeführt, die eine bisher angesammelte Sequenz-Information nicht auslöschen würde (vgl. (25) hinsichtlich einer detaillierten Beschreibung dieses Verfahrens der halbkonservativen Einführung einer Sequenzvariation). Weitere vier Zyklen der Selektion und Amplifikation ergaben dann vier Klone, von welchen drei eine Consensus-Sequenz zur Bindung von Eisenoxid trugen.
Während die kombinatorische Bibliothek in LamB die vielversprechende Möglichkeit der Verwendung von Bakterien-Außenmem branproteinen als Plattformen zur Präsentation von Bibliotheken diverser Polypeptide einführte, war der Selektionsprozess, der für die Bibliothek verwendet wurde, arbeitsintensiv und in seiner Anwendbarkeit sehr beschränkt. Die Zielverbindung, Eisenoxid, wurde praktischerweise ausgewählt, um ein Screenen auf Magnetismus zu ermöglichen, eine Vorgangsweise, die nicht für das Screenen auf eine Mehrzahl der interessanten Wechselwirkungen, die Polypeptide aufweisen, verwendet werden konnte. Die vorliegende Erfindung bietet eine Benützer- freundliche, effiziente und präzise Selektionsmethode, mit der kombinatorische Bibliotheken von Proteinen, Glykoproteinen oder Proteoglykanen, die auf der stabilen Plattform eines Außenmembran-Polypeptides präsentiert werden, gescreent werden können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung sieht ein Verfahren zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen einem (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, und einer Zielverbindung vor, welche Wechselwirkung u. a. spezifische, vorgeschriebene Eigenschaften des (Poly)peptids, an dem Interesse besteht, widerspiegelt, wie Affinität des (Poly)peptids für eine vorbestimmte Zielverbindung, enzymatische Aktivität, oder die Hemmung eines biologisch aktiven Moleküls. Bei dieser Wechselwirkung ist mindestens einer der Wechselwirkungspartner unbekannt. Das Verfahren ermöglicht die Indentifizierung des unbekannten Wechselwirkungspartners, d. h. eines (Poly)peptids, an dem Interesse besteht, und/oder der Zielverbindung. Bei einigen Ausführungsformen können beide Wechselwirkungspartner unbekannt sein, z. B. wenn ein unbekannter Ligand nach Bindung an eine Rezeptorstelle eine bestimmte Wirkung auf die Zelle, in die man eingreifen muss, ausübt und sowohl der Ligand als auch die Rezeptordomäne, an die er bindet, identifiziert werden müssen. (Die Wörter "identifizieren" und "Identifizierung" werden hier wie auch im Rest der Beschreibung verwendet, um sowohl die Entdeckung von (Poly)peptiden, an welchen ein Interesse besteht, die in der Natur vorkommen, als auch das Design von nicht natürlich vorkommenden Polypeptiden zu bezeich nen.) Ausführungsformen dieser Erfindung werden CISTEMs genannt, eine Abkürzung für "Cellular Imprinting by Selection: Teleological Evolution of Molecules" (Zellprägung durch Selektion: teleologische Evolution von Molekülen). Ein CISTEM übt auf eine Population gentechnisch hergestellter Zellen einen selektiven Druck aus, um die Häufigkeit der Zellen, in welchen ein Außenmembran-Polypeptid vorgeschriebene Eigenschaften aufweist, zu amplifizieren. Dieses Verfahren wird "Prägung" ("imprinting") des Polypeptids genannt. Das Spektrum an Polypeptiden, die mit dieser Erfindung geprägt, werden können, ist breit und umfasst Proteine, Glykoproteine und Proteoglykane, die in vielerlei Größen, auf einer mannigfaltigen Anordnung von zu Grunde liegenden Strukturen und von jeder einzelnen von mehreren prokaryontischen oder eukaryontischen Zellkulturen präsentiert werden (Fig. 1, III.ii).
Die Erfindung ist auf ein Verfahren zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen einem (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, und einer Zielverbindung gerichtet, wobei mindestens einer der Wechselwirkungspartner unbekannt ist, mit den Schritten:
a) Herstellen einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zellpopulation, die so hergestellt wird, dass sie ein Membran-Polypeptid exprimiert, welches das (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, in seiner extrazellulären Domäne aufweist, wobei die extrazelluläre Domäne in einer oder mehreren Kopien an jeder Zelloberfläche unmittelbar benachbart einer Adhäsionsdomäne für ein toxisches Agens präsentiert wird, wobei die Adhäsionsdomäne und die extrazelluläre Domäne zum selben Membran-Polypeptid gehören, so dass nach einer Wechselwirkung der Zielverbindung und des (Poly)peptids, an dem Interesse besteht, das toxische Agens von der Adhäsionsdomäne ausgeschlossen ist,
b) Aussetzen der Zellpopulation einer Zielverbindung oder einer Population von Zielverbindungen für eine Zeitdauer, die ausreicht, damit die Zielverbindung mit dem (Poly)pep tid, an dem Interesse besteht, in Wechselwirkung tritt,
c) Aussetzen der Zellpopulation - gleichzeitig mit oder nach Schritt b) - dem toxischen Agens für eine Zeitdauer, die ausreicht, dass das Agens an seiner Adhäsionsdomäne anhaftet,
d) Auswählen jener Klone, die infolge der Wechselwirkung des (Poly)peptids, an dem Interesse besteht, mit der Zielverbindung einen Wachstumsvorteil haben,
e) Vermehren-Lassen der ausgewählten Klone,
f) Identifizieren des unbekannten Wechselwirkungspartners und Isolieren desselben.
Die Ausdrücke "Wechselwirkung" oder "in Wechselwirkung treten" bezeichnen für den Zweck der vorliegenden Erfindung jegliche Wirkung der Zielverbindung auf die extrazelluläre Domäne, die das (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, trägt (variable Domäne) und die dazu führt, dass das toxische Agens von der Bindung an seine Adhäsionsdomäne ausgeschlossen wird. Diese Wirkung kann die Bindung, Adhäsion, Strukturänderungen oder chemische Modifikationen der variablen Domäne, die eine Wirkung auf die Adhäsionsdomäne hat, umfassen. Eine solche Wirkung auf die Adhäsionsdomäne kann u. a. eine Konformationsänderung der Adhäsionsdomäne sein, die die schädliche Wirkung des toxischen Agens verhindert.
Die Erfindung ist in mindestens drei allgemeinen Gebieten nützlich. Erstens kann die Erfindung verwendet werden, (Poly)peptide mit Eigenschaften zu identifizieren, die in der medizinischen Diagnostik, Therapeutik, Forschung, Laborverfahren oder anderen Anwendungsgebieten nützlich sind. Unter den Polypeptiden, die mittels des hier geoffenbarten Verfahrens identifiziert werden können, sind Polypeptide, die mit praktisch jeder gegebenen Zielverbindung in Wechselwirkung treten, insbesondere mit hoher Affinität und Spezifität an diese binden, Polypeptide, die an ihre jeweiligen Zielverbindungen an mehrfachen Epitopen anhaften, Polypeptide, die an ihre jeweiligen Zielverbindungen binden, doch keine Affinität für Verbindungen zeigen, die mit den Zielverbindungen eng verwandt sind, enzymatische Polypeptide und Polypeptide, die biologische Aktivitäten aufweisen, wie Antagonismus oder Agonismus eines Rezeptors. Zweitens kann diese Erfindung dadurch, dass sie Polypeptidsequenzen identifiziert, die spezifisch mit einer Zielverbindung in Wechselwirkung treten, die eine bekannte Verbindung ist, an der ein wesentliches Interesse besteht, bei der Identifizierung der nativen Wechselwirkungspartner der bekannten Verbindung hilfreich sein. Drittens kann diese Erfindung dazu verwendet werden, die Wechselwirkung zwischen einem bekannten Polypeptid, an dem Interesse besteht, und einem bekannten Zielmolekül zu analysieren. Durch Feststellung, welche Sequenzen im Polypeptid, an dem Interesse besteht, mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung treten, hilft die Erfindung bei der Kartierung der Polypeptid-Epitope, die bei der Wechselwirkung eine Rolle spielen. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden, um eine Zielverbindung aus einer Population von Zielverbindungen zu identifizieren, die an ein bekanntes (Poly)peptid bindet. Bei dieser Ausführungsform werden Zellen, die einen bestimmten Abschnitt in der extrazellulären Domäne der Membran aufweisen, in einem Screening-Test als Testzellen verwendet zum Screenen auf pharmazeutisch aktive Verbindungen, die mit dem (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, in Wechselwirkung treten.
Folglich umfasst die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren in Form eines Screening-Tests mit hohem Durchsatz, wobei die Zellen einer Mehrzahl von Zielverbindungen ausgesetzt werden, von welchen ein unbekannter Wechselwirkungspartner für ein (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, identifiziert werden soll.
Diese Erfindung kann auch verwendet werden, um Polypeptide mit komplexeren Eigenschaften einer Wechselwirkung mit der Zielverbindung, als die vorbeschriebene Bindungsaffinität, zu identifizieren. Unter den Molekülen, die mit diesem Verfahren identifiziert werden können, sind Polypeptide, die multivalente Bindung aufweisen; Polypeptide, die fest an ein Molekül binden aber keine Affinität für ein zweites, eng verwandtes Molekül zeigen; Polypeptide, die die funktionelle Aktivität der Zielverbindung, an die sie binden, beeinflussen; und enzymatische Polypeptide.
Die Erfindung basiert auf der Wechselwirkung dreier CISTEM- Komponenten: (I) einer gentechnisch erzeugten Population prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen; (2) einer Zielverbindung; und (3) einem toxischen Agens (Fig. 5). An der Oberfläche jeder Zelle in der Population gibt es zwei Polypeptiddomänen, die bei der Durchführung des CISTEM eine Rolle spielen: die Zelldomäne, die entweder ein gegebenes (Poly)peptid trägt, dessen Wechselwirkung mit einer unbekannten Zielverbindung bestimmt werden soll, oder, im Falle eines unbekannten (Poly)peptids, die geprägte Domäne, und die Adhäsionsdomäne. Die geprägte Domäne ist sehr variabel, weil die CISTEM-Zellpopulation so hergestellt wird, dass sie bis zu 1012 unterschiedliche Oligopeptide an der geprägten Domäne aufweist. (Wenn die Population eukaryontisch ist, können die Oligopeptide diverse Oligosaccharide aufweisen.) Neben der geprägten Domäne befindet sich an der Oberfläche jeder Zelle die Adhäsionsdomäne, die Struktur, an welche das toxische Agens des CISTEM binden muss, um seine schädliche Wirkung auf die Zelle auszuüben. Das pathogene Agens kann ein Organismus oder ein Molekül sein, und es kann für die Zellen tödlich sein oder lediglich ihr Wachstum verzögern, doch ist in allen Fällen der erste Schritt bei der Zerstörung oder Verzögerung einer Zelle durch das Agens eine Bindung zwischen dem Agens und seiner Adhäsionsdomäne. Die beiden wichtigen Domänen - nämlich die geprägte Domäne und die Adhäsionsdomäne, sind in mehreren Kopien an der Oberfläche jeder Zelle exprimiert, aber sie sind immer einander angrenzend: insbesondere müssen sie nahe genug bei einander sein, dass die Zielverbindung, wenn sie mit der geprägten Domäne in Wechselwirkung steht, weit genug über die Adhäsionsdomäne reicht, dass eine Adhäsion des toxischen Agens zumindest teilweise behindert wird.
Die Zielverbindung ist das Molekül oder der Satz an Molekülen, mit welchen die von CISTEM identifizierten Polypeptidsequenzen auf die vorgeschriebene Weise in Wechselwirkung treten müssen, damit sie die Eigenschaften aufweisen oder die Funktionen erfüllen, die man von ihnen wünscht. Mit anderen Worten ge sagt, identifiziert das CISTEM Polypeptide, die mit der Zielverbindung in Wechselwirkung treten, z. B. an diese binden und gegebenenfalls diese auch strukturell oder funktionell verändern. Eine Zielverbindung kann ein Protein, Kohlehydrat, Saccharid, Glykoprotein, Proteoglykan, Hormon, Rezeptor, Antigen, Antikörper, Pathogen, Substrat, Metabolit, Übergangszustand-Analog, Cofaktor, Inhibitor, Arzneistoff, Farbstoff, Nährstoff, eine kleine Molekülverbindung usw. ohne Einschränkung sein. Jedes CISTEM stellt nur eine Bedingung an die Zielverbindung: sie muss groß genug sein, dass ihre Befestigung an der geprägten Domäne zu einem Verdecken der benachbarten Adhäsionsdomäne führt.
Um das grundlegendste CISTEM zusammenzusetzen (als Beispiel für die Ausführungsform, in welcher der unbekannte Wechselwirkungspartner das (Poly)peptid ist) und die Selektion zu initiieren, werden die folgenden Schritte durchgeführt. Zuerst wird die CISTEM-Komponente (1), die Zellpopulation, mit der CISTEM- Komponente (2), einer Lösung oder Suspension der Zielverbindung inkubiert. Während die CISTEM-Zellpopulation der Zielverbindung ausgesetzt ist, führt die strukturelle Unterschiedlichkeit der variablen Regionen des geprägten Polypeptids zu vielerlei Wechselwirkungen zwischen den geprägten Domänen und den Zielmolekülen. Das heißt, die unterschiedlichen Strukturen, die an den geprägten Domänen separater Zellen präsentiert sind, weisen charakteristische "on-rates", "off-rates" und Dissoziationskonstanten in ihren Bindungsreaktionen mit der Zielverbindung auf (Fig. 6). Nach oder während der Inkubation wird die CISTEM- Komponente (3) eingeführt: eine Population eines Bakteriozins, Bakteriophagen, Virus oder von Toxin-Partikeln wird zu den Zellen und der Zielverbindung zugegeben. Mit diesem Schritt ist die Zusammensetzung des grundlegenden CISTEM beendet, und die Selektion beginnt.
Die Wechselwirkung zwischen den drei CISTEM-Komponenten gibt solchen Zellen einen selektiven Vorteil, deren geprägte Domänen an die Zielverbindung binden (Fig. 7). Dies geschieht wie folgt. Wie zuvor betont, sind die geprägte Domäne (im Folgenden wird der Ausdruck "geprägte Domäne", wenn strukturelle Merkmale der Erfindung beschrieben werden, auch für jene Domäne verwendet, die ein bekanntes (Poly)peptid trägt, an dem Interesse besteht, dessen Wechselwirkung mit einer unbekannten Zielverbindung bestimmt werden soll. Folglich kann der Ausdruck "geprägtes Polypeptid" auch Proteine bezeichnen, die solche bekannten (Poly)peptide tragen, an welchen Interesse besteht) und die Adhäsionsdomäne des toxischen Agens unmittelbare Nachbarn auf der Zelloberfläche. Infolgedessen überlappt, wenn die Zielverbindung an eine Struktur bindet, die sich an der geprägten Domäne befindet, die Verbindung die Oberfläche der angrenzenden Adhäsionsdomäne. Diese Überlappung stört die Befestigung des toxischen Agens an der Adhäsionsdomäne und schützt somit die Zelle und ermöglicht es ihr, sich weiter zu teilen (Fig. 7). Dagegen bleiben Zellen, deren geprägte Domänen die Zielverbindung nicht mit ausreichender Affinität binden, ungeschützt und werden daher vom toxischen Agens getötet oder retardiert (Fig. 7). Somit nimmt jeder selektierte Klon an Häufigkeit und in seiner Zahl zu, während er sich weiter teilt, während ungeschützte Klone vom toxischen Agens befallen werden. Aus der Zellpopulation, die eine große Strukturenvielfalt an der geprägten Domäne präsentiert, selektiert und amplifiziert CISTEM Klone, die Strukturen exprimieren, die an die Zielverbindung binden (Fig. 8).
Modifikationen und Weiterentwicklungen des grundlegenden CISTEM ermöglichen eine Selektion auf eine vorgeschriebene Affinität oder eine Art der Wechselwirkung der geprägten Domäne mit der Zielverbindung. Multivalente Bindung kann selektiert werden, sowie auch eine hochspezifische Bindung, eine Bindung an vorbestimmte Stellen oder eine Bindung durch bestimmte Strukturmotive. Außerdem können CISTEMs erweitert werden, so dass sie nicht nur auf eine Bindung selektieren, sondern auch auf funktionelle Aktivität; diese erweiterten CISTEMs können zur Schaffung von Enzymen und anderen funktionell aktiven Molekülen verwendet werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

i. EINLEITUNG

Diese Erfindung sieht ein Verfahren zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen einem (Poly)peptid und einer Zielverbindung vor, wobei einer der Wechselwirkungspartner unbekannt ist, wodurch (Poly)peptide identifiziert werden, die vorgeschriebene Eigenschaften aufweisen, wie eine hohe Affinität für eine vor bestimmte Zielverbindung, enzymatische Aktivität, oder die Fähigkeit, die Aktivität einer Zielverbindung zu ändern, oder unbekannte Zielverbindungen identifiziert werden, die vorgeschriebene Wirkungen auf ein bekanntes (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, ausüben. Das Verfahren beruht auf einer Konvergenz von drei verschiedenen Gebieten der biologischen Forschung: i. die Untersuchung prokaryontischer und eukaryontischer Zellmembranen und ihrer komplexen Bestandteile; ii. die Untersuchung der Evolution mikrobieller Populationen unter selektivem Druck von Toxinen, Bakteriozinen oder viralen Parasiten; und iii. das Design und Screenen von Oligonukleotid- codierten kombinatorischen Bibliotheken von Polypeptiden.
Die Ausführungsformen der Erfindung werden CISTEMs genannt, für "Cellular Imprinting by Selection: Teleological Evolution of Molecules" (Zellprägung durch Selektion: teleologische Evolution von Molekülen). Der nächste Abschnitt (V.ii) beschreibt die grundlegende Struktur und Funktion von CISTEMs. Diese grundlegende Funktion involviert die Wechselwirkung von drei "CISTEM- Komponenten", und in den folgenden Abschnitten (V.iii-V.v) wird jede Komponente genauer betrachtet: die Vorgangsweisen für die korrekte Manipulation jeder Komponente und deren Integration in ein gesamtes CISTEM sind vollständig beschrieben oder es wird Bezug darauf genommen. Der letzte Abschnitt (V.vi) beschreibt Modifikationen und Weiterentwicklungen der Erfindung, die mehrere wichtige Erweiterungen ihrer Fähigkeiten ermöglichen.

ii. GRUNDLEGENDE STRUKTUR DER ERFINDUNG

Die Erfindung besteht aus drei Komponenten. Diese sind: (I) eine hergestellte Population von Zellen; (2) eine Zielverbindung; und (3) ein toxisches Agens (Fig. 5). Die CISTEM- Zellpopulation kann prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Wenn der Wechselwirkungspartner das (Poly)peptid ist, an dem Interesse besteht, wird diese Population, eine extrazelluläre Domäne (die "geprägte Domäne") eines Außenmembran-Polypeptids (das "geprägte Polypeptid") so hergestellt, dass es sehr variable Peptidsequenzen aufweist. Wenn die CISTEM-Zellpopulation eukaryontisch ist, haben die Glykosylierungsstellen innerhalb der geprägten Domäne variable komplexe Saccharide. Eine große Sequenzvariabilität an der geprägten Domäne wird durch die Insertion variabler Oligonukleotide an jenen Stellen im Polypeptid-Gen erreicht, die den translatierten Regionen entsprechen, in welchen die Variation gewünscht wird. Techniken zur Insertion eines Gens für ein exogenes Oligopeptid an einer Zielstelle in einem Außenmembran-Protein-Gen wurden unter "Hintergrund" (III.iv.a) beschrieben, und eine Ausweitung dieser Techniken, die die Insertion variabler Oligonukleotide ermöglicht (105 bis 1012 verschiedene Sequenzen anstelle einer einzigen, stereotypisierten Nukleotidsequenz) werden nachfolgend im Detail beschrieben (V.iv.c).
Wie unter "Hintergrund" (III.iv) beschrieben wurde, können viele pathogene Agenzien Zellen nur dann töten oder ihr Wachstum verzögern, wenn sie zuerst an eine spezifische Domäne an der Zelloberfläche binden können. Das toxische Agens eines CISTEM bindet an eine Adhäsionsdomäne, die sich unmittelbar angrenzend an die geprägte Domäne an der Oberfläche der Zellen in der CISTEM-Population befindet (Fig. 5). Die benachbarten extrazellulären Domänen bei den meisten der in dieser Erfindung verwendeten Außenmembranproteine sind durch 3-30 Å voneinander getrennt. (Der annähernde Inter-Loop-Abstand für jedes der geprägten Polypeptide, die in diesem Dokument als spezifische Beispiele erwähnt werden, kann in der Literatur gefunden werden (jede der folgenden Literaturstellen gibt Annäherungen für den Inter-Loop-Abstand für eines oder mehrere der hier erwähnten Polypeptide an: 4, 23, 28, 38, 39, 41, 76, 105, 126, 127, 141).) Bei den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung, die nachstehend detaillierter beschrieben sind, ist diese Anordnung der Domänen das Ergebnis einer sorgfältigen Auswahl eines geprägten Polypeptids und eines toxischen Agens, derart, dass sich die geprägte Domäne unmittelbar angrenzend an die Adhäsionsdomäne befindet. (Wie unter "Hintergrund" (III. v) betont wurde, dient fast jedes Außenmembran-Polypeptid als Rezeptor für mehrere toxische Agenzien, von welchen jedes eine bestimmte Adhäsionsdomäne benützt). Bei anderen Ausführungsformen dieser Erfindung sind jedoch die Außenmembranproteine genetisch verändert, um ein Hybrid-Polypeptid zu konstruieren, bei welchem die geprägte Domäne neben der Adhäsionsdomäne platziert ist. Die Techniken zur Herstellung von Außenmembranproteinen, einschließlich der Fusion von zwei separaten Polypeptiden zur Bildung eines chimären polytopischen Polypeptids, wurden unter "Hinter grund" (III.iv.c) beschrieben; ihre spezifischen Anwendungen für die Ausführungsformen dieser Erfindung sind nachstehend beschrieben (V.iv).
Die Zielverbindung ist jedes Molekül oder Satz von mehreren, bestimmten Molekülen, an welchen Interesse besteht, an die die von dieser Erfindung identifizierten Polypeptidsequenzen binden müssen, um die von ihnen verlangten Funtionen auszuüben. Mit anderen Worten gesagt identifiziert diese Erfindung Polypeptidsequenzen, die die Zielverbindung oder irgend eine in der Zielverbindung inkludierte Untergruppe von Molekülen binden, und dieser Bindungsvorgang ist für die Funktionen, für die die Polypeptide letztlich angewendet werden, wie eine enzymatische Aktivität oder eine Änderung der biologischen Aktivität der Zielverbindung, notwendig. Bei der Anwendung dieser Erfindung für die Analyse molekularer Wechselwirkungen ist die Zielverbindung eine bekannte Verbindung, an der Interesse besteht, von welcher man annimmt, dass sie wichtige Wechselwirkungen mit unbekannten Polypeptiden hat. Die Identifizierung dieser unbekannten Polypeptide wird unterstützt durch die erfindungsgemäße Identifizierung von Sequenzen, mit welchen die Zielverbindung eine Bindung eingeht. Bei der Epitop-Kartierung ist die Zielverbindung ein Molekül, an dem Interesse besteht (nicht unbedingt ein Polypeptid), von dem man weiß, dass es an einer Wechselwirkung mit einem Polypeptid, an dem Interesse besteht, beteiligt ist. Durch Identifizierung von Polypeptidsequenzen, die die Zielverbindung binden, hilft diese Erfindung bei der Darstellung jener Regionen des bekannten Polypeptids, die an dieser Wechselwirkung mit der Zielverbindung direkt beteiligt sind. Für jedes der drei Anwendungsgebiete, die hier erwähnt wurden - Identifizierung von Sequenzen mit nützlichen Funktionen; Wechselwirkungsanalyse; und Epitop-Kartierung - sind im nächsten Abschnitt (V.iii) spezifische Zielverbindungen beschrieben.
Die dritte Komponente der Erfindung ist das toxische Agens, Die wichtigste Bedingung für das toxische Agens wurde bereits erwähnt: die Wirkungen des Agens auf Zellen muss unbedingt von der Fähigkeit des Agens abhängen, an eine Adhäsionsdomäne, die an die geprägte Domäne angrenzt, zu binden. Andere Attribute des toxischen Agens, z. B. eines pathogenen Agens, wie Virulenz und Konzentration, können nötigenfalls mittels üblicher Labor- Verfahren geändert werden. Diese Attribute und ihre Adaptierungen sind im Abschnitt über toxische Agenzien (V.v.) beschrieben.
Es gibt zwei Schritte bei der Durchführung der Selektion auf Polypeptidsequenzen, die die Zielverbindung binden. Bei den meisten Ausführungsformen dieser Erfindung werden diese Schritte sequenziell durchgeführt, obwohl sie in manchen Fällen simultan sein können. Zuerst wird die CISTEM-Zellpopulation, die Komponente (I) der Erfindung, mit einer Suspension oder Lösung der Zielverbindung, der Komponente (2) der Erfindung, inkubiert. Die Inkubationslösung ist ein Standardmedium für Zellwachstum, genauer im Abschnitt über Zelllinien und Medien (V.iv.g) beschrieben. Während der Inkubation führt die strukturelle Unterschiedlichkeit der variablen Regionen zu einem breiten Spektrum von Bindungs-Wechselwirkungen zwischen geprägten Domänen und Zielmolekülen: die verschiedenen Strukturen, die an den geprägten Domänen separater Zellen aufscheinen, weisen charakteristische "on-rates", "off-rates" und Dissoziationskonstanten in ihren Bindungsreaktionen mit der Zielverbindung auf '(Fig. 6). Die Inkubation wird fortgesetzt, bis die Bindung zwischen den geprägten Domänen und den Zielverbindungen sich Gleichgewichtsmengen nähert. Für die meisten Ausführungsformen der Erfindung reicht eine Stunde aus. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Inkubationszeit abgekürzt, um Polypeptide zu favorisieren, die nicht nur eine hohe Affinität für die Zielverbindung aufweisen, sondern auch außerordentlich hohe "on-rates" aufweisen; diese CISTEMs sind im Abschnitt über die Weiterentwicklungen der Erfindung (V.vi) beschrieben.
Nach der Inkubation wird das toxische Agens, die Komponente (3) der Erfindung, zur Suspension von Zellen und Zielverbindung zugegeben. Wie im Abschnitt über toxische Agenzien (V.v) beschrieben, erfolgt die Einwirkung auf die Zellpopulation durch ein für das Agens passendes Verfahren. Wenn beispielsweise das Agens ein Bakteriophage ist, wird die Suspension von Zellen und Zielverbindung einer klassischen Phageninfektion ausgesetzt. Alternativ erfolgt die Einwirkung des Agens auf die Zellpopulation, wenn das Agens ein Colicin ist, einfach durch Zugabe des Colicins zum Medium, in welchem die Zellen mit der Zielverbin dung inkubiert sind. Wenn das toxische Agens in Form eines pathogenen Agens ein reproduzierender Organismus ist, wie ein Bakteriophage, kann es notwendig sein, seine Wirkung nach einer Einwirkungsperiode zu stoppen. Die richtige Konzentration des pathogenen Agens, Einwirkungszeit und Verfahren zum Stoppen der Wirkung des Agens sind im Abschnitt über toxische Agenzien (V.v). beschrieben.
Die Zugabe des toxischen Agens zur Suspension von Zellen und Zielverbindung vervollständigt die Zusammenstellung des CISTEM, und die Selektion beginnt. Die Wechselwirkung zwischen den drei CISTEM-Komponenten verleiht jenen Zellen einen selektiven Vorteil, deren geprägte Domänen die Zielverbindung binden: wenn eine an der geprägten Domäne befindliche Struktur die Zielverbindung bindet, überlappt die Verbindung die Oberfläche der angrenzenden Adhäsionsdomäne. Da der Abstand zwischen benachbarten extrazellulären Domänen der bei dieser Erfindung verwendeten Polypeptide nur 30-300 nm (3-30 Å) ist, ist selbst ein kleines Peptid-Hormon eine Zielverbindung, die groß genug ist, um von der geprägten Domäne, an welcher sie gebunden ist, die angrenzende Adhäsionsdomäne zu überlappen. Diese Überlappung stört die Befestigung des toxischen Agens, wodurch die Zelle geschützt und ihr eine Vermehrung ermöglicht wird (Fig. 7). Zellen, deren geprägte Domänen die Zielverbindung nicht mit ausreichender Affinität binden, bleiben ungeschützt und werden folglich getötet oder durch das pathogene (toxische) Agens retardiert (Fig. 7).
Jede Zelle der CISTEM-Population exprimiert mehrfache Kopien ihres geprägten Polypeptids, und die Bindung ist ein dynamischer Prozess, der "on-rate" und "off-rate" ausgleicht. Deshalb bleiben, selbst wenn das geprägte Polypeptid einer Zelle eine hohe Affinität für die Zielverbindung aufweist, einige Kopien des geprägten Polypeptids einen Teil der Zeit ungeschützt. Folglich besteht für jede Zelle in einer CISTEM-Population, gleichgültig, wie hoch ihre Affinität für die Zielverbindung ist, eine gewisse Wahrscheinlichkeit, dass sie von einem toxischen Agens getroffen wird. Nichtsdestoweniger ist diese Wahrscheinlichkeit geringer, wenn die Affinität einer Zelle für die Zielverbindung höher ist. Weiters ist, weil jeder Klon in einem CISTEM in mehrfachen Kopien vorhanden ist, (die CISTEM-Zellpopulation ist redundant), die Wahrscheinlichkeit, dass eine einzige Zelle getoffen wird, auch der Bruchteil der klonalen Population dieser Zelle, der getroffen werden wird, und die differentielle Eliminierung von klonalen Populationen ist die tatsächliche Grundlage der Selektion. Somit nimmt jeder selektierte Klon an Häufigkeit und an Zahl zu, während er sich weiter teilt, während die ungeschützten Klone zerstört werden. Kurz gesagt selektiert und amplifiziert CISTEM Klone, die Strukturen exprimieren, welche die Zielverbindung binden (Fig. 8).

iii. DIE ZIELVERBINDUNG

Die Zielverbindung kann ein Protein, Kohlehydrat, Saccharid, Glykoprotein, Proteoglykan, Hormon, Rezeptor, Antigen, Antikörper, Pathogen, Substrat, Metabohit, Übergangszustands-Analog, Cofaktor, Inhibitor, Arzneistoff, Farbstoff, Nährstoff etc. ohne Einschränkung sein. Die Wirkung der Zielverbindung, die für die Erfindung relevant ist, ist, dass sie infolge ihrer Größe nach der Wechselwirkung mit der geprägten Domäne von der geprägten Domäne bis zur Adhäsionsdomäne reicht. Dies ist bei den meisten geprägten Polypeptiden, die von dieser Erfindung geprägt sind, 30-300 nm (3-30 Å). Alternativ kann, unabhängig von ihrer Größe, die Wechselwirkung zwischen der Zielverbindung und der geprägten Domäne zu einer Konformations- und/oder chemischen Änderung der variablen Domäne und/oder der Adhäsionsdomäne führen, was eine Befestigung des toxischen Agens verhindert. Die Zielverbindungen, ihre Quelle, Herstellung und Verwendung in CISTEMs mit besonderen Anwendungen sind in diesem Abschnitt beschrieben. Obgleich die Konzentration der Zielverbindung in einem CISTEM auch für seine Funktion wichtig ist, hängt diese Konzentration von der Art anderer CISTEM-Komponenten ab und wird daher in einem späteren Abschnitt (V.v) besprochen.
Bei CISTEMs, die für die Prägung von Polypeptiden entworfen sind, um als hoch-spezifische Marker oder Trennungsmittel in diagnostischen Tests zu dienen, ist die Zielverbindung einfach das Molekül, das vom Polypeptid markiert ("tagged") und/oder getrennt werden soll. Beispielsweise ist bei einer Ausführungsform der Erfindung, die für das Design eines diagnostischen Polypeptids verwendet wird, das fest und spezifisch an Human Immunodeficiency Virus (HIV) bindet, die Zielverbindung HIV gp120, die extrazelluläre Untereinheit eines Haupt-HIV-Glyko proteins (114). Die Herstellung von rekombinantem gp120 in löslicher Form, die zur Verwendung in CISTEMS geeignet ist, ist in der Literatur beschrieben (59, 66). Eine andere Ausführungsform der Erfindung wird verwendet, um ein diagnostisches Polypeptid für die direkte Detektion eines anderen Virus, Human T- cell Leukemia Virus type I (HTLV-1) zu designen; hier ist die Zielverbindung das HTLV-1-Oberflächen-Glykoprotein gp46 (35). Die Herstellung von authentischen, glykosylierten HTLV-1 gp46 in einem rekombinanten Vaccinia-Virus/T7-Polymerase-System ist in der Literatur beschrieben (9). Diagnostische Tests zur Detektion einer menschlichen Virusinfektion binden oft nicht an das Virus selbst, sondern eher an die gegen das infektiöse Agens gezogenen Antikörper. Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung prägt ein Polypeptid, so dass es eine hohe Affinität für einen monoklonalen Antikörper, MAbT7, aufweist. Die Zielverbindung bei diesem CISTEM, MAbT7 selbst, ist im Handel erhältlich (Novagene) und ist in der Literatur beschrieben (43).
Die Erfindung wird auch verwendet, um Polypeptide zu prägen, damit sie als Antagonisten, Agonisten oder Modulatoren der funktionellen Wirkung biologisch aktiver Moleküle dienen. Wenn diese Erfindung zur Prägung eines Polypeptids verwendet wird, damit es als Antagonist dient, kann die Zielverbindung eines der Moleküle sein, das an der Wechselwirkung, die antagonisiert werden soll, beteiligt ist. HIV gp120 ist das Virus-Glykoprotein, das an den CD4-Rezeptor bindet, und somit vermittelt es die Virusinvasion der Humanzelle (114). Die Ausführungsform dieser Erfindung, die ein Polypeptid (ICAM-1, das in III.v.c, beschrieben ist) so prägt, dass es spezifisch an HIV gp120 bindet, schafft ein Polypeptid, das als Antagonist der Wechselwirkung zwischen dem Virus-Glykoprotein und seinem Wirtszellen-Rezeptor dienen könnte.
Die von einem CISTEM selektierten Polypeptide werden mit größerer Wahrscheinlichkeit eine gegebene molekulare Wechselwirkung funktionell antagonisieren, wenn die Zielverbindung des CISTEM so weit wie möglich auf eine aktive Stelle des Wechselwirkungspartners verringert wird. Strukturen an jedem Wechselwirkungspartner, die von der aktiven Stelle unterschiedlich und topologisch weit weg sind, sind als Zielverbindungen weniger günstig, weil ein Polypeptid, das solche Strukturen bindet, nicht in die normale Wechslewirkung der aktiven Moleküle eingreifen kann. Beispielsweise prägt eine Ausführungsform dieser Erfindung ein Polypeptid (E. coli OmpA, welches in Fig. 13 gezeigt ist und weiter in III.iv.a, III.v.b. und VI beschrieben ist), so dass es als Antagonist der Wechselwirkung zwischen den Signalproteinen eukaryontischer Zellen, Ras und Raf, fungiert (119). (Aktivierung von Raf, eine Proteinkinase, durch das unmittelbare upstream Protein, Ras (169), initiiert Reaktionsabläufe, die zur Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren, der Stimulierung zahlreicher Gene (100) und letztlich zur Zellproliferation und -differenzierung (124) führen. Konstitutiv aktive onkogene Mutanten von Ras oder Raf kommen in vielen Humantumoren vor (19, 57). Bei diesem CISTEM ist die Zielverbindung die Domäne von Raf (Aminosäuren 51-131), von welcher man weiß, das sie direkt an der Bindung an Ras (Raf's sogenannter Ras-Bindungsdomäne, oder Raf-RBD) beteiligt ist (18). Die Konstruktion eines rekombinanten Expressionsvektors für Raf-RBD, die Expression in E. coli und die Reinigung des Proteins sind in der Literatur beschrieben (94). Die Verwendung von Raf-RBD anstelle des gesamten Raf als Zielverbindung gewährleistet, dass die vom CISTEM selektierten Polypeptide an genau jener Domäne von Raf binden, die mit Ras in Wechselwirkung tritt, anstatt an Raf-Epitope, die für die wichtige Zell-Signalisierungs-Wechselwirkung unwesentlich sind.
Wenn diese Erfindung verwendet wird, um Polypeptide so zu prägen, dass sie als Agonisten anstatt als Antagonisten eines Rezeptors oder eines biologischen Reaktionsablaufes dienen, ist die Zielverbindung der Rezeptor oder das Biomolekül, das das geprägte Polypeptid aktivieren soll. Beispielsweise ist bei einer Ausführungsform dieser Erfindung, die ein Polypeptid (E. coli OmpA) so prägt, dass es Interleukin 6 nachahmt und als Agonist des Interleukin 6-Rezeptors (IL-6R) fungiert, die Zielverbindung eine solubilisierte Form von IL-6R: die Expression von löslichen Human-IL-6R- in CHO-Zellen und die Reinigung des Proteins sind in der Literatur (176) beschrieben. Nachdem dieses CISTEM Polypeptide mit einer Affinität für IL-6R selektiert, wird ein sekundäres Screening verwendet, um Polypeptide zu isolieren, deren Bindung an den Rezeptor zur Transduktion des Signals führt, das normalerweise von IL-6 initiiert wird. Dieses sekundäre Screening ist im Abschnitt über die Erweiterungen des grundlegenden CISTEM (V.vi) beschrieben.
Wenn diese Erfindung zur Schaffung von Agonisten verwendet wird, wird die Zielverbindung so weit wie möglich bis auf die aktive Stelle des Rezeptors oder Biomoleküls, das agonisiert werden soll, verkleinert. Dies erfolgt deshalb, weil das Entfernen von unwesentlichen Epitopen von der Zielverbindung die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass ein geprägtes Polypeptid, das die Zielverbindung bindet, auch als Agonist aktiv sein wird.
Bei einem anderen Anwendungsbeispiel dieser Erfindung auf die Schaffung von Agonisten wird ein Polypeptid, wie E. coli OmpA, geprägt, damit es als Mimic bestimmter mikrobieller Antigene dient und somit eine spezifische Immunantwort hervorruft. Bei diesen Ausführungsformen der Erfindung ist die Zielverbindung aus mehr als einem Molekül zusammengesetzt: zahlreichen monoklonalen Antikörpern oder polyklonalen Antiseren, die von Individuen stammen, welche einem spezifischen Antigen ausgesetzt waren, wie Meningikokken-Opa-Proteinen (I). Die zusammengesetzte Zielverbindung wird als Prägung verwendet - ein "Negativ" oder "Fußabdruck" ("foot print") des Antigens, und aus diesem Fußabdruck gießt es ein positives Abbild des Antigens: wenn ein Polypeptid (in diesem Fall OmpA) geprägt Wird, so dass es den gesamten Satz an Antikörpern bindet, die die Seren, welche gegen ein Antigen gezogen sind, zusammensetzen, dann besteht die Wahrscheinlichkeit, dass dieses geprägte Polypeptid eine Immunantwort hervorrufen wird, die jener sehr ähnlich ist, die vom Antigen provoziert wird (136). Zu den Antikörpern, die für die Verwendung als Zielverbindung in einem CISTEM für die Prägung von E. coli OmpA geeignet sind, damit es Neisseria-Protein Opa 5c nachahmt, zählen Amb B306, mAb A222/5b und andere, in der Literatur (2, 130) beschriebene.
Um Katalysatoren für chemische Reaktionen, wie Esterhydrolyse, zu schaffen, werden Polypeptide so geprägt, dass sie an Übergangszustands-Analoga binden. Die Herstellung und Struktur dieser Übergangszustands-Analoga sind in der Literatur beschrieben (40, 162). Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Phosphonat-Übergangszustands-Analog (Struktur und Herstellung in 40 beschrieben) als Zielverbindung für die Prägung von E. coli OmpA verwendet, damit es als Katalysator der Hydro lyse von p-Nitrophenyl-Estern fungiert.
Bei anderen Ausführungsformen dieser Erfindung, die zur Schaffung von Polypeptiden mit spezifischer enzymatischer Aktivität verwendet werden, ist die Zielverbindung nicht ein Übergangszustands-Analog, sondern statt dessen ein modifiziertes Substrat. Die Zielverbindung ist ein Molekül, das strukturell sehr ähnlich, aber nicht identisch mit dem Substrat ist, auf welches das geprägte Polypeptid letztlich wirken wird. Der Grund für die Verwendung einer leicht modifizierten Struktur anstatt des Substrates selbst, ist der Folgende: würde das Substrat selbst als Zielverbindung verwendet, würden geprägte Polypeptide, die nicht nur das Substrat binden sondern auch die gewünschte enzymatische Aktivität ausüben, das Substrat verändern und es dann freisetzen, wodurch die darunterliegende Zelle für das toxische Agens angreifbar würde. Das heißt, würde das Substrat selbst als Zielverbindung verwendet, würde CISTEM gegen Klone selektieren, die Polypeptide mit der gewünschten Enzymaktivität exprimieren. Daher muss die Zielverbindung ein wirksames Struktur-Mimic des Substrats sein (d. h. Polypeptide, die die Zielverbindung binden, müssen auch an das Substrat binden können), aber sie muss unangreifbar für die vorgeschriebene Enzymaktivität sein (d. h. Polypeptide, die enzymatisch auf das Substrat wirken, müssen unfähig sein, auf die Zielverbindung zu wirken.
Beispielsweise ist bei einer Ausführungsform dieser Erfindung, die E. coli OmpA so prägt, dass es als Sequenz-spezifische Protease wirkt, die die Bindung zwischen zwei Methioninen hydrolysiert, die Zielverbindung das Oligopeptid NH2-R1-R2-R3-M1=M2- R4-R5-COOH. M1 und M2 bedeuten Methioninreste; die Bindung zwischen diesen, die durch "=" dargestellt ist, ist eine nicht- hydrolysierbare Methylengruppen-Bindung. Normale Amidbindungen sind durch "-" dargestellt. R1....5 sind variable Reste, die aus den 20 Aminosäuren zufällig ausgewählt sind. Diese Reste werden so variiert, dass nur geprägte Polypeptide, die an das konsistente M1=M2-Motiv der Zielverbindung binden, durch das CISTEM ausgewählt werden. Geprägte Polypeptide, die eine hohe Affinität für ein anderes Peptid-Motiv aufweisen, binden höchstens nur eine ganz kleine Fraktion der Ziel-Polypeptide und bleiben daher für das toxische Agens angreifbar. Mehrere Verfahren für die Synthese dieser Oligopeptid-Zielverbindung sind in der Literatur beschrieben (99).
Nachdem das CISTEM Klone selektiert hat, die geprägte Polypeptide exprimieren, welche das modifizierte Substrat binden, wird ein sekundäres Screening verwendet, um geprägte Polypeptide zu isolieren, die nicht nür die Zielverbindung binden, sondern auch die gewünschte enzymatische Reaktion durchführen. Sekundäre Screenings, einschließlich dem einen, das im CISTEM verwendet wird, welches Polypeptide so prägt, dass sie die Bindung zwischen zwei Methioninen hydrolysieren, sind im Abschnitt über Weiterentwicklungen des CISTEM (V.vi) beschrieben.
Zusätzlich zur Schaffung funktionell aktiver Polypeptide, wie Antagonisten und Enzyme, umfassen die Anwendungsgebiete dieser Erfindung auch die Analyse von Wechselwirkungen (derzeitige Techniken vgl. 138, Beispiele in 179, und oben unter III.vi beschrieben). Durch Screenen einer diversen Polypeptid-Bibliothek auf Sequenzen, die spezifisch mit einer Zielverbindung, an der ein wesentliches Interesse besteht, in Wechselwirkung treten, ist diese Erfindung bei der Identifizierung der nativen Wechselwirkungspartner der Verbindung hilfreich. Diese Fähigkeit der Erfindung wird durch das CISTEM veranschaulicht, welches E. coli OmpA so prägt, dass es an Raf-RBD bindet (für eine genauere Beschreibung dieser Zielverbindung, siehe oben). Obwohl die strukturelle Wechselwirkung zwischen Ras und Raf-RBD durch kristallographische und Mutations-Analyse (18) gut charakterisiert worden ist, ist die Aktivierung von Raf durch Ras ein komplexer Prozess, den man bisher noch nicht rollständig versteht, und es ist vermutlich eine Wechselwirkung mit anderen Molekülen daran beteiligt. Das CISTEM, das OmpA so prägt, dass es Raf-RBD bindet, hilft bei der Identifizierung von Polypeptiden, die bei Raf-Aktivierung eine Rolle spielen. Das CISTEM selektiert multiple Peptidsequenzen, die eine Affinität für die Zielverbindung, Raf-RBD, aufweisen. Diese Sequenzen oder die Oligonukleotide, die für sie codieren, werden dann in allgemein ausgeübten Verfahren zur Durchsuchung von Sequenz-Bibliotheken und/oder cDNA-Bibliotheken von Ras/Raf-exprimierenden Zellen verwendet.
Diese Erfindung wird auch zur Epitop-Kartierung (32, 51, 138) verwendet, die zur Erforschung der Oberfläche der struk turellen Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen dient. Bei CISTEMs zur Epitop-Kartierung ist die Zielverbindung eines der beiden Moleküle, deren Wechselwirkung kartiert werden soll. Üblicherweise ist der Wechselwirkungspartner, der am leichtesten in löslicher Form hergestellt wird, jener, der als die Zielverbindung dient. Somit ist es, wenn einer der beiden Wechselwirkungspartner ein Membranprotein ist, oft das andere Molekül dasjenige, das als Zielverbindung dient. Bei einem CISTEM, das zur Kartierung der Epitope der Wechselwirkung zwischen Ras und Raf-RBD verwendet wird, dient Raf-RBD als Zielverbindung. Wie oben festgestellt, ist es in löslicher Form leicht herzustellen (94). Somit wird eines der in Wechselwirkung tretenden Proteine in viele kleinere Domänen zerschnitten, die in Routine-Tests auf ihre Fähigkeit, an den anderen Wechselwirkungspartner zu binden, geprüft werden können.
Bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung bilden mehrere separate Moleküle zusammen die Zielverbindung. Jedes Molekül muss die Größenanforderungen des CISTEM erfüllen und muss im CISTEM in einer Konzentration vorhanden sein, die ausreicht, um Klonen, die daran mit hoher Affinität binden, einen Schutz zu verleihen. (Die Selektion durch CISTEMs mit mehreren verschiedenen Zielmolekülen bevorzugt sehr stark die Bindung durch geprägte Domänen an mehrere verschiedene Moleküle, weil die wirksame Konzentration der Zielverbindung wesentlich höher ist für eine Zelle, deren geprägte Domäne an eines der beiden unterschiedlichen Moleküle binden kann, als für eine Zelle, deren geprägte Domäne nur ein Molekül binden kann.) Wenn die Zielverbindung eine Molekül-Bibliothek ist, hilft das CISTEM bei der Identifizierung der Wechselwirkungspaare der Moleküle: Polypeptide, die in der geprägten Domäne exprimiert werden, werden auf ihre Affinität für bestimmte Mitglieder der Molekül- Bibliothek, aus der die Zielverbindung zusammengesetzt ist, selektiert. Jene Zellen, die ein geprägtes Polypeptid exprimieren, das an eines oder mehrere Moleküle in der Zielverbindung bindet, werden selektiert, wogegen Zellen, die ein geprägtes Polypeptid exprimieren, das nicht an irgendeinen Bestandteil der Zielverbindung bindet, durch das toxische Agens des CISTEM eliminiert werden. Bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung, die nachstehend (V.vi) beschrieben sind, besteht die Zielverbindung aus einer Bibliothek von Polypeptiden oder von Phagen präsentierten Polypeptiden, die von der CISTEM-Zellpopulation selbst sezerniert werden.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist die Zielverbindung jener Wechselwirkungspartner, der auf Grund seiner Wechselwirkung mit einem gegebenen (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, z. B. einem Abschnitt eines natürlich vorkommenden Zelloberflächen-Rezeptors, der in der extrazellulären Domäne präsentiert ist, identifiziert werden soll. In diesem Fall ist die Zielverbindung der unbekannte Wechselwirkungspartner. Bei diesem Beispiel können die Zellen, die die Rezeptor-Domäne, an der Interesse besteht, aufweisen, mit chemischen Verbindungen aus einem Pool von Substanzen inkubiert werden. Überlebende Zellen sind Indikatoren dafür, dass die Verbindung, die mit diesen Zellen in Wechselwirkung getreten ist, eine Anwärter-Substanz für eine Wechselwirkung mit der Rezeptor-Domäne ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, bei welchem die geprägte Domäne auf autokrine Weise bindet. Bei dieser Ausführungsform wird die Zielverbindung von der Zelle sezerniert. Eine solche Anwendung von CISTEM ermöglicht die Selektion von Zellen aus einer Population von Zellen, die verschiedene Domänen exprimieren, für eine Wechselwirkung mit einer bestimmten Zielverbindung, die von den Zellen sezerniert wird, oder die Selektion von Zellen aus einer Population von Zellen, die verschiedene Zielverbindungen sezernieren und eine bestimmte Domäne für eine Wechselwirkung mit einer bestimmten Zielverbindung präsentieren. In beiden Fällen werden Zellen aus der Population selektiert, die gegen die Wirkung des toxischen Agens durch das richtige Zusammenpassen von sezernierter Zielverbindung und geprägter Domäne, die von derselben Zelle präsentiert wird, geschützt sind.

iv. DAS GEPRÄGTE POLYPEPTID

Wie oben festgestellt wurde (II), wird der Ausdruck "Polypeptid" in diesem Dokument so verwendet, dass er Proteine, Glykoproteine und Proteoglykane umfasst. Um von dieser Erfindung geprägt zu werden, muss ein Polypeptid mindestens eine extrazelluläre Domäne aufweisen, die exogene Oligopeptid-Insertionen annimmt, ohne dass die Translation oder der Export des Polypep tids an die Zelloberfläche gestört wird. Diese Fähigkeit, Insertionen anzunehmen, wurde bei zahlreichen sezernierten Polypeptiden sowie bei jedem der Dutzenden von Bakterien-, Hefe- und Säugermembran-Polypeptide, die topologisch mittels Genfusionstechniken kartiert wurden, beobachtet. Mehrere dieser Polypeptide, wie E. coli OmpA, E. coli LamB und Säuger-ICAM-1, ihre Eigenschaften und ihre Fähigkeiten, exogene Sequenzen in extrazellulären Domänen zu präsentieren, sind genauer unter "Hintergrund" (III.iv.a) beschrieben.
Die Membran-Polypeptide können autolog oder heterolog für die Zelle sein.
Vorzugsweise ist das Membran-Polypeptid heterolog. Durch Verwendung einer Zellpopulation, der das autologe Protein fehlt, wird ein Wettbewerb zwischen einer Bindungsstelle, die im natürlich vorkommenden Membran-Protein vorhanden sein kann, und der (Poly)peptid-Sequenz, an der Interesse besteht, für eine Wechselwirkung mit der Zielverbindung ausgeschlossen. Im Falle, dass die Zelle das autologe Membran-Polypeptid enthält, aber ansonsten die gewünschten Eigenschaften für ihre Verwendung bei der vorliegenden Erfindung hat, wird das Gen, das für das Membranprotein codiert, inaktiviert, z. B. durch Deletion. Standardmolekularverfahren sind für den Fachmann erhältlich.
Exogene Insertionen an einer extrazellulären Domäne sind an zwei Stufen jedes CISTEMs beteiligt. Erstens wird eine Oligopeptid-Markierung ("tag") in die geprägte Domäne insertiert, und Zellpopulationen, die diese Markierung aufweisen, werden in Vorversuchen verwendet, um das CISTEM zu optimieren. Die Oligopeptid-Markierung, ihre Insertion in die geprägte Domäne und die Konstruktion von Zellpopulationen, die die Markierung aufweisen, sind alle in diesem Abschnitt beschrieben. Zweitens wird, sobald die Vorversuche mit der markierten Zellpopulation durchgeführt worden sind, die tatsächliche CISTEM-Zellpopulation konstruiert: bei dieser Population werden variable Peptidsequenzen statt einer Oligopeptid-Markierung in die geprägte Domäne insertiert. Die Schritte bei der Konstruktion von CISTEM-Zellpopulationen sind ebenfalls hier beschrieben.

a) Klonieren des geprägten Polypeptid-Gens auf einen geeigneten Vektor

Mittels herkömmlicher, in der Literatur (146) beschriebener Verfahren wird das Gen, das für das geprägte Polypeptid codiert, auf einen passenden Vektor kloniert. Die Expressionsmenge des Vektors ist für die Funktion des CISTEM wichtig. Bei den meisten CISTEM-Zellpopulationen findet man etwa 1000 Kopien des geprägten Polypeptids pro Zelle. Wie jedoch nachstehend beschrieben ist, wird in einigen Fällen die Expression so eingestellt, dass man eine passende CISTEM-Selektion erreicht. Bei bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird die Regulierung der Expressionsmenge des geprägten Polypeptids durch die Verwendung eines Vektors ermöglicht, der einen induzierbaren Promotor, wie die prokaryontischen lac-regulierenden Elemente (76) aufweist, die mit Isopropyl-β-D-thiogalaktopryanosid (IPTG) oder dem eukaryontischen Interferon-Promotor (67) induzierbar sind. Der Vektor enthält auch einen selektierbaren Marker, wie ein Gen für Antibiotika-Resistenz, um die Transformation zu erleichtern (selektierbare Marker und ihre Verwendung bei der Klonierung von Vektoren sind in der Literatur, einschließlich 146 und 109, umfassend beschrieben).
Für prokaryontische Proteine werden übliche Expressionsplasmide sehr wohl verwendet, und die in bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung geprägten Polypeptide wurden bereits auf geeignete Plasmide platziert. Beispielsweise wurde auf pEV218 (76), das bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung verwendete Plasmid, E. coli OmpA (E. coli Outer membrane protein A ist weiters in III.iv.a., III,v.b. und VI beschrieben) unter die induzierbare Kontrolle der lac-regulierenden Elemente, die auf dem allgemeinen Plasmid mit hoher Kopienzahl, pUC9, vorhanden sind (74), gestellt. Die Expression von ompA auf pEV218 wird weiters durch das Vorhandensein eines TAG-Stop-Codons gesteuert, das der Aminosäure 7 des Polypeptids entspricht: wenn das Plasmid zur Transformation eines Bernstein- supprimierenden Wirts verwendet wird, wie E. coli UH203 (supF), wird die Expression nicht nur durch Induktion mit IPTG reguliert, sondern auch durch die Konzentration der Suppressor-tRNA. Das Plasmid umfasst auch ein Gen für Ampicillin-Resistenz. In ähnlicher Weise wird auf pSB1649 (28), E. coli lamB durch den induzierbaren lac-Promotor auf dem allgemeinen Plasmid pAC1 reguliert. Für eukaryontische Polypeptide sind allgemeine Virus- Vektoren geeignet, und viele Polypeptide wurden in geeignete Vektoren kloniert. Beispielsweise kann für das polytopische Säuger-Glykoprotein (ICAM-1) (Intercellular Adhesion Molecule-1 ist weiters in III.v.c beschrieben), welches bei einer bevorzugten eukaryontischen Ausführungsform dieser Erfindung geprägt wird, der CDM8 cDNA-Expressionsvektor pCD1.8 in Verbindung mit dem COS-Zellexpressionssystem verwendet werden (148, 159).
Die Vektoren, die das Gen für das geprägte Polypeptid tragen werden repliziert und isoliert. Sie können durch eine Zellpopulation (146), mittels PCR-Techniken (146), oder durch irgendwelche andere, allgemein verwendete, in der Literatur beschriebene Methoden repliziert werden. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden 10&sup8; bis 10¹&sup0;. Kopien des Vektors isoliert. Die genaue Anzahl hängt von der Anzahl verschiedener Klone ab, die zusammen die CISTEM-Zellpopulation bilden, und von der im nachfolgenden Schritt c verwendeten Technik zur Insertion der variablen Oligonukleotide in die Vektoren.

b) Insertion einer Oligopeptid-Markierung in die geprägte Domäne

Das Gen für eine gut charakterisierte Oligopeptid-Markierung ("tag") wird in den Vektor an einer genetischen Stelle insertiert, die der geprägten Domäne des Polypeptids entspricht. Alternativ kann die Oligonukleotid-Markierung eine Nukleotid- Sequenz der natürlich vorkommenden Sequenz ersetzen. Das Ersetzen geschieht durch Herausschneiden einer natürlichen Codier- Region und durch Insertion der Oligonukleotid-Markierung an dessen Stelle. Die Markierung kann jede Peptid-Sequenz sein, von der bekannt ist, dass sie mit hoher Affinität und Spezifität an einen Liganden bindet, der im Handel erhältlich oder durch in der Literatur beschriebene Techniken im Labor leicht herstellbar ist. Ein Beispiel für ein im Handel erhältliches Markierungs/Liganden-Paar ist die T7-Sequenz (Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln- Gln-Met-Gly), die an den T7-Antikörper (von Novagene erhältlich) bindet, wie in der Literatur beschrieben ist (43, TB15-Protokoll von Novagene). Ein Beispiel für ein Markierungs/Liganden-Paar, das in der Literatur beschrieben ist, ist die Aminosäure-Sequenz 36-41 des eukaryontischen Polypeptids Ras und die Ras-bindende Domäne (Aminosäure-Sequenz 51-131) von Raf (18). Die Herstellung und Reinigung von Ras-RBD mittels allgemein praktizierter Techniken ist in der Literatur beschrieben (94). Viele andere Markierungs/Liganden-Paare, wie Hexapeptide, die an spezifische Antikörper binden, sind ebenfalls in der Literatur beschrieben (z. B. 58 und 147). Um das Gen für die Oligopeptid-Markierung an einer genetischen Stelle zu insertieren, die für die geprägte Domäne codiert, kann jede übliche Technik zur Insertion eines Oligonukleotids an einer spezifischen Stelle in einem Vektor verwendet werden (z. B. 23 und 146). Auf mehrere solche Techniken wird oben hingewiesen (III.iv.a), und eine bevorzugte Vorgangsweise ist hier detaillierter beschrieben.
Viele Außenmembran-Polypeptide wurden topologisch kartiert, und diese Karten sind in der Literatur erhältlich (III.iv.a). Unter Verwendung einer topologischen Karte einer Sequenz eines Membran-Polypeptids werden zwei Restriktionsendonuklease-Stellen (Stelle R1 und Stelle R2) identifiziert, von welchen jede im Vektor unik ist und sich in der genetischen Region befindet, die für die geprägte Domäne codiert. Wenn an der gewünschten Insertionsstelle noch nicht zwei unike Restriktionsstellen existieren, können sie hergestellt werden, indem irgendeine aus einer Anzahl von in der Literatur beschriebenen Vorgangweisen verwendet wird (Beispiele für unike Restriktionsstellen, die an einer gewünschten Insertionsstelle hergestellt werden, sind in 28, 29, 141 und 146 beschrieben). Der Vektor wird an den beiden bezeichneten Stellen durch Verdau mit den Restriktions-Endonukleasen R1 und R2 unter Befolgung der Protokolle und Einhaltung der Bedingungen, die von den Lieferfirmen der Enzyme angegeben wurden, gespalten. Dies ergibt einen linearisierten Vektor mit nicht- komplementären klebrigen Enden ("sticky ends") (RS1 und RS2) und ein herausgeschnittenes Fragment. Der linearisierte Vektor wird mittels elektrophoretischer Standard-GrößenfraktionieruTlg (146) isoliert.
Eine Oligonukleotid-Matrize, die das Gen für die Markierung aufweist, wird unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie der Phosphoramitid-Chemie, synthetisiert, oder sie kann von Handels- Labors erhalten werden, die Oligonukeotide anbieten (Methoden zur Synthetisierung von Einzelstrang-Oligonukleotiden sind beschrieben, vgl. 29 und 82). Die Oligonukleotide sind synthetisiert, so dass sie sich 5'-P--R1--Markierungsgen--R2--3' lesen, worin P die Primer-Sequenz für eine "proof-reading" Polymerase, wie Vent®-Polymerase (New England Biolabs) ist, R1 und R2 die oben erwähnten Restriktions-Endonukleasestellen sind, und --Markierungsgen-- die genetische Sequenz ist, die für die Oligopeptid-Markierung codiert. (Es kann notwendig sein, ein oder zwei Extra-Oligonukleotide zu inkludieren, die das Markierungsgen flankieren, so dass die Markierung in frame in Bezug auf das geprägte Polypeptid translatiert wird). Unter Verwendung der Polymerase, deren Primer P ist, wird die Oligonukleotid- Matrize verwendet, um ein Doppelstrang-Oligonukleotid zu erzeugen. Dieses Oligonukleotid wird mit den Restriktions-Endonukleasen R1 und R2 unter Bedingungen verdaut, die von den Enzym- Lieferfirmen beschrieben sind, was ein Oligonukleotid mit den klebrigen Enden RS1' und RS2' ergibt. Dieses Oligonukleotid, das klebrige Enden besitzt, die zum linearisierten Vektor komplementär sind, wird in den Vektor mittels eines allgemeinen Ligationsverfahrens ligiert (146). Das Ergebnis ist, dass das Gen des Vektors für das geprägte Polypeptid die Oligopeptid- Markierung an einer genetischen Stelle trägt, die der geprägten Domäne entspricht.
Eine alternative Vorgangsweise für die Konstruktion des Markierungsgens mit den klebrigen Enden RS1' und RS2' wird bei einigen bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung verwendet. Bei dieser Vorgangsweise werden zwei halb-komplementäre Einzelstrang-Oligonukleotide mittels herkömmlicher Technik (29, 82) synthetisiert oder von einem Labor bezogen, das Oligonukleotide anbietet. Die beiden Einzelstrang-Oligonukleotide werden so synthetisiert, dass sie bei ihrer Anlagerung ein Doppelstrang-Oligonukleotid mit den Sequenzen RS1'--Markierungsgen--R52' bilden. Dieses Doppelstrang-Oligonukleotid wird dann in den oben beschriebenen linearisierten Vektor ligiert.
Ein Beispiel für diese Vorgangsweise ist von einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung vorgesehen, welches die Konstruktion einer E. coli-Population involvierte, die die T7- Markierung (Fig. 9) am Loop IV von OmpA präsentierte. In pEV218 (76) wurde das ompA-Gen so hergestellt, dass es eine Reihe von Restriktions-Endonuklease-Stellen in einer genetischen Region trug, die dem extrazellulären Loop IV des Polypeptids entsprachen (Fig. 9). Dieses Plasmid wurde mit SacI (Enzym und Reaktionspuffer von New England Biolabs) und XbaI (Enzym und Reaktionspuffer von MBI Fermentas) verdaut, was ein Fragment des Restriktionsstellen-Polylinkers und das linearisierte Plasmid ergab. Das linearisierte Plasmid wurde mittels Standard-Gelelektrophorese (146) isoliert. Zwei Einzelstrang-Oligonukleotide wurden mittels herkömmlicher Technik synthetisiert, so dass sie sich wie folgt lesen: Oligonukleotid 1: Oligonukleotid 2:
Die Sequenz in eckiger Klammer weist das Gensegment auf, das für das Oligonukleotid codiert, welches vom T7-Antikörper erkannt wird. Diese beiden Einzelstrang-Oligonukleotide wurden in MBI Fermentas Klenow-Puffer angelagert, wobei sie das Doppelstrang-T7-Markierungs-Gen-Segment mit klebrigen Enden bilden, die komplementär zu den klebrigen Enden an pEV218 waren, das, wie im obigen Absatz beschrieben, von SacI und XbaI linearisiert worden war. Als das Doppelstrang-Oligonukleotid in das linearisierte Plasmid ligiert wurde, war das T7-Markierungs-Gen-Segment in frame mit dem ompA-Gen auf pEV218. Das neue Konstrukt wurde als pEV218T7 bezeichnet.
Nach Insertion des Markierungsgens in den Vektor wird der Vektor verwendet, um eine Population von Zellen zu transformieren, welchen eine chromosomale Kopie des Gens für das geprägte Polypeptid fehlt. Stämme, welchen chromosomale Gene für Außenmembran-Polypeptide fehlen, sind in der Literatur (z. B. 28, 74 und 159), sowie nachstehend im Abschnitt über Zelllinien und Medien (V.iv.g) beschrieben. Herkömmliche Transformationsmethoden (89, 109) werden verwendet, und Transformanten werden durch ihre Expression des vom Vektor getragenen selektierbaren Markers, wie eines Gens für Ampicillin-Resistenz, selektiert. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung, in welcher E. coli OmpA so hergestellt wurde, dass es die T7-Polypeptid-Markierung an Loop IV aufweist, wurde pEV218T7 verwendet, um den E.coli-Stamm UH203 (lac, supF, ompA, recA, proAB, rspL) (74) gemäß einem üblichen Elektrotransformationsverfahren wie folgt zu transformieren.
25 ml einer Übernacht-Kultur von UH203 (Luria-Nährmedium, 37ºC) wurden in 11 LB suspendiert. Die Zellen wurden unter Schütteln bei 37ºC gezüchtet. Als die Kultur OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,5 erreicht hatte, wurden die Zellen 15 min lang auf Eis gekühlt und danach in einem kalten Rotor bei 4000 · g 15 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt. Das Sediment wurde vorsichtig in 11 eiskaltem, 10%igem Glyzerin resuspendiert und wie zuvor zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde drei Mal wiederholt, und die Zellen wurden in 1 ml eiskaltem, 10%igem Glyzerin resuspendiert. 42 ul der Zellsuspension wurden mit 2 ul DNA- (pEV218T7, oben beschrieben)-Lösung (1pg, gelöst in TE) gemischt und 10 min lang auf Eis inkubiert. 40 ul dieser Suspension wurden in eine Elektroporations-Küvette (BIO-RAD Gene Pulser® mit Pulse Controller® wurde verwendet. Die Geräte-Einstellungen waren wie folgt: 2,5kV; 200Ω; 25uF; Zeitkonstante = 4,9 ms) pipettiert. Unmittelbar nach der Elektroporation wurden die Zellen in 60 ul SOC-Medium gewaschen und in ein Kultivierungsröhrchen transferiert. Die Zellen wurden dann 1 h lang bei 37ºC in einem Schüttelkolben sich erholen gelassen. Schließlich wurden die Zellen auf LB-Platten mit 100 ug Ampicillin/ml plattiert.

c) Insertion variabler Oligopeptide in die geprägte Domäne

Es gibt mehrere Wege, um die variablen Oligonukleotide zu erzeugen, die in den Vektor insertiert werden und schließlich in die variablen Regionen, die die CISTEM-Zellpopulation aufweist, translatiert werden. Um die Insertion in die Vektoren zu erleichtern, müssen die variablen Oligonukleotide konservierte Sequenzen an ihren Termini aufweisen, so wie das im vorigen Abschnitt beschriebene Markierungsgen die definierten Termini RS1 und RS2 erhalten hatte. Weil die Nukleinsäuren, die zusammen die SELEX-Bibliotheken (162) ergeben, auch aus zufälligen oder fast zufälligen Sequenzen bestehen, die von stereotypisierten Termini flankiert sind, können die Verfahren, die zur Erzeugung von SELEX-Bibliotheken verwendet werden (vgl. zu diesen Verfahren 82, worin sie im Detail beschrieben sind) auch verwendet werden, um die Oligonukleotid-Inserts zu konstruieren, die hier benötigt werden. Beispielsweise sind in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung variable Oligonukleotide mit definierten Sequenzen an ihren Termini unter Verwendung der Festphasen- Phosphoramidit-Chemie (29,82) leicht zu synthetisieren: an definierten terminalen Positionen wird nur eines der vier Nukleotide für die Addition an die in Synthese befindlichen Stränge zur Verfügung gestellt, wogegen an variablen Positionen eine Mischung aus mehreren Nukleotiden den Strängen präsentiert wird (82). Alternativ kann mit der End-Addition von Basen, katalysiert durch terminale Transferase in Gegenwart nicht- limitierender Konzentrationen mehrerer Nukleotide, eine sehr variable Sequenz an einen definierten Terminus angehängt werden (82). Sehr variable Sequenzen können auch durch Selektion von Fragmenten bestimmter Länge aus dem Verdau von natürlichen Zell- DNA- oder -RNA-Präparationen erhalten werden (146).
Bei einem CISTEM zum Screenen der von einer cDNA-Bibliothek codierten Polypeptide sind die variablen Oligonukleotide die cDNA-Bibliothek-Gene, wobei definierte Sequenzen an die Termini (82) ligiert sind, um die Insertion der Gene in die Vektoren zu erleichtern. Die Größe der cDNA-Bibliothek; die von einem solchen CISTEM gescreent wird, wird bei einigen Ausführungsformen dieser Erfindung reduziert, indem das Screening lediglich auf Gene, an denen Interesse besteht, reduziert wird, was durch einen Vergleich der cDNA-Bibliothek-Gene mit in genomischen Bibliotheken katalogisierten Sequenzen bestimmt wird. Bei einem CISTEM zur Analyse der Wechselwirkung zwischen einem bekannten Polypeptid und einer zweiten bekannten Verbindung, an der Interesse besteht, sind die variablen Oligonukleotide Abschnitte des Gens, das für das bekannte Polypeptid codiert. Beispielsweise sind bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung, bei welcher die Wechselwirkung zwischen den eukaryontischen Zell- signalisierenden Proteinen Ras und Raf analysiert wird, die in pEV218 insertierten Oligonukleotide Abschnitte der Sequenz, die für Ras codiert.
Um die Trunkierung des geprägten Polypeptids zu verhindern, werden Stop-Codons aus variablen Oligonukleotid-Insertsrausgeschlossen. Dies wird erreicht, indem Oligonukleotide so synthetisiert werden, dass sie sich D1(NNP)nD2 lesen, worin D1 und D2 durch die definierten Sequenzen repräsentiert sind, die die Insertion von Oligonukleotiden in Vektoren erleichtern; n stellt die Anzahl von Triplett-Codons dar, die zusammen den variablen Abschnitt jedes Oligonukleotids ausmachen; N stellt alle vier Nukleotide, jedes mit gleicher Wahrscheinlichkeit, dar; und P stellt eine Untergruppe von Nukleotiden, jedes mit gleicher Wahrscheinlichkeit, dar. NNP codiert für alle 20 Aminosäuren, schließt jedoch das Auftreten von Stop-Codons, die durch die CISTEM-Zellpopulation erkannt werden, von vornherein aus. Somit werden, wenn P G, C oder T sein darf, die Stop-Codons TAA und GGA aus den Oligonukleotid-Inserts ausgeschlossen. Die Synthese von Oligonukleotiden, die sich D1(NNP)nD2 lesen, durch Festphasen-Phosphoramidit-Chemie oder durch terminale End-Additions- Transferase ist in der Literatur beschrieben (28, 82). Es ist nicht notwendig, das Auftreten aller dreier Stop-Codons in insertierten Oligonukleotiden von vornherein auszuschließen, weil die CISTEM-Zellpopulation aus Stop-Codon-supprimierenden Mutanten zusammengesetzt werden kann, die eines oder mehrere der Stop-Codons translatieren können. Zahlreiche Suppressor-Stämme sind in der Literatur beschrieben (z. B. 28, 76).
Wenn das geprägte Polypeptid ein Glykoprotein oder Proteoglykan ist, können die insertierten Oligonukleotide Consensus- Sequenzen für N-verbundene Glykosylierung (41) mit umfassen. Diese werden als definierte Sequenzen snythetisiert, die die variable Sequenz jedes Oligonukleotids unterbrechen. Bei CISTEMs, die ein Element eines Struktur-Designs beinhalten, können variable Oligonukleotid-Inserts eine Mischung aus definierten und variablen Positionen, Sequenzen, die für feststehende Motive codieren, oder statistische Vorlieben für bestimmte Sequenzen oder Strukturen beinhalten.
Die variablen Oligonukleotide werden an einer vorgeschriebenen Stelle in den Vektoren, die mittels in Schritt a beschriebener Verfahren konstruiert und amplifiziert wurden, insertiert. Zwei bevorzugte Vorgangsweisen für eine genau gezielte Insertion sind hier beschrieben - eine, bei welcher die Anzahl der in jeden Vektor insertierten Oligonukleotide definiert ist, und eine andere, bei welcher die Anzahl der Inserts variabel ist. Die zur Verfügung stehenden Vorgangsweisen zur Insertion von Oligonukleotiden an spezifischen Vektor-Stellen sind gewiss nicht auf die beiden hier beschriebenen beschränkt. Tatsächlich kann jede der Genfusionstechniken, die zur Insertion eines für einen Reporter-Teil codierenden Gens in das Gen für ein Membran- Protein (III.iv.a) verwendet werden, mit derselben Wirkung wie die Vorgangsweisen, die beschrieben werden, angewandt werden.
Die Insertionsstelle im Vektor ist so angeordnet, dass dort insertierte Oligonukleotide als Teil der geprägten Domäne translatiert werden. Die Stelle der Insertion kann weiter spezifi ziert sein (d. h. innerhalb der Sequenz, die für die geprägte Domäne codiert) gemäß einer Strukturanalyse oder Vorschriften für eine besondere Art der Wechselwirkung zwischen der geprägten Domäne und der Zielverbindung. Zur Insertion von Oligonukleotiden werden bei beiden der hier skizzierten Vorgangsweisen Restriktions-Endonuklease-Stellen, die im Vektor unik sind, verwendet, und sie befinden sich an oder nahe der vorgeschriebenen Insertionsstelle. Wenn eine unike Restriktionsstelle an der Insertionsstelle noch nicht vorhanden ist, so kann eine hergestellt werden, indem eine von einer Anzahl von in der Literatur beschriebenen Vorgangsweisen (z. B. 28, 29, 141 und 146) verwendet wird.
Um nur ein einziges variables Oligonukleotid pro Vektor zu insertieren, müssen zwei verschiedene Restriktionsstellen, von welchen jede im Vektor unik ist, so angeordnet sein, dass sie ein kurzes Restriktionsfragment, das die vorgeschriebene Insertionsstelle enthält, flankieren. Wenn die klebrigen Enden, die durch Spaltung des Vektors mit einer Endonuklease (R1) an ihrer uniken Stelle zurückbleiben, RS1 und RS1' sind, während Schneiden mit der anderen Endonuklease (R2) an ihrer uniken Stelle die klebrigen Enden RS2 und RS2' zurück lässt, dann erhalten die variablen Oligonukleotide, die in Schritt 3 erzeugt werden, die definierten und konservierten klebrigen Enden RS1 und R52'. Die Vektoren werden von beiden Restriktions-Nukleasen (R1 und R2) verdaut, und die Verdau-Produkte werden Größen-fraktioniert, um die Vektoren zu isolieren, von welchen jeder nicht-komplementäre klebrige Enden RS1' und RS2 aufweist. Die Population der Restriktions-verdauten Vektoren wird mit einer etwas kleineren Population variabler Oligonukleotid-Inserts (Vektoren/Insert 1,5-2,0) vereinigt, und man lässt die Ligation stattfinden. Da die klebrigen Enden der Vektoren zueinander nicht komplementär sind, kann jeder Vektor weder "shut" ligieren, noch mit anderen Vektoren ligieren. In ähnlicher Weise können die Oligonukleotid- Inserts, da sie nicht-komplementäre klebrige Enden RS1 und RS2' aufweisen, weder zu Loops selbst-ligieren, noch miteinander zur Bildung von Konkatemeren multipler Oligonukleotide ligieren. Die einzige Ligation, die stattfinden kann, ist die Insertion eines variablen Oligonukleotids in jeden Vektor. Nachdem die Ligation stattgefunden hat, wird die Vektor-Population Größen-fraktio niert, um Vektoren, die kein Insert erhalten haben, zu verwerfen. In der resultierenden Vektor-Population hat jeder Vektor ein variables Oligonukleotid an der vorgeschriebenen Stelle in der Region, die für die geprägte Domäne codiert.
Ein Beispiel für diese Vorgangsweise zur Insertion nur eines einzigen variablen Oligonukleotids pro Vektor wird von einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung geliefert, bei welcher eine Zellpopulation so hergestellt wird, dass sie variable Oligopeptide an Loop IV von E. coli ompA aufweist. In pEV218 (76) wurde das ompA-Gen so hergestellt, dass es einen Polylinker mit vielen Restriktions-Endonuklease-Stellen an einer genetischen Region, die dem extrazellulären Loop IV des Polypeptids entspricht, trägt (Fig. 14). Dieses Plasmid wird mit SacI (Enzym und Reaktionspuffer von New England Biolabs) und XbaI (Enzym und Reaktionspuffer von MBI Fermentas) unter von den Lieferfirmen beschriebenen Bedingungen verdaut, was ein Fragment des Restriktionsstellen-Polylinkers und das linearisierte Plasmid ergibt. Das linearisierte Plasmid wird mittels Standard-Gelelektrophorese (146) isoliert. Einzelstrang-Oligonukleotide werden mittels herkömmlicher Technik (29) so synthetisiert, dass sie sich 5'GGTCTAGA(VNN)nCGAGCTC3' lesen, worin N alle vier Nukleotide, jedes mit gleicher Wahrscheinlichkeit, bedeutet; Cnd V für C, G oder A, jedes mit gleicher Wahrscheinlichkeit, steht. Unter Verwendung von in der Literatur (29) beschriebenen allgemeinen Protokollen werden ein 5'-Primer und eine "proof-reading"- Polymerase, wie die Vent®-Polymerase, verwendet, um Doppelstrang-Oligonukleotide aus den Einzelstrang-Matrizen zu erzeugen. Diese doppelsträngigen, sehr variablen Oligonukleotide werden dann mit SacI und XbaI unter von den Lieferfirmen beschriebenen Bedingungen verdaut, was sehr variable Oligonukleotide mit nichtkomplementären klebrigen Enden 5'-CTAG und AGCT-3' ergibt. Die sehr variablen Oligonukleotide werden dann in das linearisierte Plasmid ligiert (MBI-Ligationspuffer, Bedingungen von der Lieferfirma beschrieben); sie ligieren in nur ein Oligo pro Plasmid, und in nur einer Orientierung. Herkömmliche elektrophoretische Größen-Fraktionierung (146) wird verwendet, um ligierte Plasmide, die ein Insert enthalten, zu isolieren. Das Produkt dieser Vorgangsweise ist eine Population von Plasmiden (pEV218I), die an der genetischen Stelle, die dem Loop IV von OmpA entspricht, eine sehr variable exogene Sequenz tragen, die frei von TAA- und TGA-Stop-Codons ist.
Zur Konstruktion einer Vektor-Population, in welcher jeder Vektor zwischen 0 und n variable Oligonukleotide an einer vorgeschriebenen Stelle trägt, kann die folgende Vorgangsweise verwendet werden. Zuerst befindet sich eine Restriktionsstelle, die im Vektor unik ist, an der vorgeschriebenen Insertionsstelle, d. h. an einer genetischen Stelle, die der geprägten Domäne des geprägten Polypeptids entspricht. (Wenn an der gewünschten Stelle noch keine unike Restriktionsstelle vorhanden ist, kann eine solche mittels herkömmlicher, in der Literatur beschriebener Methoden, wie Oligonukleotid-directed Mutagenese (z. B. 28 und 76) hergestellt werden. Wenn die Endonuklease (R), die an dieser uniken Stelle schneidet, komplementäre klebrige Enden RS und RS' zurücklässt, dann erhalten die variablen Oligonukleotide, die mittels der oben beschriebenen Vorgangsweisen erzeugt worden sind, definierte und konservierte komplementäre klebrige Enden RS und RS'. Die Vektoren, die das Gen für das geprägte Polypeptid tragen, werden durch R geschnitten. Die Vektoren werden dann mit einem Überschuss an variablen Oligonukleotid-Inserts vereinigt. Mehrere verschiedene Ligations- Vorgänge können stattfinden. Zuerst können die Vektoren, die komplementäre klebrige Enden RS und RS' aufweisen, an andere Vektoren ligieren oder selbst-ligieren, wobei sie sich ohne ein Oligonukleotid-Insert schließen. Zweitens können die variablen Oligonukleotide, die auch komplementäre klebrige Enden RS und RS' aufweisen, i) als Loop selbst-ligieren, ii) in einen Vektor mit den klebrigen Enden RS und RS' ligieren, iii) miteinander ligieren, wobei sie eine Multi-Oligonukleotid-Verkettung bilden, die selbst die Ligationen i, ii oder iii vollziehen kann. Nach der Ligation kann die Größen-Fraktionierung verwendet werden, um alle Inserts, die nicht in einen Vektor ligiert haben, und alle Vektoren, die keine Inserts erhalten haben, zu verwerfen. Dies ergibt eine Vektoren-Population, von welchen jeder zwischen 1 und n variable Oligonukleotide an der vorgeschriebenen Stelle im Gen, das für das geprägte Polypeptid codiert, aufweist. Ein spezifisches Beispiel für dieses Verfahren zur Konstruktion einer Vektor-Population, in welcher jeder Vektor zwischen 0 und n variable Oligonukleotide an einer vorgeschriebenen Stelle aufweist, ist in der Literatur zu finden (die Konstruktion einer solchen Bibliothek von Vektoren ist detailliert in 28 und 29 beschrieben).
Die Vektoren, welche variable Oligonukleotid-Inserts tragen, werden zur Transformation einer Population von Zellen verwendet, denen das Gen für das geprägte Polypeptid fehlt. Herkömmliche Transformationsmethoden (89, 109) können verwendet werden. Transformanten werden durch ihre Expression des vom Vektor getragenen selektierbaren Markers, wie eines Gens für Antibiotika-Resistenz, selektiert. (Eine effiziente Transformation kompetenter prokaryontischer Zellen erreicht bis zu 10&sup9; Transformanten/ml. Das Produkt der Transformation ist eine Population von Zellen, von welchen jede eine unterscheidende Oligonukleotid-Insertion an einer genetischen Stelle trägt, die einem Punkt in der geprägten Domäne entspricht. Nach der Transformation wird die Zellpopulation durch Wachstum in einem geeigneten Medium amplifiziert (V.iv.g).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung, bei welcher die CISTEM-Zellpopulation so hergestellt wird, dass sie variable Oligopeptide an Loop IV von E. coli OmpA aufweist, wird die Transformation auf folgende Weise durchgeführt. Die variable Plasmid-Population, pEV218I, deren Konstruktion oben beschrieben wurde, wird zur Transformation von E. coli Stamm UH203 (lac, supF, ompA, recA, proAB, rpsL) (dieser Stamm, seine Vermehrung und seine Transformation sind vollständiger in 74 beschrieben) gemäß einem allgemeinen Transformationsverfahren, das in der Literatur beschrieben ist (74, 76, 109), verwendet. Die UH203- Population wird in mit 100 ug Ap/ml ergänztem Luria-Nährmedium, gezüchtet, wobei auf AP-Resistenz der Transformanten selektiert wird.
Die Expression des geprägten Polypeptids wird mit der für den Promotor des Vektors geeigneten Verbindung induziert. So wird beispielsweise bei der oben erwähnten bevorzugten Ausführungsform die Population von UH203, die mit pEV218I transformiert ist, mit Im IPTG induziert. Dies ergibt eine Population von Zellen, die so viele Klone umfasst, als Transformanten im vorigen Schritt vorhanden waren. Jeder Klon weist ein unterschiedliches Oligopeptid an der geprägten Domäne auf. Wenn das geprägte Polypeptid ein Glykoprotein oder ein Proteoglykan ist, tragen die Glykosylierungsstellen in der geprägten Domäne diverse und unvorhersagbare Oligosaccharide. (Allgemein praktizierte Verfahren zur Verifizierung, dass eine extrazelluläre Domäne in diesem Fall, die geprägte Domäne - glykosyliert wurde, sind in der Literatur (62) beschrieben.) Kurz gesagt zeigt die CISTEM-Zell-Population eine umfassende kombinatorische Bibliothek von Proteinen, Glykoproteinen oder Proteoglykanen.

d) Genetische Manipulationen des geprägten Polypeptids

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein CISTEM konstruiert, bei welchem das geprägte Polypeptid ein polytopisches Membran-Protein ist, in welchem die Domäne, die Insertionen annimmt, direkt angrenzt an die Adhäsionsdomäne eines toxischen Agens, welches für die Verwendung im CISTEM geeignet ist. Diese bevorzugte Konfiguration ist in Fig. 5 dargestellt, und mehrere der Kombinationen von Polypeptid/toxischem Agens, die diese Konfiguration aufweisen, sind in Tabelle 1, unter "Hintergrund" (III.v) und in der Literatur (165) angeführt. Wenn diese Polypeptid/Pathogen-Kombinationen oder andere gleich diesen, verwendet werden, wird das CISTEM mit einem Minimum an genetischer Manipulation am geprägten Polypeptid zusammengesetzt; die einzige notwendige Manipulation ist die Einführung einer Oligopeptid-Markierung ("tag"), sowie variabler Peptidsequenzen an der geprägten Domäne, wie oben beschrieben. Die Liste der Polypeptide, die geprägt werden können, ist keinesfalls auf polytopische Proteine, die aneinander angrenzende Adhäsions- und geprägte Domänen aufweisen, beschränkt. Zur Erhöhung der Diversität der Polypeptide, die mittels CISTEMs geprägt werden können, werden zwei genetische Manipulationen verwendet.
Wenn sezernierte Proteine geprägt werden, so werden sie zuerst in ihre Glykolipid- oder Transmembran-verankerten Isoformen übergeführt. Da die Translokation sezernierter Proteine und die Membran-Insertion integraler Proteine vom selben Zellmechanismus bewerkstelligt werden (vgl. 153 und voranstehend in III.iii), können viele sezernierte Proteine einfach durch Carboxyl-terminale Befestigung eines hydrophoben Transmembran-Bereiches oder einer Signal-Sequenz für Glykolipid-Addition in Membran-gebundene Isoformen übergeführt werden. Beispielsweise kann das Gen- Fragment, das für die 37-Carboxyl-terminalen Aminosäuren des Zerfall-beschleunigenden Faktors codiert, ein eukaryontisches Glykophospholipid-verankertes Protein, mit dem Gen für ein sezerniertes Protein, wie das menschliche Wachstumshormon, fusioniert werden, zwecks Targeting und Verankerung des Proteins an der apicalen Oberfläche humaner Darmzelllinien. Diese Vorgangsweise zur Überführung eines sezernierten Proteins in seine Glykolipid-verankerte Isoform ist in der Literatur beschrieben (36, 37, 112). Die Überführung sezernierter Polypeptide in Isoformen, die durch transmembrane Bereiche verankert sind, ist ebenfalls in der Literatur beschrieben. Beispielsweise kann Heparin-bindender epidermaler Waschstumsfaktor-artiger Wachstumsfaktor (HB-EGF) als längere, Membran-überspannende Isoform (HB-EGFTMII) exprimiert werden, die eine extrazelluläre Domäne aufweist, welche strukturell mit dem sezernierten Polypeptid identisch ist (132). In ähnlicher Weise kann das Lymphozyten- Differenzierungs-Antigen CD8 entweder als Glykoprotein, das an der Membran durch eine hydrophobe Domäne verankert ist, oder als sezerniertes Polypeptid, in welchem ein Bereich von 38 Aminosäuren, einschließlich des Transmembran-Bereiches, deletiert ist (79), exprimiert werden. Andere Beispiele und Techniken für die Überführung sezernierter Polypeptide in Isoformen, die durch Transmembran-Bereiche verankert sind, sind in der Literatur beschrieben (128, 142, 172).
Eine zweite genetische Manipulation des geprägten Polypeptids wird durchgeführt, wenn der zu prägenden Domäne eine angrenzende Adhäsionsdomäne fehlt. Dies ist der Fall, wenn das für die Prägung gewählte Polypeptid nicht polytopisch ist, oder wenn die toxischen Agenzien, die an Domänen angrenzend an die geprägte Domäne anhaften, unbekannt oder für die Verwendung im CISTEM schlecht geeignet sind. In jedem Fall wird die Sequenz für eine funktionelle Adhäsionsdomäne mit dem Gen für die extrazelluläre Domäne fusioniert, wodurch ein Gen für ein chimäres Polypeptid geschaffen wird, welches sowohl die funktionelle Adhäsionsdomäne als auch die variable Domäne aufweist. Beispielsweise bleibt die Colicin-A-Adhäsionsdomäne von E. coli OmpF, wenn sie an separate Domänen von einem anderen Außenmembran-Protein, OmpC, fusioniert wird, als Colicin-A-Rezeptor funktionell (69). Eine Gruppe eukaryontischer Virus-Systeme, die in der Literatur (44, 101) beschrieben ist, liefert weitere Beispiele für die Insertion funktioneller Adhäsionsdomänen. In ihrer Anwendung auf Aus führungsformen dieser Erfindung funktionieren diese Systeme wie folgt. Die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers (scA) wird an der Oberfläche eines Virus, wie eines Milz-Nekrose-Virus, präsentiert, wie in der Literatur beschrieben (44, 101). Das Antigen, das vom scA erkannt wird, wird dann als ein exogenes Insert in der extrazellulären Domäne, die als Adhäsionsdomäne des geprägten Polypeptids dienen wird, exprimiert. (Techniken zur Insertion exogener Sequenzen an angepeilten Stellen in extrazellulären Domänen sind oben (V.iv.b) beschrieben, und unter "Hintergrund" (III.iv.a) wurde ausführlich darauf Bezug genommen). Auf diese Weise wird eine funktionelle Adhäsionsdomäne für den Virus an der gewünschten Stelle, direkt angrenzend an die geprägte Domäne, erzeugt.
Um die bisher beschriebenen Manipulationen am geprägten Polypeptid kurz zusammenzufassen, kann ein sezerniertes Polypeptid in eine Membran-gebundene Isoform übergeführt werden, und eine funktionelle Adhäsionsdomäne kann neben der Domäne, die durch diese Erfindung geprägt werden soll, insertiert werden. Auf Grund dieser Manipulationen kann jede der in Fig. 1 gezeigten Polypeptid-Familien durch diese Erfindung geprägt werden.

e) Prägung von Polypeptiden in der Wechselwirkungsanalyse oder Epitop-Kartierung

Wenn diese Erfindung zur Identifikation von Polypeptiden, die mit einer gegebenen Zielverbindung in Wechselwirkung treten, verwendet wird, kann das geprägte Polypeptid des CISTEM jedes für eine Prägung geeignete Außenmembran-Polypeptid sein. Beispielweise ist bei einem CISTEM, der Polypeptid-Sequenzen identifiziert, die mit dem eukaryontischen Zell-signalisierenden Polypeptid Raf (V.iii) in Wechselwirkung treten, das geprägte Polypeptid E. coli OmpA. Das extrazelluläre Loop IV von OmpA wird geprägt, so dass es eine hohe Affinität für Raf-RDB (V.iii) aufweist. Die auf ihre Affinität für Raf-RBD selektierten Sequenzen werden dann verwendet, um Sequenz-Bibliotheken und cDNA-Bibliotheken aus Säuger-Zellen mit aktiven Ras-Raf-Reaktionsabläufen zu screenen.
Auf ähnliche Weise kann, wenn diese Erfindung zur Epitop- Kartierung angewendet wird, das geprägte Polypeptid jedes für eine Prägung geeignete Außenmembran-Polypeptid sein. Beispiels weise wird das CISTEM, das OmpA so prägt, dass es an Raf-RBD bindet, verwendet, um die Oberfläche der Wechselwirkung zwischen den Zell-signalisierenden Polypeptiden Ras und Raf zu kartieren. Abschnitte des Gens, das für Ras codiert, werden in die genetische Stelle insertiert, die für E, coli OmpA Loop IV codiert. Das CISTEM selektiert dann Klone, die Abschnitte von Ras aufweisen, welche eine hohe Affinität für Raf haben. Auf diese Weise identifiziert das CISTEM die Epitope an Ras, die an Raf binden.

f) Prägung von Polypeptiden, damit sie eine funktionelle Aktivität aufweisen

Bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung prägen Polypeptide so, dass sie eine funktionelle Aktivität aufweisen. Von diesen prägen die bevorzugten Ausführungsformen Polypeptide, die natürlicherweise für die Durchführung der von ihnen gewünschten Funktionen gut geeignet sind. (Die unter "Hintergrund" (III.ii) dargelegten Struktur- und Funktionskategorien ergeben einen Überblick über die Neigungen, die bestimmte Familien der Außenmembran-Polypeptide zeigen.) Beispielsweise sind die Polypeptide vom Typ Ia im allgemeinen kompetent für Funktionen, bei denen eine Adhäsion auf Grund hoher Affinität oder eine spezifische Bindung an extrazelluläre Zielverbindungen eine Rolle spielen. Sie sind daher gut geeignet, um für die Verwendung als hochspezifische Marker oder Antagonisten kleiner Polypeptide, wie kleiner Peptid-Hormone, geprägt zu werden. Anderseits sind die Polypeptide vom Typ II oft Enzyme mit extrazellulären aktiven Stellen, wie Glycosyltransferasen. Einige Polypeptide vom Typ II sind dann gut geeignet, um so geprägt zu werden, dass sie eine enzymatische Aktivität aufweisen. Wenn diese Erfindung verwendet wird, um ein Polypeptid zu prägen, damit es als funktionell aktiver Effektor dient, ist das vorzugsweise geprägte Polypeptid eine Membran-gebundene Isoform eines sezernierten Proteins, wie eines menschlichen Wachstumshormons.
Weiters ist das geprägte Polypeptid bei bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung ein Molekül, das natürlicherweise eine Funktions- oder Strukturhomologie mit Molekülen aufweist, die Funktionen ausüben, welche jenen, die man vom geprägten Polypeptid wünscht, ähnlich oder mit diesen identisch sind. Beispielsweise fand man Struktur-Homologe zu E. coli OmpA in Haemophilus, Shigella, Neisseria, Bordetella und Streptococcus. (Die Sequenzen und Funktionen von Homologen zu E. coli OmpA sind in 15, 25-27, 78, 84, 85, 108, 154, 160 und 167 beschrieben). Bei diesen virulenten Bakterien spielen die OmpA-Homologe eine Rolle bei der Adhäsion an Wirts-Geweben und werden oft durch die spezifische Immunantwort des Wirtes erkannt. Die Struktur- Homologie zwischen OmpA und diesen antigenen Adhäsinen führt dazu, dass OmpA gut geeignet ist für eine Prägung zur Verwendung in Fällen, die eine Mimikry homologer Adhäsine erfordern. Zwei derartige Anwendungsfälle sind die kompetitive Inhibierung mikrobieller Adhäsion und die Impfung, was später detaillierter beschrieben wird (VI).
Anders als bei vielen anderen Formen der kombinatorischen Chemie (III.vi) können mit dieser Erfindung Bibliotheken von Polypeptiden, die von eukaryontischen Zellen exprimiert wurden, gescreent werden. Dadurch wird der Umfang der für diese Erfindung zugänglichen Moleküleigenschaften stark erweitert, denn eukaryontische Polypeptide weisen Saccharide auf, eine zweite Gruppe extrem komplexer, chemisch unterschiedlicher Moleküle (III.ii.d). Die Oligo- und Polysaccharide, die an der geprägten Domäne hängen, sind nicht auf dieselbe systematische Art verschieden wie die zu Grunde liegende Polypeptid-Sequenz, weil, wie unter "Hintergrund" (III.ii.d) beschrieben, das an einer bestimmten Stelle an einem Polypeptid hängende Saccharid-Molekül keine einfache Funktion der lokalen Aminosäure-Sequenz ist. Statt dessen wird die Glykosylierung an einer Stelle in komplexen und unvorhersehbaren Weisen durch Änderungen an der lokalen Sequenz oder an der Sequenz an anderer Stelle im Polypeptid (111) verändert. Daher wird, wenn die Glykosylierungsstellen innerhalb der geprägten Domäne erhalten bleiben, während unmittelbar flankierende Regionen durch das oben beschriebene Verfahren variiert werden (V.iv.c), eine semirandomisierte Diversität von Zuckerstrukturen an eine systematische Diversität von Polypeptidsequenzen angehängt, wodurch eine komplexe Glykoprotein- oder Proteoglykan-Bibliothek geschaffen wird.
Wenn die Zielverbindung eines CISTEMs von Natur aus mit glykosylierten Polypeptiden in Wechselwirkung tritt (d. h., die Zielverbindung in ihrer natürlichen Konstellation an Glyko proteine oder Proteoglykane bindet), so ist bevorzugt, dass das geprägte Polypeptid glykosyliert ist. Dazu ist es notwendig, dass die CISTEM-Zellpopulation eukaryontisch ist. Die Adhäsionen, die einer Entzündung, Blutgerinnung, den Wechselwirkungen zwischen Spermium und E1 und der interzellulären Erkennung zu Grunde liegen, werden alle durch Glykoproteine oder Proteoglykane vermittelt. Daher sind für die Identifikation von Molekülen zur Verwendung als Antagonisten oder Agonisten bei diesen Vorgängen CISTEMs mit eukaryontischen Zellpopulationen und glykosylierten, geprägten Domänen bevorzugt.
Die unvorhersehbaren Auswirkungen einer Peptidsequenz- Variation nach einer Glykosylierung im gesamten Polypeptid verdienen einen Hinweis zur Vorsicht. Da Veränderungen an einer Peptidsequenz die Glykosylierung an vollständig verschiedenen Domänen eines Polypeptids verändern können, darf das toxische (pathogene) Agens des CISTEM keine spezifische Glykosylierung an seiner Adhäsionsdomäne benötigen. Andernfalls werden durch unerwartete Änderungen in den Zuckern, die an der Adhäsionsdomäne hängen, einige Zellen gegen das pathogene Agens immun, selbst wenn sie die Zielverbindung nicht an ihren geprägten Domänen binden. Wie zuvor festgestellt, muss die Adhäsionsdomäne eines bei einem CISTEM verwendeten pathogenen Agens gut charakterisiert sein (III.v). In den meisten Fällen zeigt die Charakterisierung, ob das Agens für die Adhäsion Glykosylierungen braucht oder nicht. Dies kann außerdem durch Entfernen von Glykosylierungen vom Rezeptor und Testen auf Empfänglichkeit für das Agens verifiziert werden; Methoden zum Entfernen von Glykosylierungen sind in der Literatur beschrieben (62, 111).
Zur Verwendung als geprägte Polypeptide in Ausführungsformen dieser Erfindung werden Polypeptide, die eine strukturelle Integrität aufweisen, bevorzugt. Es ist besonders bevorzugt, dass sie nicht nur ihre Eigenschaften bei Freisetzung von der Zelloberfläche beibehalten, sondern auch unter den Umgebungsbedingungen - möglicherweise in vivo - in welchen die geprägten Moleküle letztlich angewendet werden, Stabilität zeigen. Unter den prokaryontischen Polypeptiden sind β-Barrels außergewöhnlich stabil; sie können nur durch Kochen in starken Detergentien (141) denaturiert werden. Und in eukaryontischen Polypeptiden verleiht die Glykosylierung andernfalls verformbaren Protein- Strukturen (111) oft eine Strukturstabilität. In einigen Fällen kann die strukturelle Integrität geprägter Domänen durch genetische Manipulationen erhöht werden. Solche Manipulationen können vor oder nach der Prägung vorgenommen werden, und sie können verwendet werden, um die Stabilität von Strukturen, die an der Außenmembran befestigt oder von dieser freigesetzt werden, zu erhöhen.
Genetische Manipulationen an den geprägten Polypeptiden können auch verwendet werden, um ein Element eines rationalen Struktur-Designs in ein CISTEM einzuführen. Die Strukturanalyse der Zielverbindung, ihrer nativen Liganden oder Moleküle, die natürlicherweise Funktionen ausüben, die jenen, die man vom geprägten Polypeptid wünscht, ähnlich sind, können die Insertion orbestimmter Motive in die geprägten Polypeptide leiten. Eine Neigung zur Bildung bestimmter struktureller Motive, wie α- Helices, kann in die geprägten Domänen eingebaut werden durch die Insertion variabler Oligopeptide, welche nicht vollkommen randomisiert sind, sondern statt dessen eine statistische Neigung für Sequenzen aufweisen, die die gewünschten Motive bilden. Vorbestimmte Motive können auch in die konservierten Regionen geprägter Domänen insertiert werden. Beispielsweise können Polyprolin oder α-Helices verwendet werden um eine variable Region von der Zelloberfläche weg zu verlängern, wodurch sie für ein verborgenes Epitop an der Zielverbindung mehr zugänglich wird. Obgleich eine genetische Manipulation auf Grund von Informationen der Strukturanalyse keinesfalls für CISTEMs notwendig ist, kann sie in Verbindung mit CISTEMs verwendet werden, um Polypeptide zu designen, die für die Ausübung gewünschter Funktionen gut geeignet sind.

g) Zelllinien und Medien

Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Zellpopulation des CISTEM aus Zellen, welchen eine chromosomale Kopie des Gens für das geprägte Polypeptid fehlt, die aber fähig sind, nach Transfektion mit einer episomalen oder von einem Vektor getragenen Kopie dieses Gens das geprägte Polypeptid zu translatieren, exportieren und in der Außenmembran zu insertieren. Somit setzt beispielsweise bei mehreren bevorzugten CISTEMs, die E. coli OmpA (III.iv.a) so prägen, dass sie an eine von mehreren Zielverbindungen binden (V. iii.VI), der E. coli-Stamm UH203 (74), der ompA ist, die CISTEM-Zellpopulation zusammen. In ähnlicher Weise setzt bei CISTEMs, die E. coli LamB (III.iv.a) so prägen, dass sie eine Zielverbindung, E. coli Stamm 51755 (28) binden, welcher das lamB-Gen fehlt, die Zellpopulation zusammen. Ein eukaryontisches Beispiel wird von mehreren bevorzugten eukaryontischen CISTEMs geliefert, die humanes ICAM-1 so prägen, dass es an irgendeine von mehreren Zielverbindungen bindet. Bei diesen CISTEMs werden COS-7-Zellen verwendet; diesem Stamm fehlt ICAM-1, er wird aber leicht mit einem ICAM-1-Gen, das am CDM8-Expressions-Vektor getragen wird, transfiziert (das COS-7/CDM8-Expressionssystem ist in 148 und 158 beschrieben).
Die Stämme, die CISTEM-Zellpopulationen zusammensetzen, sind vorzugsweise Stop-Codon-Suppressoren; das heißt; sie erkennen eines der Stop-Codons, wie das UAG, als translatierbares Codon. Der Grund hiefür ist, dass alle vom die CISTEM-Zellpopulation zusammensetzenden Stamm erkannten Stop-Codons aus den variablen Oligonukleotiden, die in das vom Vektor getragene Gen für das geprägte Polypeptid insertiert sind, ausgeschlossen werden müssen. (Die Synthese variabler Oligonukleotide, die frei von bestimmten Stop-Codons sind, und ihre Insertion in das Gen für das geprägte Polypeptid sind voranstehend beschrieben (V.iv.c).) Daher wird die Synthese variabler Oligonukleotide vereinfacht, wenn die CISTEM-Zellpopulation eines der Stop-Codons erkennen kann. Beispielsweise ist E. coli UH03, das bei mehreren bevorzugten CISTEMs für die Prägung von OmpA verwendet wird, supF, d. h. fähig, das UAG-Stop-Codon zu translatieren. Folglich müssen variable Oligonukleotide, die in den OmpA-Vektor (pEV218) insertiert sind, frei von den Stop-Codons UAA und UGA, nicht aber von UAG, sein. Dies wird mittels des oben beschriebenen Syntheseverfahrens (V.iv.c) leicht erreicht. Auf ähnliche Weise ist S1755, der Stamm, der in CISTEMs, die LamB prägen, verwendet wird, supE44, d. h. fähig, UAG zu translatieren.
Das Medium, in welchem die CISTEM-Zellpopulation vermehrt wird, hängt einfach vom Stamm ab, welcher die Population zusammensetzt. Beispielsweise wird E. coli UH203 in Luria-Nährmedium oder Agar gezüchtet. Wenn ein Stamm ein Plasmid mit einem Antibiotika-Resistenz-Gen enthält, werden die passenden Antibiotika zum Medium oder zum Agar zugegeben. Standard-Medien für alle üblicherweise verwendeten Stämme prokaryontischer und eukaryon tischer Zellen sind in der Literatur beschrieben (10). Die Bedingungen für die Transformation von CISTEM-Zellen mit dem das geprägte Polypeptid tragenden Vektor hängen auch vom Zelltyp ab und sind sowohl voranstehend (V.iv.a) als auch in der Literatur (109, 146) näher beschrieben. Die Induktion der Expression des geprägten Polypeptids erfordert eine Inkubation der Zellpopulation mit der Verbindung, die den induzierbaren Promotor des geprägten Polypeptids aktiviert (V.iv.a). Wie voranstehend beschrieben sind jedoch bestimmte induzierbare Promotoren, wie die lac-Promotor/Operator-Elemente, "durchlässig" ("leaky"), so dass sie eine geeignete Expressionsmenge des geprägten Polypeptids ohne jegliche Induktion ermöglichen.
Wenn die CISTEM-Zellpopulation mit einer Suspension oder Lösung der Zielverbindung inkubiert wird, enthält das Medium im Allgemeinen nur die Mindesterfordernisse für eine Aufrechterhaltung der Zellen zusätzlich zur Zielverbindung. Das Vorhandensein reichlicher Makromoleküle, die nicht die Zielverbindung sind, kann zur Selektion auf Klone führen, deren geprägte Domäne nicht an die Zielverbindung bindet, sondern statt dessen an einen der Bestandteile des Mediums. So werden beispielsweise bei bevorzugten CISTEMs, die OmpA prägen, E. coli UH203 in Gegenwart irgendeiner von mehreren Zielverbindungen in ATCC-Medium 52 inkubiert (10). Bei einigen CISTEMs wurde jedoch Luria-Nährmedium verwendet. Bei mehreren bevorzugten CISTEMs zur Prägung von ICAM-1 werden COS-Zellen mit der Zielverbindung in TC Minimal Medium Eagle oder Minimal TC Medium 99 inkubiert (10). Minimal-Medien für andere, üblicherweise verwendete prokaryontische und eukaryontische Zelllinien sind in der Literatur beschrieben (10). Die Konzentration der Zielverbindung und die Dauer der Inkubation sind für die CISTEM-Funktion wichtig und sind detailliert in einem späteren Abschnitt besprochen (V.v).
Wenn die Erfindung zur Identifizierung funktionell aktiver Polypeptide, wie von Enzymen oder Inhibitoren der biologischen Aktivität einer Zielverbindung, verwendet wird, findet die Inkubation mit der Zielverbindung unter chemischen und Wärmebedingungen statt, die jenen, unter welchen das geprägte Polypeptid letztlich angewendet wird, so ähnlich wie möglich sind. Beispielsweise prägt ein bevorzugtes eukaryontisches CISTEM ICAM-1 so, dass es als Antagonist für die Wechselwirkung von HIV gp 120 mit dem Rezeptor CD-4 dient (114). Bei diesem CISTEM wird die Zellpopulation mit der Zielverbindung, dem voranstehend beschriebenen löslichen HIVgp120 (V.iii) bei einer Temperatur und Ionenkonzentrationen inkubiert, die jenen von humanem extrazellulärem Fluid angenähert sind (Tabelle 2). Bei der Anwendung der Erfindung auf die Wechselwirkungsanalyse oder Epitop-Kartierung findet die Inkubation unter chemischen und Wärmebedingungen statt, die jenen, in welchen die untersuchte Wechselwirkung natürlicherweise stattfindet, so ähnlich wie möglich sind.

v. DIE PARAMETER VON TOXISCHEM AGENS UND CISTEM

Viele Außenmembran-Polypeptide sind Adhäsionsstellen für mannigfaltige Agenzien, die die Zellen bei ihrem Eindringen töten oder deren Vermehrung verzögern (III.v). Jedes dieser Agenzien erkennt eine bestimmte Adhäsionsdomäne am Polypeptid- Rezeptor (Fig. 2 und 3). Die Adhäsionsdomänen einer großen Vielfalt toxischer Mittel sind in der Literatur gründlich charakterisiert (Tabelle 1, Überblick in 164). Unter Verwendung dieser Charakterisierungen wird ein toxisches Agens, dessen Adhäsionsdomäne neben der geprägten Domäne (wie in Fig. 5 gezeigt) liegt, identifiziert. Falls das Polypeptid, das geprägt werden soll, bitopisch ist, oder wenn ein geeignetes toxisches Agens mit einer Adhäsionsdomäne angrenzend an die geprägte Domäne nicht findbar ist, wird eine funktionelle Adhäsionsdomäne durch genetische Manipulationen des geprägten Polypeptids angehängt oder insertiert; diese Manipulationen sind im vorangehenden Abschnitt (V.iv) und unter "Hintergrund" (III.iv) beschrieben.
Sobald ein toxisches Agens mit einer Adhäsionsdomäne neben der geprägten Domäne identifiziert wurde, werden die folgenden Schritte durchgeführt, um die Selektion des Agens auf Zellen, in welchen die geprägte Domäne die Zielverbindung bindet, zu erreichen und zu optimieren. Diese Vorgangsweise dient zwei Funktionen. Erstens erreicht sie, dass das toxische Agens Zellen, in welchen die geprägte Domäne nicht an die Zielverbindung bindet, stark schädigt, während es jene Zellen, in welchen die geprägte Domäne wirksam an die Zielverbindung bindet, unbeeinträchtigt lässt. Mit anderen Worten zeigt diese Vorgangsweise, dass das Mittel für die Durchführung der CISTEM-Selektion kompetent ist.
Zweitens wird diese Vorgangsweise verwendet, um die Versuchsbedingungen zu bestimmen, die eine verlässliche CISTEM- Selektion ermöglichen. Zur Adaptierung der CISTEM-Selektion können zahlreiche Parameter einschließlich der Folgenden variiert werden: die Konzentration der Zielverbindung ([T]), mit welcher die CISTEM-Zellpopulation inkubiert wird; die Dauer der Inkubation mit der Zielverbindung; wie zahlreich Infektion mit dem pathogenen (toxischen) Agens zu Beginn ist ("multiplicity of infection", MoI); die Dauer der Inkubation mit dem pathogenen Agens; die Temperatur; die Expressionsmenge des geprägten Polypeptids. Jeder dieser Parameter kann durch Variieren des Parameterwertes über eine Anzahl von CISTEM-Versuchen, wie hier beschrieben wird, optimiert werden. Es braucht jedoch nicht jeder Parameter für jede Ausführungsform dieser Erfindung optimiert zu werden. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden mindestens zwei Parameter durch mehrere Versuche optimiert, wie hier beschrieben ist, wogegen andere Parameter durch allgemeine Labormethoden oder Präzedenzfälle, die hier beschrieben sind, festgesetzt werden. Bei der hier beschriebenen Optimierung sind die Konzentration der Zielverbindung [T] und die anfängliche Infektionsmultiplizität MoI die beiden Parameter, die über eine Anzahl von Versuchen variiert werden. In den nachfolgenden Beispielen (VI) wird eine Optimierung beschrieben, bei welcher zwei andere Parameter, nämlich die Menge der Expression des geprägten Polypeptids und die Dauer der Inkubation mit dem toxischen Agens, variiert werden.
Bei den Vorgangsweisen zur Demonstration, dass das toxische Agens kompetent ist, um die CISTEM-Selektion durchzuführen und zur Optimierung der CISTEM-Parameter wird die Zellpopulation, deren Konstruktion voranstehend beschrieben ist (V.iv.b) benützt. Bei dieser Zellpopulation wird eine Oligopeptid-Markierung ("tag") in der geprägten Domäne präsentiert. Diese Markierung bindet mit hoher Affinität und Spezifität an einen leicht verfügbaren Liganden. (Der T7 Markierungs/T7-Antikörper ist ein bevorzugtes Beispiel für ein Markierungs/Liganden-Paar; dieses Paar und andere sind voranstehend und in der Literatur beschrieben (vgl. V.iv.b).) Bei der hier beschriebenen Optimierung wird die Expression des geprägten Polypeptids, das die Oligopeptid- Markierung trägt, auf eine relativ geringe Menge, die auf etwa 1000 Kopien pro Zelle geschätzt wird, reguliert. Wie voran stehend festgestellt wurde, ist jedoch bei der Optimierung einiger Ausführungsformen dieser Erfindung, wie jener, die in den Beispielen (VI) beschrieben ist, die Menge der Expression des geprägten Polypeptids einer der variierten Parameter. Das Verfahren, mittels welchem die Regulierung des geprägten Polypeptids erreicht wird, hängt davon ab, welcher heterologe Promotor das Gen für das geprägte Polypeptid steuert. Beispielsweise ist auf pEV218T7 (V.iv.a), dem ompA-Plasmid, das in einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung verwendet wird, ompA unter der Kontrolle der regulierenden lac-Elemente, die durch Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) induziert werden. Außerdem weist das ompA-Gen auf pEV218T7 ein TAG-Stop-Codon auf, das der Aminosäure 7 (76) des Polypeptids entspricht; daher wird bei der Expression im Bernsteinsupprimierenden (supF) Wirt E. coli UH203, die ompA-Expression nicht nur durch die Menge der Induktion mit IPTG reguliert, sondern auch durch die Konzentration der Suppressor-tRNA, die aus einem Plasmid exprimiert wird. Eine geringe Expressionsmenge an OmpA wird mit 1,0 mM IPTG- Induktion erreicht. Auf pSB1649 ist lamB unter der Kontrolle des regulierenden lac-Elements, und die Expression wird reguliert, wie in der Literatur beschrieben ist (28). Die Regulierung der Expression von ICAM-1 aus pCD1,8, dem CDM8-Vektor-Konstrukt, das bei einer bevorzugten eukaryontischen Ausführungsform dieser Erfindung verwendet wird, ist ebenfalls in der Literatur beschrieben (148, 158, 159).
Zwei Zellpopulationen (Populationen A und B), die die Oligopeptid-Markierung in der geprägten Domäne aufweisen, werden in einem Medium, das für den Zelltyp und den Expressionsvektor passend ist, gezüchtet. (Beispielsweise wird bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung E. coli UH203, das von pEV218T7 transformiert wurde, bei 37ºC in Luria-Nährlösung, ergänzt mit 100 ug/ml Ampicillin, und 1,0 mM IPTG zur Induktion der pEV218I-Expression, gezüchtet; die Bedingungen für das Wachstum anderer Zelltypen sind voranstehend (V.iv.g) und in der Literatur (10) beschrieben.) Eine dritte Population von Zellen (C) desselben Stamms wie die Populationen A und B, die vom selben Vektor transformiert ist, wie die Populationen A und B, doch ohne die Oligopeptid-Markierung, wird im selben Medium gezüchtet. (So wird beispielsweise bei der oben erwähnten, beson ders bevorzugten Ausführungsform E. coli UH203, transformiert von pEV218 anstatt von pEV218T7, unter den oben beschriebenen Bedingungen gezüchtet.) Die Populationen B und C werden jeweils gezüchtet, um drei klonale Subpopulationen von 10&sup6; Zellen, B1, B2, B3 und C1, C2, C3 zu erzeugen. Die Population A wird gezüchtet, um neun klonale Subpopulationen, A1, A2 ... A9, zu erzeugen, die jeweils 10&sup6; Zellen aufweisen.
Die Populationen A1 ... 9 und C1 ... 3 werden mit der Zielverbindung inkubiert, wogegen die Populationen B1 ... 3 unter identischen Bedingungen, jedoch ohne die Zielverbindung inkubiert werden. Die optimalen Bedingungen und Zeit, die für die Bindung zwischen der Oligopeptid-Markierung und, der Zielverbindung notwendig sind, sind von der Lieferfirma des Markierungs/Zielverbindungs-Systems oder in der Literatur (43, 18, 147, 58) vorgeschrieben. Bei der besonders bevorzugten Ausführungsform, bei welcher die T7-Markierung an Loop IV von E. coli OmpA präsentiert ist, und der T7-Antikörper (Novagene) als Zielverbindung dient, wird die Zellpopulation, die pEV218T7 exprimiert, mit mAbT7 mindestens 30 min lang inkubiert. Die Konzentration der Zielverbindung, mit welcher die Zellen inkubiert werden, wird systematisch über die Populationen A1 ... 9 und C1 ... 3 variiert, um jene Konzentration zu identifizieren, die für die CISTEM-Selektion optimal ist (Tabelle 3). Die Populationen A1 ... 3 werden jeweils mit der niedrigsten Konzentration der Zielverbindung inkubiert. Diese Minimum-Konzentration ist je nach den Eigenschaften des Agens und der Verfügbarkeit der Zielverbindung verschieden, ist jedoch im Allgemeinen annähernd 10³ · Konzentration der Zellen x Anzahl der geprägten Polypeptide pro Zelle. So wird beispielsweise für eine Population von 10&sup6; E. coli, die unter den oben beschriebenen Bedingungen gezüchtet werden, um etwa 1000 Kopien von OmpA pro Zelle zu exprimieren, 0,001 mg mAbT7 in 1 ml Medium verwendet. Dies ist annähernd 4 · 10³ Zielmoleküle (mAbs) pro geprägtem Polypeptid. Die Populationen A4 ... 6 werden mit einer höheren Konzentration der Zielverbindung inkubiert, wie 10 · der Konzentration, die bei den Populationen A1 ... 3 verwendet wird. Die Populationen A7 ... 9 und C1 ... 3 werden mit der höchsten Konzentration der Zielverbindung inkubiert, wie 100x der Konzentration, die bei den Populationen A1 ... 3 verwendet wird.
Nach der Inkubation werden die Populationen A1 ... 9, B1 ... 3 und C1 ... 3 dem toxischen Agens ausgesetzt. Die Technik des Einwirkenlassens hängt von der Natur des Agens ab und ist für gutbekannte Agenzien in der Literatur beschrieben. Verfahren zum Einwirkenlassen von Bakteriophagen auf prokaryontische Zellpopulationen sind von Callendar (34) beschrieben; Verfahren zum Einwirkenlassen von Colicinen auf prokaryontische Zellpopulationen sind von Pattus et al. (135) beschrieben; und Verfahren zum Einwirkenlassen von Viren auf eukaryontische Zellpopulationen sind von Fields et al. (68) beschrieben. Wie die Konzentration der Zielverbindung bei der hier beschriebenen Optimierung, wird die Konzentration des Agens über die Zellpopulationen variiert, um optimale Bedingungen für die Selektion des CISTEM zu identifizieren (Tabelle 3). (Wie voranstehend bemerkt, wird jedoch nicht jeder Parameter bei der Optimierung jeder Ausführungsform dieser Erfindung variiert. Bei der nachstehend beschriebenen Optimierung, beispielsweise (VI), ist die Konzentration der Zielverbindung nicht einer der Parameter, die variiert werden. Statt dessen ist die Konzentration feststehend, wogegen zwei andere Parameter variiert werden.). Die Populationen A1, 4, 7, B1 und C1 werden der niedrigsten Konzentration des toxischen Agens ausgesetzt. Diese Konzentration variiert von CISTEM zu CISTEM, je nach den Eigenschaften des Agens, der Methode und der Dauer des Einwirkenlassens, und der Verfügbarkeit (und somit der Konzentration) der Zielverbindung, sie ist aber im Allgemeinen etwa die Mindestkonzentration, die notwendig ist, um auf jede Zelle in einer voll empfänglichen Population während eines CISTEM-Laufs einzuwirken. So ist für viele lytische Bakteriophagen, wie E. coli K3 oder 1, wenn das Verfahren des Einwirkenlassens die klassische Phagen-Infektion (34) und die Dauer der Inkubation mit Bakteriophagen 60 min bei 37ºC ist, die Konzentration 2-5 · die Zellkonzentration, oder MOI ~ 2-5. Die Zellpopulationen A2, 5, 8, B2 und C2 werden einer verdoppelten Konzentration des Agens ausgesetzt, und die Populationen A3, 6, 9, B3 und C3 werden noch einer weiter verdoppelten Agens-Konzentration ausgesetzt. In Tabelle 3 sind die Variation der Zielverbindung und die Agenskonzentrationen über die Zellpopulationen bei dieser Vorgangweise zur Optimierung der CISTEM- Selektion zusammengefasst.
Die Konzentrationen bei dieser Vorgangsweise können je nach dem Wesen des toxischen Agens und dem Verfahren des Einwirkenlassens variieren, jedoch ändern sich mehrere grundlegende Aspekte der Vorgangsweise von CISTEM zu CISTEM nicht. Zuerst hat bei den Kontroll-Populationen B und C das toxische Agens uneingeschränkten Zugang zu seinem Rezeptor und wirkt daher auf jede Zelle ein. Die Population B ist für das Agens empfänglich, weil die Population, obwohl die Zellen an der geprägten Domäne die Markierung tragen, nicht dem Liganden der Markierung ausgesetzt ist. Daher bleibt die Adhäsionsdomäne des toxischen Agens freiliegend und funktionell. Die Population C ist empfänglich, weil der Ligand, obwohl die Zellpopulation dem Liganden ausgesetzt ist, nicht durch das geprägte Polypeptid, dem die Markierung des Liganden fehlt, gebunden wird. Weil die Adhäsionsdomäne des toxischen Agens bei den Populationen B und C gleichermaßen freiliegend und funktionell bleibt, sind die Ergebnisse der Einwirkung des Agens auf diese Populationen die gleichen. Somit ergibt bei diesen Kontrollversuchen die Einwirkung des Agens dieselben Resultate für die Populationen B1 und C1; gleichermaßen für die Populationen B2 und C2; und für die Populationen B3 und C3. Diese Kontrollen bestätigen zwei Schlussfolgerungen, die für CISTEM kritisch sind; 1. die Anwesenheit der Ziel- Liganden hat keinen Einfluss auf die Aktivität des toxischen Agens, vorausgesetzt, dass der Ligand nicht an das geprägte Polypeptid gebunden ist; 2. die Anwesenheit der Markierung in der geprägten Domäne hat keinen Einfluss auf die Aktivität des toxischen Agens, vorausgesetzt, dass die Markierung nicht an einen Ziel-Liganden gebunden ist.
Während die Kontroll-Populationen B und C für das toxische Agens vollkommen empfänglich sind, weisen die Populationen A1 ... 9 ein Resistenz-Spektrum, das bis zur Immunität reicht, auf. Bei den Zellen der Population A hat die geprägte Domäne die Oligopeptid-Markierung, welche während der Inkubation den Ziel- Liganden bindet. Dies hat zur Folge, dass die angrenzende Adhäsionsdomäne für das toxische Agens verdeckt bzw. von diesem ausgeschlossen ist, und die Zellen geschützt sind. Die Populationen A1 ... 9 weisen ein Resistenz-Spektrum auf, weil sie einem Spektrum von Konzentrationen des Ziel-Liganden ausgesetzt sind. Wenn das Konzentrations-Spektrum weit genug ist, reicht das Resistenz-Spektrum von einer teilweisen Empfänglichkeit bis zur vollständigen Immunität.
Aufgrund dieser Vorversuche findet man die Konzentration des toxischen Agens, die eine funktionelle CISTEM-Selektion ermöglicht, wie folgt. Eine allgegenwärtige pathogene Wirkung - d. h. jede Zelle in einer Population wird vom Agens beeinflusst - ist leicht feststellbar, wenn die Zellpopulationen Agenzien gemäß den in der Literatur beschriebenen Protokollen (34, 68, 135) ausgesetzt werden. Beispielsweise führt bei der Einwirkung von virulenten lytischen Phagen auf prokaryontische Populationen die allgegenwärtige pathogene Wirkung zu einer konfluenten Lyse der Population mit null überlebenden Kolonien (34). Die niedrigste Konzentration des toxischen Agens, bei welcher jede Zelle in den Kontroll-Populationen (B und C) vom Agens beeinflusst wird, ist eine passende Menge für die CISTEM-Selektion. Wenn beispielsweise einige Zellen aus B1 und C1 (Tabelle 3) dem toxischen Agens entkommen, die Zellen von B2 und C2 aber alle vom Agens beeinflusst werden, dann ist die passende Konzentration des toxischen Agens für CISTEM MoI = 10. Bei diesem Beispiel konnte die Mindestkonzentration, die für eine allgegenwärtige Wirkung notwendig ist, durch weitere Versuche mit MoIs im Bereich von 5 bis 10 genauer bestimmt werden.
Nachdem man die Konzentration des toxischen Agens für das CISTEM gefunden hat, wird die optimale Konzentration der Zielverbindung wie folgt bestimmt. Jedes CISTEM hat eine annähernde Schwellenaffinität, Ka = t, so dass Klone, deren geprägte Domänen die Zielverbindung mit einer unter dieser Schwelle liegenden Affinität binden (Ka< t) durch das toxische Mittel aus der Population eliminiert werden, wogegen Klone, deren geprägte Domänen eine über der Schwelle liegende Affinität aufweisen (Ka> t) vor dem Agens geschützt sind, und somit selektiert werden. Die Schwelle für ein CISTEM kann durch Einstellen der Konzentration der Zielverbindung festgesetzt werden. Um die Schwelle auf annähernd jener Affinität festzusetzen, die die Oligopeptid-Markierung, die die Populationen A und B aufweisen, für ihren Liganden zeigt, ist die Zielkonzentration, die im CISTEM verwendet wird, die geringste Menge, die der Population Ai in Gegenwart des toxischen Mittels bei MoI des CISTEM einen vollständigen Schutz verleiht. (Eine vollkommene Immunität gegen das Agens ist leicht feststellbar, wenn die Zellpopulationen den Agenzien gemäß den üblichen, in der Literatur beschriebenen Protokollen (34, 68, 135) ausgesetzt werden.) So werden beispielsweise, wenn die wie oben beschrieben bestimmte Konzentration des toxischen Agens für das CISTEM MoI = 10 ist, und die Population A5 eine vollkommene Immunität gegen das toxische Agens aufweist, wogegen die Population A2 durch das Agens leicht reduziert wird (Tabelle 3), 104 Moleküle der Zielverbindung pro geprägtem Polypeptid verwendet, und zwar bei einem CISTEM zur Selektion auf Zellen, deren geprägte Polypeptide die Zielverbindung mit einer Affinität binden, die gleich oder größer ist als die Affinität, welche die Oligopeptid-Markierung für ihren Liganden aufweist. Eine etwas niedrigere Konzentration der Zielverbindung, wie 103 Moleküle pro geprägtem Polypeptid, wird zur Selektion auf Zellen mit geprägten Polypeptiden verwendet, die eine Affinität für die Zielverbindung aufweisen, die wesentlich höher ist als die Affinität, die die Oligopeptid-Markierung für ihren Liganden aufweist. Eine höhere Konzentration der Zielverbindung, wie 105 Moleküle pro geprägtem Polypeptid, wird verwendet, um die Schwellenaffinität des CISTEM weit unter der Affinität festzusetzen, die die Markierung für ihren Liganden aufweist.

vi. Identifizierung des (Poly)peptids, an dem Interesse besteht

Die Anwendung von CISTEM auf Zellpopulationen ergibt Zellklone, die das Selektionsverfahren infolge der Wechselwirkung mit der (den) Zielverbindung(en) überleben. Somit ist ihr Überlebensmerkmal das (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, welches sie an der Oberfläche präsentieren. Die Sequenz des Polypeptids, an dem Interesse besteht, wird durch die DNA- Sequenz codiert, welche in die Display-Domäne insertiert wurde. Die überlebende Zellpopulation kann monoklonal oder polyklonal sein. Im letzteren Fall müssen die überlebenden Zellen auf Agar- Platten ausplattiert werden, um Kolonien zu gewinnen, die von Einzelzellen stammen (Stand der Technik der Bakterien-Genetik). Die Amplifizierung monoklonaler Zellpopulationen und die nachfolgende Herstellung ihrer Plasmid-DNA folgt Standard-Protokollen der rekombinanten DNA-Methodik. Da das Plasmid für das Display-Protein und sein insertiertes Polypeptid, an dem Interesse besteht, codiert, liefert die DNA-Sequenzanalyse der insertierten DNA-Markierung (Stand der Technik der rekombinanten DNA-Technik) die DNA-Sequenz des Inserts und ermöglicht daher eine Vorhersage der Aminosäure-Sequenz des Polypeptids, an dem Interesse besteht, welches exprimiert wurde und an der Oberfläche als integraler Teil des Membran-Proteins präsentiert wurde. Die insertierte DNA stammte entweder von einem Pool willkürlich synthetisierter Oligonukleotide, oder von DNA-Segmenten, die aus natürlich vorkommender mRNA (cDNA) oder genomischer DNA stammte. Die erhaltene DNA und verwandte Polypeptid-Sequenzen können genau geprüft werden, so dass sie zu Sequenzen bekannter Proteine und ihren verwandten Genen passen. So kann die Sequenzanalyse verwendet werden, um das Polypeptid, an welchem Interesse besteht, zu identifizieren und dessen Zusammensetzung bekannten Genen oder DNA-Sequenzen und deren vorhergesagten Proteinen zuzuschreiben und/oder mit diesen in Beziehung zu setzen.

vii. MODIFIKATIONEN UND WEITERENTWICKLUNGEN DES GRUNDLEGENDEN CISTEM

Mit Modifikationen und Weiterentwicklungen des grundlegenden CISTEM werden mehrere Erweiterungen seiner Fähigkeiten erreicht, einschließlich Folgender: i. Erhöhung der maximalen Affinität selektierter Polypeptide für die Zielverbindung; ii. Spezifizierung der Anzahl der Bindungsstellen, die ein multivalentes geprägtes Polypeptid mit der Zielverbindung verbinden; iii. Selektion auf geprägte Polypeptide, die sowohl eine hohe Affinität für die Zielverbindung als auch eine geringe Affinität für eine zweite Verbindung aufweisen; iv. Selektion nicht nur auf Affinität, sondern auch auf funktionelle Aktivität; v. Screenen der von einer cDNA-Bibliothek exprimierten Polypeptide auf Bindung an eine Zielverbindung; vi. Selektion auf geprägte Polypeptide, die eine Affinität für eine oder mehrere aus einem Satz multipler, verschiedener Zielverbindungen aufweisen.
Um die maximale, in einem CISTEM erreichbare Affinität zu erhöhen, wurden wiederholte CISTEM-Läufe durchgeführt (Fig. 10). Sobald eine Population von Klonen, die eine Affinität für die Zielverbindung aufweist, von einem CISTEM selektiert wurde, werden die Vektoren, die das Gen für das geprägte Polypeptid tragen, aus dieser Population isoliert durch übliche Techniken, die für den Vektor passen und in der Literatur (146) beschrieben sind. Neue variierbare Oligonukleotide, wie die oben beschrie benen (V.iv.c), werden dann in die Vektoren neben den ursprünglichen variablen Insertionen insertiert. Dies erfolgt mittels derselben Vorgangsweise, die verwendet wurde, um die ursprüngliche Insertion variabler Oligonukleotide an einer genetischen Stelle, die der geprägten Domäne entspricht, zu erreichen. (Eine solche Vorgangsweise ist voranstehend beschrieben (V.iv.c). Alternativ wird eine Variation nicht als Erweiterung der ursprünglichen Oligonukleotid-Inserts eingeführt, sondern als oligomere Umordnung der ursprünglichen Inserts (die Vorgangsweise der oligomeren Umordnung von Oligonukleotid-Inserts ist in 28 beschrieben), oder als beschränkte Mutagenese der ursprünglichen Inserts (Techniken für die beschränkte Mutation der Oligonukleotid-Inserts sind in 11 und 133 beschrieben; die Insertion mutierter Oligonukleotide erfolgt gemäß der oben beschriebenen Vorgangsweise, V.iv.c, zur Insertion variabler Oligonukleotide in eine angepeilte Stelle in einem Vektor). Mit anderen Worten kann Oligopeptid-"Sequenz-Raum" (der Sequenz-Raum kombinatorischer Bibliotheken ist in 63 definiert) mittels einer Anzahl von Strategien durchsucht werden, von welchen einige für das Screenen anderer kombinatorischer Bibliotheken angewandt wurden (11, 28, 29, 82, 133, III.vi). Die Vektoren, die frische Variationen an einer Stelle tragen, die der geprägten Domäne entspricht, werden dann zur Transformation einer Zellpopulation gemäß allgemeiner, oben angeführter Protokolle (V.iv.a) verwendet, wodurch eine neue CISTEM-Zellpopulation geschaffen wird. Diese Population wird dann noch einer weiteren Selektionsrunde durch CISTEM unterzogen (Fig. 10). Dieser Zyklus der Einführung einer Variation, der Selektion auf eine Affinität für die Zielverbindung und des Vermehrenlassens selektierter Klone wird wiederholt, bis die Bindung zwischen der geprägten Domäne und der Zielverbindung den gewünschten Grad der Affinität erreicht.
Die Anzahl der von einem CISTEM auf Affinität für die Zielverbindung gescreenten Oligopeptid-Sequenzen wird erhöht, d. h. der Sequenz-Raum wird vermehrt, indem CISTEMs parallel durchgeführt werden, indem CISTEMs mit Robotik-Strategien mit hohem Durchsatz verbunden werden, indem CISTEMs in großem Umfang durchgeführt werden oder indem CISTEMs in einem Chemostat mit kontinuierlichem Durchsatz durchgeführt werden.
Zur Schaffung geprägter Polypeptide, die eine multivalente Bindung der Zielverbindung aufweisen, können multiple variable Regionen durch sequenzielle CISTEM-Läufe (Fig. 11) geprägt werden. Zuerst wird eine einzige Region oder Domäne des geprägten Polypeptids so geprägt, dass sie die Zielverbindung bindet. Als nächstes wird die selektierte Zellpopulation, die die zuvor geprägte Domäne aufweist, so hergestellt, dass sie eine variable Region an anderer Stelle im geprägten Polypeptid aufweist, entweder in einer ungeprägten Region der zuvor geprägten Domäne, oder in einer gänzlich separaten Domäne. Dies wird wie folgt erreicht. Zuerst werden die Vektoren, die das Gen für das geprägte Polypeptid tragen, von der selektierten Zellpopulation mittels allgemeiner Techniken, die für den Vektor passen und in der Literatur (146) beschrieben sind, isoliert. Danach werden unter Verwendung der oben beschriebenen Vorgangsweisen (V.iv.c) für die Insertion variabler Oligonukleotide an einer spezifischen Stelle in einem Gen variable Sequenzen an einer genetischen Stelle insertiert, die einer extrazellulären Domäne des geprägten Polypeptids entspricht. Diese Stelle unterscheidet sich jedoch von jener Stelle, an welcher variable Oligonukleotide für die ersten Runde der CISTEM-Selektion insertiert wurden. Die Vektoren, welche nun selektierte Seqxuenzen an einer Stelle und variable Oligonukleotide an einer anderen Stelle tragen, werden zur Transformation einer Zellpopulation (V.iv.a) verwendet, wobei eine neue CISTEM-Zellpopulation geschaffen wird. Diese Population wird noch einer weiteren Runde der CISTEM-Selektion unterzogen. In dieser Runde ist die Konzentration der Zielverbindung niedriger als in der vorherigen Runde, wodurch die Schwellenaffinität für die Selektion, t(V.v), erhöht wird. Der Grund dafür ist, dass nach der ersten Selektionsrunde jede Zelle in der CISTEM-Population an die Zielverbindung bindet, und das CISTEM nun nur solche Zellen selektieren muss, die geprägte Polypeptide exprimieren, die an die Zielverbindung an multiplen, unterschiedlichen Epitopen binden. Mit jeder neuen Region des geprägten Polypeptids, die geprägt wird, wird ein neues Epitop an der Zielverbindung gebunden.
Bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung selektieren auf geprägte Polypeptide, die eine hohe "on-rate" in ihrer Bindung mit der Zielverbindung aufweisen. Bei diesen CISTEMs wird die CISTEM-Zellpopulation nicht mit der Zielverbindung vor der Einführung des toxischen Agens vorinkubiert. Statt dessen wird das toxische Agens gleichzeitig mit der Zielverbindung eingeführt. Die Konzentrationen von Agens und Zielverbindung werden über mehrfache Versuche variiert, wie in den Optimierungsverfahren an anderer Stelle in diesem Dokument detailliert beschrieben ist (V.v und VI). Die Konzentrationen werden so eingestellt, dass nach der gleichzeitigen Einführung von Agens und Zielverbindung in die CISTEM-Zellpopulation Klone, deren geprägte Polypeptide an die Zielverbindung relativ rasch binden, geschützt werden, wogegen Klone, deren geprägtes Polypeptid langsamer an die Zielverbindung bindet, durch das toxische Agens eliminiert werden.
Ein CISTEM, welches ein Polypeptid so prägt, dass es eine hohe Affinität für eine Zielverbindung aufweist, aber eine extrem geringe Affinität für eine zweite Verbindung, die hier "zurückgewiesene Verbindung" genannt wird, wird folgendermaßen konstruiert. Die Größe der Zielverbindung, die Größe der zurückgewiesenen Verbindung, und der Abstand zwischen der geprägten Domäne und der Adhäsionsdomäne werden, falls notwendig, so verändert, dass sie den folgenden Bedingungen entsprechen: wenn die Zielverbindung an die geprägte Domäne gebunden ist; verdeckt sie die Adhäsionsdomäne, wogegen, wenn die zurückgewiesene Verbindung an die geprägte Domäne gebunden ist, diese zu klein ist, um die Adhäsionsdomäne zu verdecken. Wenn dieses Kriterium nicht zufällig erfüllt wird (d. h., wenn die zurückgewiesene Verbindung zufällig nicht extrem klein ist), dann kann der Durchmesser der Zielverbindung und der Abstand zwischen den Domänen wie folgt verändert werden. Die Zielverbindung kann durch Schaffung eines Multimers vergrößert werden. (Die Vorgangsweise zur Schaffung eines Multimers hängt vom Wesen der Zielverbindung ab, jedoch werden viele Techniken zur Verbindung multipler Kopien einer Verbindung allgemein ausgeübt und sind in der Literatur beschrieben.) Der Abstand zwischen der geprägten Domäne und der Adhäsionsdomäne kann vergrößert werden, indem eine der Domänen an eine Stelle am geprägten Polypeptid bewegt wird, die von der anderen Domäne topologisch weiter entfernt ist. Die Transposition der geprägten Domäne involviert einfach die Insertion variabler Oligonukleotide gemäß der oben beschriebenen Vor gangsweise (V.iv.c) an einer genetische Stelle, die einer anderen extrazellulären Domäne des geprägten Polypeptids entspricht. Bei vielen prokaryontischen und eukaryontischen Ausführungsformen dieser Erfindung kann die Adhäsionsdomäne an eine andere extrazelluläre Domäne des geprägten Polypeptids transponiert werden, ohne ihre Funktion als Rezeptor für das toxische Agens zu beeinflussen. Der Vorgang zur Transposition einer Adhäsionsdomäne ist oben (V.iv.d) sowie in der Literatur (44, 161) beschrieben. Wenn als Ergebnis des Weiter-auseinander- Bewegens von Adhäsionsdomäne und geprägter Domäne, eine oder mehrere extrazelluläre Domänen, die bei der Funktion des CISTEM keine Rolle spielen, zwischen den beiden, topologisch getrennten Domänen, die für die CISTEM-Funktion kritisch sind, auftreten, können die überflüssigen Domänen durch Polyprolin-Linker ersetzt werden, um zu gewährleisten, dass extrazelluläre Strukturen nicht die richtige Verdeckung der Adhäsionsdomäne durch eine an die geprägte Domäne gebundene Zielverbindung behindern.
Sobald die drei kritischen Distanzen - die Distanz zwischen der geprägten Domäne und der Adhäsionsdomäne, der Durchmesser der Zielverbindung, und der Durchmesser der zurückgewiesenen Verbindung - mit dem oben erwähnten Kriterum übereinstimmen, wird die CISTEM-Zellpopulation sowohl mit der Zielverbindung als auch mit der zurückgewiesenen Verbindung inkubiert. Danach wird das toxische Agens des CISTEM eingeführt, und dies führt zu zwei Selektionsdrücken. Ein Druck begünstigt Zellen, die geprägte Polypeptide mit höherer Affinität für die Zielverbindung exprimieren (Fig. 12): eine an eine geprägte Domäne gebundene Zielverbindung verdeckt die angrenzende Adhäsionsdomäne und dient somit zum Schutz der darunter liegenden Zelle vor dem toxischen Agens. Unter den Zellen, die eine gewisse Affinität für die Zielverbindung aufweisen, begünstigt ein zweiter selektiver Druck Zellen mit geringerer Affinität für die zurückgewiesene Verbindung; eine an eine geprägte Domäne gebundene, zurückgewiesene Verbindung verdeckt nicht nur nicht die angrenzende Adhäsionsdomäne, sondern sie verhindert auch die Bindung durch eine Zielverbindung (Fig. 12). Kurz gesagt verringert die Affinität eines geprägten Polypeptids für die zurückgewiesene Verbindung wirksam dessen Affinität für die Zielverbindung. Somit begünstigt die Selektion solche Zellen, die geprägte Domänen mit einer hohen Affinität für die Zielverbindung und einer niedrigen Affinität für die zurückgewiesene Verbindung aufweisen (Fig. 12).
Um nicht nur auf Affinität, sondern auch auf funktionelle Aktivität der geprägten Polypeptide zu selektieren, kann ein grundlegender CISTEM mit einem sekundären Screenen auf Aktivität gekoppelt werden. Im ersten Schritt der gekoppelten Selektion selektiert ein CISTEM Klone, deren geprägte Polypeptide an die Zielverbindung auf die vorgeschriebene Art binden. Aus dieser Population von Klonen oder aus den geprägten Domänen, die aus einer solchen Population extrahiert werden, selektiert ein sekundäres Screenen jene Strukturen, deren Bindung an die Zielverbindung die gewünschte funktionelle Aktivität aufweist. Geprägte Domänen, die von der Zelloberfläche durch ein Detergens oder durch Expression als sezerniertes Isomorph freigesetzt werden (isomorphe Formen und ihre Interkonversion sind oben in III.iv.b beschrieben), können jeglichen üblicherweise praktizierten Screenings oder Tests auf Aktivität oder einer Modifikation der Aktivität der Zielverbindung unterzogen werden. Beispielsweise prägt ein CISTEM E. coli OmpA so, dass es mit hoher Affinität an löslichen IL-6-Rezeptor bindet. (Diese Zielverbindung ist voranstehend detaillierter beschrieben (V. iii).) Die geprägten Polypeptide, die mittels einer herkömmlichen milden Detergens, von dem man weiß, dass es OmpA nicht denaturiert, von der Zellmembran befreit sind, werden dann einem zweiten Screening auf ihre Fähigkeit, den Zell-gebundenen, funktionalen IL-6-Rezeptor zu agonisieren, unterzogen. Dieser Screen auf agonistische Aktivität ist in der Literatur (95) beschrieben. Alternativ kann eine extrem starke Selektien auf funktionelle Aktivität auf den von CISTEM selektierten Satz von Zellklonen ausgeübt werden, und es erfordert keine Befreiung der geprägten Domänen von den Zellmembranen. Tatsächlich können CISTEMs, gerade weil sie replizierende Zellpopulationen liefern, mit Selektionsvorschriften gekoppelt werden, die der genetischen Komplementierung sehr ähnlich sind. Bei diesen Selektionsvorschriften hängt der Vorrat jeder Zelle an einer lebenswichtigen Verbindung, wie einem Nährmittel, von der Durchführung, seitens der geprägten Domäne, jener Funktion, die von ihr erwünscht ist, wie der enzymatischen Aktivität, ab. Anders gesagt, wandelt die funktionelle Aktivität der geprägten Domäne entweder die Zielverbindung in eine Verbindung um, die für die darunter liegende Zelle lebenswichtig ist, oder sie sichert die lebenswichtige Verbindung für die Zelle.
Bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung besteht die Zielverbindung aus einer Bibliothek separater und unterschiedlicher Moleküle, die hier "die Zielbibliothek" genannt wird. Ein CISTEM, bei welchem eine Zielbibliothek (anstatt einer einzelnen Zielverbindung) verwendet wird, dient zur Selektion von in Wechselwirkung stehenden Paaren, bei welchen ein Element jedes selektierten Paares das an der geprägten Domäne eines geschützten Klons präsentierte Oligopeptid ist, und das andere Element ein Zielbibliotheks-Molekül ist, das an dieses Oligopeptid bindet und somit zum Schutz des Klons dient. Vorausgesetzt, dass jedes Molekül in der Zielbibliothek groß genug ist, um den Größenanforderungen für die CISTEM-Funktion (V.iii) zu entsprechen, und dass es im Medium in einer Konzentration vorhanden ist, die adäquat ist, um Zellen, deren geprägte Polypeptide an eines oder mehrere Moleküle in der Zielbibliothek binden, einen Schutz zu verleihen, kann die Zielbibliothek so viele unterschiedliche Moleküle aufweisen wie erwünscht, und sie kann gemäß jeder bekannten Methode zur Herstellung oder Isolierung von Molekül-Bibliotheken konstruiert werden. Diese Verfahren sind teilweise unter "Hintergrund (III.vi) besprochen und umfassen die Folgenden: Phagen-Display-Technik (8, 12, 33, 58, 118, 134, 147); Selex-Technik (82); und andere Techniken für die Bibliothek-Konstruktion, die in der Literatur besprochen sind (99).
Bei CISTEMS, bei welchen Zielbibliotheken beteiligt sind, werden nötigenfalls zwei Strategien angewendet, um die Konzentration jedes Moleküls in der Zielbibliothek auf die für eine wirksame CISTEM-Selektion notwendige Mindestmenge zu erhöhen, d. h. um die Konzentration zu erreichen, die notwendig ist, um jenen Zellen, deren geprägte Polypeptide an eines oder mehrere der Moleküle in der Zielbibliothek binden, einen Schutz vor dem toxischen Agens zu verleihen. Bei einer Strategie werden die CISTEM-Zellpopulation und die Zielbibliothek jeweils amplifiziert, in Fraktionen unterteilt, und einander in Mikrotiter- Vertiefungen ausgesetzt. Dies macht möglich, dass die Konzen tration der Zielmoleküle hoch genug ist, um jenen Zellen einen Schutz zu verleihen, deren geprägte Polypeptide an eines oder mehrere Moleküle in der Zielbibliothek binden.
Bei der zweiten Strategie zur Erhöhung der Konzentration jedes Moleküls in der Zielbibliothek wird die Zielbibliothek von der CISTEM-Zellpopulation selbst sezerniert. Wie unter "Hintergrund" (III.vi) beschrieben wurde, können Bibliotheken variabler Oligopeptide als Fusionen an das Gen-Protein 3 von filamentösen Phagen von E. coli (M13, fl oder fd) präsentiert ("displayed") sein (die filamentöse Phagen-Display-Technik ist in 8, 12, 33, 58, 118, 134 und 147 beschrieben und demonstriert). Filamentöse Phagen erzeugen relativ avirulente Infektionen, bei welchen Phagen-Partikel von der Wirtszelle durch Extrusion freigesetzt werden, wobei die Zelle intakt bleibt (122). Daher kann eine CISTEM-Zellpopulation, die ihre eigene Zielbibliothek sezerniert, wie folgt hergestellt werden.
Wie beim oben beschriebenen grundlegenden CISTEM wird eine Zellpopulation, der ein Gen für das geprägte Polypeptid fehlt, mit einer Bibliothek exogener Kopien dieses Gens transformiert, worin variable Oligonukleotide an der genetischen Stelle, die der geprägten Domäne entspricht, insertiert worden sind. Beispielsweise wird bei der Konstruktion einer oben beschriebenen E. coli-CISTEM-Zellpopulation (V.iv.c) E. coli UH203 mit pEV218I, einer Bibliothek von ompA-Plasmiden mit variablen Oligonukleotiden an der genetischen Stelle, die dem extrazellulären Loop IV des Membranproteins entspricht, transformiert. Die resultierende Zellpopulaltion weist eine Bibliothek exogener Oligopeptide an der geprägten Domäne auf. Bei einer Erweiterung des grundlegenden CISTEM wird diese Zellpopulation dann mit einem zweiten, extra-chromosomalen genetischen Element transformiert, das für eine sezernierte Bibliothek von Oligopeptiden codiert. Die OmpA-prägende Zellpopulation wird beispielsweise mit einer Bibliothek filamentöser Bakteriophagen transfiziert, die so hergestellt ist, dass sie exogene Oligopeptide am Gen-Protein 3 aufweist (Viele solcher Bibliotheken sind in der Literatur beschrieben, insbesondere in 8, 12, 33, 58, 118, 134 und 147.) Jede Zelle in der Population hat nun zwei extra-chromosomale genetische Elemente; eines codiert für OmpA, in welchem ein extrazelluläres Loop ein exogenes Oligopeptid aufweist; das andere codiert für einen stabil extrudierten M13- Phagen, in welchem gp3 ein zweites exogenes Oligopeptid aufweist, das von jenem, das an der Zelloberfläche präsentiert ist, unterschiedlich ist (Fig. 14).
Die CISTEM-Population, die zwei extra-chromosomale genetische Elemente exprimiert, wird dann dem toxischen Agens des CISTEM ausgesetzt, wobei man denselben Protokollen zum Einwirkenlassen folgt, wie sie für das grundlegende CISTEM beschrieben wurden (V.v. und VI). Nach der Einwirkung des toxischen Agens ist ein Klon in der CISTEM-Population nur geschützt, wenn das vom Klon sezernierte Zielbibliotheks-Molekül spezifisch an die geprägte Domäne des Klons bindet. Das heißt, ein Klon wird durch ein autokrines Loop geschützt. Beim spezifischen CISTEM, bei welchem E. coli eine OmpA-Bibliothek aufweist und eine M13-Bibliothek sezerniert, dient K3 als pathogenes (toxisches) Agens (Fig. 13). Ein E. coli-Klon wird vor K3 nur geschützt, wenn das am Loop IV von OmpA präsentierte exogene Polypeptid spezifisch an das M13 bindet, das der Klon selbst sezerniert. Die Gene für beide Elemente dieses in Wechselwirkung tretenden Paares von Oligopeptiden werden aus der geschützten zelle leicht gewonnen. Zusammenfassend gesagt selektiert durch autokrinen Schutz von Klonen ein CISTEM mit einer Zielbibliothek auf spezifisch in Wechselwirkung tretende Paare von Oligopeptiden sowie auf jene Gene, die für sie codieren.
Bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung werden verwendet, um festzustellen, ob bestimmte Moleküle spezifisch mit einem geprägten Polypeptid, das nicht durch Insertion variabler Oligopeptide verändert worden ist, in Wechselwirkung treten. Jedes Außenmembran-Polypeptid, das von einem pathogenen Agens als Rezeptor benützt wird, einschließlich Polypeptide, die durch die oben beschriebenen Manipulationen (V.iv.d) hergestellt wurden, kann in diesen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden. Weil das geprägte Polypeptid nicht so hergestellt wurde, dass es hoch-variable Oligopeptide aufweist, gibt es keine "geprägte Domäne", und die Adhäsionsdomäne des toxischen Agens kann sich irgendwo auf dem geprägten Polypeptid befinden. Wie bei den grundlegenden, oben beschriebenen CISTEM-Zellpopulationen wird das geprägte Polypeptid von einem induzierbaren Promotor exprimiert (V.iv.a). Die Zellpopulation, die induziert ist, um das geprägte Polypeptid zu exprimieren, wird einer Zielbibliothek gemäß einem der oben beschriebenen Verfahren zur Konstruktion von Zielbibliotheken und deren Einführung in CISTEMs ausgesetzt. Es können entweder Mikrotiter-Vertiefungen oder die autokrinen Loop-Methoden verwendet werden, um die Konzentration der Zielbibliothek-Moleküle zu erhöhen. Das toxische Agens des CISTEM wird dann gemäß den für das grundlegende CISTEM beschriebenen Vorgangsweisen eingeführt (V.v.). Zellen sind nur geschützt, wenn Moleküle in der Zielbibliothek an das geprägte Polypeptid binden und somit eine Adhäsion des toxischen Agens verhindern. Somit bieten diese Ausführungsformen dieser Erfindung eine leichte und direkte Methode zum Testen der Affinität eines Molekül-Satzes für das geprägte Polypeptid.

BEISPIELE

i. BEISPIEL 1: EIN E. COLI OMPA/COLIPHAGEN K3/mAbT7-CISTEM

a) E. coli-Außenmembran-Protein A

Das E. coli-Außenmembran-Protein A (Nukleotid-Sequenz in 14, Primärstruktur in 42 beschrieben) ist ein Polypeptid mit 325 Resten und weist ein Amino-terminales, achtsträngiges β-Fass (Membraninsertion und Struktur in 126 und 127 beschrieben) mit vier extrazellulären Domänen (an der Oberfläche freiliegende Regionen in 48, 126 und 127 beschrieben), drei periplasmatische Loops (periplasmatische Einwirkung in 68 identifiziert) und einen periplasmatischen Carboxyl-terminalen Anteil mit etwa 150 Resten auf (Fig. 3). Die β-Fass-Konformation ist extrem stabil und kann nur durch Kochen in starken Detergentien (III.ii.b) denaturiert werden. OmpA, das natürlicherweise in etwa 2-3 · 105 Kopien pro Zelle vorhanden ist (92), zählt zu den am reichlichsten vorhandenen Proteinen in der Außenmembran von E. coli. Es ist auch in der bakteriellen Evolution weitgehend konserviert (108).
Wie unter "Hintergrund" (vgl. III.iv.a) beschrieben wurde, werden exogene Oligonukleotide, die in das ompA Gen an Stellen insertiert sind, die den extrazellulären Domänen des Polypeptids entsprechen, normalerweise als Teil des Polypeptids translatiert und stören die Insertion des Polypeptids in die Außenmembran nicht. Weiters werden die von diesen exogenen genetischen Insertionen codierten Oligopeptide an der Oberfläche der Zelle präsentiert, nehmen stabil gefaltete Strukturen an und können Enzym-, Agonisten-, oder Antagonisten-Aktivitäten aufweisen.

b) Konstruktion einer Zellpopulation zum Testen und Optimieren der CISTEM-Selektion

Um eine Zellpopulation zur Verwendung zum Testen und Optimieren der CISTEM-Selektion zu konstruieren, wurde eine E. coli- Population, der Wildtyp-OmpA fehlt, so hergestellt, dass sie eine Plasmid-codierte Kopie von OmpA exprimiert, in welcher das extrazelluläre Loop IV des Polypeptids das T7-Markierungs-Oligopeptid aufwies (Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), welches an den im Handel erhältlichen T7-Antikörper (Novagene) bindet. Bei pEV218 (76), wurde das ompA-Gen, welches unter der IPTG-induzierbaren Kontrolle des lac-Promotors steht, so hergestellt, dass es einen Polylinker mit vielen Restriktions-Endonuclease-Stellen in einem genetischen Bereich trägt, der dem extrazellulären Loop IV des Polypeptids entspricht (Fig. 9). Dieses Plasmid wurde mit SacI (Enzym und Reaktionspuffer von New England Biolabs) und XbaI (Enzym und Reaktionspuffer von MBI Fermentas) verdaut, was ein Fragment des Restriktionsstellen- Polylinkers und das linearisierte Plasmid mit klebrigen Enden, die von den Restriktionsenzymen zurückgelassen wurden, ergab. Das linearisierte Plasmid mit den klebrigen Enden wurde mittels Standard-Gelelektrophorese (146) isoliert. Zwei Einzelstrang- Oligonukleotide wurden mittels einer herkömmlichen Technik synthetisiert (Oligonukleotide sind von Handels-Labors erhältlich, und Verfahren zur Synthetisierung von Einzelstrang- Oligonukleotiden sind in 29 und 82 beschrieben und darauf Bezug genommen), so dass sie sich wie folgt lesen: Oligonukleotid 1: Oligonukleotid 2:
Die Sequenz in den eckigen Klammern bildet die T7-Markierungs-Gensequenz. Diese beiden Einzelstrang-Oligonukleotide wurden in Klenow-Reaktionspuffer (MBI Katalog) angelagert, wobei sie das doppelsträngige T7-Markierungs-Gen mit klebrigen Enden bilden, die zu dem klebrigen Enden an pEV218 komplementär sind, linearisiert durch SacI und XbaI wie im obigen Absatz beschrieben. Wenn das Doppelstrang-Oligonukleotid in das linearisierte Plasmid ligiert (MBI Fermentas Ligationspuffer) war, wurde das T7-Markierungs-Gen in frame in das OmpA-Gen an pEV218 insertiert. Das neue Konstrukt wurde mit pEV218T7 bezeichnet.
Das Plasmid pEV218T7 wurde zur Transformation einer Population des Stammes UH203 (lac, supF, ompA, recA, proAB, rpsL) (74) gemäß üblicher, voranstehend detailliert beschriebener Transformationsmethoden verwendet (V.iv.b).

c) Vor-Optimierung der CISTEM-Selektion durch Coliphagen K3

Coliphage K3 dringt in E. coli ein, indem er an die Loops I, II und III von OmpA bindet. Loop IV wird nicht vom Phagen verwendet, und tatsächlich haben exogene Oligopeptide an Loop IV keine Einwirkung auf die K3-Empfänglichkeit der Zelle (die K3- Adhäsionsdomänen sind in Fig. 3 gezeigt; ein kurzer Überblick über die Bakteriophagen ist unter "Hintergrund", III.v.b, angeführt, und Bakteriophage K3 sowie seine Rezeptor-Anforderungen sind in 76, 126 und 127 beschrieben). Das folgende Verfahren wurde durchgeführt, um zwei Ziele zu erfüllen: a) schlüssig zu demonstrieren, dass Zellen, deren geprägte Polypeptide die Zielverbindung binden, vor einem K3-Angriff geschützt sind, wogegen Zellen, deren geprägte Polypeptide nicht an die Zielverbindung binden, durch den Phagen eliminiert werden, und b) eine Vor-Optimierung der Dauer der Inkubation der CISTEM- Zellpupulation mit Phagen K3 zu erreichen. Das Prinzip dieses Versuchs ist in Fig. 14 veranschaulicht.
E. coli MC4100 (pEGFP-N1), ein Kanamycin-resistenter, ompA- Wildtyp-Stamm, welcher hier als U (für "unmarkiert) bezeichnet wird, wurde über Nacht in Luria-Nährmedium (Luria broth, LB), ergänzt mit 25 ug Kanamycin/ml, gezüchtet. E. coli UH203 (pEV218T7), welches hier als T (für "tagged", markiert) bezeichnet wird, ist ein Ampicillin-resistenter ompA&supmin;-Stamm, der wie voranstehend beschrieben (V.iv.b) durch ein Plasmid, das für OmpA codiert, das die T7-Markierungssequenz am vierten extrazellulären Loop des Polypeptids trägt, transformiert wurde. Dieser Stamm wurde über Nacht in LB, ergänzt mit 100 ug/ml Ampicillin/ml und 5 mM IPTG zur Induktion der pEV218T7-Expression, gezüchtet. Jede Übernacht-Kultur wurde mit LB auf OD6&sub0;&sub0; = 0,001 verdünnt. Um jede von zwei gemischten Populationen zu erzeugen, wurden 50 ul-Aliquots der U-Kultur mit 50 ul- Aliquots der T-Kultur gemischt. Eine gemischte Population wurde 20 min lang bei 37ºC nur mit 20 ul PBS inkubiert, während die andere unter denselben Bedingungen mit 20 ul PBS plus 0,1 ug anti-T7-Markierungs-mAb (Novagene mAbT7) inkubiert wurde. (In Tabelle 4 ist die Anwesenheit oder Abwesenheit von mAbT7 durch ein + oder - angezeigt). In 1 ml LB verdünnte Phagen-K3 wurden dann in jede gemischte Population mit einer Multiplizität der Infektion (MoI) = 10 eingeführt. (Phagen-Stammlösung wurde mittels der herkömmlichen Methode zur Herstellung von "T-even" Phagen hergestellt (34).) Proben-Aliquots von 100 ul wurden von jeder Population zu den in Tabelle 4 gezeigten, festgesetzten Zeiten genommen, nämlich unmittelbar vor dem Einführen von Phagen (in der Tabelle als T = 0, Phage - gezeigt), unmittelbar nach der Einführung von Phagen (in der Tabelle als T = 0, Phage + gezeigt) und zum Zeitpunkt 2 min. 10 min. 30 min. 60 min. 90 min. 120 min. 180 min und 240 min nach der Einführung von Phagen. Aliquots wurden auf mit 100 ug Ampicillin/ml ergänzte LB-Platten, und auf mit 25 ug Kanamycin/ml ergänzte LB-Platten plattiert. Die Kolonien wurden nach einer Inkubation der Platten über Nacht bei 37ºC gezählt.
Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigten, dass die Wechselwirkung zwischen mAbT7 und der T7-Markierung an Loop IV von OmpA die Zellen vor Phagen-K3 schützten. Diese Schlussfolgerung ist sehr kurz in Tabelle 5 zusammengefasst. Zellen, die die T7- Markierung an Loop IV von OmpA aufwiesen, waren vor einer Phagen-K3-Infektion geschützt, und dieser Schutz hing von der Inkubation der Zellen mit mAbT7 ab. Zellen, die Wildtyp-OmpA anstelle der OmpA-T7-Markierungsfusion exprimierten, waren für Phagen-K3 empfänglich, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von mAbT7. Somit sind Zellen, deren geprägte Polypeptide die Zielverbindung binden, vor einem K3-Angriff geschützt, wogegen Zellen, deren geprägte Polypeptide die Zielverbindung nicht binden, durch den Phagen eliminiert werden.
Dieser Versuch dient auch zur Vor-Optimierung der CISTEM- Selektion durch Phagen-K3. Wie in Tabelle 4 und Fig. 15 gezeigt, waren U-Zellen in der gemischten Population aus U- und T-Zellen, die mit mAbT7 inkubiert wurden, aus der Population nach 30 min Inkubation mit Phagen-K3 vollkommen elliminiert. T-Zellen hielten dagegen eine ziemlich stabilie Population noch lange nach 30 min Inkubation mit dem Phagen aufrecht. Dies läßt darauf schließen, dass bei einem Beginn mit MOI = 10, die Mindestzeitdauer für Phagen-K3 zur Eliminierung aller Zellen, die nicht an die Zielverbindung gebunden hatten, 30-60 min wäre.
Das anfängliche jähe Absinken der T-Zellen, dem eine abrupte Stabiliserung (vgl. Fig. 15) folgte, ließ darauf schließen, dass der Antikörper zum Zeitpunkt, an welchem der Phage eingeführt wurde, noch kein Gleichgewicht bei der Bindung der T7-Markierung erreicht haben könnte. Die Vorinkubation mit dem Antikörper dauerte 20 min. und der vollständige Schutz der T-Zellen war offenbar etwa 30 min nach der Einführung des Phagen erreicht, was andeutet, dass die Zeit, die notwendig ist, damit der Antikörper bei der Bindung der Markierung ein Gleichgewicht erreicht, etwa 50 min war. Diese Vermutung wurde durch die folgende Vor- Optimierung der Dauer der Inkubation der Zellpopulation mit der Zielverbindung bestätigt.
Die Stämme U und T wurden über Nacht unter den oben beschriebenen Bedingungen gezüchtet. Jede der fünf gemischten Populationen von U- und T-Zellen wurde geschaffen, indem ein 50 ul-Aliquot der U-Kultur (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,001) entnommen und mit einem 50 ul-Aliquot der T-Kultur (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,001) vereinigt wurde. Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurde jede gemischte Population bei 37ºC mit 7 nN mAbT7, verdünnt in PBS, eine verschiedene Zeitdauer lang inkubiert: 1 min. 10in. 20 min. 30 min. oder 60 min lang. Die Phagen-K3-Stammlösung, die mit LB auf 1 ml und MoI = 10 verdünnt worden war, wurde zu jeder gemischten Zellpopulation unmittelbar nach der Inkubation der Population mit dem Antikörper zugegeben: Jede Population wurde 30 min lang mit Phagen inkubiert. Aliquots wurden dann entnommen, und ihre Zusammensetzung auf U- und T- Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Wie in Tabelle 6 gezeigt, blieben Zellen, die Wildtyp-OmpA aufwiesen, vor Phagen ungeschützt, unabhängig von der Inkubationsdauer mit mAbT7. Dagegen erhielten Zellen, die die T7-Markierung am Loop IV von OmpA aufwiesen, zunehmenden Schutz vom Antikörper, während die Inkubationsdauer verlängert wurde. Wie man aus den Ergebnissen der Vor-Optimierung der (oben beschriebenen) Phagen-K3-Inkubation erwartet hatte, verlieh der Antikörper den T-Zellen erst nach einer Inkubationszeit zwischen 30 und 60 min einen vollständigen Schutz.

d) Anfänglicher Test der CISTEM-Selektion

Die vorbereitenden, Einzel-Parameter-Optimierungen der Inkubationszeit mit mAbT7 und der Dauer der K3-Selektion ermöglichten einen anfänglichen Test der Fähigkeit von CISTEM, seltene Zellen zu selektieren, deren geprägte Polypeptide die Zielverbindung aus einem Hintergrund von Zellen binden, deren geprägte Polypeptide die Zielverbindung nicht binden. Um die Selektion seltener Zellen zu demonstrieren, wurde das folgende Verfahren durchgeführt.
Die E. coli-Stämme U (unmarkiert) und T (markiert) sind oben beschrieben. U wurde über Nacht in mit 25 ug Kanamycin/ml ergänztem LB gezüchtet. T wurde über Nacht in LB gezüchtet, ergänzt mit 100 ug Ampicillin/ml und 1 mM IPTG, um die Expression von pEV218T7, dem für OmpA codierenden Plasmid mit der T7- Markierung an Loop IV des Polypeptids, zu induzieren. Jede Übernacht-Kultur wurde mit LB auf 600 = 0,005 verdünnt. Ein 50 ul-Aliquot der U-Kultur wurde mit einem 50 ul-Aliquot der T- Kultur gemischt, um eine gemischte Population zu erzeugen. Wie in Tabelle 7 gezeigt, war, obwohl die gemischte Population mit gleichgroßen Aliquots von U- und T-Kulturen gebildet worden war, diese hauptsächlich aus U-Zellen zusammengesetzt. Der Grund hiefür war vermutlich der, dass die sehr geringe OmpA-Expressionsmenge, die im T-Stamm induziert worden war (nur 1 mM IPTG wurde verwendet), diesen Stamm wesentlich weniger -lebensfähig machte als es der U-Stamm unter Standard-Kultivierungsbedingungen war. Die gemischte Population wurde bei 37ºC mit 68nM mAbT7 (oben beschrisben), verdünnt in PBS, 60 min lang inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 ul-Aliquots der Zellpopulation auf LB-Platten, ergänzt mit 25 ug Kanamycin/ml oder 100 ug Ampicillin/ml, plattiert. Nach dem Wachstum über Nacht wurden die Kolonien gezählt, was zeigte, dass die Population aus etwa 1 T-Zelle pro 120 U-Zellen bestand (Tabelle 7). Eine in LB verdünnte Phagen-K3-Stammlösung wurde dann zur Zellpopulation bei MoI = 2 zugegeben, was das Gesamtvolumen auf 1 ml brachte. Die Zellen wurden 120 min lang bei 37ºC mit Phagen inkubiert. Nach der Inkubation mit dem Phagen wurden 100 ul = Aliquots der Zellpopulation auf LB-Platten, die mit 25 ug Kanamycin/ml oder 100 ug Ampicillin/ml ergänzt worden waren, plattiert. Nach einer Züchtung über Nacht wurden die Kolonien gezählt.
Kontrollversuche wurden gemäß demselben Protokoll durchgeführt, außer dass PBS ohne mAbT7 und/oder LB ohne Phagen-K3 zugegeben wurde, wie in Tabelle 7 gezeigt. Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigten, dass seltene Zellen (1 in > 100), die eine geprägte Domäne aufwiesen, welche die Zielverbindung gebunden hatte, vor Phagen-K3 vollständig geschützt waren, wogegen alle Zellen, die die Zielverbindung nicht gebunden hatten, rasch aus der Population eliminiert wurden.
Ein systematischer Test auf die Empfindlichkeit von CISTEM bei der Selektion seltener Zellen, die die Zielverbindung binden, aus einem großen Überschuss von Zellen, die die Zielverbindung nicht binden, wird folgendermaßen durchgeführt. Übernacht-Kulturen der E. coli-Stämme U (ungeprägt) und T (geprägt) sind oben beschrieben. 50 ul - 1 ml-Aliquots der U- und T-Übernacht-Kulturen werden vereinigt, um vier Populationen zu bilden, von welchen jede ein unterschiedliches Verhältnis von U-Zellen zu T-Zellen repräsentiert: 10&sup8;U zu 10&sup4;T; 10&sup8;U zu 10³T; 10&sup8;U zu 10²T; und 10&sup9;U zu 10²T. Jede Population wird 60 min lang bei 37ºC mit 10 nM mAbT7 inkubiert. Um die Zusammensetzung der Population zu überwachen (d. h., die Anzahl von U- und T-Zellen), werden alle 30 min (d. h., zum Zeitpunkt 30 min und 60 min), zwei Aliquots von 5 ul entnommen, ein Aliquot wird auf mit 100 ug Ap/ml ergänzte LB-Platten plattiert, und das andere Aliquot wird auf mit 25 ug Km/ml ergänzte LB-Platten plattiert. Die Platten werden dann über Nacht inkubiert, und die Kolonien werden gezählt, um die Populationszusammensetzung zu bestimmen. Unmittelbar nach dem Entfernen von Aliquots zum Zeitpunkt 60 min. werden Bakteriophagen-K3 (oben beschrieben) in die Zellpopulation zu MoI = 2 eingeführt. Die Mischung wird 180 min lang bei 37ºC inkubiert. Wiederum wird ein Probenaliquot von 5 ul zur Überwachung der Populationszusammensetzung mit einer Mikropipette alle 20 min entnommen, plattiert und gezüchtet, und die U- und T-Zellen werden wie oben beschrieben gezählt. Nach der Inkubation mit Phagen wird eine Probe von etwa 1000 Zellen entfernt, plattiert, gezüchtet, und ihre Zusammensetzung wie oben beschrieben bestimmt.
Die Demonstration der Fähigkeit von CISTEM, seltene Zellen zu selektieren, die die Zielverbindung bindet aus einem Hintergrund von mindestens 100 Mal so vielen Zellen, die die Zielverbindung nicht binden, gestattet eine endgültige Optimierung der CISTEM-Leistung mit zwei Parametern. Jede der fünf T-Popula tionen wird 15 min lang mit einer bestimmten Menge an IPTG im Medium induziert: 0 mM; 0,25 mM; 0,5 mM; 1,0 mM; oder 2,0 mM. Fünf gemischte Populationen von 10&sup5;U und 10³T, die jeweils eine verschiedene Induktionshöhe der T-Zellen repräsentieren, werden durch Vereinigung von Aliquots, wie oben beschrieben, erzeugt. 10 nM mAbT7 wird zu jeder Population zugegeben, und die Populationen werden 60 min lang bei 37ºC inkubiert. Während der 60 min Inkubation wird die Popultionszusammensetzung überwacht, wie oben beschrieben, indem alle 20 min Proben-Aliquots von 5 ul entnommen, plattiert, und gezüchtet werden, und die Anzahl der U- und T-Zellen gezählt werden. Nach der Entnahme eines Aliquots zum Zeitpunkt 60 min wird Coliphage K3 mit einem MoI von 2 eingeführt. Während der nächsten 180 min werden die Populationen überwacht, indem alle 20 min eine 5 ul-Aliquot-Probe entnommen wird. [IPTG] und Dauer der Inkubation mit K3, die zur Eliminierung aller U-Zellen führen, mit gleichzeitiger Eliminierung der wenigsten T-Zellen sind die optimalen Parameter-Werte zur Verwendung im CISTEM.
Die hier beschriebenen Optimierungsversuche sehen Paramter- Werte ([IPTG], Dauer der Inkubation mit K3, [mAbT7], Dauer der Inkubation mit mAbT7) vor, die es dem CISTEM ermöglichen, alle Zellen, die nicht an die Zielverbindung binden, zu zerstören, während so wenige Hochaffinitäts-Zellen wie möglich eliminiert werden.

e) Konstruktion einer OmpA-prägenden CISTEM-Zellpopulation

OmpA-Plasmid pEV218 (oben beschrieben, in Fig. 9 gezeigt, Konstruktion in 76 beschrieben) trägt einen Polylinker mit vielen Restriktions-Endonucleasestellen in einer genetischen Region, die dem extrazellulären Loop IV des Polypeptids entspricht. Dieses Plasmid wird mit SacI (Enzym und Reaktionspuffer von New England Biolabs) und XbaI (Enzym und Reaktionspuffer von MBI Fermentas) unter von den Lieferfirmen beschriebenen Bedingungen verdaut, was ein Fragment des Restriktionsstellen-Polylinkers und das linearisierte Plasmid ergibt. Das linearisierte Plasmid wird mittels Standard-Gelelektrophorese (146) isoliert. 106 unterschiedliche Einzelstrang-Oligonukleotide werden mittels herkömmlicher Technik synthetisiert (die Synthese variabler Oligonukleotide ist ausführlich in V.iv.c und 82 beschrieben), so dass sie sich wie folgt lesen:
worin N alle vier Nukleotide, jedes mit gleicher Wahrscheinlichkeit, repräsentiert; und V für C, G oder A, jedes mit gleicher Wahrscheinlichkeit, steht. (Der E. coli-Stamm UH203 ist supF, zur Translation des UAG-Stop-Codons fähig. Deshalb müssen variable Oligonukleotide, die in den OmpA-Vektor pEV218 insertiert werden, frei von Stop-Codons UAA und UGA sein, jedoch nicht von UAG.) Unter Verwendung eines in der Literatur (29) beschriebenen Standard-Protokolls werden ein 5'-Primer und eine "proof- reading"-Polymerase (wie Vent®Polymerase) verwendet, um Doppelstrang-Oligonukleotide aus den einzelsträngigen Matrizen zu erzeugen. Diese doppelsträngigen, sehr variablen Oligonukleotide werden dann mit SacI und XbaI unter Bedingungen, die von den Lieferfirmen (New England Biolabs bzw. MBI Fermentas) beschrieben sind, verdaut, was sehr variable Oligonukleotide mit nicht- komplementären klebrigen Enden ergibt. Die hoch variablen Oligonukleotide werden dann in pEV218 ligiert (MBI Ligationspuffer, Bedingungen von der Lieferfirma beschrieben), das wie im vorigen Absatz beschrieben linearisiert war. Weil die SacI- und XbaIklebrigen Enden nicht-komplementär sind, ligieren sie in nur einem Oligonukleotid pro Plasmid; und nur in einer Orientierung. Herkömmliche elektrophoretische Größenfraktionierung (146) wird verwendet, um ligierte Plasmide, die ein Insert enthalten, zu isolieren. Das Produkt dieses Verfahrens ist eine Population von Plasmiden (kollektiv als pEV218I bezeichnet), die an der genetischen Stelle, die Loop IV von OmpA entspricht, eine hoch variable exogene Sequenz tragen, die keine UAA- und UGA-Stop- Codons hat.
Die variable Plasmid-Population pEV218I wird zur Transformation von E. coli Stamm UH203 (lac, supF, ompA, recA, proAB, rpsL) verwendet (dieser Stamm, seine Vermehrung und seine Transformation sind voranstehend umfassender und auch in 74 und 76 beschrieben). Die UH203-Population wird in mit 100 ug Ap/ml ergänztem Luria-Nährmedium gezüchtet, was eine Population von 10$ Zellen ergibt, die 10&sup6; Klone aufweisen, von welchen jeder ein verschiedenes Element der pEV218I-Population trägt.

f) CISTEM-Selektion auf OmpA mit hoher Affinität für mAbT7

Die UH203 (pEV218I)-Population von 10&sup8;-Zellen plus etwa 100 UH203 (pEV218T7)-Zellen wird 15 min lang bei 37ºC in 100 ml LB- Medium, ergänzt mit 100 ug Ap/ml und IPTG zwischen 0,25 und 2,0 mM, wie mittels des oben beschriebenen Optimierungsversuchs bestimmt, inkubiert. Dies ergibt eine Population von 10 s Klonen, die 106 unterschiedliche Klone aufweisen, von welchen jeder eine verschiedene exogene Oligopeptid-Sequenz an Loop IV von OmpA präsentiert. Einer dieser Klone weist die T7-Markierungssequenz auf. Nach der anfänglichen 15-minütigen Induktion der pEV218I/pEV218T7-Expression wird 10 nM mAbT7 zu den 100 ml der Zellen zugegeben. Die Zellen werden mit dem mAb 60 min lang bei 37ºC inkubiert. Coliphage K3 wird dann mit MoI = 2 eingeführt (das Verfahren für Züchtung und Handhabung von K3 ist oben und in 76, 126 und 127 beschrieben). Die Inkubation mit K3 läuft für die benötigte Mindestzeitdauer, wie mittels des oben beschriebenen Optimierungsversuchs festgestellt, weiter. Nach der Inkubation mit dem Phagen wird die Zellpopulation zentrifugiert, um Zellen vom Phagen und den Lyse-Produkten zu trennen, und die Zellen werden in 100 ml NB, ohne 100 mM NaCl-Ergänzung, resuspendiert, um ein völliges Stoppen der Infektion mit K3 zu garantieren (die Unfähigkeit von Phagen-K3 NB ohne NaCl-Ergänzung zu infizieren, ist in 126 demonstriert). Diese Zellpopulation repräsentiert ein Set von Klonen, die durch CISTEM auf Bindung an die Zielverbindung, mAbT7, selektiert wurden.
Um die Anzahl der selektierten Klone zu amplifizieren, wird die selektierte Zellpopulation bei 37ºC in 100 ml NB auf 10&sup6; Zellen gezüchtet. Die Expression von OmpA wird dann stark induziert durch 2,5 mM IPTG für eine Zeitdauer von 15 min. Nach der Induktion werden 10&sup4; Zellen aus der selektierten Population auf NB-Agar, enthaltend 0,5% Natriumdesoxycholat, plattiert. (Natriumdesoxycholat verhindert das Wachstum von Zellen, die OmpA nicht in der Außenmembran insertieren; solche Zellen sind "falsche Positiva", die vom CISTEM nur ausgewählt werden, weil sie kein OmpA aufweisen, und nicht wegen ihrer Fähigkeit, mAbT7 an Loop IV von OmpA zu binden. Die Natriumdesoxycholat-Ergänzung verhindert auch eine K3-Infektion, was eine weitere Garantie gegen eine Fortsetzung der Infektion ist.) Plattierte Zellen werden bei 37ºC inkubiert, um Kolonien zu züchten, die aus Zellen zusammengesetzt sind, in welchen Loop IV von OmpA ein exogenes Oligopeptid mit hoher Affinität für die Zielverbindung, mAbT7, enthält.

ii. BEISPIEL 2: EIN E. COLI OMPA/COLIPHAGEN-K3/NEISSERIA MENINGITIDIS-ANTIKÖRPER-CISTEM

a) E. coli-Außenmembran-Protein-A und Neisseria-Opa-Proteine

Mehrere jüngste Entdeckungen zeigen, dass eine wichtige OmpA-Funktion, die solch hohe Expressionsmengen und evolutionäre Konservierung des Polypeptids erklärt, die Adhäsion an und Invasion von Wirtsgeweben ist. Es wurde kürzlich demonstriert, dass E. coli OmpA wesentlich beiträgt zur Invasion von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns - einem kritischen Schritt in der Pathogenese neonataler E. coli-Meningitis. In ähnlicher Weise sind OmpA-Homologe direkt beteiligt an der mikrobiellen Anhaftung, Invasion von Wirtszellen und Pathogenese durch Haemophilus influenzae (154 zeigt die Virulenz auf, die direkt auf ein OmpA-Homolog zurückzuführen ist), Neisseria meningitidis (85 und 167 zeigen die Virulenz auf, die direkt auf OmpA-Homologe zurückzuführen ist), Neisseria gonorrhoeae (15, 84, 85, 117 und 160 zeigen die Virulenz auf, die direkt auf OmpA-Homologe zurückzuführen ist) und anderer virulenter Mikroben (74, 81). Die strukturelle Homologie zwischen OmpA und einem breiten Spektrum antigener Adhäsine macht OmpA gut geeignet für die Prägung zur Verwendung in Anwendungsfällen, die eine Mimikry homologer Adhäsine erfordern. Eine solche Anwendung ist die Impfung. Wenn ein Polypeptid (in diesem Fall OmpA) so geprägt ist, dass es an Antikörper bindet, die die Seren gegen ein Antigen bilden, kann das geprägte Polypeptid eine Immunantwort sehr ähnlich jener, die durch das Antigen provoziert wird (97), hervorrufen. Zu den Antikörpern, die zur Verwendung als Zielverbindung bei einem CISTEM zur Prägung von E. coli OmpA zur Nachahmung von Neisseria meningitidis Opa-Proteinen (beschrieben in 1, 2, 130 und 167) geeignet sind, zählen mAb B33 (in 167 beschrieben), welches mit allen Opa-Proteinen reagiert, mAbs P322 und P514 (in 2 beschrieben), die mit einer großen Untergruppe von Opa-Proteinen reagieren, und mAb B306 (in 2 beschrieben), mAb A222/5b (in 130 beschrieben) und andere, die in der Literatur beschrieben sind.

b) CISTEM-Selektion auf OmpA mit hoher Affinität für Antikörper gegen Neisseria meningitidis Opa-Proteine

Die Konstruktion einer Zellpopulation zum Testen und Optimieren der CISTEM-Selektion, die Optimierung und Demonstration der CISTEM-Funktion und die Konstruktion einer OmpA-prägenden CISTEM-Zellpopulation werden genau wie oben beschrieben (VI.i.a-e) durchgeführt: dieses CISTEM, wie das in Beispiel 1 beschriebene, verwendet Phagen-K3, um aus einer Zellpopulation mit variablen Inserts eine Länge von 20 Aminosäuren an Loop IV von mpA zu selektieren. Während jedoch in Beispiel 1 OmpA so geprägt wird, dass es an mAbT7 bindet, prägt dieses CISTEM OmpA so, dass es an Antikörper gegen Neisseria meningitidis Opa-Proteine bindet. Daher sind, während im in Beispiel 1, Teil f beschriebenen Protokoll 10 nM mAbT7 notwendig war, für dieses CISTEM 10 nM von jedem der folgenden Antikörper notwendig: B33; P322; P514; B306; und A222/5b. Abgesehen von dieser Substitution ist das Protokoll zur Prägung von OmpA zur Bindung von anti-Opa-Antikörpern so, wie im Beispiel 1, Teil f beschrieben.
Jedes Polypeptid (Spalte A) ist mit den pathogenen Agenzien (Spalte B) angeführt, die in einem CISTEM zur Prägung des Polypeptids verwendet werden konnten: den extrazellulären Domänen, die die Adhäsionsdomänen des Agens bilden (Spalte C; die Nummerierung beginnt am Amino-Terminus), einer Domäne, die an die Adhäsionsdomäne unmittelbar angrenzt und so geprägt werden konnte, dass sie eine Zielverbindung bindet (Spalte D); und Literaturstellen (Spalte E). Tabelle 1 Tabelle 2
Serielle Verdünnungen von pathogenem Agens und Ziel-Konzentrationen bei der Vor-Optimierung der CISTEM-Selektion. Die in der Tabelle angeführten Zellpopulationen sind im Text beschrieben. Tabelle 3 Tabelle 4 Tabelle 5 Tabelle 6 Tabelle 7

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Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen einem (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, und einer Zielverbindung, wobei mindestens einer der Wechselwirkungspartner unbekannt ist, mit den Schritten:

a) Herstellen einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zellpopulation, die so hergestellt wird, dass sie ein Membran-Polypeptid exprimiert, welches das (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, in seiner extrazellulären Domäne aufweist, wobei die extrazelluläre Domäne in einer oder mehreren Kopien an jeder Zelloberfläche unmittelbar benachbart einer Adhäsionsdomäne für ein toxisches Agens präsentiert wird, wobei die Adhäsionsdomäne und die extrazelluläre Domäne zum selben Membran-Polypeptid gehören, so dass nach einer Wechselwirkung der Zielverbindung und des (Poly)peptids, an dem Interesse besteht, das toxische Agens von der Adhäsionsdomäne ausgeschlossen ist,

b) Aussetzen der Zellpopulation einer Zielverbindung oder einer Population von Zielverbindungen für eine Zeitdauer, die ausreicht, damit die Zielverbindung mit dem (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, in Wechselwirkung tritt,

c) Aussetzen der Zellpopulation - gleichzeitig mit oder nach Schritt b) - dem toxischen Agens für eine Zeitdauer, die ausreicht, dass das Agens an seiner Adhäsionsdomäne anhaftet,

d) Auswählen jener Klone, die infolge der Wechselwirkung des (Poly)peptids, an dem Interesse besteht, mit der Zielverbindung einen Wachstumsvorteil haben,

e) Vermehren-Lassen der ausgewählten Klone,

f) Identifizieren des unbekannten Wechselwirkungspartners und Isolieren desselben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Membran-Polypeptid ausgewählt ist aus an Glykolipid verankerten Polypeptiden, bitopischen integralen Membran-Polypeptiden, polytopischen integralen Membran-Polypeptiden oder Membran-gebundenen Isoformen eines sezernierten Polypeptids.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der unbekannte Wechselwirkungspartner das (Poly)peptid ist, an dem Interesse besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die extrazelluläre Domäne des Membran-Proteins eine stark variable Region enthält, die nach Wechselwirkung mit der Zielverbindung als das (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, oder ein Teil davon, identifiziert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die variable Domäne von einer cDNA-Bank kodierte (Poly)peptide oder Teile davon aufweist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Membran-Polypeptid für die Zellen heterolog ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Membran-Polypeptid gentechnisch so konstruiert wird, dass es die extrazelluläre Domäne und die Adhäsionsdomäne einander benachbart an der Zelloberfläche enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die extrazelluläre Domäne eine stark variable Region enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielverbindung aus einer Mischung von Verbindungen zusammengesetzt ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9 in Form eines Screening-Tests mit hohem Durchsatz, wobei die Zellen einer Mehrzahl von Zielverbindungen ausgesetzt werden, aus welchen ein unbekannter Wechselwirkungspartner für ein (Poly)peptid, an dem Interesse besteht, identifiziert werden soll.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wechselwirkung durch die Fähigkeit des (Poly)peptids, an dem Interesse besteht, sich an die Zielverbindung anzuhängen oder diese zu teilen definiert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wechselwirkung eine antagonisierende Wirkung ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wechselwirkung eine agonisierende Wirkung ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielverbindung ein Antikörper oder ein Antikörperfragment des (Poly)peptids, an dem Interesse besteht, ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielverbindung eine Verbindung ist, die von den Zellen sezerniert wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das toxische Agens ein pathogenes Agens ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das pathogene Agens ein Bakteriophage ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das pathogene Agens ein Virus ist.

19. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das pathogene Agens auf die Zellen eine stärkere oder schwächere Wirkung hat als das korrespondierende natürlich vorkommende pathogene Agens.

20. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Parameter ausgewählt aus Virulenz des pathogenen Agens, Infektionswirksamkeit des pathogenen Agens und/oder Konzentration des pathogenen Agens; Konzentration der Zielverbindung; Wachstumsrate der Zellpopulation und Anzahl der auf der Oberfläche jeder Zelle aufscheinenden variablen Regionen so eingestellt werden, dass sie zu einer Selektion von Klonen führen, die variable Domänen aufweisen, welche mit der Zielverbindung mit einer Affinität, die über einem vorgeschriebenen Niveau liegt, in Wechselwirkung treten.

21. Verfahren nach Anspruch 4, welches weiters eine Wiederholung der Schritte b) bis e) aufweist, bis die Zellpopulation die gewünschte Anzahl bestimmter Klone aufweist, die alle variable extrazelluläre Domänen aufweisen, welche mit der Zielverbindung über ein gewünschtes Maß an Wechselwirkung hinaus in Wechselwirkung treten.

22. Verfahren nach Anspruch 4, welches weiters die Schritte aufweist: Einführen neuer Sequenz-Variationen an den variablen Regionen von in Schritt d) ausgewählten Klonen; Vermehren-Lassen der in Schritt d) ausgewählten Klone, die nun neue Sequenz- Variationen in ihren variablen Domänen aufweisen, in einem Nährmedium; Wiederholen der Schritte g) bis i) bis ausgewählte Klone die gewünschte Art der Wechselwirkung mit der Zielverbindung aufweisen.

23. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Membran-Protein an der Oberfläche der Zelle eine zusätzliche Domäne benachbart sowohl der variablen Domäne als auch der Adhäsionsdomäne aufweist, von welcher zusätzlichen Domäne bekannt ist, dass sie mit der Zielverbindung auf festgelegte Weise in Wechselwirkung tritt.

24. Verfahren nach Anspruch 4 zur Identifizierung von (Poly)peptiden, an welchen Interesse besteht, die mit einer Zielverbindung in Wechselwirkung treten und ihre Funktion beeinflussen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Screenen der variablen Regionen, die die in Schritt d) ausgewählten und in Schritt e) amplifizierten Klone aufweisen, auf ihre Fähigkeit, die Funktion der Zielverbindung zu beeinflussen.

25. Verfahren nach Anspruch 4 zur Identifizierung von Polypeptiden, an welchen Interesse besteht, als Enzyme, welches Verfahren weiters das Platzieren der Zellpopulation in ein Nährmedium, in welchem die Versorgung jeder Zelle mit einer lebenswichtigen Verbindung von der variablen Region dieser Zelle abhängt, die enzymatisch auf eine Verbindung wirkt, die der Zielverbindung strukturell ähnlich jedoch nicht identisch mit dieser ist.