JPH07501203A - 改良された顕示ファージ - Google Patents

改良された顕示ファージ

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良された顕示ファージ 発明の背景 発明の分野 この発明は突然変異したエビトビツク（エピトープ、以下同じ）ペプチドの集合 体（ｌｉｂｒａｒｉｅｓＸライブラリー、以下同じ）又はファージ表面のポテン シャル結合タンパク質ドメインの発現及び顕示と、類似性（親和性、以下同じ） の高い種を確証するために行う、これらの集合体のスクリーニングに係わるもの である。
情報公開に関する声明 アミノ酸配列はタンパク質の三次元構造及びその働きを決定するものである。ポ リペプチド鎖上にある残留物（残基、以下同じ）は、タンパク質の三次元構造決 定において他の残留物より重要である。溶剤にさらされたアミノ酸の置換は、点 （Ｉｏｃｉ）の内部における置換はど三次元構造に影響を及ぼさない。
「タンパク質エンジニアリング」はタンパク質結合の特徴を変える目的でその配 列を操作する技術である。タンパク質の結合に影響を与える要素は知られている が、新たな補体表面を作り出すことは困難とされている。
ＤＮＡ再結合（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）技術の開発によって、天然のタンパク 質をコートし更に突然変異させた遺伝子を圧出（発現、以下同じ）する方法で遺 伝子を突然変異させ、突然変異タンパク質を得ることが可能になった。突然変異 遺伝子を生成する方法の幾つかは既に知られている。一つは［タンパク質手術（ Ｓｕｒｇｅｒｙ月と呼ばれ、選ばれた遺伝子内における一つないし二つの予定さ れた突然変異導入方法を用いる。この方法では、予め完全に決定された基ポリペ プチドの配列が顕示され、その結合上の特徴が評価される。
上記と極端に異なる方法は、無差別突然変異遺伝子であり、放射線や様々な化学 物質といった特定されない突然変異遺伝子による方法である。
核酸合成法の適切なサイクルのベース混合物を使って、予定されたヌクレオチッ トを無差別に変化させることができる。混合物のベースの割合により、コドン（ ｃｏｄｏｎ）の各位置に対し、それぞれのアミノ酸が退行ＤＮＡの数により圧出 されるポリペプチドにおいて生じる頻度が決まる。オリファントその他（ＯＬＩ Ｐ８６）及びオリファント及びストルール（ＯＬＩＰ８７）は、非常に退化した オリゴヌクレオチットのリゲーション及びクローニングを行っており、これは促 進物質の突然変異に用いられている。彼らは類似した方法をタンパク質コード化 範囲の変化に使うことができると言っている。ただし彼らは次のようなことは意 図していない。
ａ）変化させるためタンパク質残留物を選択すること。又はｂ）適切な特異性の ある突然変異体を選択或はスクリーニングすること。
レイドバール、オルソン及びザウアー（ＲＥＩＤ８８ａ）は合成退化オリゴヌク レオチドを用いて２０種のアミノ酸全てを通じて、二つ又は三つの残留物を同時 に変化させた。ヴアーションその他（ＶＥＲ３８６ａ、　ＶＥＲ３８６ｂ）も参 照のこと。レイドバール、オルソン及びザウアーは、一度に何個まで残留物が変 化させられるかについて、或いは異なったアミノ酸をコードする多量なりＮＡの 不均衡さの問題については触れていない。
多くの研究者が、突然変異していない異抗原エピトープをファージ表面に向け、 天然ファージ表面タンパク質に融合させて、エピトープが抗体に認められること を実証してきた。
ダルベツコ（ＤＵＬＢ８６）は、異抗原エピトープをウィルス表面上のタンパク 質に結合させ、圧出されたキメラ−タンパク質が、異エピトープが抗体にとどく ようウィルス表面上に顕示する方法を提案している。１９８５年スミス（ＳＭＩ Ｔ８５）は、ＥｃｏＲＩヌクレアーゼ内遺伝子の機能しないセグメントをバクテ リオ・ファージｆ１の遺伝子ＩＩＩに挿入、「フェーズ内」の状態にしたと報告 した。
遺伝子ＩＩＩのタンパク質は感染力に必要なマイナー・コートのタンパク質であ る。スミスは、再結合ファージがＥｃｏＲＩヌクレアーゼ内に対して高められた 固定抗体によって吸着させることを実証している。デ・う・クルゾその他（ＤＥ ＬＡ８８）は、遺伝子ＩＩＩタンパク質への挿入物質としての、Ｍ２Ｓ上のプラ スモジウム・ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）から、サーカムスポロツ オイト・タンパク質のリピート領域の７ラグメントを圧出した。彼らは、ラビッ トの実験において再結合ファージが抗原であると同時に免疫原であり、更にこの ような再結合ファージがＢエピトープ・マツピングに使用できることを示した。
研究者たちは類似した再結合ファージがＴエピトープ・マツピングや予防摂取の 開発に用いられ得ると提案している。
マツ力ファーテイその他（ＭＣＣＡ９０）は、抗体のＦｖフラグメントの結合物 をｐ■タンパク質のＮターミナルに圧出した。Ｆｖフラグメントは突然変異しな かった。
ラットナー、グリツク、及びバード、ｆ０８８１０６６３０（ｐｕｂｌ、　１９ ８８年９月７日、及びジーエックス・コーポレーションに分担された米国アプリ ケーション０７１０２１．０４６、に優先される）（ＬＧＢ）は、多様単鎖抗体 ドメイン（ＳＣＡＤ）をある抗原領域に結合させるため、スクリーニングできる と推測している。その方法は、単鎖抗体の結合決定領域をコード化するＤＮＡを 変化させ、ＳＣＡＤ染色体をファージ・ラムダのｇｐｖ遺伝子内にサブクローニ ングして５ＣＡＤ／ｇｐ　Ｖキメラがファージ・ラムダの外部表面に顕示される ようにした上、類似性クロマトグラフィーで抗原に結合するファージを選択する ことによって行うものである。
パームリー及びスミス（ＰＡＲＩＩ８８）は、可能なヘキサペプチドを全て顕示 するエピトープ集合体を構築し、抗体に結合するエピトープを分離するのに使用 することが可能だと提案している。
エピトープ集合体の検討において、著者たちは、異なったアミノ酸の表示（ｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｎｎ）のバランスをとることが望ましいとは言っていない 。挿入物質が外因タンパク質の完全なドメインをコートすべきであるとも教えて いない。エピトープは、構造のあるタンパク質とは異なり、無構造のペプチドで あると考えられている。スコツト及びスミス（ＳＣＩＴ９０）及びクワーラその 他（ＣｆｌＲ９０）は、ターゲットの抗体として可能性のあるヘキサペプチド・ エピトープが、退化オリゴヌクレオチドを溶解し、ｆｄファージの遺伝子■とと もにエピトープをコートして、溶解された遺伝子をファージに感染した細胞に圧 出することによって無差別に突然変異させる「エピトープ集合体」を用意した。
細胞は結合ファージを作り出し、その表面にエピトープを顕示した。固定抗体に 結合したファージは酸で溶出され、研究された。
デヴリンその他（ＤＥＶＬ９０）は同様に、１１１３フアージを使Ｌ）、ストレ プトアビジンによって認められた無選択の１５個のエピトープのため、スクリー ニングを行っている。
スコツト及びスミス、クワーラその他、及びデヴリンその他において、集合体か ら各位置におけるアミノ酸の非常に偏ったサンプルを得る結果となった。退化オ リゴヌクレオチド生成上、最も重要な事は、各位置において２０種のアミノ酸全 てが確実にコードできるようにすることだった。二番目には停止のシグナルが頻 度を最低限に抑えることである。結果的にスコツト及びスミス、及びクワーラそ の他はＮＨＫ（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ’、Ｃの同量の混合。Ｋ＝ＧとＴの同量の混合） を用い、デヴリンその他はＮＮ５（Ｓ＝ＧとＣの同量の混合）を使った。最も好 条件のアミノ酸から最も悪条件のアミノ酸まで、頻度比を最低限にしようとする 試みも、酸化アミノ酸及び基礎アミノ酸が生じる率を均等にしようとする試みも なかった。
デヴリンその他は、類似性によって選択された数個のストレプトアビジン結合ペ プチドの特徴を述べたが、これらのペプチドの類似定数を測定しなかった。クワ ーラその他は彼の用いたペプチドの類似定数を得たが、最良のへフサペプチドの 類似率（３５０−３００ｎＭ）はターゲットの抗体により認知された天然のメッ ト・エンケファリン・エピトープ（７ｎＭ）と［比較にならないほど」弱いこと がわかり落胆した。クワーラその他は、恐らくファージ（ｐＨ１のコピーを約４ 個持つ）と二価ターゲットのＴｇＧとの間に多価の相互作用が起こるために、フ ァージを持つ類似性の高いペプチドが酸の流出のもとで結合されたままだったの ではないかと推測している。スコツト及びスミスはターゲットの抗体（Ａ２）に 対する類似性が参考用のミオヘメリトリン（■ｙｏｈｅｍｅｒｙｔｈｒｔｎ）・ エピトープ（５０ｎＭ）のそれと比較し得るペプチドを発見することができた。
しかし、スコツトもスミスも、ターゲットに対する結合ファージの復帰不能の結 合により、類似性の高いペプチドが幾つか失われたのではないかという懸念を表 している。
ラッドナーその他、Ｙ０９０１０２８０９、は本書の参考文献にまとめられてお り、予定されたターゲットと類似性のある新規結合タンパク質の生成及び確認の プロセスを説明している。このプロセスによると、ポテンシャル結合ドメインを コードする遺伝子（単なるエピトープ、ペプチドとは区別される）であり、予定 されたコドンを制限された数だけ無選択で変異発生させることによって得られた 遺伝子は、遺伝因子に結合される。この遺伝因子は結果的にキメラ圧出生成物を ウィルス（特に糸状のファージ）又は細胞の外部表面に顕示する。次に、ゲノム が、色層分析のターゲットに結合したタンパク質のためにコードする結合遺伝子 のような遺伝子を含むウィルスや細胞を確証するために、色層分析に基づいた選 択が用いられる。ラッドナーその他はウィルス又は細胞がターゲットに非常にし っかりと結合しているために生存できる状態で洗い流せない場合に、関連遺伝子 を復帰させる方法を幾つか検討した。それらの方法とは、遺伝子を（ｇｒａｖｉ ｎｇ　ｔｈｅｍ）位置づけて（ｉｎ　５ｉｔｕ）り０７トグラフイツク・マトリ ックスにおいて培養したり、マトリックスを分解し、接種剤として培養器に入れ たり、マトリックスとターゲットの物質の間にあるつながりを減成したり、ウィ ルスや細胞を減成させた上でそれらのＤＮＡを復帰させたりするといった方法で ある。しかしこれらの方法はまたターゲットに特定の目的を持たずに結合してい るウィルスや細胞も復帰させてしまう。
１０９０１０２８０９もまた変異発生の方法を検討しており、それには２０種の アミノ酸を全てほぼ同量の割合でもたらす方法も含まれている。ただしこれはエ ビトビツク・ペプチドの場合ではなく、タンパク質ドメインの変異発生において のみ有効な方法である。
発明の要旨 現在の発明は、上述のような不備不足を克服することが意図されている。発明に おける具体的方法の一つに、「顕示ファージ」の集合体が予定されたターゲット と高い類似性のあるドメインの結合を確証する方法として使用されているものが ある。
ポテンシャル結合ドメインはファージの表面に顕示される。これは、ポテンシャ ル結合ドメインと、少なくともファージにおいて天然のコート・タンパク質の機 能できる部分がら成り立つキメラ外部表面タンパク質をコードする、結合遺伝子 を圧出することによって達成できる。好ましい方法においてはセミランダムな変 異発生のパターンを用いる「多様化または変化」（バリニゲ−ジョン、ｖａｒｉ ｅｇａｔｉｏｎ）と呼ばれる方法である。これは突然変異を、結合の特性に最も 影響を与えそうであり、かつその根底をなす構造を破壊する可能性が最も低い親 結合ドメインの残留物に対して集中させる方法である。その結果、どのファージ でも単一の異結合ドメインのみを顕示する一方（恐らく多数の複製により）、フ ァージ集合体は全体として何千、何百万という異なる結合ドメインを顕示するこ とになる。ファージ集合体は類似性分離技術によってスクリーニングされ、成功 （高類似性の）結合ドメインのあるファージが確証され、これらのファージは、 成功結合ドメインの配列を知るために復帰され、特徴を調べられる。その上でこ れらの成功結合ドメインは親結合ドメインとして、バリニゲ−ジョン及び類似性 による分離に再び用いられるのである。
発明における別の具体的方法として、顕示ファージがその表面に、天然外部表面 タンパク質とポテンシャル・エピトープから成るキメラ外部表面タンパク質を顕 示するものがある。これらの顕示ファージから成り立っているエピトープ集合体 内では、異エピトープに当たる領域の変動性が非常に高くなる（ｈｙｐｅｒｖａ ｒｔａｂｌｅ）。この集合体は抗体又は他の関連結合タンパク質を用いてスクリ ーニングされ、類似性の高いエピトープが確証される。ボテンシャル結合ドメイ ンの顕示、変異遺伝子、及びスクリーニングに関する参考文献は、別途指示がな い限り、ポテンシャル・エピトープの変異遺伝子及びスクリーニングにおいて展 示すべく、ミュータテイス・ミュータンディス（ｍｕｔａｔｉｓ　ｌｌ１ｕｔａ ｎｄｉｓ）に持参し申請すべきである（ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｔａｋｅｎ　ｔｏ 　ａｐｐｌｙ）。
前述の通り、キメラコート・タンパク質の複製が数個単一ファージ上に顕示され ている場合、特にターゲットが多価であれば（抗体の場合はそうである）復帰不 能な結合が起こる危険がある。
そのような場合、溶出増減率により最後に溶出されたファージは、最も高い類似 性のあるエピトープ又は結合ドメインを有するものではな（、当初の溶出状態の もとてターゲットに結び付いていられるだけの類似性はあっても、復帰不能な状 態に結合するだけの類似性はない。結果として、技術的に知られている方法論で は、多くの目的のため最も好ましい種類である、非常に高い類似性のあるエピト ープ又は結合ドメインを復帰復帰させることができないかもしれない。
我々はキメラ・コート・タンパク質に対し、異エピトープ又は結合ドメインと、 ある位置において特定のプロテアーゼにより分割し得るワイルドタイプ（野性型 、以下同じ）のファージ・コート・タンパク質のもともとの配列との間に、リン カ−（ｌｊｎｋｅｒ）配列を施すことによって復帰不能結合の問題に対処するこ とを提案する。この場合、ファージ集合体は固定ターゲットとともに生成される 。類似性の低いファージはターゲットから溶出され、固体フェーズ（類似性の高 いファージを有する）のみが保持される。前述のリンカ−配列が分割され、結合 されたエピトープ又は結合ドメインを残したままファージの粒子がリリースされ る。その後粒子を復帰させること（そのＤＮＡを、相当するエピトープ又は結合 ドメインの配列を決めるよう並ばせる）か、又は結合されたペプチドを復帰させ ることも可能である（及びそのアミノ酸を直接配列させる）。前者の復帰方法の 方が好ましい。ＤＡをコードすると、試験管内でＰｃｔ？を用いるか、或いは試 験管内で高い類似性のある顕示ファージがある適切なホスト細胞を生体内で移行 （ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）させることによって、増幅させることができるか らである。分割できるリンカ−による結合タンパク質の生成は技術的に知られて いる一方、このようなリンカ−をファージのキメラ・コート・タンパク質のコン トロールされた分割を行うために使用することは、これまで報告されていない。
復帰不能の結合に対処するもう一つの方法は、結合ドメインが「ミニ・タンパク 質」である場合に適している。つまり比較的小さいペプチドで構造の安定度が主 に一つ又はそれ以上のコバレント・クロスリンクの存在に起因するもの、例えば （ジスルフィド、以下同じ）二硫化合物結合が上げられる。上記の例で示したよ うに、類似性の低いファージが先に除去される。残った高類似性の結合ファージ は、クロスリンクを壊す反応物質、例えば二硫化合物結合のドメインの場合はジ チオトレイトールなどとともに処理されるが、ペプチド結合体を分割したり、或 いはクロスリンクされていないアミノ酸の側方鎖を変更したりしない。これは通 常、結果としてファージを徹底的にリリースするか、又は他の方法によってファ ージの溶出をさせるに充分な変質を起こすことになる。
以上二つの方法が違いに相反するものでないことは当然である。
周知のエピトープ顕示ファージ集合体において、ファージのゲノムは、Ｍ１３の ワイルド・タイプ遺伝子■タンパク質遺伝子で、その一つがキメラ・コート・タ ンパク質をコードするものをこ−どする遺伝子を置換することによって変えられ た。その結果、ワイルド・タイプ遺伝子■タンパク質のノーマルな複製が５個す べてキメラ−コート・タンパク質に置換された。この場合各７７−シはターゲッ トに対し５個のポテンシャル結合個所を有しており、従って非常に高い結合性が ある可能性がある。
類似性の高いエピトープ（又は結合ドメイン）とともに、これは復帰不能結合に 対処する上で役立つかもしれない。
顕示ファージ、特にエピトープ顕示ファージのターゲットに対する結合性を減ら し、復帰不能結合の問題を緩和するための現在の発明における一つの方法は、フ ァージが二つの遺伝子を含むように生成することである。それぞれの遺伝子がコ ート・タンパク質を圧出し、一つがワイルド・タイプ・タンパク質を、もう一つ が同系キメラ・コート・タンパク質をコードする。従って、ファージを持つ類似 したエピトープ又は結合ドメインにおいては、ワイルド・タイプ及びキメラ・コ ート・タンパク質の分子の比率が異なる場合もあり、因って異なった結合性を有 する可能性がある。集合体の平均比率は二つの同系遺伝子にょる圧出レベルに左 右される。
キメラ・コート・タンパク質の割合を同系のワイルド・タイプ・コート・タンパ ク質に変えられた方が利点がある。例えば、進化の初期段階プロセスにおいて、 ターゲットに対する結合ドメインの類似性はかなり低い。特にドメインがターゲ ットに対する類似性が全くない親結合ドメイン基づいていればなおさらである。
変質はキメラ遺伝子を調整可能な促進物質のコントロール下に置くことにより達 成できる。　同系ワイルド・タイプ遺伝子を、二番目の、異なった調整のなされ た促進物質のコントロール下に置くことは可能かもしれないが、これは旧３遺伝 子■の場合と同様、遺伝子がポリジストロニック・オペロン（ｐｏｌｙｃｉｓｔ ｒｏｎｉｃ　ｎｐｅｒｎｎ）の一部であれば実現不可能となる。その場合、ワイ ルド・タイプ遺伝子の圧出は、メチオニン・イニシェーション・コドンをロイシ ン・イニシェーション・コドンと置換することによって削減できる。
１１１３遺伝子■は前述の通り、この糸状のファージ（一つのファージにつき５ 個の複製）のマイナーなコート・タンパク質の一つをコードする。異エピトープ がファージ・コートに顕示されるようにこの遺伝子を変えようとした人たちによ り報告された復帰不能結合の困難性を考慮すると、Ｍ１３主要コート・タンパク 質の使用を避けた方がよいことは明白である。しかし、我々はキメラの主要コー ト・タンパク質は、事実、スクリーニングの目的のためのポテンシャル結合ドメ インの顕示に役立つことを発見した。一つのファージにつきこのタンパク質の複 製が１０００以上あるにもかかわらずである（実際、そうであるが故に役立つと 言えることもある）。主要（［）コート・タンパク質は同様にエピトープ・ファ ージの集合体を構築するのに役立つと信じられている。
我々はまた、ポテンシャル結ドメイン（又はエビトビツク・ペプチド）をこの主 要コート・タンパク質に、そして恐らく他のタンパク質にも付着させる上で適し たリンカ−も開発した。
最後に、エピトープ集合体において分かった問題は幾つかが、アミノ酸の非常に 偏った配置につながる変異発生パターンの使用に起因しているということがらす れば、現在の発明もまた、偏りがより少なく、従ってより効率的なエピトープ・ ファージ集合体につながる、様々な改善されたパターン志向であると言えよう。
図面についての簡単な説明 図１はファージを遺伝子ファージとしていかに使うがを示す。
（ａ）は脂質二層にとどまっているワイルド・タイプ・プリコート・タンパク質 である。シグナル・ペプチドは外賓スペースにある。（ｂ）では、キメラ・プリ コート・タンパク質が同じように、シグナル・ペプチドと成熟したタンパク質配 列の間に介在するポテンシャル結合ドメインとともに、閉じ込められている。
（Ｃ）と（ｄ）では、シグナル・ペプチドがワイルド・タイプ及びキメラ・タン パク質からそれぞれ分割されているが、コート・タンパク質配列の残留物によっ ては、脂質二層と相互作用し、成熟タンパク質が完全に性質に移行するのを防ぐ ものである。
（ｅ）と（ｆ）では、成熟したワイルド・タイプ及びキメラ・タンパク質が、外 賓スペースに向かって伸びるに従い、単一成分ＤＮＡファージのコートに生成さ れていく。ファージは外膜を通り、媒体の中に入って復帰したりクロマトグラフ ィーによって評価されたりする。図２はファージｆ１のコート・タンパク質にお けるＣ−ｓを示す。
好ましい具体的方法の詳細説明 ■、顕示方法 Ａ、概要 現在の発明においては、ポテンシャル結合ドメイン（ｐｂｄ）又はポテンシャル ・エピトープはファージ表面においてファージのコート（外部表面）タンパク質 （ｏｓｐ）とともに結合形態をとって顕示される。このキメラの外部表面タンパ ク質はファージ・ゲノムに挿入された顕示遺伝子によって圧出されたポリペプチ ドの生成物である。従って、１）ファージのゲノムは、追加的な遺伝物質に耐え るか、又は置換可能な遺伝物質を有することによって、顕示遺伝子の導入をさせ なければならない。２）ピリオン（ｖｉｒｉｏｎ）は、遺伝物質の挿入又は置換 を認めた後、ゲノムをパッケージする能力を持たなければならない。更に３）フ ァージ表面の０３Ｐ−ＩＰＢＤタンパク質の顕示は、ファージの広がりに障害と なるようにバイリオン構造を破壊してはならない。
ウィルスの粒子が生成されると、そのコート・タンパク質は、ａ）細胞形質から 、ｂ）外賓から、またはＣ）脂質二層内からファージに付着することができる。
顕示遺伝子の直接生成物は、コート・タンパク質が外賓又は脂質二層内からファ ージに付着する場合、例えば、ｐｈｏ　Ａシグナル（ＭにＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰ ＬＬＦＴＰＶＴに＾）といった機能的分泌シグナル・ペプチドを、アミノ終点（ 末端、以下同じ）において特徴としなければならない。分泌シグナルがポテンシ ャル結合ドメイの顕示に必要であれば、特に好まれる方法は、雑種遺伝子が圧出 されるバクテリアの細胞が「分泌可能な」分離の一種である。
異エピトープ又は結合ドメインをコードするＤＮＡ配列は、加工コート・タンパ ク質のアミノ終点が通常フリー・エンドに位置づけられるなら、コート・タンパ ク質を適切にコードする配列に先行すべきであり、カーポクシー終点（カルボキ シ末端、以下同じ）が通常のフリー・エンドにあるなら後行すべきである。
ファージの形態発生経路により、ＩＰＢＤが折り返す（ｆｏｌｄ）機会のある環 境が決まる。ＩＰＢＤが必要不可欠な二硫化物を含む場合、外賓において生成さ れたファージが好ましい。ＩＰＢＤは細胞内では折り返さない可能性があるから である。（これらのタンパク質は）７−ジが細胞からリリースされた後に折り返 すことができる）一方ＩＰＢＤが大きな又は非水溶性の補足グループ（補欠分子 族、以下同じ）（Ｆｅ４Ｓ４クラスターなど）を必要とする場合は、細胞内で生 成されたファージが好ましい。ＩＰＢＤが分泌した場合、補足グループの欠如の ために折り返すことができない可能性があるからである。
多様化手法（バリニゲ−ジョン）が導入された時、多種感染によって、一つのＰ ＢＤのために遺伝子を持つが、少なくともそ　゛の表面に幾つかの異なったＰＢ Ｄの複製を持つ雑種ＧＰが生成される可能性がある。結果的に低多種感染（ＭＯ Ｉ）となる状況下で７アージにより細胞を感染させることによって、この可能性 を最低限に押さえることが望ましい。
あるバクテリア・ファージにとって望ましいＯ３Ｐは、通常ファージ表面に最大 数の複製を持つものである。このことが０３Ｐ−ＩＰＢＤのワイルド・タイプに 対する比率を変える際、最大の柔軟性を持たせられる上、類似性による分離を成 功させる可能性が最も高いからである。更に、一つか二つの複製の中にしか存在 しないタンパク質は、通常、形態発生又は感染において必要不可欠な機能を持っ ている。このようなタンパク質を追加又は挿入によって突然変異させると、ＧＰ の生存度を低減する結果となる。
しかしながら、Ｍ１２ｇｌＩ［タンパク質のようなＯ３Ｐは、ＰＢＤの顕示を促 すＯ３Ｐとして優れた選択であると言える。
ワイルド・タイプのｏｓｐ遺伝子は保存することが望ましい。
ｊｐｂｄ遺伝子の粒子は受理側ｏｓｐ遺伝子の二番目の複製又は新規に生成され たｏｓｐ遺伝子に挿入する。ｏｓｐｉｐｂｄ遺伝子は調節済促進物質のコントロ ール下に置かれることが望ましい。我々のプロセスは、ＩＰＢＤから出たＰＢＤ の進化を促進するものである。そうすることにより、幾つかは新しい機能を有す るようになる、つまり選択されたターゲットに結合されるということである。
進化する遺伝子を複製遺伝子上に置（ことは、タンパク質属の進化において広（ 認められたシナリオである。遺伝子の複製がタンパク質の先祖からタンパク質属 が進化する上で第一の段階であったとすることは、現在一般的に認められている 考え方である。遺伝子の複製を二個持つことにより、影響を受けた生理学的過程 はそのうち一個の遺伝子の突然変異に耐えることが可能になるのである。この過 程はよく理解されており、グロブリン属（ＤＩＣＫ８３、ｐ［１５ｒｒ、及びＣ ＲＥ１８４、ｐ１１７−１２５参照）について文献化されている。
ユーザーはＯ８Ｐ遺伝子候補において１ｐｂｄ遺伝子の一部を挿入する個所を選 ぶ必要がある。はとんどのバクテリアファージのコートは秩序立てられている。
糸状のファージは、螺旋形の格子という言葉で描写できる。イソメトリック・フ ァージは二十面体の格子のようである。それぞれの主要コート・タンパク質にお ける各モノマーは格子の端にあり、付近のモノマーと決められた相互作用を起こ す。通常の格子接触を全てではないかい（らか行うことによって、格子に適合す るタンパク質は、ピリオンの安定性を次のようにしてなくしていく。ａ）ピリオ ンの形成を削除する。ｂ）ピリオンを不安定な状態にする。Ｃ）ピリオンの間に ギャップを残しておき、核酸が保護されないようにする。従って、バクテリアフ ァージにおいては、生成された０８Ｐ−ＩＰＢＤ結合タンパク質内にピリオンの 中の他のタンパク質と相互作用をする親Ｏ８Ｐの残留物を保持することが重要な のである。
Ｍ１３ｇＶｌにおいては、成熟タンパク質を全て保持することが望ましいが、Ｍ １３ｇｌＩＩでは最終１００個の残留物（又はそれ以下でもよい）を保持すれば 充分である。このように低（したｇ■タンパク質は、完全なｇ■タンパク質と類 似した形で表される。ｇ■りンパク質はファージの感染力に必要だからである。
顕示遺伝子は既知の促進物質、望ましくはＩａｃＵＶ５、ｉｃ、又はｔｒｐとい った調整された促進物質の下に位置づける。
Ｂ、糸状ファージ 糸状ファージｉ、：１ｉ１３、ｆｌ、ｆｄ、　Ｉｆｌ、　Ｉｋｅ、　Ｘｆ、　Ｐ ｆｌ、及びＰｆ３が含まれ、特定の関連がある。糸状ファージＭ１３のライフサ イクル全体は、共通するクローニングと配列へクテルであり、よく理解されてい る。Ｍ１３の遺伝子構造（ＳＣＨＡ７８）はピリオンの物理的構造（ＢＡＮＮ８ １．　ＢＯＥＫ８０、Ｃ）ＩＡＮ７９、ＩＴＯＫ７９、ＫＡＰＬ７８、ＫＵＨＮ ８５ｂ、ＮＵ）ＩＮ８７、ＭＡＫ０８０、ＭＡＲＶ７８、ＭＥＳＳ７８．０ＨＫ Ａ８１．　ＲＡＳＣ８６、Ｒ１１ＳＳ８１゜５１１Ａ７８、ＳＭＩＴ８５、ｆＥ Ｂｓ７８、及びＺＩＭＭ８２）とともに知られティる。
コート・タンパク質の構造及び機能に関する最近の検討は、ＲＡＳＣ８６を参照 のこと。
マーヒン及び共同研究者−同（ＭＡＲＶ７Ｂ、ＭＡＫＯ８０，ＢＡＮＮ８１）ハ 、関連が深井ファージｆ１のおよそその三次元ピリオン構造を、発生の組み合わ せ、生化学、及びＸ線回折によるウィルスのファイバーによって調べた。図２は バナーその他（ＢＡＮＮ８１）のモデルに従って描かれたもので、タンパク質の Ｃ−ｓのみしか示していない。円筒形のさやにある穴のようなものは、タンパク 質の側方グループによって満たされており、その中のＤＮＡを保護している。タ ンパク質の各モノマーのアミノ終点（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）はこの円筒の外側にあ り、カーボクシー終点はＤＮＡの近くの、より小さい半径にある。他の糸状ヅア ージ（例えばＰＦＩ又はＩｋｅ）は、異なった螺旋形の対照を為しており、その 全てには、多くの短いａ−螺旋形モノマ−−ピリオン表面上の各モノマーにアミ ノ終点があるもの　−から成るコートがある。
１、Ｍ１３主要コート・タンパク質（ｇ■）Ｍ１３の主要コート・タンパク質は 遺伝子■にょってコードされる。５０個のアミノ酸の成熟した遺伝子■コート・ タンパク質は、７３個のアミノ酸プリコートとして合成されている（ＳＣＨＡ７ ８、ＩＴＯＫ７９）。最初の２３個のアミノ酸は、発生期のポリペプチドを細胞 膜内に挿入させる典型的なシグナル配列から成る。プリコートが自然に膜内に入 るのか、それともホストの分泌成分、例えば５ｅｃＡ　’Ｐ　５ｅｃＹなどの動 きによって入るのかは今なお議論の対象であるが、現在の発明を操作する上では 何ら影響を及ぼさない。
Ｅ、ｃｏｌｆシグナル・ペプチダーゼ（ＳＰ−Ｉ）はアミノ酸１８．２１．及び ２３を認識し、より狭い範囲ではあるが残留物２２も認識して、プリコート（ｒ ｌｌＨＮ８５ａ、　ＫＩＩＨＮ８５ｂ、　０ＬＩＶ８７）の残留物２３及び２４ の間を割る。シグナル配列が除去された後、成熟コートのアミノ終点は膜内の性 質サイドに位置づけられる。カーポクシー終点は細胞形質サイドにある。成熟ア ミノ酸コート・タンパク質５０個の複製約３０００個が膜内で隣どうしに並び、 密接に関連し合っている。
我々は、以下から成る三部に分かれた遺伝子を構築した。
■）シグナル配列をコートし、（２）及び（３）に対し膜内を通じて分泌を指示 するＤＮＡ ２）成熟したＢＰＴＩ配列をコードするＤＮＡ３）成熟したＭ１３ｇＶＩＩｌタ ンパク質をコードするＤＮＡこの遺伝子はＢＰＴＩをＭ１３ファージ表面上にお いて活発に見せる。
２、Ｍ１３マイナー・コート・タンパク質一般導入された結合ドメイン又はエピ トープは更に糸状ファージ上にキメラのマイナー・コート・タンパク質の一部と して顕示できる。これらの遺伝子■、■、■、及び■によってコードされ、それ ぞれはピリオンにつき約５個の複製において存在し、形態発生又は感染に関連を 持つ。それとは対照的に、主要なコート・タンパク質は一つのピリオンにつき２ ５００個の複製内に存在する。遺伝子■、■、■、及び■タンパク質はピリオン の端に存在する。
３、　Ｍ１３ｇｌｌｌマイナー・コート・タンパク質草−成分のサーキュラ−・ ファージＤＮＡは、遺伝子■タンパク質の複製約５個と結び付き、膜にあるコー ト・タンパク質のパッチを通して、ＤＮＡがタンパク質の螺旋状のさやに閉じ込 められるように押し出される（ｆＥＢ３７８）。ＤＮＡは（ウィルスのゲノムを 大きく制限するような）ペアをベースとせず、ベースは配列と無関係に相互に介 入し合う。
スミス（ＳＭＪＴ８５）及びデ・う・クルゾその他（ＤＥＬＡ８８）は、遺伝子 ■に挿入すると、新規タンパク質ドメインがピリオンの外部表面に現れることを 示した１、ミニ・タンパク質の遺伝子は、スミス及びデ・う・クルゾその他が使 用した個所、別のドメイン領域に呼応するコドンにおいて、又はタンパク質の表 面ループに対し、或いは成熟したタンパク質のアミノ終点に対して、遺伝子■に 結合させることができる。
出版された文献にはすべて「ｄの単一変化（ｓｉｎｇｌｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ） 遺伝子■を含むベクテルが用いられている。従って、ｇ■の複製５個すべては同 様に変化させられている。遺伝子■はかなり大きく　（１２７２ｂ、　ｐ、又は ）７−ジ・ゲノムの約２０％）、遺伝子全体の複製を安定した状態でファージに 挿入できるかどうかは確かでない。更に、２ｍタンパク質の複製５個は全てピリ オンの一端に集中している。二価ターゲットの分子（抗体など）が二価ファージ を結合するとき、結果としてできた複合体は復帰不能となる。ファージのターゲ ットへの結合が復帰不能であることから、ターゲットに対して最も高い類似性を 持っている新規ポリペプチドをコードする遺伝子配列を有するＧＰの類似性増大 を阻んでしまう。
復帰不能な複合体の形成を抑制するためには、■のうちカーポクシー終点の分の みをコードする二番目の合成遺伝子を用いることができる。例えば以下の成分か ら成る遺伝子を生成することもできる。（５′から３′まで） ■）促進物質（調整されているものが望ましい）２）リポサム結合場所 ３）イニシェーション・コドン ４）膜内部を通して（５）及び（６）の部分に分泌を指示する機能的なシグナル ・ペプチドをコードする配列５）ポテンシャル結合ドメインをコードするＤＮＡ ６）Ｍ１３ｇｌＩＩタンパク質の残留物２７５がら４２４までをコードするＤＡ ７）トランスレーション・ストップ・コドン８）（オプション）トランスレーシ ョン・ストップ・ソゲナルｇ■タンパク質では、アミノ終点の半分のためにしの 結合が起こり（感染力のため）、カーボクシー終点の半分のためにパッケージン グが起こる。従って、上述のキメラｇ■タンパク質はウィルスのコート内で生成 することが可能性であるが、感染力を増す働きはない。
ワイルド・タイプの遺伝子■を残しておき、不変の遺伝子■タンパク質が存在す るようにする。
このようにして雑種の遺伝子が、シグナル配列（例・バクテリアｐｈｏ人又はｂ ｌａ遺伝子或いはＭ１３ファージ遺伝子■のシグナル配列）及び少なくとも糸状 ファージ（例・Ｍ２Ｓ）のコート・タンパク質（例：Ｍ１３遺伝子■又は遺伝子 ■タンパク質）の機能的部分をコードするＤＮＡに操作上接続しているポテンシ ャル結合ドメインをコートするＤＮＡを含むことがある。顕示生成物ハホスト細 胞の膜内（脂質二層）に移され、そこでシグナル・ペプチドが分割されて処理済 みの雑種タンパク質が残される。この雑種タンパク質のコート・タンパク質に似 た部分のＣ終点は、脂質二層に閉じ込められ、この雑種タンパク質が外賓のスペ ースに出ないようにする。（これはワイルド・タイプ・コート・タンパク質にお いて典型的なことである）発生期ファージ粒子の単一ストラントＤＮＡは、外賓 スペースに入る際、脂質二層からワイルド・タイプ・コート・タンパク質と雑種 タンパク質の両方を収集する。雑種タンパク質はこのように、糸状ファージの表 面外被にファージされ、ポテンシャル結合ドメインをその外部表面にさらしたま まにする。
４、ＰＦ３のコート・タンパク質 他の糸状ファージにおいても同様な構造が生成され得る。ＰＦ３は、ＩｎｃＰ− １プラスミツト（ｐｌａｓｍｉｄ）を寄生させる緑膿菌細胞を感染させる、よく 知られた糸状ファージである。ゲノムは全て配列され（ＬＩＩＩＴ８５）、複写 及び生成に係わる遺伝子シグナルは知られている（ＬＵＩＴ８７）。Ｉ”ｆ３の 主なコート・タンパク質は、分泌を指示するシグナル・ペプチドを持たないとい う点において通常と異なっている。配列には荷電残留物人ＳＰ７、ＡＲＧ３７、 ＬＹＳ４０、及びＰＨＥ４４−Ｃｏｏがあり、これらは外に出たアミノ終点と一 致する。
従って、ＩＰＢＤがＰＦ３の表面に現れるようにするために、以下から成る三分 割遺伝子を構築する。
１）緑膿菌に分泌を起こさせるとして知られているシグナル配列（ＩＰＢＤの分 泌を生じさせるものとして知られていることが望ましい）で、枠内で結合するも の ２　）ＩＰＢＤ配列をコートする遺伝子の一部で、枠内で結合するもの ３）成熟したＰｆ３コート・タンパク質をコートするＤＮＡ更に、アミノ酸１個 から１０個のためのフレキシブル・リンカ−をコートするＤＮＡは１ｐｂｄ遺伝 子の一部とＰｆ３コート・タンパク質遺伝子との間に導入される。また、特定の プロテアーゼの認識個所をコードするＤＮＡ、例えば細胞プラスミノゲン（ｐｌ ａｓｍｉｎｏｇｅｎ）起動質又は血液凝集因子Ｘａなどは１ｐｂｄ遺伝子の一部 とＰｆ３コート・タンパク質遺伝子との間に導入される。特定プロテアーゼの認 識個所を形成するアミノ酸はまたフレキシブル・リンカ−としても機能する。こ の三分割遺伝子は、ＰＦ３に導入され、いかなるＰｆ３遺伝子の顕示にも介入し ないようにされる。遺伝子再結合の可能性を減少させるため、（３）部はワイル ド・タイプの遺伝子に係わる多くの潜伏突然変異体を有するように生成されてい る。シグナル配列が分割され、Ｉ　ＰＢＤが外賓に存在するようになると、成熟 コート−タンパク質はアンカー及びファージ生成シグナルとして働く。この結合 タンパク質がワイルド・タイプ・コート・タンパク質にフォローされたルートと 異なるルートによって脂質二層に入り、留まるようになってもかまわない。
遺伝子の構築 顕示遺伝子の構造コード配列は、キメラ・コート・タンパク質と必要なあらゆる 分泌シグナルをコートする。［キメラ・コート・タンパク質」とは第一アミノ酸 配列（基本的には、少なくともファージ・コート・タンパク質の機能的部分に相 当する）と第二アミノ酸配列、例えば第一アミノ酸のいかなるドメインとも異な り、実質的に同類でないものとの結合である。キメラ・タンパク質は異ドメイン を提供する場合がある。異ドメインは（異なるタンパク質ではあるカリ第一タン パク質を圧出する生体内に見られるか、あるいは異なった種類の生体によって顕 示されるタンパク質構造の「種間」、「遺伝子間」等結合である可能性がある。
異ドメインは第一アミノ酸配列のアミノ又はカーポクシー終点に（介入スペーサ ーとともに又はなしで）生じるか、又は第一アミノ酸配列に介入する場合がある 。第一アミノ酸配列はファージの表面タンパク質に完全に一致するか、あるいは 、例えば結合ドメインの顕示を可能にするよう変えることができる。
１ｐｂｄ遺伝子をｏｓｐ遺伝子に挿入するのに理想的な個所は、ａ）ＩＰＢＤが 元の形に折り返すところ、ｂ）Ｏ３Ｐドメインが元の形に折り返すところ、及び ｃ）２つのドメイン間に介入がないところである。
Ｏ８Ｐのアミノ又はカーホクシー終点が溶剤にさらされていることを示す、ファ ージのモデルが存在する場合、成熟したＯ３Ｐのその終点はｉ　ｐｂｄ遺伝子の 挿入用として主要な候補となる０低分解三次元モデルで十分である。
三次元構造がない場合、成熟したＯ５Ｐのアミノ酸及びカーポクシー終点は１ｐ ｂｄ遺伝子の挿入用として最良の候補である。機能的な結合には、ドメイン間の 不要な相互介入を避けるため、ＩＰＢＤ及びＯ３Ｐドメイン間に追加残留物が必 要となる場合がある。
必要であれば、無選択配列ＤＮＡ又はＩ　ＰＢＤ又はＯ３Ｐと同様のタンパク質 の特定配列のためのＤＮＡコードをｏｓｐの一部と１ｐｂｄの一部の間に挿入す ることができる。
Ｏ３Ｐ内におけるドメイン境界での結合もまた機能的結合を得るための理想的な アプローチである。スミスは、非定型ＤＮＡを「１の遺伝子ＩＩＩにサブクロー ニングする際における、そのような境界を開発している（Ｓ１１１Ｔ８５）。
ＩＰＢＤを顕示させるのに適したＯ５Ｂドメインを確証する基準は、ＩＰＢＤを 確証する際に用いられる基準と多少異なっている。Ｏ８Ｐを確証する際、０ＳＰ Ｆメインは最終的な分子の結合の時にも現れない上、遺伝子を多様化手法の各ラ ウンドにおいて何度も合成するのにも必要としないため、最低のサイズはそれほ ど重要にならない。生成上の重要事項は次のとおりである。ａ　）Ｏ５ＰＩＰＢ Ｄ結合がＩＰＢＤの顕示を生じさせること。ｂ）ｆｉ初の遺伝的構造が適度に好 都合であること。及びｃ　）ｏｓｐ：：１ｐｂｄ遺伝子が遺伝的に適合性があり 操作が容易であること。ドメインを確証する方法はいくつかある。原子の組み合 わせに依頼する方法はジャニン及びコーシア（ＪＡＮＩ８５）によって検討され ている。これらの方法はαカーボン（Ｃα）の間の距離、分割平面（ＲＯ３Ｅ８ ５参照）、又は埋没表面のマトリックスを用いる。コーシア及び協力者−同は、 ドメイン構造のある多（の天然タンパク質の特徴を相互関連させた（彼らの定義 に基づく）。ラッシンは、サーモリジンの残留物２０６−３１６から成るドメイ ンの安定性について正確に予測した（ＶＩＴＡ８４、ＲＡＳＹ８４）。
多くの研究者は、安定したドメインの分離と確証のため、部分的なタンパク質分 解及びタンパク質配列分析を用いている。
（例えば、ＶＩＴＡ８４、ＰＡＴＥ８３．５ＣＯＴ８７ａ、　及びＰＡＢＯ７９ ヲ参照ノコと）パポその他は、コリファージからのｃｌリプレッサが二つのドメ インを含むことを示す熱量測定を用い、更にドメイン境界を知るため、部分的な タンパク質分解を使った。
唯一利用できる構造上の情報が候補に上げられたＯ８Ｐのアミノ酸配列のみであ るならば、我々はターンやループを予測するためにその配列を使うことができる 。ループやターンの中には正確に予測されるものが出てくる可能性は非常に高い 。（チュー及びファスマン（ＣＨＯυ７４）参照）これらのロケーションはまた １ｐｂｄ遺伝子の一部を挿入する個所として候補に上げられるところである。
１個又はそれ以上の新しいドメインをタンパク質に結合させることにより、細胞 から出される新しいタンパク質の機能を、親タンパク質の機能と異なるものにさ せることができる。ワイルド・タイプ・コート・タンパク質のシグナル・ペプチ ドは純粋なポリペプチドのために機能できても、結合を外に出すよう指示するこ とはできない。セフ依存パスウェイを使うため、異なるシグナル・ペプチドを要 する場合がある。従ってキメラＢＰＴｌ／１ｉ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質を圧 出し顕示するには、（ｐｈｏ＾の）非定型シグナル・ペプチドを用いる必要性が あることを発見した。
ペプチドを顕示するファージは、ターゲット、殊に多価ターゲットから溶出させ ることが困難である。ある特異なプロテアーゼ分割場所、例えば血液凝集因子Ｘ ａを結合タンパク質に導入し、結合ドメインが遺伝子パッケージから分離され得 るようにできる。このような分離には、結果として得られたファージ全てに同類 のコートタンパク質があり、そのため、ファージを顕示しているポリペプチドが 類似マトリックスから分割なしで溶出できるとしても、同様に感染力があるとい う利点がある。この段階では、別の方法では失われてしまうかもしれない、価値 ある遺伝子の復帰を可能にする。我々の知る限りにおいては、情報を含む遺伝子 パッケージを復帰させるか、あるいは感染力が異なるファージ全体を類似した感 染力を持つファージに転化させる方法として、特定のプロテアーゼを用いること を発表したり提案した者はだれもいない。
特異性の高いプロテアーゼが数多（存在する。本発明はある特定のプロテアーゼ に関するものではないが、分離状態においてはリンカ−を分離し、ファージの生 存に欠かせないポリペプチド、又は（非常に珍しいケースを除き）ポテンシャル ・エピトープ／結合ドメインは分離しないようにするため、プロテアーゼは十分 特定化されていることが望ましい１例えば低温などといった特定の分離状態にお ける選択条件が、条件外では不適切なプロテアーゼの使用を可能にすることもで きる。
血液凝集及び補足システムには多くの非常に特異なプロテアーゼが含まれている 。通常、カスケードの初期段階における酵素は、後の段階のものより特異性が高 い。例えば因子Ｘ　（ＦＸ）はトロンビンより特異性が高い。（ＣＯＬ１８７表 １０−２参照）ウシのＦ、ＸはＩ　Ｉｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇによ り分離するが、ヒトのＦｌＸはＩｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇにより分離する 。プロテアーゼのペアのうち、どちらが使用されてもよい。トロンビンが使われ る場合、最も望ましいトロンビンに敏感なリンカ−は機維素原、因子Ｘｍ、及び プｏｌ−ロンビンに見られるものである。リンカ−の配列を、トリンビンを得た 種から取ることが望ましい。例えば、もしウシのトロンビンを使用する場合、ウ シの繊維素原又はウシのＦ。
Ｘ■からとられたリンカ−を使うべきである。
ヒトの因子であるＸｌは、ヒトの因子■Ｘを二個所に分割する（ＣＯＬＭ８７、 ｐ、４２）。
ＱＴＳＫＬＴＲ１４５／ＡＥＡＶＦ及び５ＦＮＤＦＴＲ１８０／ＶＶＧＧＩ１４ ’ある。
従って、上記二つの配列（特に下線を引いた部分）のうちどちらでもＰＢＤ及び ＧＰ表面アンカー・ドメイ（ＧＰＳＡＤ）のあいだのリンカ−として統合し、こ れらを分割するのにヒトのＦ、ＸＩを使うことができる。
ヒトのカリツクレイン（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）はヒトのＦ、）１１をＲ３５３ において切断する。（Ｃ（ルＭ８７、ｐ、２５８）ＬＦＳＳＭＴＲ３５３／ＶＶ ＧＧＬＶ この配列は上に示したｈＦ、ＸＩに非常に類似している。５ＳＩＩＴＲＶＶＧの 配列をＰＢＤとＧＰＳＡＤの間のリンカ−として統合し、ヒトのカリツクレイン でＰＢＤをＧＰから分離することが可能である。
ヒトのＦ、　ＸＩ　ＩはヒトのＦ、　ＸＩをｌ？３６９において切断する。（Ｃ ＯＬＩ！８．７ｐ、２５６） ＫＩＫＰＲ３６９／ＩＶＧＧＴ ＫＩＫＰｌ？ＩＶＧをＰＢＤとＧＰＳＡＤノ間ノリンカートシテ統合できる。Ｐ ＢＤはそれからＧｌ’からｆＦ、ＸＩＩで分離され得る。
結合タンパク質を分離するのに用いられてきた他のプロテアーゼには、エンテロ キナーゼ、コラ−ゲナーゼ、チモシン、ウロキナーゼ、レニン、及びある種のシ グナル・ペプチドが含まれる。Ｒｕｔｔｅｒ、ＵＳ　４，７６９．３２６を参照 のこと。
プロテアーゼ抑制因子を探す時、同類の特異性の基礎を持つターゲットのプロテ アーゼ及び他のプロテアーゼは、ＰＢＤをＧＰから分離することに用いるには適 切ではない。ターゲットのプロテアーゼに基礎が似ているリンカ−は顕示ファー ジのどこにも統合されるべきではない。優れた結合体が残り全体から分離するの を不必要に困難にしてしまう可能性があるからだ。
リンカ−の特定場所における特有な分離において立体化学的な妨害がある場合、 分離場所がよりよく見えるようにそのリンカ−を変えることができる。例えば、 タリシン（柔軟性を増すため）又はプロライン（最大に延長するため）を分離個 所とタンパク質全体の間に介在させることによって行う。ＧＵＡＮ９１ではグリ シンの豊富なリンカ−（ＰＧＩＳＧＧＧＧＧ）をトロンビン分離個所（ＬＶＰＲ ＧＳ）の直ぐ後ろに導入することによって、ＧＳＴ結合タンパク質のトロンビン の分離を改善した。適切なリンカ−の確証が多様化手法及び選択によってできる 可能性がある。
遺伝子の調整部分の配列は、天然の調整要素の配列に基づいている。ａ）促進物 質、ｂ）シーン／ダルガルノ配列、ｃ）トランスクリプショナル・ターミネータ −０調整要素はまた、天然の調整領域の一般的配列の知識に基づいて生成され得 る。これらの調整要素の配列はコード領域と関係がある。制限された場所はまた 調整領域に挿入されているか、隣にあって、操作しやすくなっている。
類似性分離の基本的機能は、ターゲットとの類似性が高い、（Ｉ　ＰＢＤから生 じた）ＰＢＤを有するＧＰを、ターゲットとの類似性が低いＧＰから分離するこ とである。ファージの溶出量がファージ表面にあるＰＢＤの数に左右されるので あれば、類似性が低い多くのＰＢＤ、　ＧＰ（ＰＢＤｖ）があるファージは、数 が少なく、より類似性の高いＰＢＤ、　ＧＰ（ＰＢＤｓ７）を有するファージと 相互溶出する可能性がある。顕示遺伝子の規則は、類似性によってきちんと分離 されるよう、はとんどのファージがＰＢＤを十分顕示すること、といった内容で あることが望ましい。調整可能な促進物質を用いて顕示遺伝子の現れるレベルを コントロールすると、多様化された遺伝子全体の色層分析的特徴の細かい調整が 可能となる。
植物のバクテリア細胞において生成された遺伝子合成の誘発は、調整された促進 物質、例えばＩａｃＵＶ５、ｔｒｐＰ、又はｔａｃなどの使用によって実施され てきた。（ＶＡＮＴ８２）合成されるタンパク質の量を調整する要因は、かなり 十分に理解されており、現在では広範囲に及ぶ非定型タンパク質がＥ、　ｃｏｌ ｉ、　Ｂ、　５ｕｂｔｉ　ｌｉｓその他のホスト細胞において、少なくともかな りの量が生成されるようになった。（ＳにＥＲ８８，ＢＥＴＴ８８）顕示遺伝子 の促進物質は、少量の化学誘導剤によって調整される。例えば、ｌａｃ促進物質 とハイブリッドｔｒｐ−１ａｃ（ｔａｃ）促進物質は、イソプロフィル・チオガ ラクトサイト（ＩＰＴＧ）によって調整可能である。構築された遺伝子用の促進 物質は天然ｏｓｐ遺伝子から取る必要はない。バクテリアにおいて機能する調整 可能な促進物質であれば何でもよい。漏れのない促進物質が望ましい。
合成される遺伝子のコート部分は、タンパク質レベルで生成され、ＤＮＡ内にお いてコートされる。ＤＮＡ配列を考案する上での主要な課題は、望ましい多様な ポテンシャル結合ドメイン（又はエピトープ）を得ることであるが、遺伝子操作 を更に進め、再結合と同時的突然変異の可能性を最低限にし、選択されたホスト 細胞において効率的なトランスレーションを達成できるよう、制限個所を設ける ことも検討されている。
現在の発明はＤＮＡ合成又は構築における一定の方法に限られている訳ではない 。従来のＤＮＡ合成物質も、多様なりＮＡ　（現在、混合探子の生産に用いられ る方法と類似したもの）のため適切な反応物質の変更を行ったものであれば使用 してよい。
ファージは遺伝子的に操作され、例えばＥ、ｃｏｌｉ、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ。
ｏｒ　Ｐ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａといった増幅に適したホスト細胞に移される。
本発明はＤＮＡによる細胞の変化において一つの方法に制限したり、ある特定の ホスト細胞に限ったりはしない。
イニシャル・ポテンシャル結合ドメイン（ＩＰＢＤ）本発明のおかげで、抗体の 抗原結合個所以外のターゲットに結合できるタンパク質が得られるようになった 。付随して起こる問題のため、ある抗原の可変ドメインイガイのターゲット用で ある場合、分離定数Ｋｄ（Ｐ、　Ａ）＜　１０−６モー　ル／リットル（＜１０ −７モール／リツトルの方が望ましい）であり、タンパク質Ｐは結合タンパク質 をして機能させる。「抗体の可変ドメイン」の除外は、この目的のためタンパク 質が抗原であるという理由のみによって「結合タンパク質」と考慮されないこと を明確にすることを意図している。しがし抗原は、酵素とその基盤、又はホルモ ンとその細胞受容体といったように、抗体以外の物質と結合するため、結合タン パク質に値する可能性がある。更に、Ｕ結合タンパク質」には、スタフィロコツ ヵル・タンパクＡのように抗体のＦｃに結合するタンパク質が含まれることも指 摘されるべきであろう。
本発明は、抗体の可変ドメインにおける大幅可変（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ）領域に相応するコドンの多様化を通して新規抗体の開発に使うことも可能であ るが、主に抗体ではない、又は抗体の可変ドメインでもない結合タンパク質の開 発に使用されている。
新規抗体は免疫学的技術によって得られるが、新規酵素やホルモンなどは得られ ない。
はとんどの大型タンパク質は、識別可能なドメインと呼ばれる小球になる。顕示 方法は、類似性分子（抗体となる可能性がある）を得ることができる遺伝子ファ ージを安定した、構造のあるドメイン（「イニシャル・ポテンシャル結合ドメイ ン」、Ｉ　ＰＢＤである）を変えることによって最初に完成した。変更の成功度 は、例えば変えられた遺伝子ファージが類似性分子に結合するかどうかを知るこ とによって測定できる。原子結合やタンパク質配列の同類性を完全に無視するわ けにはいがないものの、ＩＰＢＤの確証という目的のため、「ドメイン」の−一 温度の上昇やカオトロピック動因など混乱させる力に直面した時、全体構造を保 持することｍ−という安定性を強調する定義付けが好まれる。タンパク質のドメ インが、そのタンパク質の選択されたターゲラ］・に結合する能力を主に左右す る場合、本書では「結合ドメインＪ（ＢＤ）と称する。
Ｉ　ＰＢＤは、多（の突然変異遺伝子に対する受容度を考慮した上で選択される 。−たびＩ　ＰＢＤをファージ上に顕示でき、類似性による選択に左右されるこ とがわかれば、ＩＰＢＤをコートする遺伝子は多角的突然変異遺伝子の特別のパ ターン、本書で「多様化方法（バリエゲニション）」と呼ぶ方法によって決めら れる。この方法は、適切なりローニングと増幅段階の後、それぞれが単一ポテン シャル結合ドメイン（ＩＰＢＤの変異体）を顕示する多数のファージ生成につな がるが、全体的に異なってはいても構造的に関連のあるポテンシャル結合ドメイ ン（ＰＢＤ）を数多く顕示するものである。それぞれの遺伝子ファージは、５ｏ ｎｏフアージ上に顕示されたＰＢＤをコードするｐｂｄ遺伝子のバージョンを持 っている。その場合、望ましい結合特性のあるＰＢＤを持つ顕示ファージを確証 するため類似性による選択が使われる。これらの顕示ファージは増幅することも 可能である。類似性選択及び増幅により豊富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を１又 は２サイクル行った後、成功結合ドメイン（ＳＢＤ）をコードするＤＮＡは選択 されたファージから復帰させることができる。
必要があれば、ＳＢＤを持つファージがらのＤＮＡは、多様化の最終ラウンドに おけるＳＢＤを次世代のＰＢＤに結合するＰＢＤの［親ポテンシャル結合ドメイ ンＪ（ＰＰＢＤ）として用いることにより、更に「多様化」することができる。
このプロセスは、実験者が結果に満足するまで繰り返し行ってよい。その時点で 、化学合成を含む従来のどの方法でＳＢＤを生成してもよい。
イニシャル・ポテンシャル結合は・１）天然において生じるタンパク質のドメイ ンである。２）天然に生じたものではないが、実質的に配列において天然のドメ インに相応するドメインである。しかし配列において一つ又は二つの代替、置換 、又は不足があり、天然ドメインと異なる。３）実質的に配列において２つ又は それ以上の天然タンパク質配列のハイブリッドに相当する。又は、４）アミノ酸 幾何学及びアミノ酸が二義的構造寄りであることの統計的実証の知識に基づいた 論理的基盤のみによって生成された人工的ドメインである。（しかし、ｎ　ｐｒ ｉｏｒｌタンパク質生成上に制限があったために本発明のきっかけとなったので ある。）通常、ドメインは既知の結合ドメインか、又は少なくともそれと同類で あるが、既知の結合の動きを処理しないが、結合の働き（裂溝、溝など）に役立 つ二義的又はそれ以上の構造を持つタンパク質から生じることもある。ＩＰＢＤ が係わるタンパク質はターゲット物質に特定の類似性を持つ必要はない。
配列が「実質的に一致する」と見なされるべきかを決定する上で考慮すべきこと は、次の問題である。標準算式により最もよくあてはまるよう配列がなされた時 の類似性の程度、クロスリンク（二硫化物結合など９接続パターンにおける類似 性、例えばＸ線回折分析又はＮＭＲに示されるように、タンパク質がどの程度類 似した三次元構造をしているか、及び配列されたタンパク質がどの程度類似した 生物学的働きをしているかということである。この内容においては、セリンプロ テアーゼの抑制因子の間で、類似性があると認められたタンパク質のグループが 存在する。その中には最低３０％の配列上の同類性しか持たないベアもある。
Ｉ　ＰＢＤの候補物質は以下の基準を満たさなければならない。
ｌ）ドメインが存在し、意図された使用条件下で安定していること。（ドメイン は挿入されるタンパク質全てを含んでいることがある。例：ＢＰＴＩ、α−コノ トクシン　Ｇｌ、又はＣＭＴＩ−Ｉ　１１） ２）アミノ酸配列の知識が得られること。
３）特異の、及びＩＰＢＤ、ＡｆＭ　（ＩＰＢＤ）に高い類似性がある分子が得 られること。
多様化の方法を説明するため、ドメインの外部表面上にある残留物のアイデンテ ィティ−の知識及びその空間における関係が得られるようになっていることが望 ましい。しかし、この考察は結合ドメインが小さい場合、例えば４０以下の残留 物であればそれ程重要でない。
Ｉ　ＰＢＤは必要以上に大きくないことが望ましい。なぜなら小さいＳＢＤ　（ 例えばアミ７６１４０個以下）は化学的に合成でき、類似したアミノ酸配列Ｊこ おいて制限個所を設けるのが容易だからである。残留物４０個以下のＰＢＤにお けるその他の利点は、多様化された遺伝千金てが一つに合成され得ることである 。その場合、ｏｓｐ遺伝子内に適切な制限個所を設けるだけでよい。
より小さいタンパク質は、ファージ上又はＧＰのホストにおけるの新陳代謝的疲 労を最低限に抑える。Ｉ　ＰＢＤは残留物２００個以下であることが望ましい。
Ｉ　ＰＢＤは更に、容認できる結全類似性と特異性を備えられるだけの大きさが あることが望ましい。二値化物結合のような共有クロスリンクが欠如しているＩ ＰＢＤにとっては、ＩＰＢＤは残留物が最低４０個あることが望ましい。クロス リンクがあれば残留物は６個ですむ可能性がある。
ＩＰＢＤの候補物質は多くある。例えばボバイン・パンクレアティック（ウシ膵 臓、以下同じ）・トリプシン抑制物質（ＢＰＴＩ残留物５８個）、ＣＭＴＩ−１ １１（残留物２９個）、クランビン（残留物４６個）、オボムコイドの第三ドメ イン（残留物５６個）、熱に安定したエンテロトクシン（Ｅ、ｃｏｌｔの５Ｔ− １’ａ）（残留物１８個）、α−コノトクシンＧｌ（残留物１３個）、μコノト クシンＧｉｒｌ（残留物２２個）、コナス・キングコンブ・ミニ・タンパク質（ 残留物２７個）、Ｔ４１Ｊソザイム（リゾチーム、以下同じ）（残留物１６４個 ）、及びアズリン（残留物１２８個）である。表５０には望ましいＩ　ＰＢＤの リストがある。
場合によっては、ターゲットに類似性のあるタンパク質が、他の基準が十分に満 たされていな（でも望ましいＩＰＢＤであることもある。例えばＣＤ４のＶ１ド メインは、）ＩＩＶのｇｐ１２０を結合させるタンパク質のためのＩＰｌｊＤと して適切な選択である。Ｖｌの４２から５５までの領域における突然変異がｇｐ ｔｚｏの結合に強い影響を与えること、更に他の突然変異はｖｌの構造に与える 影響がずっと少ないか又は完全に混乱させてしまうことが知られている。同様に 、腫瘍壊死要因（ＴＮＦ）は、ＴＮＦ様の分子にＴＮＦ受容体に対して高い類似 性があるなら、初期の選択として適切である。
表面における突然変異さえもＰＢＤの安定性を低減させるため、選択されたＩＰ ＢＤの溶解温度は高くなければならず（５０’Ｃは許容できる最低限の温度であ り、高ければ高いほどよい。ＢＰＴＩは９５℃で溶解する）、また広範に及ぶｐ Ｈの範囲で安定していなければならない。そうすれば、選択されたＩＰＢＤから 突然変異及び結合による選択によって生じたＳＢＤが十分な安定性を保てるから である。ＩＰＢＤにおいて多様なＰＢＤを作り出している代替物質がドメインの 溶解点を一４０℃以下に下げないことが望ましい。
突然変異が起こって、ＩＰＢＤに相当するＳＢＤの安定性を高めることがあるが 、本発明のプロセスではこのことに依存していない。
多数の二硫化物のような、コバレント・クロスリンクを含むタンパク質は通常十 分安定している。２０個の残留物ごとに少なくとも二つの二硫化物を含むタンパ ク質と、少なくとも一つの二硫化物を含むタンパク質は十分な安定性があると考 えられている。
ターゲットがタンパク質又はその他の巨大分子である場合、ＩＰＢＤの具体的物 質は、南瓜属ｍａｘｉ■ａトリプシン抑制物質■（残留物２９個）、Ｂｏｓ　Ｔ ａｕｒｕｓからのＢＰＴＩ（残留物５８個）、菜種からのクランビン（残留物４ ６個）、又はＣｏｔｕｒｎｉｘ　ｃｏｔｕｒｎｉｘ　Ｊａｐｏｎｉｃａ（日本ウ ズラ）からのオボムコイドの第三ドメインといった、小さいタンパク質であるこ とが望ましい。このクラスのターゲットは、小さいタンパク質を非常に特定の方 法で存在させ得る裂溝や溝があるからである。ターゲットがスターチのように巨 大分子で緊密な構造を欠くものであれば、小さい分子のように扱わなければなら ない。コラーゲンのような明確な三次元構造の拡大巨大分子は、大きい分子とし て扱うべきである。
ターゲットがステロイドのように小さい分子であれば、Ｉ　ＰＢＤの具体化物質 は８０から２００個の残留物からなるタンパク質であることが望ましい。Ｂｎｓ 　ｔａｕｒｕｓからのりポナクリアーゼ（８音物１２４個）、Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ　ｏｒｕｚａｅからのりボナクリアーゼ（残留物１０４個）、Ｇａ１ｌｕ ｓ　ｇａｌｌｕｓからの鶏卵白シンザイム（残留物１２９個）、Ｐｓｅｕｄｏｗ ＋ｎｎａｓ　ａｅｒｕｇｅｎｏｓａからのアズリン（残留物１２８個）、又はＴ ４シンザイム（残留物１６４個）などがその例である。なぜならこのようなタン パク質は小さいターゲット分子が入れる裂溝や溝があるからである。ブルソクハ ーヘン・タンパク質データバンクにはリストにあるタンパク質全ての三次元構造 が含まれている。Ｔ４シンザイムはど大きいタンパク質をコートする遺伝子は、 この発明の目的のため標準的技術によって操作することができる。
ターゲットがミネラルで、水に溶けない場合、そのミネラルの分子の表面の特性 が考慮される。クリスタライン・シリコンのように表面がスムーズなミネラルは 、Ｉ　ＰＢＤとしてリポヌクリアーゼのような中型から大型タンパク質とともに 扱われることが最適である。十分な接触領域及び特異性を確保するためである。
ゼオライトのように荒い、溝のある表面のミネラルはＢＰＴＩのような小型のタ ンパク質又はＴ４シンザイムのようなより大きいタンパク質のどちらとでも結合 され得る。
ＢＰＴＩは全ての基準を満たすか又はそれ以上の機能があり、特に望ましいＩＰ ＢＤである。これは小さく、大変安定したタンパク質で、よく知られた三次元構 造を持っている。
小さいポリペプチドは、治療学的又は診断法的はエージェントとして使われた場 合、大きいポリペプチドと比べて下記のような利点がある可能性がある。（以下 の利点のみに限られてはいない） ａ）細胞に対する浸透がより優れている。
ｂ）サーキュレーションからより速く除去される。（画像エージェントにとって 重要である） Ｃ）抗原性がより低い。
ｄ）集合あたりの動きがより活発である。
従って、多様化と類似性選択の方法を組み合わせて、選択されたターゲットに結 合する小さいポリペプチドを確証できることが望ましい。
しかし、このサイズのポリペプチドは結合分子としては不利な点がある。オリベ ラその他（ｏｔ、Ｉｖ９０ａ）によると、「このサイズ範囲のポリペプチドは通 常、他の多くの構造と均衡状態を保っている。（固定された構造を持つためには 、タンパク質は一般的にもっとずっと大型でなければならない）」ということで ある。ペプチドのターゲット分子に対する特異な結合により、ペプチドは、結合 個所に対して補足的な一つの構造を取ることが必要となる。
一つの具体的物質において、本発明では、望ましい結合特性を持つ新規ミニ・タ ンパク質の生体合体を促進することにより、小さいポリペプチドを保持する一方 で、これらの問題を克服することができた。ミニ・タンパク質は小さいポリペプ チド（通常残留物が６０個以下である。４０個以下（「マイクロ・タンパク質」 ）であればより望ましい）である。これは数が多すぎて、非共有結合力のみの結 果としては安定した構造を持てないが、共有結合的にクロスリンクされて（例： 二値化物結合により）安定した構造になっており、従って、制御されないポリペ プチドより、むしろ大きいタンパク質分子の生物学的働きをすることができる。
ミニ・タンパク質が多様化される時、親分予肉に共有結合的にクロスリンクされ た残留物は不変のまま残されるため、構造を安定化する。例えば、二値化物結合 ミニ・タンパク質の多様化において、あるシスチンは不変であるため、圧出及び 顕示の状況下で、共有結合クロスリンク（例：二硫化物は一つ又は二つのシスチ ンのペアの間を結合させる）が形成され、大幅な変化が可能で線状、中程度のア ミノ酸に用いられ得る構造を相当制限する。換言すれば、本来広範囲に渡って無 選別化されるはずの、制限支持構造がポリペプチドに組み込まれるということで ある。
望ましい結合の特徴を持つミニ・タンパク質が−たび特徴づけられると、ＤＮＡ の再組み合わせ技術のみならず、非生物学的合成方法によって生成することが可 能となる。
付随的なりレームに対処する目的として、ミニ・タンパク質はおよそ８個から６ ０個の残留物を有する。残留物１６個のポリペプチドのアミノ酸３と８をつない でいる鎖内部の二硫化物ブリッジは、ここでは４のスパンがあるとされている。
アミノ酸４と１２が二値化物結合であれば、このブリッジは７のスパンがある。
４つのシスチンは一緒になってポリペプチドを４つのインターシスチン・セグメ ントに分割する。（１−２，５づ、９−１１．及び１３−１６である）（Ｃｙｓ ３とＣｙｓ４との間にはセグメントがない）クロスリンクされたミニ・タンパク 質の接続パターンは、クロスリンクにおける終点の比較の位置を単純に説明する 。例えば、２個の二硫化物があるミニ・タンパク質にとって、「Ｉ−３，２−４ 」という接続パターンは、１番目のクロスリンクされたシスチンが３番目のクロ スリンクされたシスチンに二値化物結合しく主要配列における）、２番目が４番 目に結合しているということを意味する。
本発明における多様化された二値化物結合ミニ・タンパク質はいくつかの種類に 分けられる。クラスＩミニ・タンパク質は、二値化物結合を形成させるため相互 作用できるシスチンの単一ペアを特徴とするものである。この結合は残留物が９ 個以下のスパンがあるもの。この二硫化物ブリッジは残留物が最低２個のスパン があることが望ましい。これは二値化物結合の幾何学的機能である。残留物２個 か３個の間隔であるとき、ブリッジされた残留物に対する制限を削減するため、 残留物のひとつはグリシンであることが望ましい。間隔の最大限度は正確さに欠 けるが、一般的には、間隔が大きいほど、二値化物結合による線状の中程度アミ ノ酸残留物に対する構造の制限が少ない。
スパンが４又は５の二硫化物ブリッジは特に望ましい。スパンが６に増えると、 制限の影響は減る。この場合、閉じ込められた残留物のうち最低１個が、主鎖に 幾何学上制限を与えるアミノ酸であることが望ましいとされている。プロリーン は最も大きな制限を与える。バリーン及びイソロイシンは主鎖を制限するが、そ の程度はより低い。この制限非シスチン残留物の位置は不変シスチンの隣である ことが望ましいが、他のブリ・ンジされた残留物の隣であってもよい。スパンが ７である場合、主鎖構造を制限する２個のアミノ酸を含むことが望ましい。これ らのアミノ酸は７つの位置のうちどこにあってもよいが、シスチンの直ぐ隣にあ るブリッジされた残留物２個であることが望ましい。スパンが８か９であれば、 制限アミノ酸を追加することもできる。
追加されたアミノ酸は第一シスチンのアミノ酸側又はカーポクシー側に現れる。
Ｒも近い「スパンされていない」アミノ酸のみがスパンの構造に影響を与えると 考えられる。
クラスＩＩミニ・タンパク質は、スパンが９個以上のアミノ酸である単−二値化 物結合を特徴とする。ブリッジされたアミノ酸は二義的構造を形成するが、これ は、構造の安定性に役立つ。これらの中程度のアミノ酸がヘアピン・スーパーセ カンダリ−構造を形成することが望ましい。例えば以下に示した式のような構造 である。
−Ｃｙｓ−ａ　ｈｅｕｘ−ｔｕｍ−βｓ＋ｒａｎｄ−Ｃｙｓ−−Ｃｙｓ−ａ　ｈ ｅｌｉｘ−ｔｕｍ−ａ　５ｔｒａｎｄ−Ｃｙｓ−−Ｃｙｓ−ｐ　ｈｅｌｉｘ−ｍ ｍ−ｐ　ｓ＋ｒａｎｄ−Ｃｙｓ−適切なヘアピン構造を作成する上で、三次元構 造が知られているタンパク質から実際の構造を複写したり、個々のアミノ酸など の二義的構造傾向データを用いたり、又はこの二つの方法を組み合わせて、構造 を作成することもできる。一つ又は二つの実際の構造がモデルとして用いられる ことが望ましく、どの突然変異が構造を妨害することなく起こせるかを決める上 で、頻度データが使われるとよい。
ンスチンとαヘリックスの最初か最後又はβストランドとの間には３個以上のア ミノ酸がないほうがよい。
更に複雑な構造（ダブルヘアピンなど）も可能である。
クラスＩｌｌミニ・タンパク質は複数の二値化物結合を特徴とする。クラスＩＩ ミニ・タンパク質に関して上記にあるような、二義的構造のあるものもオプショ ンとしである。可能性のある二硫化物結合のトポロジー数が結合数とともに急激 に増えるため（結合２個、トポロジー３個、結合３個、トポロジー１５個）、二 硫化物結合数は４つ以上にならないほうがよい。二つの二硫化物結合は３個より 好ましく、４個より３個のほうがよい。２個以上の二硫化物結合では、二硫化物 ブリッジのスパンが３０以上にならないほうがよく、最大のインターシスチン鎖 セグメントは２０を越えないことが望ましい。
熱安定エンテロトクシンのような、天然において起こるクラス■ミニ・タンパク 質は、しばしば、アミノ酸配列にクラスターされた（−Ｃ−Ｃ−又は−Ｃ−Ｘ− Ｃ−）シスチンのペアを有する。クラスタリングによって、生じ得るトロポジー の数は減り、これは利点となる可能性がある。
メタルフィンガー・ミニ・タンパク質。本発明におけるミニ・タンパク質は二硫 化物結合によってクロスリンクされるものに限られてはいない。ミニ・タンパク 質のもう一つの重要なりラスは、フィンガー・タンパク質の類似物である。フィ ンガー・タンパク質はフィンガー構造によって特徴づけられる。これは金属のイ オンが残留物Ｃ１２個とＨｒｓ２個によって統合され、その周りに四面体のアレ ンジメントを形成するものである。金属イオンはほとんどの場合亜鉛（ｎ）であ るが、鉄、銅、コバルトなどのこともある。「フィンガー」は、（Ｔ’ｈｅ又は Ｔｙｒ）−（ＩＡｘ）−ｃｙｓ−（２−４ＡＡｓ）−Ｃｙｓ−（３＾＾５）−Ｐ ｈｅ−（５ＡＡｓ）−Ｌｅｕ−（２ＡＡｓ）−Ｈ４ｓ−（３ＡＡｓ）−）１ｉｓ −（５ＡＡｓ）（ＢＥＲＧ８８；ＧＩＢＳ８８）という一般的配列を成している 。
本発明ではミニ・タンパク質を一つ又は二つのフィンガーと共に包囲する。
更に多様性のあるものを、ファージを（できれば無毒なン酵素及び／又は化学反 応物質を用いて処理することによって、ポテンシャル結合ドメインの顕示ファー ジ集合体に導入することが可能であり、そうすることにより顕示されたＰＢＤの 結合要素に影響を及ぼすことができる。類似性分離方法を使って、我々は、予定 されたターゲットを結合させる変えられたＧＰの価値を高める。アクティブな結 合ドメインが遺伝学的に完全に特定されていないので、我々は、価値を高める各 段階において、形成発生後の変更を繰り返さなければならない。このアプローチ は、ミニ・タンパク質ＩＰＢＤにおいて特に適している。これらのＳＢＤの化学 合成物質を推測することができるからである。
エビトビツク・ペプチド 本発明はまた、抗体、レクチン、酵素、又は他の結合タンパク質のエビトビツク 結合個所であるターゲットに結合されるエビトビツク・ペプチドの確証にも関連 している。抗体の場合、エビトビツク・ペプチドは少なくとも４個のアミノ酸で なければならず、最低６個又は８個のアミノ酸であることが望ましい。
通常、２０個以下のアミノ酸であるが、上限はない。ただし一般的にエビトビツ ク・ペプチドは、「線的」又は「配列した」エピトープである。エビトビツク・ ペプチドを顕示するための集合体を構築する際、典型的に、ポテンシャル・エピ トープのアミノ酸の位置は全部又はほとんど可変である。しかし、特定の位置に あることを認められたこれらのアミノ酸の間で、下記に述べたとおりタンパク質 ドメインの突然変異発生という内容において、比較的等しい配列表現がなされる 。
多様化方法−一好ましい多様性のあるポテンシャル結合ドメイン（又はエピトー プ）を得るための突然変異発生顕示可能であり検知可能な様々なドメインの数と 比べて、ドメインの突然変異によって得られる様々なアミノ酸配列数の方が大き い場合、人工の発生の効率は、残留物の変化の上での注意深い選択によって大き く高めることができる。まず、既知のタンパク質の残留物で結合の働きに影響を 与えそうであり（例えば表面の残留物）、その安定度は低下させない傾向にある ものが確証される。次にこれらの残留物をコードする全ての、又はい（つかのコ ドンが同時に変化させられ、多様なりＮＡ集合体を生産する。多様化されたＤＮ Ａの集合体は、多様なポテンシャル結合ドメインを圧出するのに用いられる。そ して関連ターゲットを結合させる機能が評価される。
本発明はこのように、作られた多様性の高い集合体であること、新規結合タンパ ク質が選択されるという点において他の方法から更に区別される。我々は顕示さ れたポテンシャル結合ドメインが、付近にある関連アミノ酸配列の「配列スペー ス」を、効率的でまとまった方法によりサンプルとするようしむける。
４つの目標により、本書では様々な多様化計画を説明している。
■）非常に大きな数の変異がある。（例えば１０７）　２）可能性のある変異の 非常に高いパーセンテージが実際に現れる。３）望ましい異変が現れる頻度が比 較的一定している。、４）バリエーションが生じるのは、制限され数のアミノ酸 残留物においてのみであり、サイトグループのある残留物で、ポテンシャル結合 ドメイン表面における共通の領域に向かっているものにおいて生じるのが最も望 ましい。
これは、遺伝子を変えるのに使う放射線やヒドロオキシル・アミンといった無差 別変異発生物質の単純な使用と区別されるべきである。突然変異が生じる場所に 対とは全く制御がきかない（あるいは不明確でしかない）。突然変異の多くは結 合ドメインの一部になっていない残留物に影響を与える。更に、突然変異発生の 適切なレベルにおいて、変えられたコドンは単一ベースの変化によって特徴付け られる傾向にあるため、制限付又は偏った範囲の可能性しか調べられない。同様 に不明なのは特定の場所における、非無選別化された配列の突然変異発生オリゴ ヌクレオタイドを用いる突然変異発生技術である。なぜならこれらの技術は多数 の変異を起こしたりテストするのに使うことができないからである。集中無選別 突然変異発生技術は知られているが、変異のディストリビューションを制御する ことの重要性に気づかれないことが多い。
「多様化されたＤＮＡ（ｖｇＤＮＡ）Ｊとは同じか又は同様の長さのＤＮＡ分子 の混合物を意味する。これは並べられた時、コドンによって違いがあり、その各 コドンにおいて異なる複数のアミノ酸をコードするが、他のコドンの位置では単 一アミノ酸しかコードしないものである。更に理解されていることは多様化され たＤＮＡ、可変コドン、及び、ある可変コドンがコードする異なったアミノ酸の 範囲と発生頻度が、事前にＤＮＡの合成物によって決められるということである 。ただし合成手法からは混合物の中にある、いかなる個々のＤＮＡ分子の配列も 知ることはできないが。多様化されたＤＮＡにおける、定められた可変コドンの 数は２０個以下であることが望ましく、５から１０個であれば更に望ましい。各 可変コドンにおいてコートされるアミノ酸の混合物は、コドンによって異なる場 合がある。多様化されたＤＮＡが導入される顕示ファージの場合は、このように して「多様化された」と言えるのである。
タンパク質において知られているドメインの一部分をコードするＤＮＡが多様化 される時、元のドメインはポテンシャル結合ドメインの親（ＰＰＢＤ）と呼ばれ る。そして多様化の結果としてコートされた多数の突然変異ドメインは集合的に ［ポテンシャル結合ドメインＪ（ＰＢＤ）と呼ばれる。予定されたターゲットに 結合する能力が知られていないからである。
我々はポテンシャル結合ドメインの様々な集合を生成させる方法について考慮す る。類似性とともに選択されたターゲットに結合する、ＰＢＤを持っファージの 選択を実行するためである・ポテンシャル結合ドメインは最初アミノ酸しベルで 生成される。どの残留物が突然変異を発生させるか、及びどの突然変異がこれら の位置で起こるかが確証されれば、ＰＢＤにターゲットに対する類似性がある場 合、確実に探知できるようにするため、様々なＰＢＤをコードする多様化された ＤＮＡを生成できる。当然、得られた個々のトランスフォーマ−の数、及び類似 性分離技術の感度により１ラウンドの多様化において可能な多様化を制限するこ とになる。
タンパク質的に多様性を持たせる方法は数多くある。極端な例では、タンパク質 の残留物数個をできる限り多様化する（「強制による突然変異発生」）方法であ り、例えば５個から７個の残留物を選び、それぞれ可能な１３−２０の変異から だに変えようとする。もう一つの極端な突然変異発生計画（「拡散−突然変異発 生」）は、もっとずっと多くの残留物をより制限された選択によって多様化させ ることである。（ＶＥＲ３８６ａ及びＰ＾に［８６参照）使われる多様化パター ンは以上の二つの極端な例の間にある。
同時に突然変移させ得るコドンの数に制限はない。しかし、可能なＰＢＤ配列が 実際に少な（とも１つのファージにより確実に顕示される突然変異方法を使うこ とが望ましい。ｖｇＤＮ＾によってコードされ多様化の各位置で最も条件の悪い アミノ酸から成るミューテンが、少なくとも一つの独立したトランスフォーマ− によって集合体内に顕示されている確立が最低０．５０であることが望ましい。
最低０．９０の確立あればより望ましい。（より好条件のアミノ酸から成り立っ ているミューテンは、当然、同一の集合体内でより生じやすい。） 多様化は典型的なトランスフォーマーントの集合体に対して、できれば１０倍以 下の（より望ましくは３倍以下の）異なったＤＮＡ配列によって、ＪＯＢから１ ０７の異なったアミノ酸配列を生じさせるのが望ましい。
αヘリシス及びβストランスを欠くミニ・タンパク質に関しては、突然変異のど のラウンドにおいても、４−６個の非シスチン・コドンのそれぞれを多様化し、 それぞれが最低、２０個のアミノ酸のうち最低８個をコードするようにする。各 コドンにおける多様化はその位置にあったものにできる。シスチンは代替物質と して可能性のあるものの一つではないが、除外されてはいない。
ミニ・タンパク質がメタル・フィンガー・タンパク質であるとき、典型的な多様 化方法においては、二つのｃｙと二つのＨｉｓの残留物と、更にオプションであ るが上述のＰｈｅ／　Ｔｙｒ、　Ｐｈｅ及びＬｅｕ残留物を不可変状態に保ち、 複数の他の残留物（通常５−１０個）が変化させられる。
ミニ・タンパク質にαヘリシスとβストランスが１個またはそれ以上ある場合、 可能性のあるアミノ酸のある位置における変更が、その位置における二次的構造 をより妨害しないと思われるものに好条件に働く。各可変アミノ酸における可能 性の数はより制限されているため、可変アミノ酸の総数は、選択過程におけるサ ンプリング効率を変更することなく多い可能性がある。
最後に説明されたミニ・タンパク質のクラスにとって、ミニ・タンパク質以外の ドメインにとっても、２０個以下、もしくは５−１０個のコドンが多様化される ことが望ましい。しかし、拡散突然変異発生方法が使われたとき、多様化される コドンの数はより高くなる可能性がある。
どの残留物を変えるかという決定は、どの残留物がドメインの表面にあり、どれ が内部にあるかということを知ることによって安易になる。
我々は数個の要因を検討した上でＰＰＢＤの残留物を選択した。その要因には以 下が含まれる。ａ　）Ｐ　Ｐ　Ｂ　Ｄの三次元構造、ｂ）ＰＰＢＤと同類の配列 、及びｃ）ＰＰＢＤとＰＰＢＤの突然変異体のモールディング。ＰＰＢＤの通常 の増幅を妨げることなく結合に強い影響を及ぼす残留物の数は、同時に変化させ られる残留物の数より大きい時、ユーザーは、一度に変化させる残留物の部分集 合を選ぶべきである。ユーザーは試行レベルの多様化方法を選び、様々な配列の 豊富さを計算する。変化した残留物と変化した各残留物における多様化のレベル は、合成多様化方法が類似分離方法の感度及び生成できる独立したトランスフォ ーマ−の数と同等になるまで調節される。
どの残留物を変化させるか選んだ後は、各可変残留物において許容できるアミノ 酸の領域を決定する。多様化方法の総合しヘルは、変化した各残留物ごとの変異 数の産物である。変化した各残留物は、多様化の異なったシステムを持つことが でき、２から２０の違った可能性を生み出す。ある多様化されたコドンによって コードされ得るアミノ酸のグループは、その「代替セット」と呼ばれている。
ミリゲン７５００などのＤＮＡ合成物質を制御するコンピューターは、いくつか のｎｔ物質（例・ｎｔ）オスフオラミダイテス）を二つ又はそれ以上の保留物か ら取ることによって、ｎｔの分配があるオリゴｎｔのあらゆるベースを合成する ようプログラムすることができる。これに代わるものとして、ｎｔ物質は、その ような比率で混合してもよく、一般に「汚れたボトル」と呼ばれる余分な保留物 の一つの中に置くことができる。各コドンは異なった方法でプログラムされ得る 。コドンのそれぞれのヌクレオタイドの位置におけるベースの「ミックス」は、 そのコドンによってコードされる異なったアミノ酸が生じる相対的頻度を決める 。
単純に多様化されたコドンは、退化したヌクレオタイドの位置にあり、二つ又は それ以上のベースの混合物で、等分子比例により混合されたものから得られるも のである。これらの混合物は、標準化された「不明瞭なヌクレオティド」コード の方法により、この仕様書に説明されている。このコードでは、例えば、退化コ ドンｒｓＮＴＪにおいては、ＳはベースＧとＣの等分子混合物を示し、Ｔは４つ のベース全ての等分子混合物であるＮ及び単−不可変ベースのチミダインを表す 。
複雑に多様化したコドンは、３つのうち最低１つの位置にあるもので、二つ異常 のベースから成る等分子混合物以外のベースによって満たされている。
単純に多様化されたコドンでも、複雑に多様化されたコドンでも、望まれる代替 セットを達成するために使われる。
あるアミノ酸又はアミノ酸のクラスが適切であることを示す情報が無い場合、我 々は全てのアミノ酸を同等の確立のもので置き換えようとする。これは、探知で きるレベル以上のミニ・タンパク質は一つでも無駄だからである。コドン（ＮＮ Ｎ）内のそれぞれの位置における４つのｎｔ全てと同等量は、アミノ酸のディス トリビューションを作り出し、その中で各アミノ酸はそれをコードするコドンの 数に比例して存在する。このディストリビューションは一つの酸化残留物ごとに 二つの基本的な残留物を与えるという不利な点がある。更に、Ｗ又はＭの発生の 発生の６倍ものＲ，Ｓ、及びＬが生じる。このディストリビューションにおいて 、５個のコドンが合成される場合、Ｌ、Ｒ，及びＳのある組み合わせをコードす る２４３の配列のそれぞれは、Ｗ及びＭのある組み合わせをコードする３２の配 列に比べて、７７７６倍豊富であることになる。５個のＷが探知できるレベルに 存在するということは、（Ｌ、Ｒ，Ｓ）配列のそれぞれを７７７６倍余分に持た なければ成らないということである。
タンパク質又はポリペプチドにおけるアミノ酸の配列が、分子の三次元的構造を 決めるということは一般的に認められている。定まった構造がない可能性の決定 も含む。決められた長さと配列のポリペプチドの中で、決まった三次的な構造を 持つものもいくつかあるが、はとんどは持たない。
特定のアミノ酸残留物は、決められたポリペプチドの三次的構造に、下記のよう ないくつか異なった方法によって影響を与え得る。
ａ）ポリペプチドの主鎖の柔軟性に影響を与えること。
ｂ）ハイドロフォピック・グループを加えること。
Ｃ）充電したグループを加えること。
ｄ）クロスリンクを形成する。例えば二硫化物、金属イオンに対するｃｈｅｌａ ｔｉｏｎ、又は二硫化物に結合するグループ柔軟性： ＧＬＹは最小のアミノ酸であり、二つの水素が０１に付いている。ＧＬＹにはＣ ８がないため、主鎖上に最大の柔軟性を与える。従ってＧＬＹは、逆ターンにお いて、特に、ＰＲＯ，ＡＳＰ、ＡＳＮ、ＳＥＲ，及びＴＨＲとの関連において、 非常に頻繁に生じる。
アミノ酸ＡＬＡ、ＳＥＲ，ＣＹＳ、ＡＳＰ、ＡＳＮ、ＬＥＵ。
ＭＥＴ、ＰＨＥ、ＴＹＲ，ＴＲＰ、ＡＲＧ、ＨＩ　Ｓ、ＧＬＵ。
ＧＬＮ、及びＬＹＳは、分岐していないβ炭素を持つ。これらのうち、ＳＥＲ， ＡＳＰ及びＡＳＮのサイドグループはしばしば主鎖に水素結合を行い、他にとっ てエネルギー的に条件の悪い主鎖の構造を持つことができる。ＶＡＬ、ＩＬＥ、 及びＴＨＲは、拡張された主鎖の構造の条件をよりよくする、分岐したβ炭素を 持っている。従って、ＶＡＬ及びＩＬＥはよくβシート内に見られる。ＴＨＲの サイトグループは主鎖に容易に水素結合するため、βシートに存在する傾向はよ り低い。
プロリーンの主鎖は、環状のサイドグループによって特別に制約される。φ角度 は常に一６０°に近い。はとんどのプロリーンはタンパク質の表面に見られる。
荷電・ ＬＹＳ及びＡＲＧは、１０．４以下又は１２．０のｐＨにおいて単一正荷電を負 う。しかし、これらのアミノ酸の、それぞれ４つ及び３つのメチレングループは 、水を嫌う相互作用を起こすことができる。ＡＲＧのグアニデイニウム・グルー プは同時に５個の水素を提供する能力があるが、ＬＹＳのアミノ・グループは３ 個しか提供できない。更に、これらのグループの幾何学はかなり違うので、これ らのグループは相互交換出来ないことが多い。
ＡＳＰ及びＧＬＵは、それぞれ−４，５及び４．６のｐＨにおＧ）て単一負荷電 を負う。ＡＳＰには一つしかメチレングループカ（ないので、嫌水相互作用はほ とんど不可能である。ＡＳＰの幾何学は主鎖の窒素に水素結合する傾向にあり、 これはＡＳＰＩこ一致するものでしばしば逆ターン及びヘリシスの初めに見られ る。
ＧＬＵはもつと頻繁にαヘリシス及び殊にこれらのへＩＪクラスアミノ終点部分 に見られる。サイドグループの負荷電１１へ１ノツシス・ディボールと安定した 相互作用があるからである。（ＮＩＣ８８８，５ＡＬＩ８８） ＨＩＳには生理学的範囲における、つまり６．２におけるイオン化ｐＫがある。
このｐＫは荷電されたグループ、又は水素提供物が受理物の近さによって変える ことができる。ＨＩＳはスズ、銅、鉄などの金属イオンに結合することができる 。
水素結合。
荷電されたアミノ酸以外に、ＳＥＲ，ＴＨＲ，ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＴＹＲ，及びＴ ＲＰは水素結合に参加することができる。
クロスリンク クロスリンクの最も重要な形態は、二つのチオルの間に形成される二硫化物結合 、特にＣＹＳ残留物のチオルである。適切に酸化されている環境の中では、これ らの結合は同時に起こる。
これらの結合は、タンパク質やミニ・タンパク質のある構造を非常に安定させる ことができる。酸化され低減されたチオル反応物質の混合物が存在する時、交換 反応が起こり、最も安定した構造が優位になる。タンパク質及びペプチドにおけ る二硫化物については、 にＡＴ２９０．１ｇＡＴＳ８９．　ＰＥＲＲ８４，ＰＥＲＲ８６，５ＡＬＩＥ８ ６．　ＷＥＬＬ８６．　ＪＡＮＡ８９．　ＨＯＲＶ８９゜ＫＩＳＩ’１８５．及 び５ＣＨＮ８６を参照のこと。
形成に特定の酵素を必要としない他のクロスリンクは次を含む。
１　ＸＣＹ　Ｓ　）　４：Ｆｅ　Ｒｕｂｒｅｄｏｘｉｎ　（ｉｎ　ＣＲＥＩ８４ ．ｐ、３７６）２　ＸＣＹ　Ｓ　）　４：Ｚｎ　Ａｓｐａｒｔａｔｅ　Ｔｒａｎ ｓｃａｒｂａｓｙｌａｓｅ　（ｉｎ　ＣＲＥＩ８４゜ｐ３７６）及びＺｎ−フィ ンガーズ（）ＩＡＲＤ９０）３ＸＨＩ　Ｓ）２（ＭＥＴ）（ＣＹＳ）：　ＣｕＡ ｚｕｒｉｎ　（ｉｎ　ＣＲＥＩ８４．ｐ、３７６）及び基本「ブルー」きゅうり タンパク質（ＧＵＳＳ８８） ４　）（ＨＩ　Ｓ　）　４：Ｃｕ　ＣｕＺｎ　５ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｓ ｕｔｎｓｅ５　）（ＣＹ　Ｓ　）　４：（Ｆｅ４Ｓ４）Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ（ ｉｎ　ＣＲＥ＋８４．ｐ、３７６）６０ＣＹ　Ｓ　）　２（ＨＩ　Ｓ　）　２： Ｚｎ　Ｚｉｎｃフィンガー（ＧＩＢ３８８）７　）（ＣＹ　Ｓ　）　３（ＨＩ　 Ｓ　）　２：Ｚｎ　Ｚｉｎｃフィンガー（ＧＡＵＳ８７．　ＧＩＢＳ８８）（Ｈ Ｉ　Ｓ）２（ＭＥＴＸＣＹＳ）のあるクロスリンク　ＣｕはＨＩＳ及びＭＥＴが Ｃｕなしに他のクロスリンクを形成できないという点において、優位である可能 性がある。
単純に多様化されたコドン 単純に多様化された以下のコドンは、比較的バランスの取れたアミノ酸のセット をコードするので、役に立つ。
１）［Ｌ、Ｐ、Ｈ，Ｒ，Ｖ、Ａ、Ｄ、ＧコセットをコードするＳＮＴ：ａ）酸形 成の（Ｄ）１個及び基本（Ｒ）１個、ｂ）脂肪に関係ある（Ｌ、Ｖ）双方及びア ロマティック・ハイドロフオビックス（Ｈ）、Ｃ）大きい（Ｌ、Ｒ，Ｈ）及び小 さい（Ｇ、Ａ）サイドグループ、ｄ）固定された（Ｐ）及びフレキシブルな（Ｇ ）アミノ酸、ｅ）一度コードされたことのある個々のアミノ酸２）［Ｍ、Ｔ、に 、Ｒ，Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｇ］上セツトコートするＲＭＧ　：　ａ）酸形成１個及び基 本２個（最大ではないが、認められる）、ｂ）ハイトロフィリックス及びハイド ロフオビックス。
Ｃ）一度コードされたことのある個々のアミノ酸３）［Ｔ、に、Ａ、Ｅコセット をコードするＲＭＧ：Ｑ）酸形成１個及び基本１個、天然１個のハイトロフイリ ツクス、ｂ）３個の好条件のαヘリシス、Ｃ）一度コートされたことのある個々 のアミノ酸 ４）［Ｌ、Ｐ、Ｈ，Ｒ，Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ］上セツトコードする ＶＮＴ　：　ａ）酸形成１個及び基本１個、ｂ）全てのクラス　荷電された中性 の／１イトロフイリツク、ハイドロ７才ビック、固定及びフレキシブル、その他 、Ｃ）一度コードされたことのある個々のアミノ酸 ５）［Ｎ、Ｓ、に、Ｒ，Ｄ、Ｅ、Ｇ２］セットをコートするＲＲ８：　ａ）酸形 成２個及び基本２個、ｂ）２個の中性ハイドロフイリック、Ｃ）２回コートされ たグリシンのみ６）［Ｆ、　Ｓ、　Ｙ、　Ｃ，Ｌ、　Ｐ、　Ｈ，Ｒ，Ｉ、　Ｔ、 　Ｎ、　Ｖ。
Ａ、Ｄ、ＧコセットをコートするＮＮＴ　：　ａ）１５個の異なったアミノ酸を 与える１６個のＤＮＡ配列。繰り返されるのはセリンのみで、他の全ては同量で 存在する。（このことにより、集合体のサンプリングが大変効率的にできるよう になる）、ｂ）酸形成及び基本アミノ酸の数は同じである。（Ｄ及びＲは１個ず つ）、Ｃ）全ての主要クラスのアミノ酸が存在している：酸形成、基本、アリフ ァティック、ハイドロフォビック、アロマティック、ハイトロフオビック、及び 天然ハイドロフィリック７）［Ｌ２．Ｒ２，Ｓ、Ｗ、Ｐ、Ｑ、Ｍ、Ｔ、に、Ｖ、 Ａ、Ｅ。
Ｇ、　５ｔｏｐ］セツトをコードするＮＮＧ　＋　ａ）αヘリシスの形成に好条 件な残留物がかなり優勢である［Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｑ、Ｋ。
Ｅ、及び、それ以下の範囲において、Ｓ、Ｒ，Ｔ］、ｂ）１３個の異なったアミ ノ酸をコードする。（ＶＨＧはＮＮＧがコードしたセットのサブセットをコード する。ＮＮＧは、酸とベースが同等であり５／９αヘリツクを好む、９個の異な ったＤＮＡにおける９個のアミノ酸をコードする。）最初の多様化においては、 はとんどの場合ＮＮＴが望ましい。
しかし、コドンがアミノ酸をコードし、αヘリツクに結合すると時はＮＮＧの方 が望ましい。
以下において我々は数個の単純多様化方法により、集合体をサンプリングする上 での効率を分析する。
（ＮＨＫ）６によってコートされる無選別へキサペプチドの集合体が報告されて いる。（ＳＣＯＴ９０．ＣＷ■Ｐ９０）表１３０はそのような集合体の予測され る状態について示している。
ＮＮＫは、ＰＨＥ、ＴＹＲ，ＣＹＳ、ＴＲＰ、Ｈｌｓ、ＧＬＮ。
ＩＬＥ、ＭＥＴ、ＡＳＮ、ＬＹＳ、ＡＳＰ、及びＧＬＵ（αセッＡＬＡ、ＰＲＯ ，ＴＨＲ，及びＧＬＹ（φセット）それぞれのために生成する。そして３個のコ ドンをＬＥＵ、ＡＲＧ、及びＳＥＲ（Ωセット）それぞれのために生成する。我 々は６千４百万の可能性のある配列を２８のクラスに分けた。これは表１３ＯＡ に示されており、これらのセットのそれぞれにあるアミノ酸の数に基づいている 。最大のクラスは、７１４．６％の配列の可能性があるφΩααααである。い かなる選択も別として、一つのクラスの配列は全て生成される確率が同じである 。表１３０Ｂはある（ＮＨＫ）６集合体から取られたＤＮＡ配列が、定められた クラスの一つに属するヘキサペプチドをコードする確率を示している。ＤＮＡ配 列の７６．３％のみがφΩααααクラスに属していることに注目せよ。
表１３００は、あらゆる数の独立したトランスフォーマ−を含む集合体の各クラ スにおいて予測される数を示す。（１０６，３・１０６、１０７．３・１０７． １０８．３・１０８．１０９及び３・１０９）独立トランスフォーマ−が１０６ の時、我々はΩΩΩΩΩΩクラスの５６％を見られるが、ααααααの０．１ ％しか見られないと予測している。配列のほとんどは、１０％以下しかサンプル が取られていないクラスにおいて見られるものである。例えばクラスφφΩΩα αのペプチドは、ターゲットに結合する集合体を分留することによって分離され る。分離された歯入れとに関係するペプチドについて我々がどれだけ知っている か考えてみてほしい。クラスφφΩΩααの４％しかサンプルとして取られてい ないため、Ωセットのアミノ酸が実際にΩセットで最高のものであるという結論 を出すことはできない。ＬＥＵが第二位置にあるかもしれないが、ＡＲＧ又はＳ ＥＲの方がよい可能性もある。ΩΩΩΩΩΩクラスのペプチドを分離したとして も、クラス内のそれより優れたメンバーが集合体の中に存在しないと決めること はできない。
＋０７１７の集合体では、完全にサンプルが取られたクラスがいくつかあるが、 ααααααクラスは１．１％しかサンプルされていない。７・６・１０７１Ｔ では、全てのアミノ酸配列の５０％が顕示されることを予測しているが、αセッ トのアミノ酸を３つ又はそれ以上含むクラスはやはりサンプル度が低い。（ＮＮ Ｋ）６集合体の完全サンプリングを達成するためには、３・１０９のＩＴが必要 である。これは、これまでに報告されている中で最大の（ＮＮＫ）６集合体の１ ０倍も大きいものである。
表１３１は（ＮＮＴ）４（ＮＮＧ）２によってコードされる集合体の予測を示し ている。豊富さに関する予測はコドンの秩序や、点在する不変コドンとは無関係 である。この集合体はアミノサッハ配列の０．１３３倍コードするが、ＤＮＡ配 列の０．０１６５倍しがコードしない。したがって５，０・１０７のＩＴ（つま り（Ｎ　ＨＫ　）６に必要な量より６００倍少い）が、はぼ完全に近い集合体の サンプリングを達成できるのである。結果は（ＮＮＴ）６にとって多少よくなり 、（ＮＮＧ）６にとって少しだけ悪くなる。制御要因はＤＮＡ配列とアミノ酸配 列の比である。
表１３２は、ＮＨＫ、ＮＮＴ、及びＮＮＧのコドンに対する＃ＤＮＡ配列と＃Ａ Ａ配列の比を表す。ＮＮＫ及びＮＮＧにっいては、ＰＢＤが基本遺伝子の一部に 顕示されているものと仮定した。例えば遺伝子■がＦｆファージに顕示されてい るということであり、「仮定すれば消失しない」という言葉に示されているとお りである。このような基本的遺伝子が使われることが要求される訳ではない。基 本遺伝子でないものが使用されると、分析は多少異なる。ＮＨＫとＮＮＧのサン プリングは多少効率が下がるものである。（ＮＮＴ）６は（ＮＮＴ）５の３．６ 倍のアミノ酸配列を与えるが、ＤＮＡ配列は１．７倍少な（て済む。また、（Ｎ 　Ｎ　Ｔ　）７は（ＮＮＴ）５の２倍のアミノ酸配列を与え、３．３倍少ないＤ ＮＡ配列を与えるのである。
したがって、単純な混合物（ＮＮＳ、ＮＮＫ、又はＮＮＮ）を用いて、ある位置 における２０個のアミノ酸を全て得ることが可能である一方、こういった単純な 混合物は、コートされたアミノ酸の非常に偏ったセットにつながる。この問題は 複雑に多様化されたコドンを使うことによって解決される。
我々はまず、ｎｔの分布が二つの制約条件にある時の、最高条件のアミノ酸と最 低条件のアミノ酸の比率を最小にするよう計算（ｆ０９０／口２８０９を参照） された混合物について説明する。その二つの条件は酸形成及び基本的アミノ酸が 同量であることと、閉鎖コドンの可能性が最小であることである。我々は、３番 目のベースをＴ又、はＱ、に制約することによって（Ｃ又はＧは同等）最大のｎ ｔ分布の探索を単純化した。しかし、本発明は複雑に多様化されたコドンの使用 を採用しており、３番目のベースはＴ又はＧ（あるいはＣ又はＧ）には限られて いないのである。
最大の分布（ｌｌｘｓＪコドン）は表１０Ａに示されており、ここに示された量 によって各タイプのアミノ酸をコードするＤＮＡ分子を作り出す。この科学反応 により２０個のアミノ酸が全てコードされることに注目せよ。その際酸形成及び 基本的アミノ酸がほぼ同量であり、最高条件のアミノ酸（セリン）は最低条件の アミノ酸（トライブトファン）のわずか２．４５４倍の頻度でコードされるに過 ぎない。ｒｆｘＳＪ　ｖｇコドンは、ＮＮＫ又はＮＮＳが１個のコドンしか与え ない数個のアミノ酸［Ｆ、Ｙ、Ｃ。
Ｗ、Ｈ，Ｑ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、に、Ｄ、Ｅ］を含むペプチドのサンプリングを最も改 善する。サンプリングの利点は集合体が比較的小さい時最も顕著である。
複雑に多様化されたコドンのみを探した結果は表１０Ｂに示されている。このコ ドンは制約条件を加えることなく、最高条件のアミノ酸と最低条件のアミノ酸の 比率を削減する。変化は小さく、酸形成及びベースの均衡をめ閉鎖コドンを最小 限にしても経費はほとんど変わらないことを示している。また、最大化を制約す ることなく酸形成及び基本アミノ酸の力関係は非常に小さいということにも注目 しておきたい。一方、制約を緩めると、最低条件のアミノ酸がＳＥＲのわずか０ ．４１２倍しか優勢でない分布となる。
ＮＮＴコドンの利点は本応用の別の個所で説明されている。
非最大化されたＮＮＴは、１６個のＤＮＡ配列のみによってコ−トされた１５個 のアミノ酸を与える。表１００に示した複雑に多様化されたコドンによってＮＮ Ｔを改良することは可能である。これによって５個のアミノ酸（ＳＥＲ，ＬＥＵ 、Ｈｌｓ。
ＶＡＬ、ＡＳＰ）がほぼ同量ずつになる。更に８個のアミノ酸（ＰＨＥ、ＴＹＲ ，ＩＬＥ＜ＡＳＮ、ＰＲＯ，ＡＬＡ、ＡＲＧ。
ＧＬＹ）はＳＥＲの７８％の量存在する。ＴＨＲ及びｃｙｓはＳＥＲの半分ある 。二値化物結合のタンパク質のためＤＮＡを多様化するとき、ＣＹＳの量を減ら すことが望ましい。この分布には高いレベルで閉鎖のない１３個のアミノ酸が見 られる。
最大化されたｆｘＳ分布は優勢度が高いアミノ酸を１１個しか許容しない。
ＮＮＧコドンもまた最大化することが可能である。等分子Ｔ。
Ｃ，Ａ、ＧがＮＮＧに用いられる時、ＬＥＵとＡＲＧについては２倍量得られる 。表１０Ｄはほぼ最大化されたＮＮＧコドンを示す。この多様化においては、４ 個のほぼ等しい最高条件のアミノ酸がある。ＬＥＵ、ＡＲＧ、ＡＬＡ、及びＧＬ Ｕである。
このセットには酸形成と基本のアミノ酸が１個ずつあることにも注意してほしい 。２個の等しく最低条件のアミノ酸もある。
ＴＲＰ及びＭＥＴである。１ｆａａ／ｍｆａａの比率は０．５２５８である。こ のコドンが６回繰り返されると、ＴＲＰとＭＥＴのみで成り立つペプーチトは、 最高条件のアミノ酸のみで成り立っているペプチドの２％しか一般度がない。こ れを［最大化されたＮＮＧ６ｖｇＤＮＡにおける（ＴＲＰ／ＭＥＴ）６の優勢」 と呼んでいる。
「汚いボトル」方法でｖｇＤＮＡを合成する時、混合物の制限された数のみ用い ることが望ましいことがある。一つの非常に役立つ混合物は、「最大化されたＮ ＮＳ混合物」と呼ばれており、ｆｘＳ混合物の最初の二つの位置の平均がＴｌ＝ ０．２４．　ＣＩ＝０．１７．　ＡＩ＝０．３３．’　Ｇ１＝０．２６であり、 ２番目の位置は最初の位置に似ており、Ｃ＝３＝Ｇｃ＝０．５である。この分布 はアミノ酸ＡＲＧ、ＳＥＲ，ＬＥＵ、ＧＬＹ、ＶＡＬ、ＴＨＲ，ＡＳＮ及びＬＹ Ｓを５％以上、ＡＬＡ、ＡＳＰ、ＧＬＵ、ＩＬＥ、ＭＥＴ及びＴＹＲを４％以上 与える。
余分な複雑に多様化されたコドンも関心を寄せられる。このコドンは最初の２つ の位ｌにおいて最大化されたＮＮＴコドンとよく似ており、３番目の位置ではＴ ：Ｇ：：９０：１０である。このコドンは１３個のアミノ酸（ＡＬＡ、ＩＬＥ、 ＡＲＧ。
ＳＥＲ，ＡＳＰ、ＬＥＵ、ＶＡＬ、Ｐ）（Ｅ、ＡＳＮ、ＧＬＹ。
ＰＲＯ，ＴＹＲ，及びＨＩＥ）を５．５％以上の比率で与える。
４．３％のＴＨＲ及び３．９％のＣＹＳはＮＮＫのＬＦＡＡ（３，１２５％）よ り一般的である。残りの５個のアミノ酸は１％以下で存在する。このコドンは全 てのアミノ酸が存在するという特徴がある。低量アミノ酸が２個以上ある配列は まれである。このコドンを用いてＳＢＤを分離する時、最初の１３個のアミノ酸 が各位置でテストされているということについてほぼ確信できる。最大化したＮ ＮＧに基づいていれば類似コドンを用いてもよい。
単純又は複雑に多様化された望ましいコドンの幾つかは、シスチンを含むアミノ 酸をコードする。これはコートされた結合ドメインの幾つかが、非可変二値化物 結合シスチンに加えてシスチンを１個又は２個有することを特徴とする、という ことを意味する。例えばＮＮＴにコードされた各位置においては、１６に１つシ スチンを得るチャンスがあるということである。６個のコドンが多様化された場 合、追加シスチンを含むドメインの割合は０．３３となる。奇数個のシスチンは 問題を起こす。Ｐｅｒｒｙ及びｆｅｔｚｅｌ（ＰＥＲＲ８４）を参照のこと。一 方、二硫化物を含む多くのタンパク質は、二硫化物を形成しないシスチンを含む 。
例えばトリスピンなどである。ペア化されないシスチンの可能性は幾つかの方法 で対応できる。
まず、多様化されたファージの集合に、サルフオリンク（イリノイ州ロックフォ ートのピアス・ケミカル・カンパニー、カタログ番号４４８９５８）などのフリ ーのチオルを強く結合させる固定反応物質の上を通過させる。ピアス社のもう一 つの製品はＴＮＢ−チオル・アガロース（カタログ番号２０４０９Ｈ）である。
同じ目的のため、Ｂ　１ｏＲａｄ社＾ｆｆ１−Ｇｅ１４−１（カタログ番号１５ ３−４５９９）を販売している。
２番目に、以下のようにシスチンを除外する多様化方法を用いることもできる。
［Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｈ，Ｌ　Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ］を与えるＮＨＴ ［Ｌ２．Ｐ２．Ｈ，Ｑ、Ｒ３，１，Ｍ、Ｔ２．Ｎ、に、Ｓ、Ｖ２、Ａ２．Ｅ、Ｄ 、Ｇ２］を与えるＶＮＳ［Ｌ２．Ｓ、Ｗ、Ｐ、Ｑ、Ｒ２，Ｍ、Ｔ、に、Ｒ，Ｖ、 Ａ、Ｅ。
Ｇ、閉鎖Ｊを与えるＮＮＧ ［Ｌ、Ｐ、Ｈ，Ｒ，Ｖ、Ａ、Ｄ、ＧＥを与えるｓＮＴ［Ｍ、Ｔ、に、Ｒ，Ｖ、Ａ 、Ｅ、ＧＥを与えるＲＮＧ［Ｔ、に、Ａ、Ｅ］を与えるＲＭＧ ［Ｌ、Ｐ、Ｈ，Ｒ，Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、ＧＥを与えるＶＮＴ又は １：Ｎ、Ｓ、に、Ｒ，Ｄ、Ｅ、Ｇ２コを与え６ＲＲ３しかし、これらのシステム はそれぞれにはＮＮＴに関して１つ又は２つの不利な点がある。ａ）許容される アミノ酸の数がより少ない。ｂ）アミノ酸は均等に与えられない。Ｃ）酸形成及 び基本のアミノ酸が起こる確率は同等ではない。又はｄ）閉鎖コドンが生じる。
けれどもＮＮＧ、ＮＨＴ、及びＶ　Ｎ　Ｔ　ｌ！　Ｎ　ＮＴとほぼ等しく役立つ 。ＮＮＧは１３個の異なったアミノ酸と閉鎖シグナルを一つをコードする。１６ 倍のミックスに２回現れるアミノ酸は２個のみである。
３番目に、予定されたターゲットに結合されるグループを増加し、余分なシスチ ンの選択された配列を評価することが可能である。構造上の制約のために与えら れたシスチンより多（のシスチンを含むものも使用できないことはない。計画以 外の二値化物結合が起こる可能性もある。これは分離されたＤＮＡ配列によって 定められた結合ドメインが不適当であるということを意味する訳では決してない 。分離ドメインの適合性は、化学的に合成されたペプチドの化学的及び生化学的 評価によって最もよく決めることができる。
最後に、フリー・チオノをフリー・チオノを特定の方法で結合させる。二硫化物 に反応しないニレマンの反応物質、イオドアセテート、又はメチルアイオダイド のような反応物質によってブロックした上、変えられた７アージをその集合内（ こ残しておくことができる。ブロックする物質はミニ・タンノマク質の結合能力 を変える可能性があるということは理解されてＪ、Ｘる。従って、異なった結合 ドメインを発見できることを予期して多様なブロック物質を用いるのである。チ オノにブロックされた顕示ファージの多様化集合は、結合のために分留される。
分離された結合ミニタンパク質のＤＮＡ配列が奇数個のシスチンを含んでいると 、ミニタンパク質を作るため可能性のある各接続力（あり、奇数個のチオノが適 切にブロックされた合成方法力く使われる。二ソウテ（ＮＩＳ）１８２．　Ｈｌ ｓ）１８Ｂ、及びその中に言及されてｌｉＸる業績）は、各チオノが異なるタイ プのブロック・グループ（こよって保護される複数のシスチンを含むペプチド合 成方法を公開している。これらのグループは、二硫化物の胆力（制御されるよう 除去され得る。我々は、１個のチオノがブロックされたまま力為、又はブロック を解かれて異なる反応物質とともに再ブロックされる変化のある、このようなシ ステムの使用を予想してＬｓる。
ＮＮＴ又はＮＮＧ多様化コドンの使用により、多様化集合体のサンプリングが非 常に効率的になる。（異なったアミノ酸配列）／（異なったＤＮＡ配列）の比率 が、ＮＮＫに対するよりずっと統合に近いか、あるいは最大化されたｖｇコドン ８ｆｘＳ）に近いためである。しかし、数個のアミノ酸は各ケースで省略される 。ＮＮＴもＮＮＧも重要なりラスのアミノ酸は全て許容する。ハイドロフォピッ ク、ハイドロフィリック、酸形成、基本、中性、ハイドロフィリック、小さいも の、大きいものである。結合ドメインを選択した後、配列の多様化及び選択をす ることが望ましい。より高い類似性又は特異性を達成するためである。この２番 目の多様化の間、前の多様化によって見逃されるアミノ酸の可能性を調べてもよ い。
２回目の多様化において望ましい方法は、新しい残留物セットによって各位置を 変えることである。このセットには、成功結合ドメイン内の位置で発見されたア ミノ酸を含み、更に初回の多様化で除外された残留物を出来る限り多く含む。
このように、後の多様化の回では、前に突然変異を生じなかったアミノ酸の位置 及び前に突然変移した位置にあり、前の代替セットになかったアミノ酸の代替物 が双方ともテストできる。
初回の多様化が完全な失敗に終わった場合、異なるパターンの多様化方法が用い られるべきである。例えば、１個のドメインの中に相互作用セットが一つ以上法 められる場合、次の多様化の回で変えられる残留物は、最初の多様化で調べたも のとは異なるセットからのものでなければならない。失敗が続（Ｘだ場合、異な るＩ　ＰＢＤに切り換えることもできる。
ターゲット結合突然変異体の類似性選択類似性分離は本発明において当初顕示シ ステムが作動して０ることを確かめるために用いられていた。つまり、挿入され た結合ドメインがターゲット物質に適合するよう、キメラのクシ部表面上のタン パク質が圧出され、ファージ表面（こ移されて、正しく位置付けられているかど うかである。この目的で使われる場合、結合ドメインは、あるタープ・ソトにと って既知の結合ドメインであり、ターゲットには類似分離過程に使われる類似分 子がある。例えば、顕示システムは、ＢＰＴＩをコードするＤＮＡを関連ファー ジの外部表面タン／ぐり質をコートする遺伝子には挿入し、通常ＢＰＴＩによっ て結合されるアンヒドロト１ノブシンとの結合をテストすることによって証明さ れ（辱る。
ファージがターゲットに結合される場合、当該結合ドメインは実際にファージに よって顕示されてし）ること力（確認できる。
結合ドメインを顕示する（そのことによってターゲットに結合する）ファージは 、そうしないものから分離される。
顕示システムが確保されれば、様々な異なるポテンシャル結合ドメインを顕示す る多様化ファージの集合体を用Ｌ）ること、更に一つ又はそれ以上のターゲット にどれほどよく結合する力）を知るため類似性分離技術を使うことが可能となる 。このターゲットは、顕示された結合ドメインの親である既知の結合ドメインに よって結合されている必要はない。つまり新しいターゲットに結合させるよう選 択してよいということである。
例えば、トリプシンではなく、ヒトのニュートロフィルエラスターゼのような別 のセリンプロテアーゼ、又はキャセプシンＧ、あるいはウマの心臓のミオグロビ ンのように全く無関係のターゲットに対するＢＰＴＩ結合ドメインを多様化し、 結合のテストすることができる。
「類似分離方法」には次のことが含まれるがそれのみに限られてはいない。ａ） 類似性コラム・クロマトグラフィー、ｂ）類似性マトリックス物質からバッチ溶 出、Ｃ）プレートに付いている類似性マトリックス物質からバッチ溶出、ｄ）蛍 光作動細胞の分類、及びｅ）ターゲット物質が存在するところでの電気永動法。
「類似性物質ｊは、「アナライト」と呼ばれる純化される物質に対する類似性が ある物質という意味で使われている。
はとんどの場合、類似性物質とアナライトの組み合わせは逆になっており、不純 物が荒らい流された後、アナライトが類似性物質から離れられるようになってい る。
類似性クロマトグラフィーが使われる場合、１）ターゲット物質の分子は、類似 性分離に適した固定サポートに応用できるほど十分な大きさと化学的反応性があ ること。
２）マトリックスに応用した後、ターゲット物質が水に反応しないことが望まし い。
３）マトリックスに応用した後、ターゲット物質が不特定な形でタンパク質に結 合したり機能低下させたりしないことが望ましい。
４）ターゲット物質の分子は、同物質をマトリックスに付けた時、タンパク質の 結合のため、変化しない表面が十分にある（通常少なくとも５００　Ａ、　２゜ これにはリンカ−に接続される原子も含まれる）はどの大きさであること。
類似クロマトグラフィーは望ましい分離方法であるが、ＦＡＣＳ、Ｚ気永動法、 又は他の方法を使用してもよい。
本発明ではファージの類似性分離を使って、適切な結合媒体によりタンパク質を コードする遺伝子を持つファージの集合体を増大する。
本発明は、１つまたは２つのターゲット物質を結合し、更に／又は１つ又は２つ のターゲット物質の結合に失敗する結合ドメインを選択することに用いられ得る 。特異性はむろん結合分子が、ターゲット物質の制限されたセットに強く結び付 く能力を有する一方、最初のセットとは区別されるべき、別のターゲット物質に 結合する力がより弱いか全くない。
類似性分離に適したほとんどの分子はターゲットとして用いることができる。
ターゲットとなる可能性のあるものには次のものが含まれるが、それだけには制 限されない。ペプチド、水溶及び非水溶タンパク質、ヌクレイド酸、リピッド、 炭水化物その他有機分子（モノメリック又はポリメリック）、無機結合物、有機 金属結合物など。セリンプロテアーゼはポテンシャル・ターゲット物質に特に関 係が深い。
クロマトグラフィー、ＦＡＣＳ、又は電気永動法においては、ターゲット物質と 二番目の化学物質とを共有原子的につなぐ必要がある。クロマトグラフィーにお ける二番目の物質はマトリックス、ＦＡＣＳにおけるい二番目の物質は蛍光筐料 、電気永動法における二番目の物質は強く荷電された分子である。多くの場合、 カップリングは不要である。ターゲット物質が既に以下のような望ましい物質を 有しているからである。ａ）固定性、ｂ）蛍光、Ｃ）荷電。他の場合においては 化学的又は物理的カップリングが必要である。
実際のターゲット物質が類似性分離に使われる固定又は決定されたアナログの準 備に使われる必要はない。それより、ターゲット物質の適切な反応アナログのほ うが便利かもしれない。
反応機能的グループのないターゲット物質、まずハロゲンのような強い反応物質 を使って反応機能的グループを作ることによって固定され得る。場合によっては 、実際のターゲット物質の反応グループが、ターゲット分子の中でそのままにし ておくべき部分を占めることがある。その場合には、追加的機能グループが合成 化学によって導入され得る。
固定のための２つの一般的な方法は広く使われている。最初の方法は、関係のあ る化合物をｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅＬ、さらにｂｉｏｔｔｎｙｌａｔｅされた誘 導物質を固定されたアビディンに結合させることである。二番目の方法はターゲ ット物質に抗体を生じさせ、様々な方法の一つを使ってその抗体を固定させて、 ターゲット物質をその固定された抗体に結合させるものである。抗体の使用は大 きいターゲット物質により適している。小さ、いターゲット物質（例えば１０個 又はそれ以下の非水素元素から成るもの）は抗体に完全にのみこまれてしまうか もしれないので、ターゲットのうちターゲット抗体化合物において表面に出てい る部分がほとんどなくなってしまう。
抗体を使用しないハイトロフォピック原子の非共有原子固定法も用いることがで きる。２．３．３　トリメチルデケインのような化合物が、ソディウム・アルギ ナドのようなマトリックス・プリカーソルのなかに混合され、混合物は凝固溶液 の中に溶出される。結果としてできるビードは全体に２．３．３）リメチルデケ インが広がり、表面に出ている。
他の固定方法は特殊な化学機能物質の存在に依存する。ポリペプチドは−ＮＨ２ （Ｎ−ターミナル、リジン）、−ＣＯＯＨ（Ｃ−ターミナル、アスパルテン酸、 グルタミン酸）、−０Ｈ（セリン、テレオニン、タイロシン）、及び−３Ｈ（シ スチン）を出す。ポリサッカライドはフリーなＯＨグループがあり、これはＤＮ Ａが糖のバックボーンを持つのと同様である。
次の表は、反応機能グループ及びポテンシャル固定反応物質の非包括的な検討で ある。
グループ　反応物質 Ｒ−ＮＯ３２，４，６−）リニトロンヘ：、ｚ−ｔ’ンフｔネート（ＴＮＢＳ） 。
（ＣＲＥＩ８４．ｐ、１１） Ｒ−Ｎ）１２　カルボン酸無水物、例・琥珀酸無水物の誘導剤、マレイン酸無水 物、シトラコニツク無水物（ＣＲＥＩ８４．　ｐ、　Ｈ）Ｒ−１ｔＨ２低減でき るンッフベースを形成するアルデハイド（ＣＲＥＴ８４．　ｐ、　１２）、グア ニード・サイクロヘキサネトイオン誘導剤（ＣＲＥＩ８４．　ｐ、１４） Ｒ−ＣＯ２）１　ジアゾ化合物（ＣＲＥＩ８４．　ｐ、　１０）Ｒ−ＣＯ２−エ ポキシド（ＣＲＥＩ８４．　ｐ、　１０）Ｒ−ＯＨカルボン酸無水物 Ａｒｙｌ−ＯＨカルボン酸無水物 インドールリング　ヘンシールハロゲン化合物及びサルフェニルハロゲン化物（ ＣＩ！ＥＩ８４．　ｐ、　１９）Ｒ−３ＨＮ−アルキルマレイマイド（ＣＲＥＩ ８４．　ｐ、　２１）Ｒ−８Ｈエチレンイミン誘導剤（ＣＲＥｒ８４．　ｐ、　 ２１）Ｒ−３Ｒアリール水銀化合物（ＣＲＥＩ８４．　ｐ、　２１）！！−３Ｆ Ｉ　二硫化物反応物質（ＣＲＥＩ８４．　ｐ、　２３）ヂオルエーテル　アルキ ルイオダイド（ＣＲＥＩ８４．　ｐ、　２９）ケトーン、シッフのベースを作り ＮａＢＨ３により削減させる。（ＣＲＥＩ８４．　ｐ、　１２−アルデハイド　 Ｃ０ＯＨを酸化する。ｖｉｄｅ　５ｕｐｒａＲ−５Ｏ３ＨＲ−３Ｏ２Ｃ１に変換 し、固定アルコール又はアミンと反応する。
トＰＯ３ＨＲ−ＰＯ２Ｃ１に変換し、固定アルコール又はアミンと反応する。
ＣＣ二重結合　ＨＢｒを加えて、それからアミン又はチオルを作る。
類似性クロマトグラフィーと関連技術に関する広範な文献は更に例を提供する。
サポート物質としての使用に適したマトリックスには、ポリステイレン、グラス 、ａｇａｒｏｓｅその他のクロマトグラフィー上のサポートなどが含まれ、ビー ズ、シーツ、コラム、ｔｅｌｌｓ。
その他必要な形態に製造できる。類似性クロマトグラフィー用サポート物質のサ ブライヤーは、以下が含まれる。マサチューセッツ州ケンブリッジ、アプライド ・プロティン・チクノロシーズ。ニューヨーク、ロックビル・センター、バイオ ・ラッド・ラボラトリーズ。イリノイ州ロックフォート、ピアス、ケミカル・カ ンパニー。ターゲット物質は、各マトリックスを作成したメーカーの、ターゲッ トの優れたプレゼンテーションに対する考慮を入れた指示通りにマトリックスに 付いている。
選択過程の初期においては、結合を行いやすくするためターゲット物質の比較的 高い集中がマトリックスに適用され得る。
ターゲットの集中度は、より高い類似性のあるＳＢＤを選ぶために大幅に減らさ れる。
顕示ファージの集中は、結合タンパク質の意図された使用に匹敵する条件下で、 類似性マトリックスに適用され、その集合は、コラム上にある、溶質の増減率の パッセージによって分溜される。この過程はターゲットに類似性を持っＰＢＤを 豊富にし、ターゲットに対するその類似性は使われる溶出物によって受ける影響 が最も小さい。豊富にされた部分は、溶出物の集中度がより高い時、コラムがら 溶出する、生存能力のある顕示ファージを含む。
溶出物質は、顕示されたＰＢＤと固定されたターゲット物質との間の非コバレン トな相互作用を弱める能力があることが望ましい。溶出物質はファージを損失さ せないことが望ましい。
成功ミニタンパク質に送られる遺伝的メツセージは、ＰＣＲのように試験管内で 行うことによってよりも、ファージを再生することによって最も好都合に増大で きる。ポテンシャル溶出物質（７）　ＩＪ　Ｘ　ｌ−１：ハ塩（Ｎａ＋、ＨＧ４ ＋、Ｒｂ＋、５０４−、Ｈ２ＰＯ４−、シトラーテ、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｈ３Ｏ４− 、ＣＯ３−、Ｃａ＋＋＋、Ｓ　ｒ＋＋、ＣＩ−、ＰＯ４−−−、ＨＣＯ３−、Ｍ ｇ＋＋、Ｂａ＋＋。
Ｂｒ−、ＨＰＯ４−一及びアセテート）、酸、熱、ターゲットを結合させること で知られている化合物、及び水溶性のターゲット物質（又はそのアナログ） エタノール、アクセトーン、エチル、又は尿素のような中性の溶質は、しばしば タンパク質の純化に用いられ、タンパク質と他の分子の間で起こる非共有原子的 相互作用を弱めることが知られている。これらの種類のうち多くはバクテリア及 びバクテリオファージに有害である。尿素は８ＭまではＭ１３に有害とならない 。塩は増減率に関する情報においてはほとんどの場合望ましい溶質である。ｐＨ を定価指せることもまた非常に望ましい溶出剤である。場合によっては望ましい マトリックスが低いｐＨにおいて不安定であり、塩と尿素が最も望ましい反応物 質であることもある。一般的にタンパク質と他の関連分子間の非共有原子的相互 作用を弱める他の溶質が使われてもよい。
溶出されない顕示ファージは、溶出に抵抗するのにターゲット物質に対する十分 な類似性のある結合ドメインをコードするＤＮＡを含む。このような成功結合ド メインをコートするＤＮＡは、いろいろな方法で復帰できる。結合顕示ファージ は単に溶出状態の変化によって溶出させるのである。他の方法としては、ファー ジを培養するか、あるいはターゲットを含む物質からフェノール（又は他の適切 な溶剤でもよい）を抽出して、ＰＣＲ又はＤＮＡ再結合技術によってＤＮＡを増 幅する。または、特定のプロテアーゼの場所が顕示ヘクテルの中に組み込まれて いる場合、そのプロテアーゼを用いて結合ドメインをＧＰから離す。
ＳＢＤを持つクローンの分析において、サポート物質（ポリステイレン、ガラス 、アガロース、セルロースその他）内にあルハリエーションは、ターゲットより もむしろサポート物質に結合するファージを区別するのに用いられる。
ハーベストされたファージは、ターゲット表現型への接続のため価値が高められ る。その際、類似性マトリックスに”固定さレタターゲット物質を使った類似性 分離手法が用いられる。ターゲット物質に結合できないファージは洗い流される 。バクテリアの成長を防ぐため、アザイドのようなバクテリオサイダル物質をバ ッファーに含めることが望ましい事がある。クロマトグラフィーにおいて用いら れるバッファーは次を含む。ａ）ターゲットを安定させるために必要なイオン又 は他の溶質、及びｂ）ＩＰＢＤから出たＰＢＤを安定させるのに必要なイオン又 は他の溶質。
類似性コラムへの結合を顕示するファージの復帰は、上述のカオトロピック物質 又は水溶可能な形態のターゲット物質の勾配があるコラムから溶出した部分を収 集することによって達成できる。後で勾配において溶出する部分は高類似性ファ ージのために価値を高められる。溶出したファージはそれから適切な細胞の中で 増幅される。
高類似性ファージがターゲットから溶出できない場合、以下のように対処するこ とができる。
１）マトリックスを栄養になる媒体とともに水で洗い、５ｉｔｕにおいて望まし いファージを成長させる。
２）マトリックスの部分を除去し、それを成長媒体に植え付けるために使う。
３）化学的または酵素的にターゲットのマトリックスに対する結合を弱め、ター ゲットにまだ結合されているＧＰが溶出するようにする。
４）ファージを退化させ、フェノール又は他の適切な溶剤があるＤＮＡを復帰さ せる。復帰させたＤＮＡはＧＰを再生する細胞を移動させるのに用いられる。
以上の手段を幾つか組み合わせてつかうことも可能である。
類似性マトリックスから復帰させたいものはいわゆるファージではなく、その中 にある、成功エピトープ又は結合ドメインを配列させるための情報であるという ことを覚えておくべきである。
ｆ０９０１０２８０９に説明されていたとおり、物質Ｂでなく物質Ａに結合する 分子、又は競争あるいは競争でない場所においてＡとＢの両方に結合する分子、 又は選択されたターゲットに結合しない分子を選択するため、説明にある手段の 類似性分離方法を変えてもよい。
後に出来る生成 本発明の手法を用うことにより、我々は、１Ｓｌｆｆ達ターゲツト物質に対し高 類似性と特異性を持つ新規タンパク質ドメインを顕示する複製可能ファージを得 ることができる。このようなファージは、結合タンパク質ドメインのアミノ酸物 質と新規結合ドメインをコードする遺伝子のＤＮＡ物質の両方を持つ。ＤＮＡが 存在することによって、高レベルの圧出システム内にある新規結合タンパク質ド メインから成るタンパク質の圧出が可能になる。このシステムは開発過程におい て使われたのと同じシステムである必要はない。
新規結合タンパク質の生成に進む。生成方法はいくつかあり、次の方法を含む。
ａ）結合ドメインをコードする遺伝子を変えて、結合ドメインがファージに付か ず水溶性のタンパク質としトン５を削除するか、結合ドメインをコードする閉鎖 コドン３を動かすことにより行う。）、ｂ）結合ドメインをコードするＤＮＡを 、既知の圧出システム内に移動させること、及びＣ）ファージを純化システムと して利用すること。（ドメインが十分小さければ、従来のペプチド合成方法によ って生成することもできるかもしれない。） 前述の通り、ミニタンパク質をＩ　ＰＢＤとして使用することの利点は、生成さ れるＳＢＤもまたミニタンパク質のように機能し、化学合成方法によって得られ る可能性が高いからである。
（ここで使われる「化学合成」という用語の意味には、細胞に制約されない環境 にある酵素媒体の使用を含む。）ペプチドは、水溶液の中でもサポート上でも化 学的に合成され得る。ステップ的合成や部分凝縮の様々な組み合わせが使用でき る。
合成が行われている間、アミノ酸の側鎖は分岐を防ぐために保護されている。以 下のようないくつかの異なった保護グループがチスタインのチオル・グループを 保護するのに役立つ。
１）４メトキシベンジル（ＭＢｚｌ　；ＭｏｂＸＮＩＳＲ８２；ＢＥＣＫ８９ｃ ）、アイオディンによって除去可能。
２）アセタミドメチル（Ａｃｅｒ）（Ｎｌ５Ｈ８６：Ｎｌ５Ｈ８６，８ＥＣＫ８ ９ｃ）、アイオディン、水銀イオン（例、水銀アクテート）、硝酸塩銀によって 除去可能。及び ３）Ｓ−パラ−メトキシヘンシル その他のチオル保護グループは標準的な参考文献を参考にしてほしい１１例　グ リーン著、［有機合成における保護グループ］ポリペブチ１への鎖が合成される と、二値化物結合が形成されなければならない。酸化媒体としての可能性がある ものは、空気（Ｎｌ５Ｈ８６）、フェリアシン化合物（ＮＩＳＨＩ８２）　、ア イオデイン（ＮＩＳＨＩ８２）、及びパフオーミック酸である。温度、ｐＨ１溶 剤、及びカオトロピック化学物質が酸化の過程で影響を及ぼすことがある。
多数の二値化物結合を持つ多くのミニタンパク質は、生物学的に活性のある形態 において化学的に合成されたものである。
本発明における成功結合ドメインは、それ自体で又はより大きいタンパク質の一 部として、結合タンパク質が適したあらゆる目的のために使うことができる。タ ーケラト物質の分離又は除去を含む。この目的のため、新規結合タンパク質は直 接又は間接的に、原子共有的又は非原子共有的にレベル、キャリアー、又はサポ ートとカップリングすることができる。
薬品として使用される時、新規結合タンパク質は適切なキャリアー又は補薬を含 む必要がある。
＊＊＊＊＊ この仕様書に記載された全ての出典は、関係のある範囲においてその内容が収録 されている。　以下の例において使われる細胞は全てＥ、ｃｏｌｉ細胞である。
例　■ ＭＩ３遺伝子Ｖｌｌｌタンパク質に対する融合としてのＢＰＩＴの顕示 例■は、Ｍｌａ上にある、成熟した遺伝子′ｖｌコートタンパク質に対する融合 物質としての、ＢＰＴＩの顕示に係わるものである。各ＤＮＡの構造は、制限分 解及びＤＮＡ配列によって確認される。
ｔ、＝シグナル配列の構造：：ｂｐｔｉ：成熟ｉコートタンパク質顕示ヘクテル オペレーターブ・クローニング・ベクテルはＭ１３及びＭ１３がら生成されたフ ァージミツドである。最初の構造はｆｌベースのファージミツトｐＧＥＭ−３２ ｆ　（−０７Ｍ）だった（ウィスコンシン州、マデイソンのプロメガ・コーポレ ーション）。
我々は次の順でコードする遺伝子を構築した。ｌ）変化させた１ａｃＵＶ５促進 物質、口）シャインーダルガーノ配列、ｆｉ）Ｍ１３遺伝子壇シグナル配列、Ｗ ）成熟ＢＰＴＩ、　ｖ）成熟ＭＩ３遺伝遺伝子−コートタンパク質ｉ）マルチプ ル・ストップ・コドン、及び輔）トランスクリプション・ターミネータ−０この 遺伝子は表１０２に図解されている。ＩａｃＵＶ５のオペレーターは対称的なＩ ａＣＯでＩＰＴＧが無いところでより強い圧力を可能にする。ワイルドタイプ遺 伝子■と同等に最長セグメントは最低限にされるため、共存する遺伝子■と再度 遺伝子的組み合わせが起こる可能性は低い。
ｉ）　ｐＧＥＭ−３Ｚｆに基づ＜ＯＣＶｐＧＥＭ−３２ｆ（Ｔｉｔ）（ウィスコ ンシン州、マデイソンのプロメガ・コーポレーション）は、ａ■ｐ遺伝子、複製 の元のバクテリア、複製の元のバクテリオファージｒｌ、多数のクローニングサ イト配列を含む１ｎｃＺオペロン、及びＴ７とＳＰ６ポリメラーゼ結合配列を含 むベクテルである。
Ｂａ■）１１及び５ａｉｌサイトは、ＩａｃＺオペロンの境界に導入された。
（１ａｃＺオペロン及び合成遺伝子に代わる物質を除去するためである）このベ クテルはｌ）ＧＥＭ−ＭＢ３／４と名付けられている。
ｉｆ）Ｍ１３ｍｐ１８に基づ＜ＯＣＶ Ｍ１３■ｐ１８（ＹＡＮＩ８５）は、ファージゲノム全体と、多数のクローニン グサイトがある１ａｃＺオペロンから成るベクテルである。（ＭＥＳＳ７７）（ マサチューセッツ州ヘバリーのニューイングランド・バイオラプス社）　Ｂａｍ ＨＩ及び５ａｉｌサイトは、ＩａｃＺオペロンの５′及び３′エンドにおいてＭ 　１３ＩＩｌｐ１８導入された。このヘクテルはＭｌ３−Ｍ　Ｂ　１／２と名付 けられている。
Ｂ）合成遺伝子 合成遺伝子（■シグナル配列：成熟ｂｐｔｉ・成熟■コートタンパク質）は１６ 個の合成オリゴヌクレオタイドから構築され、テキサス州ヒユーストンのジエネ ティック・デザインズ、Ｉｎｃ社により、に１ＭＨ８９及びＡＳ）１Ｍ８９にお ける手法と類似した方法によって合成された。表１０２にはこの配列の注釈が含 まれている。オリゴヌクレオタイトは、標準的方法を用いて５°分子のほとんど を除いて燐酸化されており、段階的に強化され、結紮された。
突出部分はＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって満たされ、ＤＮＡはｐＧＥＭ−３Ｚ ｆ（−）のＨｉｎｃｎサイトの中にクローンされた。最初の構太で表されている 。結果としてできる構造はｐＧＥＭ−ＭＢ２０である。
造はｐＧＥｉｌ−１１８Ｉである。ｐＧＥＭ−ＭＢｌのダブルストランドされた ＤＮＡは、Ｐｓｔｌで切断され、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで満たされ、５ａｉｌ リンカ−によって結紮されたにニューイングランド・バイオラブ社）。これは合 成遺伝子がＢａｍＨＩ及び５ａｉｌサイトによって結合されるようにするためで ある（表１０２）。合成遺伝子は、ｐＧＥＭＪＢ１６及びＭｌ、３−ＭＢ１５を それぞれ生成するために、Ｂａ園■及び５ａｉｌカセツトの上に得られ、導入さ れたＢａ５ａｌ及５ａｌｌサイトを使ってｐＧＥＭ−ＭＢ３／’４及びＭｌ３− ＭＢＩ／２の中にクローンされた３合成挿入物は配列された。オリジナルのリポ サム結合サイト（ＲＢＳ）は間違いであり（作られたＡＧＧＡＵＧの代わりにＡ ＧＡＧＧだった）、我々は試験管内にも生体内にも圧出されたタンパク質を探知 できなかった。
Ｃ）合成遺伝子の改変 ｌ）リポサム結合サイト（ＲＢＳ） ｐＧＥＭ−ＭＢ１６において、５ａｃｌ−ＮｈｅｌＤＮＡフラクメント（ＲＢＳ を含む）は、Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉ　ｐｈｏ＾の、機能することが知られているＲ ＢＳと非常に類似した新規ＲＢＳをコートするオリゴヌクレオチドによって置換 された。
オリジナル推定［ＩＢＳ（５°から３°）ＧＡＧＣＴＣａｇａｇｇＣＴ’ｒＡＣ ＴＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＣＴＣｒＧσｒＴｃＴＴＡＡＧＧｃＴＡＧｃＳａｃＩ　 Ｎｈｅ　Ｉ 新規ＲＢＳ（５°から３′） ＧＡＧ００ｇｇａ絽ａＡＡＴＡＡＡＡＴＧＭＧＮ野π：”［”ＣＴＧＧＴＴロア ｒＡＡＧ（χＴＡ工５ａｃＩ　Ｎｈｅ　１ 推定ＲＢＳは小文字で、開始メチオニンコドンは下線が引かれ肉ｐｔ；ＥＭ−Ｍ Ｂ２０及びｐＧＥＭ−１１８２６の合成遺伝子は、ファージＭ１３−１１１Ｂ２ ７ｐ１；ＥＭ−ＭＢ２Ｄが持っていた遺伝子の試験管内における圧出により、予 期されたサイズ、約１４．５Ｋｇの新規タンパク質種が生成された。
とＭｌ３−ＭＩ３２８をそれぞれ生成するため、変えられたファージヘクテル１ １３−ＭＢＩ／２に再度クローニングされる。
出、シグナルペプチト配列 ことは、成熟遺伝子■タンパク質のカーポクシー終点付近にある無荷電アンカー 領域による指示であり（表１１６参照）、分割シグナル配列によるものではない 。ｐｈｏ＾シグナル配列は成熟ＢＰＴＩをＥ、ｃｏｌｉのペリプラズムに分割す るよう指示できる（ＭＡＲに８６）。
更に、成熟純粋遺伝子■タンパク質がファージ形成前にリピッドニ層内に入るメ カニズムを巡る議論がある。
従って我々は、遺伝子■推定シグナル配列をコードするＤＮＡを、次をコードす る各ＤＮＡによって置換した。ｌ　）　ｐｈｏ人シグナル配列、２）ｂＩａシグ ナル配列、及び３）Ｍ１３遺伝子■シグナル。三つの代替物はそれぞれ、順番に 以下から成る融合タンパク質をコードする三分割遺伝子を生成する。（ａ）分割 を、最初の遺伝子からできた（ｂ）及び（Ｃ）のペリプラズム部分に分けること を指示するシグナルペプチド、（ｂ）始めのポテンシャル結合ドメイン（この場 合はＢＰＴＩ）で二番目の遺伝子（この場合、二番目の遺伝子は動物の遺伝子で ある）から生成されたもの。
及び（Ｃ）構造的パッケージングシグナル（成熟遺伝子■コートタンパク質）で 三番目の遺伝子から生成されたもの。
ＩＰＢＤ・パッケージング−シグナル融合がファージ表面に来る過程は図１に図 解されている。図１ａでは、純粋な遺伝子■タンパク質がリピット二層に現れ（ どのような過程を経るにせよ）、アミノ及びカーポクシー終点双方ともシトプラ ズム内にあるようにする。シグナルペプチダーゼＩは、遺伝子■タンパク質を分 割し、シグナルペプチド（細胞に吸収される）及びリピット二層をつなぐ成熟遺 伝子■コートタンパク質を解放する。成熟遺伝子シ１コートタンパク質の多くの 複製がリビッドニ層に蓄積しファージ生成を待っている（図ＩＣ）。幾つかのシ グナル配列はかなり大きいタンパク質をリピッドニ層を越えて移動させるのを指 示できる。追加コドンが、このような強力なシグナル配列を持つシグナルペプチ ダーゼＩの分割サイトをコードするコドンの後で挿入される場合、コードされた アミノ酸は、図１ｂに示されたとおりリピット二層を越えて移動させられる。シ グナルペプチダーゼ■による分割後、追加コドンによってコードされたアミノ酸 は、ペリプラズムにあるが、成熟遺伝子■コートタンパク質によってリピッドニ 層内にとどまる。図１ｄ０サーキュラー単一ストラントされたファージＤＮＡは 、成熟遺伝子■コートタンパク質が多く集中するりピッド二層の一部を通じて発 せられる。各コートタンパク質分子のカーポクシー終点はＤＮＡ付近に集まり、 アミノ終点は外側に集まる。融合タンパク質が、二層を越えたドメイン内の成熟 遺伝子■コートタンパク質に似ているため、融合タンパク質は純粋成熟遺伝子■ コートタンパク質とともに生成される。図１ｅを参照のこと。
各場合において、成熟遺伝子■コートタンパク質の一部は純粋成熟遺伝子■コー トタンパク質とともに生成することにより、表面に顕示されたＢＰＴＩドメイン を持つファージ部分を作り出すことが意図されている。分割シグナル配列のソー スや特徴はそれほど重要でばない。シグナル配列は切り取られたり退化させられ たりするからである。しかし構造パッケージングシグナルは、機能するウィルス ・シースを作り出すために純粋遺伝子コートタンパク質とともに生成されなけれ ばならないため、重要である。。
ａ）バクテリアのアルカリ・７オスフアターゼ（ｐｈｎＡ）シグナル・ペプチド ｐにＥＭ−１１８２６の構造には、新ＲＢＳ及び開始メチオニオンとＭ１３遺伝 子■プロタンパク質シグナルペプチトをコートする配列を含むＳａｃ　Ｉ−Ａｃ ｃ［Ｉ１７ラグメントが含まれる。フラグメントは、開始メチオニオン及びシグ ナルペプチドＰｈｏ＾をコートするＲＢＳ及びＤＮＡを含む複製（４つのオリゴ ｎｔｓから強化された）と置換される１、ファージはｐＧＥＭ−ｉ１Ｂ４２であ る。、　Ｍ１３ＭＢ４８はＧｅｍＭＢ４２から生じたものである。、　ｆ；ｅｎ ＭＢ４２から生じた遺伝子構造を持つＢｕｗ＋旧−８ａｌｌＤ　Ｎ　Ａフラグメ ントは、同様に分割されたヘクテル１１３ＭＢ１／２に結紮され、Ｍ１３Ｍ８４ ８の価値を高める。。
５ａｃＩ　ｍｅｔ　Ｉｙｓ　ｇｌｎ　ｓｅｒ　ｔｌｙＡＴＣ，ＯＣＡ、ＣＴＣ， ＴｒＡ、ＣＣＧ、ＴＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＴ、ＡＣＣ，Ｃ（？Ｔ″、ＧＴＧ、ＡＣ Ａ、−１１ｅ　ａｈａ　ｌｅｕ　ｌｅｕ　ｐｒｏ　Ｉｅｕ　Ｉｅｕ　ｐｈｅ　ｔ ｈｒ　ｐｒｏ　ｖａｌ　ｔｈｒＡＡＡ、ＧＣＣ，ＣＧＴ、ＣＣＧ、ＧＡＴ、−３ ’ｌｙｓ　ａｌａ　ａｒｇ　ｐｒｏ　ａｓｐ、、、、。
β−ラクタマーセ（ａｍｐ）促進物質及びシグナルペプチドをコートするＤＮＡ を、（成熟ＢＰＴＩ）：ｌ（成熟■コートタンノクク質）遺伝子内に移動させる ため、我々はまずＡｃｃ　ｍサイトコドンにａｍｐ遺伝子を導入した１、それか らＢｄｗ＋旧リンカ−をＸａＬ■サイトのｎ（２２６０、５’の促進物質に結紮 した、ヘクテルはｐＧＥＭＪＢ４５である。Ｂ８ｍ旧−４ｃｃ［［Ｉフラグメン トはａ＋ｎｐ促進物質及びＨｓｐＰＢＳを持ち、マチオナイン及びβラクタマー ゼ・ノグナルペプチドを開始する。
このフラグメントは相応するｐＧＥＭ−ＭＢ２６の７ラグメントと置換され、ｐ ＧＥＭ−ＭＢ４６の構造を生成するために使われた。
ａｍｐ遺伝子促進物質とシグナルペプチドの配列５　’　−ＧＧＡＴＣＣＧＧＹ ＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＱＣＧＧＡＡＣＣＣＣｒＡＴＴ ｒＧＴｌ”−ＴＡＴＴＩＴＴ’ＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴｒＣＡＡＡＴＡＴ（汀ＡＴ ＣＣα７ＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣ−ＣｒＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴｒ’ＣＡ ＡＴＡＡＴＡＴｒＧＭＡＭＧＧＡＡＧＡＧＴ＾ＡＴＯ，ＡＧＴ、ＡＴｒ、ＣＡＡ 、ＣＡＴ、ＴＴＣ，ＣＧＴ、ＧＴＣ，ＧＣＣ，ＣＴＴ、ＡＴＴ、ＣＣＣ，ｍ、ｍ 、Ａｍｅｔ　ｓｅｒ　ｉｌｅ　ｇｌｎ　ｈｉｓ　ｐｈｅ　ａｒｇ　ｖａｌ　ａｌ ａ　Ｉｅｕ　ｉｌｅ　ｐｒｏ　ｐｈｅｈｅ α：Ｔ、ＴＣＡ、ＴｒＴ、ＴＧＣ，ＣＴＴ、ＣＣＴ、ＧＴＴ、７７口”　ＧＣＴ 、ＣＡＴ　ＣＣＧ、￥３゛ａｌａ　ａｌａ　ｐｈｅ　ａｙｓ　ｌｅｕ　ｐｒｏ　 ｖａｌ　ｐｈｅ　ａｌａ　ｈｉｓ　ｐｒｏ、、、。
ｃ）Ｍ１３遺伝子■ノグナル　ｂｐＬｉ　成熟ｋｌコートタンパク質我々は更に １１１３ＭＢ５１を構築することもできる。これはに■Ｒ遺伝子と、前述のＢＰ ＴＩ　成熟■コートタンパク質遺伝子フラグメントに融合しているＭ１３遺伝子 ■シグナルベブチトを持っている。
Ｍ１３−ＭＢ５１が遺伝子■を持っていないため、ファースはブラックを形成て きないが、細胞ＫｍＲを取り除（ことはできる。感染したファージの部分はへル バーファージを通じて得られる。遺伝子用シグナル配列は（ＢＰＴＩ）：：（成 熟遺伝子■タンパク質）をファージの表面に方向づけることかできる。（ｖｉｄ ｅ　１ｎｆｒａ）以下はシグナルペプチド融合タンパク質の異物をまとめたもの である。
促進物質　ＲＢＳ　シグナル　融合 配列　タンパク質 ｐＧＥＭ−ＭＢ２６　ｔａｃ　新　■　ＢＰＴＩ／ＶＩＩＩコートメ正Ｍ−ＭＢ ４２　ｔａｃ　新　ｐｈｏＡ　ＢＦｒＩ／ＶＩＩＩ：７−トｐＧＥＭ−ＭＢ４６ 　ａｍｐ　ａｍｐ　ａｍｐ　ＢＰＴＩ／ＶＩＩＩコートｐＧＥＭ−ＭＢ５１　Ｌ ＨＩＩＩ　ｍ　ＢＦｎ／ＶＩＩＩ：７−ト（ｈｙｐａｔｈ、） Ｍ１３　ＭＢ４８　ｔａｃ　新　ｐｈｏＡ、　ＢＦｎＡ’ｌＩＩコート２、合成 （シグナルペプチト　成熟−ｂｐｔｉ：：ｖｉコートタンノくり質）遺伝子にコ ートされたタンノくり質生成物の分析ｉ）試験管内における分析 二重のトランスクリプション／トランスレーンヨンのプロカリオティックシステ ム（イリノイ州、アーリントンｌ）イ゛ンのアマ＝ノヤム・コーポレーション） が、ＢＰＴＩ■合成遺伝子及ヒソの派生物によってコードされたタン／ぐり質生 成物の試験管内（こおける分析に使用された。
表１０７は、３５３メチオナインの存在のもと、試験管内合成及びＳＤＳポリア クリラマイト・ジェル・エレクトロフオレシスを使った生成物の分離に続いて、 標準間接撮影１こよって見えるリストされたヘクテルによりコートされたタンノ くり質生成物のリストである。各サンプルにおいて、前βラクタマーゼ生成物（ −３１ｋｄ）が見られる。これはへクテルにとってａｍｐ一般的な選択遺伝子で ある遺伝子から派生したものである。更（こ、合成遺伝子と異物によってコート される（ｐｒｅ−ＢＰＴＩ／■）生成物（ま、示されたとおりに見える。これら の種の移動（−１４，５ｋｄ）Ｉよ、コートされるタンパク質の予想サイズと一 致している。
Ｕ）試験管内における分析 （ｂ）と（Ｃ）に詳細説明のあるヘクテルは、Ｅ、ｃｎｌｉストレインＸＬ１ブ ルー（７１１Ｘカリフオルニア州、ラホヤのストレータージーン社）及びストレ インＳＥＰ　に新たにトランスフェクトされた。Ｅ。
ｃｏ１ｉストレイン５Ｅ６００４（ＬＩＳＳ８５）はｐｒｌＡ４突然変異体を持 ち、選択においてワイルドタイプｐｒｌＡを持つストレインより許容度がより高 い。５Ｅ６００４はＦてあり、１ａｃｌのため除去される。したがって細胞は、 Ｍ１３及びＩａｃＵＶ５に感染され得す、ｔａｃ促進物質はＩＰＴＧに調整され 得ない。ストレインＳＥＰは、ＸＬＩブルーＴＭをクロスさせて、ストレイン５ Ｅ６００４（ＬＩＳＳ８５）から派生させたものである。
ＸＬＩブルーＴＩＩＩのＦは’　ＴＣＲ及びＩａｃｌｑを持つ。５Ｅ６００４は ストレプトマイシンＲ，Ｔｃｓである一方、ＸＬＩブルーＴＭはストレプトマイ シンＳ、　ＴｃＲであり、両方の親ストレインはＴｃとストレプトマイシンの組 み合わせによって殺すことが可能である。ＳＥＰ　は親ストレインの選択許容フ ェノタイプ、５Ｅ６００４（ｐｒｌＡ４）を残しておく。
新しいトランスフェクトントはＮＺＹＣＭ媒体（ＳＡＭＢ８９）において１時間 成長させられる。１．　ｈｌｌから０．５＊１１の範囲でＩＰＴＧが加えられ（ １ａｃＵＶ５とｔａｃを再抑制するため）、更に１．５時間成長させられる。
コードされた合成挿入タンパク質とコントロール要因（ベクテル、モツクヘクテ ルはな（、Ｉ　ＰＴＧもない）を表す細胞の割り数は、ＳＤＳジェルロープイン クバッファーのなかで溶解され、ＳＤＳ及び尿素を含む２０％ポリアクリラマイ ト・ジェルの中で電気永動化される。複製シェルは、ウサギの反ＢＰＴＩポ１ツ クローナル抗体を使ったウェスタン分析のために、銀着色（東京の第−社）また はナイロンマトリックスに電気的移動（マサチューセツ′ン州、ヘットフォート のミリボア社によるイモ−ピロン）させられる。
表１０８は、銀着色及び類似ジェルのウェスタン分析（こよって見られる関連タ ンパク質を示す。ウェスタン分析により、ＩＰＴＧ誘導可能なタンパク質の種が はっきりと見られる。このタンパク質には、コントロールストレイン４こ１よ見 られなｌｚテスト・ストレイン内に存在するＢＰＴ　Ｉエビトープカ（含まれる 。ＸＬＩ−ブル−ＴＭは、プロタンパク質の未加工形態のものより、この種の移 動の方が優勢であるが、完全加工形態のものと同すイスの少量のタンパク質が移 動するように見える。ＳＥＧ’　ｌこおＬ）て（ま、加工形態の方が優勢である が、未加工の種１こ相応する（よんの少量存在するのみである。
このように、ストレインＳＥＦ’におＬｌて、我々１ｊ分害１シグナル配列の後 で分割される三分割融合タン、（り質の生成を行った。
我々はＢＰＴＩから成る成熟タンｄり質の後１こ１ま遺伝子■コートタンパク質 が続き、コートタンパり質の半分１ま細胞膜を拡張すると確信している。このタ ンパク質の一つ又（まそれ以上の複製、恐らく何百もの複製が、ＭＬ３から派生 したファージ又（まＭ１３のようなファージミツトの中に組み込まれる。この構 造により、次のことが可能となる。ａ　）Ｂｌｉ’ＴＩ　ドメインを突然変異さ せる。
ｂ）各異物を一つ又はそれ以上のファージのコートに顕示する（一つのファージ につき一つのタイプ）。及びＣ）異物を顕示し我々が選択したターゲット物質に 係わる結合物質を有するファージを復帰させる。
ラシエツド及びオヘラー（ＲＡＳＣ８Ｂ）の報告によると、遺伝子■の２個の対 立因子を圧出し、成熟コートタンパり質の最初の１１個の残留物内で違いがある 細胞で生成されたファージ１よ、各タンパク質の幾つかを含む。したがって、我 々はｐｈｏＡ（シグナｌし）・ｂｐｔｉ　成熟■融合遺伝子の試験管内加工を達 成したため、表面にＢＰＴＩドメインを持つファージの生成につながる、この遺 伝子とワイルドタイプ■との共同圧出の可能性はかなり高（１と考えられる。こ れらの遺伝子のｂｐｔ　ｉドメインの突然変異発生（まファージの集合体を生み 出す。各ファージは、ファージ表面４こ顕示されたＢＰＴＩの異物をコートする 遺伝子を持っている。
■　顕示ファージ　生成、準備及び分析１、ファージ生成 ＯＣｖはＩ　ＰＴＧがなくてもＸＬＩブルーＴＭにおいて成長させられる。
典型的に、ブラックプラグがプレートから取られ、新たζこ薄められた細胞を含 む媒体２ｍｌの中で６から８時間の間成長させられる。この培養は遠心器にかけ られた後、上澄液が滴定値測定される。これはファージのストックとして更なる 感染、ファージ生成及び関連遺伝子顕示のために保たれる。
１晩おいたＳＥＰ’細胞の培養を５００１のＮＺＣＹＭｇ体で１００倍（こ薄め た液は、３７℃においてシェーカー内で０，４％の細胞濃度になるまで培養する 。この培養液に十分な量のファージストックを加え、１０個のＭｏｌとＩＰＴＧ に最終濃度０．５ｓ＋Ｍとなるようにする。培養液はもう２時間培養し続けてよ い。
Ｕ、ファージの準備及び純化 ファージを生成するバクテリア培養液は遠心器にかけられ、上澄液にあるファー ジをバクチリアル・パレットから分離させる。この上澄液に、量にして１／４の ファージ促進溶液（２０％ＰＥＧ、　３．７５Ｍアンモニア・アセテート）が加 えられ、ＰＭＳＦの最終濃度は１１１ｉｌとなる。これは２時間氷の上に放置さ れ、その後促進されたファージは遠心器で復帰させられる。ファージパレットは 、０．１％のサルコシルを含むＴｒｉｓＥＤＴＡに再溶解され、４℃で１時間放 置され、その後遠心器でバクテリア及びバクテリアの廃物を除去する。上澄液の ファージは４℃で一晩ＰＥＧにより再促進される。フ７−シバレソトはＬＢ媒体 内でとどめ置かれ、あと２回前促進されてディタージエントを除去する。ファー ジは４℃でＬＢ媒体内に保存され、滴値測定されて、分析及び結合の研究のため に使われる。
より厳格なファージ純化システムは、ＣｓＣ１勾配（ＮＥＴバッファーに溶解さ れた３、　８６ｇのＣｓＣ１（０，ＩＭ　ＮａＣｌ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、０．Ｉ Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐ１１７．７）で１０１にする）の中で遠心分離器にかける。Ｔ Ｅサーコシル・バッファーにおける１０１２から１０１３フアージを５ｍｌのＣ ｓＣｌ　ＮＥＴバッファーと混合し、３４ｋ　ｒｐｍで一晩遠心器にかける。例 えばソーホール　０ＴＤ−６５Ｂウルトラ遠心器などを用いる。４００μｍのア リクオツドは注意深く除去される。５〆ｌのアリクオツドはフランクジョンから 除去され、１５分間６５℃で暖めた後、ｏ、１％のＳＤＳを含むジェル・ローデ ィング・バッファーとともにアガローズリエル電気永動法によって分析される。
ファージを含むフラクションはプールされる。再促進され、最終的にＬＢ媒体に １１あたり１０１２から１０１３個のファージという濃度で再溶解されたファー ジである。
ｉ、ファージの分析 顕示ファージは、ポリアクリシマイドジェル電気永動法の樺準手法、及びジェル の銀着色又は、反ＢＰＴＩ抗血清（ウェスタン分析）ナイロンマトリックスに対 する電気移動法を用いて分析される。非定形型のタンパク質の顕示は、初めのタ ンパク質のシリアル・ディル−ジョンとの比較によって増量する。例えばＢＰＴ Ｉと電気永動法及びウェスタン分析の顕示ファージサンプルである。別の方法で は、ファージのシリアル・ディル−ジョンを２倍使い、その中で主要コートタン パク質と融合タンパク質が双方とも銀着色される。二つのタンパク質の種の比率 の比較により、ファージごとの融合タンパク質の数を予測すること可能になる。
一つのファージ中にある■遺伝子によりコードされたタンパク質の数が分かって いるからである（−３０００）。
融合タンパク質のバクテリオファージへの統合ベクテルＧｅｍＭＢ４２と１１１ ３ＭＢ４８によってコードされる、加よりＰＴ　１■融合タンパク質の試験管内 の圧出では、加工された融合生成物が恐らく細胞膜内に位置づけられているとい うことを示している。従って、これはファージに組み込める可能性があり、ＢＰ ＴＩの半分はファージ表面に顕示され得る。
ＳＥＰ’細胞は、コントロールとしてのＭ　１３Ｍ　Ｂ　４８又はＭ１３ｍｐ１ ８によって感染した。結果のファージは、尿素を含む２０％のポリアクリラミド ジェル中で電気水動化され（ル−ンごとに−１０１１（Ｋのファージ）、反ＢＰ Ｔ　Ｉウサギの血清を使ってナイロンマトリックスとウェスタン分析に電気移動 させられる。タンパク質の単一種が、Ｍ　１３Ｍ　Ｂ　４８ストツクフアージに よる感染がら派生したファージ中に観察されたが、これはコントロールされた感 染には観察されなかったものである。このタンパク質は一１２ｋｄのサイズで移 動したが、このサイズは完全に加工された融合タンパク質と一致する。
ファージ感染がある又は無いＳＥＰ’バクテリア細胞分解産物のウェスタン分析 により、約２０ｋｄの別のタンパク質種を表示された。この種もまた、他と比べ てより少ないが、ファージ準備において存在する。ファージ準備は更に純化する ことなく単にＰＥＧ促進されたものである。（例えば非イオン洗剤を用いたり、 ＣｓＣ１勾配遠心作用による）ディタージェントが存在する又はしないところで 行われたＭ］３ＭＢ４８ファージ準備は、サーコシル処理及びＣｓＣｌ勾配純化 がバクテリア汚染を除去はしたが、ＢＰＴｌ、ＶＭ融合タンパク質の存在には全 く影響を及ぼさないということを示した。これは融合タンパク質が統合され、フ ァージのボディに存在することを示している。
ファージ生成及びＢＰＴＩ■の統合の過程の後に、感染後及びＩＰＴＧインダク ション後が続く。ファージ生成及び融合タンパク質統合は２時間後に最高になる ようであった。この過程はその後のファージ分析及び生成に用いられる。
ファージ準備のポリアクリラミト電気永動法と、それに続く銀着色は、準備が基 本的にタンパク質の種を汚染しないこと、余分なタンパク質バンドが、コントロ ール７７−シにないＭ１３ＭＢ４８を除去されたファージに存在することを示し た。新タンパク質のサイズはウェスタン分析で見られたものと一致していた。分 割的に薄められたＢＰＴＩ　：　Ｉ’１１を統合されたファージに対する、類似 した分析は融合タンパク質と主要コートタンパク質の比率は通常的１１５０であ ることを示した。ファージは遺伝子■生成物の複製を約３０００個含むので、フ ァージ集合は平均、一つのファージにつき何十という融合タンパク質の複製を含 んでいるのである。
天然遺伝子■の最初のメチオナインの変更ＯＣＶ旧３ＭＢ４８　ハ、ＢＰＴＩ／ ［融合タンパク質を、変化したＭ１３ｍｐ１８）７−ジヘクテルの遺伝子開領域 でコードする合成遺伝子を含む。ヘクテルの残りはＭ１３ゲノムから成る。ファ ージの統合を増加するため、我々は、この遺伝子の最初のメチオニン・コドンを ＣＴＧに変えることにより、天然遺伝子■生成物の生成をやめることにした。こ のような場合、メチオニンが統合されたが、イニシェーション率は下がった。変 化はサイト特定のオリゴヌクレオチド突然変異発生によって達成された。
ＭＫＫＳ−■の残り 八ＣＴ、ＴＣＣ，ＴＣ，ＡＴＧ、Ａ＾＾、ＡＡＧ、ＴＣＴ。
ＸＩ　Ｔ　Ｓ　Ｓ　５ｔｏｐ サイト特定の突然変異発生。
（Ｌ）Ｋ　Ｋ　Ｓ　■の残り ＡＣＴ、　ＴＣＣ，＾Ｇ、　ＣＴＧ、　ＡＡ＾、　ＡＡＧ、　ＴＣＴ＞ＸＩの残 り　Ｔ　Ｓ　Ｓ　５ｔｏｐ この変更ベクテルから派生したファージの分析は、主要タンパク質に対する融合 タンパク質の比率が非常に増加したことを示した。量的予測はファージ集合内で 、一つのファージにつきＢＰＴ　Ｉ■融合の１００個の複製が統合されたことを 示した。
バクテリオファージによるＢＰＴＩ　■融合タンパク質の顕示ＢＰＴＩ　■融合 タンパク質はファージのボディ内に統合されることが示された。このファージは 更に分析され、ＢＰＴＩの半分が特定の抗体にアクセスでき、ファージ表面に顕 示できることが分かっている。
我々はウサギのポリクローン反ＢＰＴＩＩｇＧを純化して、ファージに既知の滴 値を得た。培養した後、タンパク質ＡアガローズビーズがＩｇＧに結合されるた めに加えられ、培養のため一晩放ｌされる。ＩｇＧタンパク質Ａビーズ及び結合 されたファージが遠心分離により除去され、上澄液を再度滴値測定してファージ が失われたことを確認する。ビーズに結合したファージも酸によって溶出し滴値 ゐ測定することができる。この試みには、ＷＴファージストック（Ｍ１３ｍｐ１ ８）や通常のウサギの未接種細胞から純化されたＩｇＧなどのコントロール因子 が含まれる。
表１４９は、ＷＴファージの演値測定が反ＢＰＴＩＩｇＧによって変えられない 反面、ＢＰＴＩ−Ｉ［Ｉ　Ｍ　Ｋ　（ポジティブ・コントロール、ｖｉｄｅ　１ ｎｆｒａ）は、タンパク質Ａビーズの追加があってもなくても、滴値測定におい てかなりの低下が見られた。（ＢＰＴＩの半分はファージをバクテリア・ビリに 結合するｇｌｌｐの一部であるため、これは予測されていることだった。＞　Ｍ ］、３Ｍ８４８フアージ（ＢＰＴＩ■融合タン融合タンパクツチは、ｐｆｕｓに よって判断された通り、反ＢＰＴ　Ｉ抗体及びタンパク質Ａが加えられた時、滴 値測定でかなりの低下を示した。滴値測定における抗体のみの最初の１滴は、フ ァージの２バツチと多少異なる。免疫促進ファージの復帰は、量は少ないが、Ｗ Ｔファージ・コントロールと比べるとかなりある。
より多くのコントロールが表１４１と１４２に示されている。
データは、ファージを含むＢＰＴＩ■で観察された滴値測定における損失は、こ れらのファージと、反ＢＰＴＩ抗体との特定相互作用によるＢＰＴＩエピトープ の顕示の結果であることを示している。
タンパク質Ａアガローズビーズも、通常のウサギの細胞から純化されたＩｇＧも 、特に注目すべき相互作用は見られなかった。
Ｍ　１３Ｍ　Ｂ　４８バツチ５の滴値測定におけるより大きい低下は、この準備 における融合タンパク質のより高いレベルの統合を示している。
ＢＰＴＩ−■顕示ファージにおけるＢＰＴＴ半分の機能性前述の２つのセクショ ンでは、ＢＰＴＩ■融合タン融合タンパクツジボディに統合されたこと、及びＢ ＰＴ　Ｉの半分はファージ表面に顕示されたことを説明した。顕示された分子が 機能することを示すためには、前セクションで説明した方法とほぼ同じ方法で結 合実験を行うが、抗体の代わりにプロテアーゼを使うところのみが異なる。顕示 ファージ及びコントロールは、固定されたプロテアーゼ又は固定され非働化され たプロテアーゼと相互作用できる。結合は滴値測定における顕示ファージの損失 又はビーズに対するファージの結合の決定によって評定できる。
表１４３は、ＢＰＴｌ、■顕示ファージ、Ｍ　１３Ｍ　８４８が無水トリプシン ーアガローズのビーズに結合することができた実験の結果を示す。ＷＴファーン に比べて滴値測定でかなり大きい低下があった。（ＢＰＴＩの顕示はなし）ファ ージのプール（５八Ａプール）で、それぞれがＢＰＴＴ主要コ主要コートタンパ クタインターフエースて多様化された５個のアミノ酸拡張を含むものが、滴値測 定における同様な低下を示した。コントロールでは（表１４３）、無関係のタン パク質（ストレプタビジン）を持つアガローズビーズにおいて顕示ファージの非 特異結合はほとんど観察されなかった。
顕示ファージの実際の結合は、表１４４に示された二つの実験のデータに示され ている。ネガティブコントロールはＭ１３ｍｐ１８で、ポジティブコントロール はＢＰＴＩ−１［Ｉ　Ｍ　Ｋであり、遺伝子■タンパク質に付いたＢＰＴＩの半 分であるファージは顕示され機能することが示されている。Ｍ　１３Ｍ　８４８ 及びＭ　１３Ｍ　Ｂ　５Ｂは双方ともポジティブコントロールに匹敵する方法に より、無水トリプシン・ビーズに結合されている。この方法はネガティブコント ロールの４０から６０倍も優れた方法である（顕示ファージなし）。
従って、主要コートタンパク質におけるＢＰＴＩの半分の機能性は確立されたと いえよう。
更に、表１４５は、ファージによる活性及び不活性トリプシンへの結合を比較す る。コントロールファージであるＭ１３■ｐ１８及びＢＰＴＩ−１１１Ｍ　Ｋは 、現在の応用における別の部分で詳しく説明されている結合に似た結合を示した 。トリプシンの相対結合が強まっていることに注目したい。これはＷＴファージ の活性プロテアーゼに対する非特異結合において明らかに低下が見られたことが 原因である。それぞれ°ＥＧＧＳ’リンカー拡張をドメイン・インターフェース に持つ、Ｍ１３．３Ｘ７及びＭ１３．３Ｘ　１１は、ＢＰＴＩ−ＩＩＩＭＫフ７ −ンに似た方法で無水トリプシン及びトリプシンに結び付いた。結合は、非顕示 ファージと比較して、無水トリプシン結合試験においては〜１００倍であり、ト リプシン結合試験では少な（とも〜１０００倍であった。別の゛ＦＧＧＧＳ’リ ンカー異物（Ｍ１３．３Ｘｄ）の結合はＭ１３．３Ｘ７の結合と類似していた。
結合の特異性を示すため、ヒトのニュートロフィル・エラスターゼ（）ＩＮＥ） ビーズを使って試験を繰り返し、表１４６に示したトリプシンビーズの結合と比 較した。ＢＰＴＩはトリプシンに高い類似性を示し、ＨＮＥには低い類似性を示 すため、ＢＰＴＩ顕示ファーンは、試験をこれらのビーズと結合させる際、これ らの類似性を反映するはずである。トリプシン結合におけるネガティブ及びポど テ、イブコントロールは既に上に説明があるとおりであるが、ＨＮＥビーズのた めに追加ポジティブコントロールであるＢＰＴｌ（Ｋ１５Ｌ、　ＭＧＮＧ）−１ １１ＭＡが含まれている。結果は、表１４６に示されテオリ、コノｌｌｌヲ１ｉ ｉｆｉＥ　Ｌ　タ。Ｍ１３ＭＢ４８．　Ｍ１３．３Ｘ７．　及ヒＭ１３．３Ｘ１ １フアージは、ＢＰＴＩ−ＩＩＩＭＫファージと比較でき、ＷＴファージ及ＵＨ ＮＥｔ　ン）　ｏ−ル（ＢＰＴＩ（Ｋ１５Ｌ、ＭＧＮＧ）−１ｔ［ＭＡ）ト比較 シテＩ−！Ｊ　フンンによく結合することを示した。
蓄積されたデータを総合すると、主要コートタンパク質ＭＩ３ファージとともに 、ＢＰＴＩが融合ンパク質の一部である時、両方の分子はファージの表面に顕示 され、多くの部分が特定のプロテアーゼ結合方法において機能する。
例ＩＩ ＢＰＴＩ／遺伝子■顕示ベクテルの構造ＤＮＡの操作はマニアテスその他（ＶＡ ＮＩ８２）又はサムプルツクその他（ＳＡＭＢ８９）に解説されている標準的方 法に基づいて行われた。まずＭ１３ＭＢＩ／２の１ａｃＺ遺伝子が除去された。
Ｍ１３ＭＢ１／２　ＲＦがＢａｌｌ１旧及び５ａｉｌによって切りとられ、大き いフラグメントが分離された。復帰された６６１９ｂｐフラグメントはＫｌｅｎ ｏｖ酵素で満たされ、）ＩｉｎｄｍＢ酊ｅｒリンカ−に結紮されて、ＸＬＩブル ーＴＭ（カリフォルニア州、ラホヤのストレータージーン社）細胞をトランスフ ェクトするのに用いられる。同細胞は次にブラック情報のためプレートされる。
選択されたブラックとクローンからＲＧ　ＤＮＡが準備され、再生成されたＢａ ａ旧と５ａｉｌサイト及び新Ｈ１口ｄｌｌｌサイト。
ＢｑＩ１１サイト（６９３５）の５００ｂｐアツプストリーム全てを含むＭ１３ ＭＢ１／２デルタが選ばれる。
ユニークなＮａｒｌサイトが遺伝子■のＭ１３−１１ＢＩ／２デルタにおけるコ ドン１７と１８に導入される（Ｈ−５からＧ−Ａまでのアミノ酸を変える）。
ＰＦＹＳ）ＩＳＡＥＴ ５°−ｃｔ　ｔｃｃ　ｔａｔ　ｔｃｔ　ｃａｃ　ｔｃｃ　ｇｅｔ　ｇａａ　ａｄ −３’ワイルドタイプ３’　−ｇａ　ａａｇ　ａｔａ　ａｇａ　ｃｃｇ　ｃｃｇ 　ｃｇａ　ｃｔｔ　ｔｇ−５’オリゴの突然変異発生 ５°−ｃｔ　ｔｔｃ　ｔａｔ　ｔｃｔ　ｇｇｃ　ｇｅｅ　ｇｃｔ　ｇａａ　ａｄ −３’突然変異体ＰＦＹＳＧＡＡＥＴ ヌクレオチド１６３０にユニークなＮａｒｌサイトが存在することは、制約酵素 分析によって確認されている。新しいベクテルはＭ１３１１Ｂｌ／２デルタ−Ｎ ａｒｌである。ファージＭＫは１．３ｋｂ　ＢａｍＨｉにｄフラグメントのプラ スミドｐＬｌｃ４Ｋにュージャーシー州ビスカットアウェイのフ７−マシア社） をＭ１３ＭＢ１／２デルタＮａｒｌにクローニングすることによって作られる。
合成りＰＴＩＴ伝子の挿入 ＢＰＴＩ−ｍ顕示ベクテルは標準的方法で構築された。合成りｐｉ　ｔ−■融合 は、ＢＰＴＩコード領域の最後の２個のコドンから成るＮａｒｌサイトを持つ。
二番目のＮａｒｌサイトはＢＰＴＩをコードする領域のアップストリームにアダ プターをＡｃｃ　ｍカット１１１３−ＭＢ２６に結紮することによって導入した 。
５−ＴＡＴＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＴ　−３’３−ＡＴ４ＡＧＡＣＣＧＣＧＧ ＧＣＡＧＧＣＣ−５’ＮａｒＩ　ＡｃｃｌＩＩ 結紮サンプルはＮａｒｌによって制限され、ＢＰＴ　Ｉをコードする１８０ｂｐ ＤＮＡの７ラグメントは分類された。ファージ証にのＲＦ　ＤＮＡはＮａｒｌと ともに消化され、無燐酸化され、更にｘｓｏｂｐフラグメントに結紮された。結 紮のサンプルは、ＫｍＲブラックのためプレートされたＸＬＩブルーＴ証をトラ ンスフェクトするのに使われた。
ブラックから派生したファージから分離されたＤＮＡは、ＢＰＴＩ遺伝子に相当 する３２Ｐ−燐酸化されダブルストランドされたＤＮＡ探子に対する異種交配の ためテストされる。大規模なＲＦ準備が、強い異種交配シグナルを見せているク ローンのためになされた。
制約酵素の消化分析により、ファージＶに−ＢＰＴＩを生成するため、合成りＰ ＴＩＴ伝子の複製を１個Ｕに遺伝子■に挿入することが確認された。続＜　ＤＮ Ａ配列により、ｂｐｔｉ−ＩＩＩ融合遺伝子の配列が正しく、正確なリーディン グフレームが保持されていることが確認された。表１１６は全コーディング領域 、タンパク質配列へのトランスレーション、及びポリペプチド鎖の機能部分を示 す。
ＢＰＴＩ−Ｉ［１融合遺伝子の試験管内における圧出ＭＫ−ＢＰＴＩ　ＲＦ　Ｄ ＮＡは二重プロ力すオティック・トランスクリプンヨン・トランスレーション抽 出物に加えられた（＾ｍａｒｓｈａ■）。
新しく合成された放射線レベル化されたタンパク質が生成され、次に電気永動法 により１５％ＳＤＳポリアクリラミド・ジェルにおいて分離された。ＭＷ−ＢＰ ＴＩ　ＤＮＡは、未加工遺伝子■融合タンパク質の合成を指示する。このタンパ ク質はＹＴ遺遺伝子上り７ｋｄ太き（、ＢＰＴＩの５８個のアミノ酸を遺伝子ｍ タンパク質に挿入したものに相当する。我々は細胞に拘束されないプロ力すオテ ィック抽出物から取られた、放射線レベル化されたタンパク質の免疫的促進を行 った。ウサギの反（Ｍ１３遺伝子■タンパク質）ＩｇＧも通常のウサギの細胞の ＩｇＧも、Ｖに又は麓に−ＢＰＴＴによってコードされた遺伝子■タンパク質の 免疫的促進ができた。しかしウサギの反ＢＰＴＩ　ＩｇＧは、Ｖに−ＢＰＴＩに よってコードされた遺伝子■タンパク質を促進できたが、Ｍにによるものはでき なかった。これは、１ｉｄ−ＢＰＴＴによってコードされた■タンパク質のサイ ズ増大は、ＢＰＴＩタンパク質の挿入によるものであることを確証する。
ウェスタン分析 ファージはＰＥＧ促進物質による培養から復帰されたものである。残留物の細胞 を取り除くため、復帰されたファージは高い塩分のバッファー内に再度とどめら れ、遠心分離された。これは、ＭＵＴＡ−ＧＥＮＥ（Ｒ）Ｍ１３試験管内突然変 異発生キット（カリフォルニア州すッチモンド、バイオラッド社、カタログ番号 １７０−３５７１）の説明に従って行われた。ファージのアリクオツド（最高４ ０．ｇのタンパク質を含む）は、１２．５％のＳＤＳ尿素尿素ポリアクミラミド ェル上で電気永動され、タンパク質はイモピロンのシート上に電気永動させられ る。ウェスタン・プロットは、予めＥ、Ｃｏ１１抽出物内で培養され、次にアル カリ・フォスファターゼによってヤギ及びウサギ抗体を変換させた、ウサギの反 ＢＰＴＩ細胞を用いて開発された。６７にｄの免疫反応的タンパク質が關に−Ｂ ＰＴＩの準備段階において探知されたが、ににファージには見られなかった。
免疫反応的タンパク質のサイズは、加よりＰＴＩ−Ｉ［１融合タンパク質（６， ４ＫＤと６０ＫＤ）の予期されたサイズと一致している。これらのデータはＢＰ ＴＩに特有のエピトープが、ＭＫファージではなく、■−ＢＰＴＩファージの表 面に出されることを示す。
アガローズ固定無水トリプシンにより滴値測定されるファージの中性化 無水トリプシンは、無水アルカリに変換される活性サイト・トリプシンから派生 したものである。無水トリプシンはトリプシンの特異な結合を持つが、プロテア ーゼの働きはない。ポリクローナル抗体とは異なり、無水トリプシンはフォール ドされていないＢＰＴＩにも不完全なフラグメントにも結合しないとされている 。
７　ｙ　−’）　１１１−ＢＰＴＩ及び１１３Ｆは薄められて、］、Ｏｍｇ／＋ １ｃ７）ＢＳＡを含むＴＢＳバッファーにおいて１■ｌあたり１．４・１０１２ パーテイクルの濃度にされる。薄められたファージの３０μｌが、ＴＢＳ／ＢＳ Ａバッファーにおけるアガローズ固定無水トリプシン（イリノイ州ロックフォー ドのピアス−ケミカル社）の５０％スラリーの２．５．又は１（１真１に加えら れた。２５℃において培養した後、アリクオツドが除去され、氷のように冷たい ＬＢ液の中で薄められ、ＸＬＩブルー（ＴＭ）細胞のローン上でのブラック形成 ユニットのため滴値測定される。表１１４はＭＫ−ＢＰＴＩファージが固定無水 トリプシンと４時間培養された化結果、滴値測定でかなりの損失があった力（、 Ｖに（コントロール）ファージではそのような効果はまったく見られないことを 示す。ファージの滴値測定における減少（ままた、ＭＫ−ＢＰＴＩファージに加 えられる固定無水トリプシンに比例する。ＴＢＳ／ＢＳＡバッファーにおけるア ガローズ固定スト１ノブタビジン（モンタナ州セントルイスのシグマ社）の５０ ％スラリー５μ１１こよる培養では、ＭＫ−ＢＰＴＩのファージでもＭｌファー ジでも、滴値ｉｌｌ定の・値は低（ならない。これらのデータは、ＭＫ−ＢＰＴ Ｉファージ表面上にある正しくフォールドされた、機能的なりＰＴＩタンノぐり 質の場合と一致するが、ＭＫファージ上のものの場合は一致しなし）。
フォールドされていない、不完全なりＰＴＩドメイン無水ト１Ｊプシンと結合し ないとされている。さらに、７オールドされてＬ）ないドメインは特に理由なく 粘着質であるともされてしする。
反ＢＰＴＩ抗体とともに滴値測定されるファージの中性イヒ鼠に−ＢＰＴＩ及び ＭＫファージは、ＬＢブロス内１ｍｌあたりに４・１０８のブラック形成ユニッ トの濃度になるよう薄められる。薄められたファージ１５μｌが、ウサギの反Ｂ ＰＴＩ細胞又はノーマル細胞（双方ともＬＢブロスで１０倍に薄められる）のど ちらかの同量の溶液に加えられる。３７℃で培養した後、アリクオツドカ（除去 され、氷のように冷たいＬＢ液の中で薄められ、ＸＬＩブル−（ＴＭ）細胞のロ ーン上でのブラック形成ユニ・ノドのため滴値測定される。ＭＷ−ＢＰＴＩファ ージと反ＢＰＴＩ細胞を培養すると、２時間におよび滴値測定において次第に値 が減る結果となるが、ＭＷファージにおいてはこのような結果は見られない。予 期通り、ノーマルなウサギの細胞では、Ｍに−ＢＰＴＩもＭＫもファージの滴値 測定が下がらない。反ＢＰＴＩ細胞を用いた、純粋ＢＰＴＩタンパク質による、 しかし同量のＥ、Ｃｏ１１タンパク質にはよらない以前の培養では、さいぼうが ＭＫ−ＢＰＴＩファージの滴値を下げる機能をブロックしてしまう。これらのデ ータはＭＫファージでなく　、ｔＫ−ＢＰＴＩファージ表面に生じるＢＰＴ　Ｉ 特有エピトープと一致する。つまりデータはＢＰＴｌエピトープは遺伝子■タン パク質と係わっており、この融合タンパク質と反ＢＰＴＩ抗体との組み合わせに より、細胞の感染を介する能力をブロックする。
トリプシンとともに滴値測定を行うファージの中性化ＭＫ−ＢＰＴＩ及びＭＫフ ァージは、ＬＢブロス内１０１１あたりに４−１０８のブラック形成ユニットの 濃度になるよう薄められる。薄められたファージは、同量のＬＢブロスのさまざ まな濃度の溶液に加えられる。３７℃で培養した後、アリクオツドが除去され、 氷のように冷たいＬＢ液の中で薄められ、ＸＬＩブルー（ＴＭ）細胞のローン上 でのブランク形成ユニットのため滴値測定される。０．１５１ｇのトリプシンが 入った溶液で２時間培養すると、ｔＫ−ＢＰＴＩファージでは滴僅に７０％の低 下が見られ、ＭＫファージでは１５％の低下しかなかった。ファージに加えられ るトリプシンの量を減らすと、滴僅の低下につながる結果となる。しかし、調べ られた全てのトリプシン溶液では、ＭＫ−ＢＰＴＩファージがｌ［ファージより 、トリプシンとの培養においてより敏感に反応する。従って、絹に−ＢＰＴＩフ ァージ表面に顕示されたＢＰＴＩ−ＩＩＩ融合融合タンパ色質リプシンが組み合 わせられると、細胞の感染を介する機能をブロックしてしまう。
トリプシンによる）７一ジＭＫの滴僅の低減は一般的現象の一例である。プロテ アーゼは十分な量存在するのであれば、ファージにおけるタンパク質を退化させ 、感染力を低減する。現在の応用には、この問題を解決することができる幾つか の方法がリストされている。
類似性選択システム 固定無水トリプシンによる類似性選択 Ｍに−ＢＰＴＩ及びＭにファージはＴＢＳバッフｙ　−（ＰＡＲＭ８８）におい て１■ｌあたり１．４・１０１２個のパーティカルの濃度にするよう薄められる 。我々は４．０・１０１０フアージを、アガローズ固定無水トリプンン・ビーズ （ピアス・ケミカル社）か又はＴＢＳ／ＢＳＡのアガローズ固定ストレプタヒジ ン・ビーズ（シグマ社）の５露ｌの５０％スラリー液に加えた。３時間室温で培 養した後、ビーズは３０秒間、５０００ｒｐｍでマイクロフユージにおいて遠心 分離により小球状にされ、上澄液のフランクジョンが収集される。ビーズはＴＢ Ｓ／Ｔｖｅｅｎバッファー（ＰＡＲＭ８８）で５回洗浄されるが、一度洗浄する たびにビーズは遠心分離によって小球状にされ、上澄液が除去される。最後にビ ーズは再び溶出バッファー（０，１Ｎ　ＨＣＩを含む、ｐＨ２，２に調整された グリシン入り１．　Ｏｓｇ／＋ｌのＢＳＡ　）中にとどめられ、室温における５ 分間の培養のあと、ビーズは遠心分離により小球状される。上澄液は除去され、 ｐＨ８，０の１．ＯＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩバッファーを加えて中性化される。
ファージサンプルのアリクオツドは、シュライヒャー及びシュエルにューハンプ シャー州のキーン社）のフィルタレ−ジョン・ミニフォールドを用いてナイトラ ン膜に付けられた。ファージＤＮＡは、８０℃で２時間加熱することにより、ナ イトラン上で固定された。加熱されたフィルターは、プレウォッシュ溶液（ＭＡ ＮＩ８２）とプレハイブリダイゼーション溶液（ペンシルバニア州、ウェストチ ェスターの５プライム−３プライム社）で、４２℃で１時間培養された。ＭＫＲ Ｆからの１．０にｂ　ＮａｒＩ（ベース１６３０）／　Ｘｍｎ１（ベース２８４ ６）ＤＮＡフラグメントは、３２Ｐ−ｄＣＴＰにより、オリゴラベリング・キッ トにュージャージー州、ビスキャットアウェイ、ファーマノア社）を用いて放射 線的に分類された。放射線探子は／＼イブリダイゼーション溶液（５プライム− ３プライム社）のナイトラン・フィルターに加えられ、−晩４２℃で培養した後 、フィルターは洗浄され自動的にレントゲンにかけられる。
この類似性選択システムの効率は、ドツト・プロット方法により量的に決められ る。麓に−ＢＰＴＩファージ処理無水トリプシンを溶出バッファーにさらすと、 結合ｔＫ−ＢＰＴＩファージがリリースされる。ストレプタビジン・ビーズはフ ァージＭＫ−ＢＰＴＩを保持しない。無水トリプレ・ビーズはファージＭＫを保 持しない。
表１１５にある実験で、我々は全ＭＷ−ＢＰＴＩファージの２０％が５ｕｌの固 定無水トリプシンに結合しており、ビーズを溶出バッファー（ｐ　Ｈ２，２ＨＣ Ｉ、′グリシン）で洗浄することにより復帰できると予測している１、同じ条件 のもとでは、結合し、さらにストレプタビジン・ヒースから復帰するＭＷ−ＢＰ Ｔｒファージは探知されたことがない。溶出フラクションにおいて復帰されたＭ Ｗ−ＢＰＴＩファージは、ファージに加えられた固定無水トリプシンの量に比例 するっ固定無水トリプシン又はスｔ・レプタビジン・ビーズに結合していた探知 可能ＭＫフ７−ンはなく、溶出バッファーによって復帰されたファージもなかっ た。これらのデータは、上述の類似性選択システムが、特定のフォールト・タン パク質（この場合はＢＰＴ　Ｉ　）を顕示するファージを選ぶのに用いられ得る ことを示している。アンフォールデッド又は不完全なりＰＴＩドメインは無水ト リプシンに結合しないとされている。
反ＢＰＴＩ抗体による類似性選択 ＭＫ−ＢＰＴＩ及びＭＫファージは、１．　Ｏｉ＋ｇ／　ｍｌ　ＢＳ入を含むト リス・バッファー・サリーン溶液（ＰＡＲＭ８８）において１ｍｌあたり１−１ ０１０パーテイカルの濃度まで薄められる。二つの１０８ファージが、　ｂｉｏ ｔｉｎｙｌａｔｅｄウサギのＴＢＳ／ＢＳＡにおける反ＢＰＴＩ　ＩｇＧ又はｂ ｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄウサギのＴＢＳ、／ＢＳＡにおける反マウス抗体１ｇＧ （／グマ）の２．５ｐｇに加えられ、−晩４℃で培養される。ストレブタビジン ・アガロース（シグマ）５０％のスリターは、ＴＢＳバッファーとともに６０分 間室温で培養する前にＴＢＳバッファーの３Ｑｗ＋ｇｍｌのＢＳＡとともに３回 洗浄されるが、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファ　（ＰＡＲＭ８８）で３回洗浄され 、最終的なこのバッファーの５０％の濃度において再度とどめられる。７７−シ とバイオティニレ−チットＩｇＧを含むサンプルは、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッフ ァーにおいて、ストレプタビジン・アガロースを加える前にＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ バッファーにより薄められる９、６０分間の室温培養に続き、ストレプタビジン ・アガロース・ビーズは３０秒間の遠心分離によって小球状にされ、上澄液のフ ラクションが集められた。ビーズはＴＢＳ／Ｔｖｅｅｎバッファーで５回洗浄さ れるが、一度洗浄するたびにビーズは遠心分離によって小球状にされ、上澄液が 除去される。最後にストレプタビジンーアガローズ・ビーズは再び溶出バッファ ー（０，１Ｎ　ＨＣＩを含む、ｐＨ２，２に調整されたグリシン入り１．Ｑｍｇ ／ｍｌのＢＳＡ　）中にとどめられ、室温における５分間の培養のあと、ビーズ は遠心分離により小球状にされる。上澄液は除去され、ｐＨ８，０のｌ、ＱＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩバッファーを加えて中性化される。
ファージサンプルのアリクオツドは、シュライヒヤー及ヒシュエルにューハンプ シャー州のキーン社）のフィルタレ−ジョン・ミニフォールトを用いてナイトラ ン膜に付けられた。ファージＤＮＡは、８０℃で２時間加熱することにより、ナ イトラン上で固定された。フィルターは、４２℃のプレウォッシュ溶液（ＭＡＮ Ｉ８２）で６０分間洗浄され、４２℃で６０分間、サザン・プレハイブリダイゼ ーション溶液（５プライム−３プライム社）の中で培養される。ＭＫＲＦからの １．ＯＫｂ　Ｎａｒｄ（ベース１６３０）／　Ｘｍｎ　Ｉ　（ベース２６４６） ＤＮＡフラグメントは、３２ｐ−ｄＣＴＰにより、オリボラへリング・キットに ューシャーシー州、ビスキャットアウェイ、ファーマシア社）を用イて放射線的 に分類された。ナイトラン膜は、４２℃でプレ・ハイブリダイゼーション溶液か らサザン・ハイブリダイゼーション溶液（５プライム−３プライム社）に移され る。放射線探子はハイブリダイゼーション溶液に加えられ、−晩４２℃で培養し たあと、フィルターは、室温で２ＸＳＳＣ，Ｑ、１％ＳＤＳ、　６５℃で２ＸＳ ＳＣ，Ｑ。
１％ＳＤＳで９合計３回洗浄される。ナイトラン膜は自動的レントゲンに左右さ れる。類似性選択システムの効率は、ドツト・プロット方法により量的に決めら れる。ＡＩ及びＢｌ又はＣＩ及びＤｉの比較は、ファージの大半がストレプタビ ジンーアグローズ・ビーズに粘着しなかったことを示している。ＴＢＳ／Ｔｗｅ ｅｎバッファーによる洗浄により、非特定的にストレプタビジン・ビーズに結合 していたファージの大半が取り除かれる。ストレプタビジン・ビーズを溶出バッ ファーにさらすと、既にバイオティニレ−テッド・ラビット反ＢＰＴＩ　ＩｇＧ によって培養されたＭＫ−ＢＰＴＩファージの場合のみ結合ファージをリリース する。このデータは、上述の類似性選択システムが、特定の抗原を顕示するファ ージ（この場合はＢＰＴＩ）の選択に用いられ得ることを示している。我々は以 下の計算に基づいて、少な（とも４０倍の価値を高める要因を予測している。
１１に−ＢＰＴＩファージが復帰されたパーセンテージ価値を高める要因＝ 復帰された完全なＭＫファージ 例ＩＩＩ ＢＰＴ　Ｉ　■境界拡張 ＢＰＴＩと成熟ｇｖｍｐのフレキシビキテイを増すため、我々は、これらのドメ インの間にペプチド拡張のためコドンを導入した。
融合タンパク質インターフェースにブロック拡張を加える。
Ｍ１３遺伝子■生成物は「スタークのような」領域を含む。これは電子顕微鏡に よりバクテリアの具象により示されたとおりである。（ＬＯＰＥ８５）　このタ ンパク質の予測されたアミノ酸配列は、次のような繰り返しのモチーフを含む。
ｇｌｕ、　ｇｌｙ、　ｇｌｙ、　ｇｌｙ、　５ｅｒ（ＥＧＧＧＳ）７回ｇｌｙ、 　ｇｌｙ、　ｇｌｙ、　５ｅｔ（ＧＧＧＳ）３回ｇｌｕ、　ｇｌｙ、　ｇｌｙ、 　ｇｌｙ、　ｔｈｒ（ＥＧＧＧＴ）１回。
このセクションの目的は、ドメインのインターフェースにおいて、■遺伝子生成 物に見られる連続モチーフを反映するマルチプルユニット拡張を挿入することで ある。
二つの合成オリゴヌクレオチドが合成された。我々はこれらのコドンの３番目の ベースを選び、オリゴヌクレオチドの反対方向へのトランスレーションがＳＥＲ を生じるようにした。合成オリゴヌクレオチドは焼き付けると次のユニットデュ プレツクス配列となる（　ＥＧＧＳリンカ−） ＥＧＧＧＳ ５’Ｃ，ＧＡＧ、ＧＧＡ、ＧＧＡ、ＧＧＡ、ＴＣ３″３’　ＴＣ，ＣＣＴ、ＣＣ Ｔ、ＣＣＴ、ＡＧＧ、Ｃ５“（Ｌ）（Ｓ）（Ｓ）（Ｓ）（Ｇ） デュプレックスでは共通する二つのベース・ペア５゛力＜１ノンカーの両端に下 がって（ＧＣ）おり、マルチプルユニットの結紮と、ユニークなＮａｒｌ認識配 列にクローンしてｏｃｖのＭＩ３ＭＢ４８及びＧｅｍＭＢ４２内に存在できる機 能を持たせる。このサイトはインターフェースをコードするＤＮＡの１個のコド ンの中に位置付けられている。
ＥＧＧＳリンカ−（またはマルチプルリンカ−）おベクテルＮｏｒｌサイトにク ローニングすると、この認識配列が壊れる。ＥＧＧＳリンカ−を逆向きに挿入す ると、Ｇ５５ＳＬを融合タンパク質に挿入することにつながる。
表１１３におけるＥＧＧＳリンカ−１個の遺伝子のＭＡＲＥサイトへの追加は以 下の遺伝子につながる。
７９８０８０ａ　８０ｂ　８０ｃ　８０ｄ　８０ｅ　８１８２８３８４ＧＧＥＧ ＧＧ　５ＡＡＥＧ ＧＧＴ、ＧＧＣ，ＧＡＧ、ＧＧＡ、ＧＧＡ、ＧＧＡ、丁ＣＣ，ＧＣＣ，ＧＣＴ、 ＧＡＡ、ＧＧＴＯＣｖに挿入されるリンカ−の方向に対するプリセレクションは なく、どちらの方向のマルチプルリンカ−（予期されたＥＧＧＧＳ又はＧ５５Ｓ Ｌアミノ酸配列）あるいは方向の混在（ＤＮＡの逆連続）は起こり得る。
ますます増大しているマルチプルリンカ−のはしごが、異なった愈の５　フォス フォリレーテッド及び非フオスフオリレーレツド・エンドを含む初めのオリゴヌ クレオチドを焼き付け、結紮することによって確立される。フォスフォリＩ／− デッド及び非フォスフォリレーレッド・エンドを含むオリゴヌクレオチドの混合 を用いるとマルチプルリンカ−形成の範囲にコントロール要素がもたらされる。
挿入要素のサイズの範囲を示すはしごがアガローズジエル電気永動の１５ｂｐ（ １ユニツト・デュプレックス５のアミノ酸）から６００ヘ一スペア以上（結紮さ れた２００個のアミノ酸リンカ−４０個）のスパニングにより容易に探知される 。
大きい逆連続は遺伝子的不安定性につながる。従って我々は、ＯＣＶへの結紮前 に、マルチプルリンカ−を制限酵素Ａｃｃ　Ｉ［Ｉ又はｘｈｏｌにより消化する ことによってそれらを除去することを選んだ。
リンカ−は「頭同志」又はＵ終わり同志」結紮されるとこれらの認識配列を生じ るからである。このような消化はマルチプルリンカ−のサイズの範囲を大きく減 らし、１個空８個のリンカ−・ユニット（５個空４０個のアミノ酸が５つのステ ップ）が存在することになる。これはアガローズ・ジェル電気永動で査定された ものである。
リンカ−は、標準手法により、Ｍａｒ１分割されたＯＣｖ又はＧｅａ＋ＭＢ４２ に結紮される（異なる挿入サイズのプール又はシェル純化された目立たないフラ グメントとして）。結紮に続いて、制限酵素Ｎａｒｌが加えられ、自動結紮開始 ＯＣｖを除去する（リンカ−挿入はＮａｒｌ認識配列を壊すため）。この混合物 はＸＬ−１ブルー細胞を変形しブラック（０（Ｊ　Ｍ１３ＭＢ４８）又は抗アン ピシリン・コロニー（ＯＣＶ　ＧｅＩＩＭＢ４２）に適切にプレートされるよう にする。
変形要素は、二つの３２Ｐ分析されたオリゴヌクレオチド探子のうちの一つによ り、ドツト・プロットＤＮＡ分析を用いてスクリーニングされる。一つの探子は ＤＮＡがＢＰＴＩのＰ１ループコーディングするのを補助する配列から成り、も う一つの探子はドメイン。インターフェース領域をコートするＤＮＡを補助する 配列から成る。適切なリンカ−候補は最初の探子にポジティブに反応し、２番目 の探子にはネガティブに反応するか、またはあまり反応しない。ブラック純化ク ローンは、結合分析及びＢＰＴＩ顕示のためファージストックを生成するのに使 われ、ファージ感染細胞から派生したＲｆＤ　Ｎ　Ａは制限酵素分析及び配列の ために使われる。分析された選択クローンの代表的挿入配列は次のとおりである １、 Ｍ１３　、３Ｘ４　（ＧＧＩ　Ｃ，ＧＧＡ、ＴＣＣ，ＴＣＣ，ＴＣＣ，ＣＴ　（ Ｃ，ＧＣＣ）ｇｌｙ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｌｅｕＭＬ３．３Ｘ７　（Ｇ　 Ｃ，ＧＡＧ、ＧＧＡ、ＧＧＡ、ＧＧＡ、ＴＣ（Ｃ，ＧＣＣ）ｇｌｕ　ｇｌｙ　ｇ ｌｙ　ｇｌｙ　ｓｅｒＭ１３　、３Ｘ’　ｌ　（ＧＧ）　Ｃ、ＧＡＧ、　ＧＧＡ 、ＧＧＡ、ＧＧＡ、ＴＣＣ、ＧＧＡ、ＴＣＣ，ＴＣＣ。
ｇｌｕ　ｇｌｙ　ｇｌｙ　ｇｌｙ　ｓｅｒ　ｇｌｙ　ｓｅｒ　ｓｅｒこれらの非 常フレキンプルなオリゴメトリック・リンカ−は、結合ドメインのファージ表面 上顕示を可能にするために結合ドメインをフィラメンタス・ファージの主なコー ト・タンパク質（遺伝子■）につなぐ」二で役立つと信じられている。これらは さらに他の遺伝子パッケージ用のキメラＯ３Ｐの構築にも役立つ可能性がある。
インタードメイン拡張融合タンパク質のファージへの統合ＢＰＴＩ　コートタン パク質インタフェースにおいて多様化されたペンタペプチドの拡張はＳＥＰ細胞 を感染させるのに使われる。
前セクションで述べた基準を用いて、我々は、拡張融合タンパク質がファージに 統合されることがわかった。生成されたファージのジェル電気永動とそれに続い て反ＢＰＴＩウサギ細胞を銀着色又はウェスタン分析すると、融合タンパク質が 開始融合タンパク質に似ているが、多少遅い速度で移動することがわかった。
ドメイン・インターフェースのＥＧＧＧＳリンカ−拡張に関しては、５個のアミ ノ酸ユニット拡張を含むと予測されている個別のファージストックも同様の方法 で分析される。拡張融合タンパク質の移動は、ウェスタン分析と銀着色によって 見ると、親融合タンパク質から容易に区別できる。
より詳しく分析されるクローンにや次が含まれる。Ｍｌ３．３Ｘ４（予測された アミノ酸配列Ｇ５５ＳＬのある単−逆ＥＧＧＳリンカ−を含む）、Ｍｌ：１３Ｘ ７（予測されたアミノ酸配列ＥＧＧＳのある正しい向きのリンカ−を含む）、Ｍ ｌ３．３Ｘｌ　ｌ　（ＥＧＧＧＳＧＳＳＳＬＧＳＳＬ（７）　拡張（７）　ｔニ ー　？ｈ、逆及び予測されたアミノ酸配列ＥＧＧＧＳのあるリンカ−３つを含む ）、及びＭｌ３．３Ｘｄで少なくとも５個のリンカ−又は２５個のアミノ酸から 成る拡張を含むものである。
拡張された融合タンパク質は、すべて高いレベルで（ファージ１つにつき平均何 十もの複製が存在した）ファージに統合され、ジェル電気永動により分析表れる と、移動レートは予測される拡張サイズと一致する。旧３．３Ｘ４とＭｌ３．３ Ｘ７のクローンは、親融合タンパク質と類似しているが異なる位置で移動した。
一方旧３．３Ｘ１１及ヒＭ１３．３Ｘｄハかなり大きかった。
例■　ペプチド・ファージ 以下の物質及び手法は以下の例で使われる。
１、ペプチド・ファージ 推定上の二硫化結合タンパク質ＨＰＱ６はＭ１３ファージに遺伝子■タンパク質 （Ｇｆ　ｔｉｐ）への挿入物質として顕示される。Ｍｌ３はピリオン１１個につ きｇｍｐの複製を５個持つ。ファージは標準方法で構集された。肝Ｑ６にはデブ リンのストレプタビジン結合Ｅペプチドの配列ＣＨＰＱＦＰＩ？Ｃの特長及びＦ ＩＸ２認識サイドが含まれる。
（表８２０参照）。
ストレプタビジンと全く類似性のない無関係の顕示ファージがコントロール要素 として使われる。
２、ストレプタビジン アガローズビーズに固定されたものが市販されている。（ピアス社）１■１のジ ェルあたりｌがら２ｍｇの濃度で６％ビーデッド・アガロースに固定されたスト レプタビジン（ＳｔｒＡｖ）は５０％スラリーとして与えられている。フリータ ンパク質として市販されているもの（ピアス社）はｌａｇ辺り１４．６ユニツト の特定の働きをする（ｌユニットはｌａｇのバイオチンを結合する）。ＰＢＳに おけるｌクリスタル状のものが市販されている（ポーリンガ−・マンハイム社） 。４■闇のストック溶液が作られる。
４、マイクロティター・ウェルプレートのストレプタビジン・コーティング イミュロン（＃２又は＃４）ストリップ又はプレートが使われる。
５ｔｒＡｖストックｔｏｏ＊ｔ、が２５０μＬずつのキャパシティ・ウェルに加 えられ、−晩４℃で培養される。ストックは１■１あたり１ｍｇの濃度において ＢＳＡを含む２５ｈＬのＰＢＳと置換され、４℃で更に１時間培養される。ファ ージ結合実験に用いられる前に、ウェルは０゜１％丁ｗｅｅｎを含むＰＢＳ２５ ｈＬで急激に５回洗浄される。
５、結合実験 小球実験 結合実験の直前に１０から２ｈＬのＳｔｒＡｖ小球スラリー（５から１０メＬ小 球量）が結合バッファー（１ｍｌあたりｌｌ１ｇの濃度のＢＳＡを含むＴＢＳ） によって３回洗浄される。コントロール要素又はペプチド顕示ファージを含む５ ０から１ＯｈＬの結合バッファー（合計１０８から１０１１のブラック形成ユニ ット−ｐｆｕ　ｓ）が各マイクロチューブに加えられる。結合はエンドオーバー ・エンドローチーターを使って室温で１時間行うことができる。ビーズは少しだ け遠心分離され、上澄液が除かれる。ビーズは、０，１％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢ Ｓ　１ａＬで５回洗浄される。各洗浄は５分間の培養と少量の遠心分離から成る 。最後に結合ファージは５ｔｒＡｖビーズから１０分間の培養により溶出される 。（ｂ＋＋ｌにつき１１ｇのＢＳＡを含むｐＨ２のクエン１１２／＜ッファーに よって行われる）　ＢＳＡはこの後ｐＨ８の１Ｍトリス２６ｈＬによって中性化 される。各段階に存在するファージの数は、ブラック形成ユニットがＥ、Ｃｏ１ １を含むＦｏのローン内の適切なディル−ジョン及びブレーティングに続くこと によって決まる。
プレート実験 各５ｔｒＡｖコートされたウェルに対し既知量のファージ（１０８から１０１１ のｐｆｕ　ｓ）を含む１００ＩＬの結合バｙ　７　ｙ−（１ｍｌにつきｌ＋ｏｇ のＢＳＡを含むＰＢＳ）が加えられる。培養は１時間室温にて行われ、その後非 結合ファージの除去と０．１％ＴｗｅｅｎのＰＢＳによる１０回の急激な洗浄が 続く。結合ファージはＩｔあたり１ｍｇのＢＳＡを含む、ｐＨ２の２５０μＬの クエン酸バッファーにより溶出され、６０メＬの１ＭトリスｐＨ８により中性化 される。各段階に存在するファージの数は、ブラック形成ユニットがＥ、Ｃｏ１ １を含むＦｏのローン内の適切なディル−ジョン及びブレーティングに続くこと によって決まる。
例Ｖ ストレプタビジン・アガロースに結合する顕示ファージのジシオトレイトール（ ＤＴＴ）の効果 前段階的コントロールの実験 ａ、ＨＲＰ可変バイオチン及びストレプタビジン・ビーズの使用 ５ｔｒＡｖアゲローズ・ビーズのＨＲＰ可変バイオチンへの結合能力は、５ｔＬ のビーズにっき〜１　ｘＧ（〜２５０ｐｏｏｌバイオチンに相当）とされている 。（これらの実験に使われる分量）ｂ、ＤＤＴの５ｔｒＡｖビーズに統合するＨ ＲＰ可変バイオチンに対する効果 ５ａＬの５ｔｒＡｖビーズは結合バｙ　７７−　（ＴＢＳ−ＢＳＡ）におけるｌ ＯｎｇのｆｌＲＰバイオチンとともにＤＴＴの変化量（少なくとも９９％は低減 された）があるところを培養される。室温で１５分間培養した後、ビーズは結合 バッファーとＨＩＩＰ物質を加えた溶液中で２回洗浄された。色を生じさせるこ ともでき、量的方法で検討された。
表８２７は、バイオティニレートしたホースラディツシュ・パーオフサイト（Ｈ ＲＰ）が２ｈＭ以下の濃度のＤＤＴではそれほど影響を受けないことを示してい る。２０から５ｈＭのＤＴＴ溶液もまたＨＩＩＰと５ｔｒＡｖビーズがない時の 基質との相互作用を抑制したので、全般的にこのシステムにおいてマイナスの効 果が生じた。
＋ＩＰＱＢ顕示ファージの感染力に対するＤＴＴの効果１１ＰＱ６の１０８ｐｆ ｕｓがＤＴＴの異なった濃度の溶液がある中で結合バッファー（ＴＢＳ−ＢＳＡ ）に加えられた。室温で１時間培養された後、薄められプレートされてｐｆｕｓ としての滴値がめられた。表８２８はＨＰＱ６顕示ファージの感染力に対するＤ ＴＴの効果を示す。
従ってＤＴＴは、この範囲の濃度においてはファージの感染力に効果を及ぼさな いか、又はファージを薄める時に効果が逆になってしまったかのどちらかである 。これらのコントロール要因の実験から、ＤＴＴは５ｔｒＡｖに結合するペプチ ド顕示ファージにおける媒体を減らす効果に関する研究において１０ｗＭ以下の 濃度で用いることができることは明らかである。
表８２９は、ファージＨＰＱ６とＭＫＴＮの５ｔｒＡｖビーズに対する結合への ＤＴＴへのもっとも顕著な効果は、ＤＴＴが０．１及び１．０ｍ１ｌの間に生じ た。この濃度では、前段階コントロール実験においてはマイナスの効果が観察さ れなかった。これらの結果は、Ｉ（ＰＱ６顕示ファージの場合、ＤＴＴは５ｔｒ Ａｖに対する結合に大きな効果を持ち、顕示ペプチド内の二硫化物ブリッジが優 れた結合にとって必要になる、ということを強く示している。
例■ 要因Ｘａ分割によるストレプタビジン結合顕示ファージのリリース ファージＨＰＱ６はポバインＦＸ２認識サイトを持つ（Ｙ’１ＥＧＲ／ＥＶ）多 くの場合、ＩＥＧＲはＦＸ３にとって十分な認識サイトだが、我々はこのサイト を各方面に拡張し、効率的な分割を実現するようにした。５ｔｒＡｖビーズ上に 結合スルタメ、ＨＰＱ６ファージをＦＸ２とともに予め培養することが表８３２ に示されている。従って、ＦＸ３（２，５ユニツト）のこの濃度が、処理された 顕示ファージの滴僅に目立った効果を表さなかったものの、５ｔｒＡｖに結合す る処理顕示ファージの能力には非常に大きな効果がある。これはＦＸ３認識及び 分割する働きにより除去される５ｔｒＡｖ認識配列認識数する。
表８３３は５ｔｒＡｖに結合したあとのＨＰＱ５のＦＸ３処理の効果を示す。タ ーゲットに結合した顕示ファージをｐＨまたはカオトロピック媒体による溶出に 代わり、ＦＸ３を用いて除去できるが？１（ＰＡ６顕示ファージはＳｔｒ＾Ｖに 結合することができ、更に、ＦＸ３バッファー又は２．５ユニツトのＦＸ３があ る同じバッファーにおいて３時間培養される。溶出量はｐＨ２溶出によって判断 されるが、ファージ結合の合計数と比較される。従って顕示ファージがバッファ ーのみからゆっ（りと除去される一方、ＦＸ３の存在はこのレートでかなり太き （なる。
ＦＸ３による、５ｔｒＡｖからのＨＰＱ６顕示ファージの除去は、培養時に加え られた酵素の機能としても研究されている。これは表８３４に示されている。酵 素のより高い濃度におけるＮ、Ｂ。
（１時間１．２Ｕ又は２時間２−５１１）、処理済みファージの感染力喪失はｐ ｆｕｓにより測定とされている。
表１Ｏ゛多様なりｇコドンから得られた豊富性Ａ、最大化され７”、：　ｆ　ｘ 　Ｓ　ニアトン、［Ｄ］＋［Ｅ］　−［１］＋［Ｒ］　ニョリｔｒｌＪ約１　ｌ 　、２６　．１８　．２６　．３０　ｆ２　ｌ　、２２　．１６　．４０　．２ ２　ｘ３１．５　．０　．０　．５　Ｓ Ａ　４．８０ｇｔＣ２，８６％− Ｄ　６．ＯＯ＆　Ｅ　６．ＯＯ＆ Ｆ　２．８６ｔ　Ｇ　６．６０ｔ Ｈ３、ｇｏｔ　工　２．ＢＧ％ Ｋ　５．２０ｔ　Ｌ　６．８２１ Ｍ　２．ＢＧ”ｔ　Ｎ　５．２０９ｋ Ｐ　２．８８を　。　３．６０＆ １　６．８２智　。
７　４．１６’ｔ　Ｖ　６．６０ｔ Ｗ　、ｔ　Ｍ　５．２０を 、を ［Ｄ］　＋　［Ｅ］　ｍ　［Ｋ］　＋　［Ｒ］　−，１２比率−Ａｂｕｎ（Ｗ） ／Ａｂｕｎ（Ｓ）　−０，４０７４１２，４５４，４０７４−９４８０ ２５，０２５，１６６０，８９８７ ３１４，７８８，０６７６，８５２０ ４３６，２９Ｂ　、０２７５　．８０７７５　８９．０９５　．０１工２　−７ ６５７６　２１８．７　４．５７・コＯ−”　、７２５８７　５３６．８　１８ ６・１０”　、６８８１表１０．多様なりｇコドンから得られた豊富性（続）Ｂ 、非制約、最大化 １　ｌ　、２７　、ｉ９　．２７　．２７２　ｌ　−２１，１５，４３，２１ Ａ　４．０５ｇｔＣ２，８４％ Ｄ　５．８１ｆ　Ｅ　５．８１を Ｆ　２．８４ｔ　Ｇ　５．６７１ｋ Ｈ４，０Ｂ警　工　２．８４１ に　５．８１を　Ｌ　６．８３ｇｋ Ｍ　２Ｊ４を　Ｎ　５．８：Ｌ％ ｐ２・８５を　Ｑ　４．０８を Ｒ６，８３を Ｔ　４．Ｏ５ｇｋＶ　５．６７に ＠　２．１　Ｙ　５．８４を ［Ｄ］　＋　［Ｅ］　＝　Ｏ，１１６２［Ｋ］　＋　［Ｒ］園。、１；６；４比 率−Ａｂｕｎ（Ｗｌ／Ａｂｕｎ（ｓｌ　−０，４１１７６１２Ａ２ＢＧ　、４１ １７６　．９４１９２　５．８９８１　．１ｇ９５５　．８８７２３　１４．３ ２４１　．０６９８１　．８３５６４　３４．７８７５　．０２８７５　．７８ ７１５　８４．４８４９　．０１１８３６　．７４１３５Ｇ　２０５．１８０　 、ＱＯ４Ｂ７４　．６９８２８表１０・多様なりｇコドンから得られた豊富性（ 続）Ｃ０最大化されたＮＮＴ １　ｌ　、２０７１　．２９２９　．２０７１　．２９２９２　ｌ　、２９２９ 　．２０’ｎ　、２９２９　．２０７Ｌ３１Ｌ　、０　．０　．０ アミノ駿　豊富性　アミノ酸　豊富性 Ａ　６．０６な り　８．５８ｋ　Ｅ　ｎｏｎｅ Ｆ　Ｇ、ＯＧを　Ｇ　Ｇ、０６を Ｈ８−５８智　工　６．０６を Ｋ　ｎｏｎｅ　Ｌ　８．５８Ｎ Ｍ　ｎｏｎ＝　Ｎ　ｆｓ、０６＆ Ｐ　６　、０６’＜　Ｑ　ｎｏｎｅ Ｒ６，０６ｇｔ　。
４２１１　ｖ　８．５８を Ｗ　ｎｏｎｅ　Ｙ　６．０６Ｎ ｉ　五ｊ　ｌｊ　ストップ・フリー ４　１６．０　．０６２５　：Ｌ。
５　３２・０　．０３１２Ｓ　Ｃ ６６４，０，０１５６２５１＋ ７　１．２Ｂ、０　．００７８４２５　１゜表１０：多様なりｇコドンから得ら れた豊富性（続）１　ｌ　、２３　．２１　．２３　．３３２　１　．２１５　 −２８５　．２８５　．２１５３　１　．０　．０　．０　１．０ アミノ酸　豊富性　アミノ酸　豊富性 Ａ　９．４０＆　ＣＩ！ｏｎｅ Ｄ　ｎｏｎｅ　Ｅ　９．４０ｋ Ｆ　ｎｏｎｅ　Ｇ　７．１０ｋ Ｒｎｏｎｅ　工　ｎｏｎｅ に　６．６０を Ｍ　４　、９０　ｋ　Ｎ　ｎｏｎｅ Ｐ　６．００を　Ｑ　６．００智 Ｒ９，５０＆　５　６．６０１ ’Ｊ’　Ｇ、Ｇ　＆　Ｖ　７−Ｌｏｔ Ｗ　Ｙ　ｎｏｎｅ ｉ　二ｊ　上族！ヨＰ　ストップ・フリー１　１９３Ｂ８　．５１５７９　０． ９３４２　３．７５８８　．２６６０４　０．８７２３３　７．２Ｂ７６　．１ ３７２２　０．８１４８４　１４．１２８９　．０７０７８　０．７６１０５　 ２７．３９２９　３．６５・１０“２０．７：ＬＯ８Ｇ　５３．１０９　：Ｌ、 ８８・１．０”　０．６６３９７　１０２．９６　９．７２・１０′’　０．６ ２００表１０．最大化されたｖｇコドンから得られた豊富性（続）Ｅ、最大化さ れたＮＮＳ　（ＮＨＫは類似した分布を示す）アミノ酸　豊富性　アミノ酸　豊 富性 Ａ　６．２５ル　Ｃ３，１２５ｋ Ｄ　３．１２５智　Ｅ　３．１２５を ？　３．：Ｌ２５を　Ｇ　６．２５智 Ｈ３，１２５％　工　３．１２５を Ｋ　３．１２５を　Ｌ　９．３７５ｔ Ｍ　３．１２５七　Ｎ　３．１２５ｋ Ｐ　６．２５ｔ　Ｑ　３．１．２５ｋ Ｒ’９．３７５を　Ｓ　９．３７５暫 Ｔ　６．２５ｔ　Ｖ　６．２５＆ Ｗ　３．１２５ｔ　Ｙ　３．１２５１ ＳセＯｐ　３．１２５を ユ　Ｌば」ζ１ユ】　Ｌ？ＬｌＪ　ストップ・フリー１、　３．０　．３３３３ ３　．９６８７５２　９．０　．１ｍ１１１　．９３８５３　２７．０　．０３ ７０４　．９０９１．５４　８１．０　．０１２３４５ｇ７　．８８０７５　２ ４３．０　．００４１１５２　Ｊ５３２６　７２９．０　１３７・１０“”　、 ８２ＳＳ５７　２１、Ｅｉ７．０　４．５７・１０’　、８００７表１０２ｂ： ５ａｌＩリンカー挿入後の注釈遺伝子配列番号 〆正Ｍポリリンカーより −３５貝に更径　−１０ Ｗ　ΔＧΔＣＣヒセａＣＴ−７７ ｆ；、ＩＨＸ　Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　ｓｅｑ。
ｌｔＭｌｘｌｘｌｓ　１　ｒ、１ｖｌｂｌｘｌｘｌｓｌｌ　１　ｌ　２　ｌ　３ １４　ｌｓｌ　６　ｌ　７　ｌｓｌ　９　ｌ　１ｏｌｌＡＴＧｌＡＡＧＩＡＡＡ ｌＴＣＴｌＣＴＧｌＧＴｒｌＣＴＴｌＡＡＧＩＧＣＴｌＡＧＣｌ−１０７骨愉 ＩＶＩＡＩＶＩＡＩＴＩＬＩＶＩＰＩＭＩＬ＋１１ｘｌ　１２１１３１１４１１ ｓｌ　１６１１７１１８１１９１２０＋１ＧＴｒｌＧｃＴｌｃ；Ｔｃ１Ｇｃａｌ ｘｃｃｌＣＴＧＩＧＴｘｌｃＣＴｌｘｚｌ慢℃ｌ−１３７Ｌ上ａ≦は　、ＬＦＬ ニー ｌ５ＩＦＩＡＩ：（ＩＰＩＤＩＦＩｃＩＬＩＥ＋ｌ　２１１２２＋　２３１２４ １２５１２６１２７１２８１２９１３０１１　ＴＣＣｌ　ＴＴＣｌ　ＧＣＴ　Ｉ 　ＣＧＴ　Ｉ　ＣＣＧ　ｌ　ＧＡＴ　ｌ　ＴＴ’Ｃｊ　ＴＧＴ　Ｉ　ＣＴＣＩ　 Ｇ芯１−　１６−。
ＩＰＩＰＩＹＩＴＩＧＩＰＩＣＩＫＩＡＩＮｌ　３１１３２１３３１３４１３５ １３６１３７１３８１３９１４０にＪＪＩエーユ 表１０２ｂ：５ａｌＩリンカー挿入後の注釈遺伝子配列（続）１工１工ＩＲＩＹ ＩＦＩＹＩＮＩＡＩＫＩＡＩＩＧＩＬＩＣＩＱＩＴＩＦＩＩＹＩＧＩＧ＋ｌ　ｂ ｌｌ　５２＋　５３１５４１５５１５６１５７１５８１５９１６０１ｘｌＧｃｃ ｌＣＴＧｌＴＧｃｊｃＡｃｌＡｃｃｌｒｒｒｌＧｒＡＩＴｘｃｌａＧＴｌｃａｒ ｌ−２５７１ｃＩＲＩＡＩｉＲＩＮＩＮＩＦＩＫ＋１６１１６２１６３ｉ　６４ １６５１６；６１６７１６８１６９１１　ＴＧＣＩ　ＣＧＴ　ｌ　ＧＣＴ　ｊ　 ＡＡＧ　ｊ　ＣＧＴ　ｌ　ＡＡＣＩ　ＡＡＣｌ　＋ｒＴｒ　ｌ　ＡＡＡ　ｌ　− ２８４Ｌ１匹」ニス ＩＳＩＡＩＥＩＤＩＣＩＭＩＩＴＩＣＩＧ＋＋　７０１７１１７２１７３１７４ １７５＋　７６１７７１７８１７９１１ＴＣＧＩＧＣＣＩＧＭＩＧＡＴＩＴＧＣ ＩＡＴＧＩＣＧＴＩＡＣＣＩＴＧＣＩＧＧＴＩ−３１４Ｄ二■二Ｌ　Ｌ五曲二は ＢＰＴＩ／Ｍ１３境界 、Ｉ ＩＧＩＡＩＡＩＥＩＧＩＤＩＤＩＰＩＡＩＫＩＡＩＡＩｌ　ｓｏｌ　ｓｌｌ　８ ２１８３１１３４１８５１８６１８７１　ａａｌ　８９＋　９０１９１１１ＧＧ Ｃ１Ｇｃｅ　ＩＧｃＴ　ＩＧＡＡＩＧＧＴ　ＩＧＡＴＩＧＡＴ　Ｉ　ＣＣＧＩＧ ＣＣＩＡＡＧ　ＩＧｃＧ　１ａｃｅ　ｌ　−３５０１ＦＩＮＩＳｉＬＩＱＩＡＩ ＳＩＡＩ’ｒ１１　９２１　９３１　９４ｉ　９５１　９６１　９７１　９８＋ 　タ９１１ｏｏ　ｌｌｒｒｃ１ＭＴｌｒＣＴＩＣＴｃｌＣＡＡｌｃＣＴｌτ＞１ ＧｃｒｊＡ＝ｊ　−３７７」山−≦Ｌ ＩＥＩＹＩＩＩＧＩＹＩＡＩＷｌ １１０１１１０２１１０３ｊ１０４１１０５１１０ｇｌ１０７１１　（ａＧ　ｌ 　ＴＡＴ　Ｉ　ＡＴＩ’　ｌ　ＧＧＴ　Ｉ　ＴＡＣｌ　ＧＣＧ　Ｉ　ＴＧＧ　ｌ 　−３９８ＩＡＩＭＩｖ１ｖＩＶＩＩＩＶＩＧＩＡＩｌ　１ｏｓ　ｌ　１ｏ９１ 　ｎｏ　ｌ　１１１１１１２１　：ｕｓ１１１＋　ｌ　ｕｓ　ｌ　ｕ６１ＩＧＣ ＣＩＡＴＧＩＧＴＧＩＧＴＧＩＧＴＴＩＡＴＣＩＧＴＴＩＧＧＴＩＧＣＴＩ　− ４２５Ｌ」迫α」−一一二 二１２ＬＬ 表１０２ｂ：５ａｌＩリンカー挿入後の注釈遺伝子配列（統）ＩＴＩ　工ＩＧＩ 　工１ １１１７１１１ｓ　ｌ　１１９１１２ｏ　１１　ＡＣＣｌ　ＡＴＣｌ　ＧＧＧ　 ｌ　ＡＴＣｌ　−４３７ＩＫＩＬＩＦＩＫＩＫＩＦＩＴＩＳＩＫＩＡＩ１１２１ １１２２１１．２３１１２４１１２５１１２６１１２７１１２ａｌ１２９１１３ ０１ＩＡＡＡＩＣＴＧＩＴＴＣＩＭＧＩＡＡＧＩＴＩＴＩＡＣＴＩＴＣＧＩＡＡ ＧＩＧＣＧ＋−４６７ｎ虚り工３ １ｓ１．１．１．１ １１３１１１３２１Ｄ３１１３４１ １ＴＣＴＩＴＭＩＴＧＡＩＴＡＧＩ　ｑ−４８６シよＥ１工 ＡＧＴＣＴＡ　ＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡ　ＧＣＧＧＧＣＴ　ＴｒＴｒｌ’ １Ｔｒ−５２１ゑ工Ωコへ　ＧＡＣｃセｇｃａ　ＧＧＴＣＧＡＣＣｇｇｃａセ９ Ｃ−３市七−却ま 以下の酵素相当物質に注意のこと。
≧工工　ＩＩＩＩシ巴工　んエエエエ　■シ江必工工一工　舗凪匣工冴工　１エ エ　Ｍ−シルユニ闇　に　市　ｃ＞ｕ　−閾　ｄ　閾　田４ｍｍ　−１）■　Φ 　−−市　市 に−Ｉ：ｙｅ揶二■−−− ＡＪｌｆｌ＋１１＞１１１１Ｐ−１ｏ）Ｏ１＋ｌｌ０）（０′き　−ｕＱｔｗｆ ｆｌｍ−一　−〉〉〉・−１）−’＞　、−１ｋ１＋ｌＴｈ１４　に　ｋ　に　 −一＋−４−Ｉ−１闇ＱＩＥ＠國に一一一史　÷　１：　島　−ぺ　Σ　Σ　〉 〉〉ひ　閾　闇　工　ｋ　國　−−− 閣　＜　に　０　閾　Σ　Ω　切　の Σ　Ｏｚ　Ｈ、、ｓ　Ｉ４　に　に ト　Σ　ＣＱＥ−ｘ　に　に Ｋ　Σ　ＨΣ　Σ　Σ Ｎｏ　ＤＮＡ　（ｃｏｎＩ＋ｒｏＬｌ　−ｐＧＫＮ−３Ｚｆ　（−１ Ｖ闘Ｘ−圃１６ ｖ本：Ｍ−ＭＢ２０ ｐＧＥＭ−ＭＢ２＋５ 注： ａ）　ａｍｐ　（ｂ　Ｉ　ａ）遺伝子によってコード化されるプレ／ベータ・ラ クタマーゼｂ）合成遺伝子及び派生構造によりコードされるブレＢＰＴＩ／Ｖｒ ＩＩペプチドＣ）　−生成物なし　７　＋　生成物あり；即　−不明 表１０８：生体内に圧出されたシグナル：：ＢＰＴＩ：：成熟ＶＩＩＩタンパク 質種のウェスタン分析 Ａ）ストレインＸＬＩブルーにおりる圧出′　２ム１１　°− ｐＧＥＭ−３２ｆ（−１− ｐＧＦＭ−ＭＢ）−６ＶＩＩＩ ｐＧＥＭ−ＭＢ２０　ＶＸ工Ｘ　＋４−ｐＧＤ！−ＭＢ２６　ｖ工ｒｒ、　＋＋ ＋　＋／−ｐＧＤｌ−ＭＢ４２　ｐｈｏＡ、　＋＋Ｂ）ストレインＳＥＦ　にお けろ圧出 σ　ｂ　、＋ ｐＧＥＭ−ＭＢ４２　ｐｈｏＡ　＋／−◆十半注： ＋／−，，，ｎい存在 ＋、、、、、存在 ＋＋、、、、強い存在 ＋＋＋、、、非常に強い存在 表１０９：　Ｍ１３　遺伝子　ｌｌ１ １５７９　５ｌ−ＧＴ　ＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡ　ＴＴＡＴＩ’ＣＧＣＡＡ　ＴＴ ＣＣＴＴＴＡＧＴ２Ｅ！５１　ＴＡＡＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＴσｍＴＧ　ＧＧＴ ＡＴＴＣＣＧＴ表１１０１ＮａｒＩの遺伝子エエＩへの導入Ａ）ワイルドタイプ ＩＩＩ、シグナルペプチドをコードする部分Ｂ）ＩＩＩ、シグナルペプチドをＮ ａｒＩサイトでコードする部分Ｃ＋：ｑ　ユゴエｉＭ；へ　ａｅｅａａ：ｃａｅ ｃｇｃｃｒｃａ　Ｌ１シ≧１λζ　ＧＴＧＴＧＧ−−３５−Ｋ　−１０ （残留物２０がら２３は存在しないン １Ｅ１１４：アブローズ固定された無水トリプシンを用いたファージ滴値の中性 化時間の機能としての残留物滴値の割合 こニエゴー」生−一」−一」−一二−二艷順−ＢＰＴ工　５μｍ工Ｓ　９９　１ ０４　１０５２μ１ＬＡＴ　８２　７１　５１ ５μｌｕＴ　５７　４０　２７ １０μ１ＩＡＴ　４０　３０　２４ ＭＩＫ５μｍ工Ｓ　１０６　９６　９Ｅ１２μｌｎＴ　９７　１０３　９５ ５μｍ工ＡＴ　１１０　１１１　９６ １０μｌｕＴ　９９　９３　１０ｇ 凡例：　工Ｓ＝固定ストレブタビジン ＩＡＴ＝固定無水トリプシン 表１１５＝固定無水トリプシン上のＭＫ−ＢＰＴＩファージの類似性選択溶出バ ッファー内で復帰された ＭＫ−ＢＰＴＩ　５　μｌ　工Ｓ　く（１−１０μｌ　ＩＡＴ　５０ １０　μｍ　工ＡＴ　＜ｃｌ ＩＡＴ＝固定無水トリプシン ・　探知されず 表１１６：シグナルＩＩＩ：：ｂｐｔｉ：：成熟エエエのトランスレージコン表 １１６：シグナルＩＩＩ：：ｂｐｔｉ：：成熟ＩＩＩのトランスレージ１ン（続 ）表１１６：シグナルＩＩＩ：：ｂｐｔｉ：：成熟エエエのトランスレージコン （ＭＥ） 表１１６：シグナルＩＩＩ：：ｂｐｔｉ：：成熟ＩＩＩのトランスレージコン（ 続）表１１６　：　’／グナｚｕＩＩＩ：：ｂｐｔｉ：：成熟ＩＩＩのトランス レーション（続〉表１１６：シグナルＩＩＩ：：ｂｐｔｉ：：成熟ＩＩＩのトラ ンスレーション（続）Ｓｅｃｏｎｄ　Ｂａ５ｅ ４１６１ａ １　３１６４ｇ 表１３０：　（ＮＮＫ）’によりコードされる集合体のサンプリングＡ、各クラ スにおけるヘキサペプチドの数合計−６４，０００，０００ストップ、フリー配 列αは［ＷＭＦＹＣＩＫＤＥＮＨＯ］のうちの一つΦは［ＰＴＡＶＧ］のうちの 一つ Ωは［ＳＬＲコのうちの一つ どの順でも並んでいるペプチドのセットを表す。例えば、７２９＝３６の配列は Ｓ、Ｌ、及びＲのみから成り立っている。
表１３０　：　（ＮＮＫ）’によりコードされる集合体のサンプリング（続）Ｂ 、アルストップ・フリーＤＮＡ配列が決められたクラスからヘキサペプチドをコ ードする確立表１３’Ｏ：　（ＮＮＫ）　８によりコードされる集合体のサンプ リング（続）Ｃ０各クラスにある異なったストップフリー・アミノ酸配列の数で 、様々なサイズの集合体に予測されるもの 集合体のサイズ＝　１．０ＯＯＯＥ＋０６合計＝　９．７４４６Ｅ＋０５　ｋ　 ｓａｍｐｌｅｄ　−１５２集合体のサイズ＝３．０ＯＯＯＥ＋０６合計＝　２． ７８８５Ｅ＋０６　’ｋ　ｓａｍｐｌｅｄ　−、４，３ｇ表１３０　：　（ＮＮ Ｋ）’によりコードされる集合体のサンプリング（続）集合体のサイズ−１，０ ＯＯＯＥ＋０７合計＝　８．１２０４Ｅ＋ＯＧ　ｋ　ｓａ＋ｎｐｌｅｄ　−１２ ＋６９集合体のサイズ＝　１ｏｏｏＯＥ＋０７合計−１８６３３Ｅ＋０７　ｋ　 ｓａｍｐｉｅｄ　−２９，ｉｎ表１３０　：　（ＮＮＫ）’によりコードされる 集合体のサンプリング（続）集合体のサイズ＝７　、６０００Ｅ＋０７合計−３ ，２１２５Ｅ４−０７　ｋ　ｓａｍｐｌｅｄ　−５０，１９集合体のサイズ＝　 １．０ＯＯＯＥ＋０８合計＝　３．６５３７Ｅ＋０７　ｋ　ｓａｍｐｌｅｄ　− ５７，０９−表１３０　：　（ＮＮＫ）’によりコードされる集合体のサンプリ ング（続）集合体のサイズ−３，０ＯＯＯＥ＋０８合計−５，２６３４Ｅ＋０７ 　ｋ　ｓａｍｐｌｅｄ　−８２，２４集合体のサイズ＝　１．ｏｏｏｏＥ＋Ｑ９ 合計＝　６．１９９９Ｅ＋０７　ｋ　ｓａｍｐｌｅｄ　−９６−８７表１３０・ 　（ＮＮＫ）’によりコードされる実合体のサンプリング（続）集合体のサイズ −３，０ＯＯＯＥ＋０９合計−６，３８９０Ｅ＋０７　ｋ　ｓａｍｐｌｅｄ　− ９９，８３＝ｔ３０　：　（ＮＮＫ）’によりコードされる集合体のサンプリン グ（続）Ｄ、計算された量の式 表１３１１　（ＮＮＴ）’　（ＮＮＧ）”によりコードされる集合体のサンプリ ングＸｌ１Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ，Ｌ、Ｐ、Ｈ，Ｒ，Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ−Ｃ ’あり得る。
ｒはＬ２．　Ｒ２，Ｓ、　Ｗ、　Ｐ、　Ｑ、　Ｍ、　Ｔ、　Ｋ、　Ｖ、　Ａ、Ｅ 、　Ｇであり得る。
８５５・１０＠アミノ酸配列から成る集合体は、１４７・１０’ＤＮＡ配列であ る。
以下の表は、あるＤＮＡ配列が決められたクラスのうちの一つとなる確率を示す ・集合体のサイズ＝１．０　サンプリング＝０．００００１％表１３１　：　（ ＮＮＴ）”　（ＮＮＧ）２によりコードされる集合体のサンプリング（続）以下 のセクシ薔ンは各クラスにいくつの配列が異なったサイズの集合体に予測される かを示す。
表１３１　：　（ＮＮＴ）’　（ＮＮＧ）２によりコードされる二合体のサンプ リング（続）表１３１　：　（ＮＮＴ）’　（ＮＮＧ）”によりコードされる集 合体のサンプリング（続）表１３２＝異なった単一多様化コトンの相対的効率Ｎ ＮＫ　ｓ、ｓｓ　１３．８６　２ｍ、４９予測　［２、８６・１０’］　［８， ８７・１０’ｌ　［２，７５・：ＬＯＩＯ］ストップ・バニッシュ　（３，２・ １０’ｌ　（６，４・１０’）　（１，２Ｂ・１０５ＮＮ７　１．３ｇ　１．４ ７　ｍ、５７（ｚ−ａｓ・ｚｏｇ］（ｘ、ｇａ−１ｏ’１［２Ｊａ４０”］（７ ，５９・：ＬＯ’）　＋１：Ｌ４４０’）　（：Ｌ、７１−：ＬＯ”）ＮＮＧ　 ２．０４　２．３６　２．７２表１４０：ファージ力価における抗ＢＰＴＩ　Ｉ ｇＧの効果ｐ＝３ＦＩｎ　（ｃ）　１００　９０　３６ｔｙ＋ａａ　１１　１ （ａ）タンパク質Ａアガローズビーズ 表１４１　ファーシカ価における抗ＢＦｒＩ　ＩｇＧの効果Ｆ’３ＭＩＰｉ８　 １００ｆｂ）　１０７　１０５　７２　６５ψ　ａ　１−５　（＊　″ （ａ）タンパク質Ａアガローズビーズ 表１４２：ファーシカ価に対す引態ＦｒＩ及び非免疫血清の効果）’、！３Ｍ！ ３４１１（ｄ）　１００　３０　１２５　１３　１２１ψ　”　７　！ニーー （ａ）ノーマルなウサギの血清から取られた純化ＩｇＧ（ｂ）タンパク賀Ａアガ ローズビーズ （Ｃ）プラーク形成ユニットとして測定された入力ファージの割合（％）（ｄ） バッチ番号４ （ｅ）バッチ番号５ 表１４３・アンヒドロトリプシンのある顕示ファージの力価における。ニア。
ＫＬ３ＫＰＬＢ　１００（ａｌ　１２１　にＮＤＦＬ３ＫＢ４８１００　５１ｉ １　：：ＯＯ９８５ＡＡＰｏｏｌ　１００　４４　ＬＯＱ　９３（ａ）入力の割 合（％）として表現されたプラーク形成ユニット表１４４＝アンヒドロトリプシ ンへの顕示ファージの結合実験１゜ スト′イ′　溶出フ・−ジ”　Ｍ１３ＭＰ１ｇと。比較Ｈユ３ＭＰ１１１　０． ２　＋ｉｌｌ　ｉ、０Ｂ７：ｘ−工＝ひグ　７．９　３９．５Ｍ１３ＶＢ４８　 １１．２　５６．０ 実験２゜ ストレイン　溶出ファージ（”ｌ　Ｍｌ　３ＭＰ　ｌ　８との比較Ｘユコｒｘｐ Ｌ８　０−３　１．０ Ｒｉ工−エエｒＭ１ｃ　Ｌ２．０　４０．０！’Ｃ３ＭＢ５ｇ　１７．０　５ｇ 、７表１４５：アンヒドロトリプシンまたはトリプシンへの顕示ファージの結合 ＦＬＩＦ／Ｐ’１８　１　０．ｉ　１　１２−３ｃＬＯ″　１．ＱＥＰＴニーＩ よりＯ：　ｌ　９．Ｌ　９１　１　：、１７　５虹０３Ｍ１３．３Ｘ７　１　２ ５．０　２５０　１１．４　ｇ虹ｏ’Ｍ１３．３Ｘ１１１　９．２　９２　ｌ　 Ｏ，２７１，２ｙ−ＬＯ’（ａ）プラーク形成ユニット酸はビーズから溶出し、 人力の割合（％）として表現されている。
（ｂ）非顕示ファージｌ［１３ｍ［ＰＩ３に対する比較。
表１４６．１１示ファージのトリプシンまたはヒトの二ニートロフィル・エラス ターゼへの結合とユコト！Ｐｅａ１５ｘユＯ″’−１３ｘｌＯ”＝、０ＥＦＴ工 ４１ｍＤＩＩＫＩ　１．０　２０００　ｌ　５ｘｌＯ”　１Ｌ７！ｃ３ＭＩＢ４ ａｌ　Ｏ，Ｌ３　２１０　ｌ　９ｘｌＯ”　３０．０！ｃ３．３Ｘ７１　１．４ ５　２３００　ｌ　シｑＯ−’　３．３Ｍ：３．３Ｘ：；１０．ａｌｆｉｏｏ１ ２ｘ工＋ｙ’６．７：Ｉ２τ：コ、こｌｌｘ二〇°”　２　ｌ　４．１　ｍ、４ Ｘ二ｏ４（ｃｌ　ＢＰτＸ−Ｘ　よりグ　（にユ５　Ｌｎ＝む１表８２０：スト レプタビジン結合ファージ表８２８：ＨＰＱ６！ｌｌｒ示ファージの感染力に対 するＤＴＴの効果２０　：Ｌ、０８ 人力　Ｋｃツ４．２　ｘ　１０”、　ＦＧＱｆｓ　３．３　ｘ　ＬＯ”。
表８３２：因子Ｘ、による培養前のＨＰＱ６顕示ファージのストレプタビジンビ ーズに対する結合における効果 ＝　’　１１　１　雪　、ｊ　、、ニ ア、６　Ｘ　１０’　Ｌ、６　Ｘ　’Ｏ’　Ｌ４＝　４　４　−１　−１ 添ｎＯ量　除去された％ ｕ　−５１３５ 参考文猷 ＡＳＫＨ８９：　Ａｊｈｆｎａ−ｎ、Ｍａｔ＝ｈｅｗｓ、ａｌｌ！ｄ　Ｆｒにｋ 　ｆｉ９８９＋　Ｐｒｏヒｅｉ二Ｅｎｇｉｎｅ＝ｉ：１ｇ　２ｆ５）：　３８７ −９１゜ＲＡＭＮＢ１：　Ｂａｎｎｅｒ、ＤＷ、ＣＮａｖｅ、ａｎｄ　ＤＡ　― ぼガニ、Ｎａｅｕｒａ　ｆＬ９８１）ｒ２ｊｉ：８：Ｌ４−８−６゜ ：１ｉ（ＥＣＸａ９ｅ：　ＩＥ！ａｃｋ！Ｌｒ、Ｓ、　Ｅ　Ａこｈ＠！：Ｔ−Ｏ ｎ　＋　−にＧＯｒｄＯｎ　ｒ　Ｅｕｒ　Ｊ　：ｔ　Ｌ　ＯрP工Ｔ （ＯＣＣ２０１９８９＋、工旦旦（１）フ９−８４゜Ｓｃｉ＠ｎｃ＠　ｆｍ９８ ８］、　２ｉＱ：１０４Ｌ−１０４３゜ＢＯＥＸ８Ｇ：　３ｏ＠’ｘ＝、ＪＤ、 Ｍ　Ｒｕ５ｓａｌ、λｎ６　Ｐ　Ｍｅｄｔ二、：；　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　ｆ１９ ８０）。
−μ：１０３４１６゜ ＣＦＪ’ｕ’ｎ９：　ＣよｕＬ：ｇ、ＣＪ、Ｐ　Ｍｏｄｅユ、ａｎｄ　Ｇ　Ｂｌ 凸ａＬ、Ｐｒｏｃ　ＮａｅＬ　Ａｃａｄ　Ｓｃ±ＵＳＡ　（：Ｌ９７９１　、ヱ ｉ：Ｌ２５１４２５５゜Ｃｏｏロア４：　Ｃｈｏｕ、ＰＹ、ａｎｄ　ＧＤ　Ｆａ ｓｍａｎ、Ｂｉｏａａｉ、ｍ’−ｒＹ　（１，９７４＋。
エユ：　ｆ２１２２２−４５゜ ＣＯＬＭ８７：　譬ａ　′　〒　−ｉＪ、５＠：口ｎｄ　Ｅｄｉｅｉｏｎ、Ｅ（ ｉ土ヒｏｒｓＣｏ工ｍａ二、Ｅｉ＝ｓｈ、Ｈａｒｄａ＝、ａｎｄ　Ｓミニ−；ａ 二９　Ｐｕｂ工１ｓｈａｄ　ｂｙＰｉ、ｐＰｉｎｃ口ｅ：、Ｐｈ１ｌ＆ｄｅｌｐ ｈｉａ、ＰＡ、’＝９８７．　工ＳＩＮ　０−３９７−１−；−；；二１とＬｌ ｌ、Ｗ　Ｅ　Ｆ：＠ｔ！！ＬａｊｌｌＬ　＆　Ｃｏ、Ｎｅｗ　Ｙｏ＝３ｃ、ｚり ８４゜ＣＷ：λコＯ：　Ｃ’１Ｌ＝１ｈ、ＳＥ、ＥＡ　Ｐａ仁＠ｒ！１．　ＲＷ 　ＢＬ−−巳ｅｅ、＆ｎｄ　ＷＪ　ＤＯ’ｄ＠：ｒＰｒｏｃ　Ｍａｔ工　入ｅａ ｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、（Ａｕｇｕｓｔ　１９９０）、旦ヱ：６３７８−６３８２ ゜ＤＥＬＡＪ！８：　ｄｅ　ｌｘ　Ｃｒｕｚ、　ＶＦ、　ＡＡ　Ｌａｌ　ａｎｄ 　ＴＦ　ＭｃαＬｅｃｈａｎｒＪ　！１ｉｏｌ　Ｃｈａｍ、［Ｌ９Ｂ１３１．２ ｊ！＋９１４３１８−２２゜ＤＥＶＩＪＯ＝　Ｄｅｗ工ｕ、に、ＬＣＰａｎｇＪ ｌｂａｎ、ａｍ　ＰＥ　Ｄｅｖｌｉｎ、５ｃｉａｎｃａ。
（２７Ｊｕｌｙ　１９９０）、　ｋＥ：４０４−４０６゜Ｄ工Ｃ１日コニ　Ｄｉ ｃ３ｃａｒｓｏｎ、Ｌ：、＆ｎｄ　工　Ｇａ１ｓ、　’　・　−−Ｊ−’　４　 １　、τｈａ Ｂａｊａ二とｂユ／ＣｕｆｆＩｍｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、Ｍａ ｍｏ　Ｐａｒｋ、Ｃλ。
Ｌ９Ｅ１３゜ ｐロア２８６：　Ｄｕ１ｂｅｃロロ、Ｒ，σＳ　ＰａＬｅＬｌｅ　４，５９３， ００２．　σｕｎａ　３．　Ｌり８Ｇ。
２ｉ：２０４Ｌ−４３゜ 口ＥＮ８５！：　Ｋｕｈｎ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｗ　Ｗｉｃｋｎａｒ、　Ｊ　Ｂｉ ｏｌ　Ｃｈｅｘｎ　（１９８５）　。
２ａ１日＝シＩ、　Ｄａｎｈａｒｄｅ、　ＤＴ、　Ｄ　Ｄｒｅｇｓｌａｒ、ａｎ ｃｌ　ＤＳ　Ｒａｙｅ／１ｉｃｏｒｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ：Ｌ二ｇ　Ｈａｒ！： ＋ｏｒ　Ｌａｂｏｚｃｏｒｙ、ｌり７８．、ｐ４４９−ＮＩＣ：８８：　Ｎ１ｃ ｈｏｌｓｏｎ、＝ｒ　ｗＪ　Ｂｅｃ）ｃ−ａｌ、ａｎｄ　＝ｗ　ｍｅ亡ｈｅｗｓ 、Ｎａｎｕｒｅ（Ｌ９１１８１．　ＪｕｆＬ：６５１−５６゜Ｎ’ＺＳＥａ２： 　Ｎ１５ｈｉｕｅｈｉ、Ｙ、ｄ　Ｓ　Ｓａｋａ３ｃｉｂａｍ、ＦＥＢＳ　Ｌ＠Ｃ ｍ　（Ｌ９８２）ｒよ幻ｉ：２ｇｏ−２゜ ＮＸＳ’ＥＢＧ：　Ｎｉｇｈｉｕｃと１．ｙ、Ｋ　Ｋ−ｇｌＹ＠、Ｙ　Ｈｏｅｄ 、ＴＸ　Ｗａｅａｎａｂｅ、ａｎｄ　５Ｓａ３ｃａｋｉｂａｘ、　Ｂｉｏｐｏｌ ｙｍｅｒｓ、＋１９ｆｔ６１．３ｊｚＳ６１−８゜ｏｍεユニ　Ｏｈｋａｗａ、 工、ｗｄ　ＲＥ　Ｗａｂｓｅａ＝、Ｊ　ヨｉ：Ｌ　Ｃｈａｍ　（１９８１１。
＝Ｉ：　９９５１−９９５８゜ ０ＬｒＶ９０ａ：　０１ｉｖ＠ｒａ、ヨＭ、Ｊ　［ｖｉａｒ、ＣＣ１ａ：ｘ、Ｃ Ａ　Ｒａｍ１工ｏ、Ｇ？Ｃｃｒｐｕ：、　ＦＣＡｂｏｇａｄｉ＝、　：ＥＥ　Ｈ ａｒｍ、　ＳＲＷｏｏｄｗａ＝ｄ、　ＤＲＨｉｌｌｙａ＝ｃｌ、　コＣ１Ｚ、　 ５ｃｉａｎｃ＝、（２０Ｊｕ１７１９９０１．　■：Ｚ５７−ＰＡＢＯ７９：　 ｐａｂｏ、ｃｏ、ＲＴ　５ａｕｅ＝、σＭ　ｓｅ”ａ＝（ｖａ＝＝、ａｎｄ　Ｍ 　ＰＣａｓｈｎａ。
Ｐ＝ｏｃ　Ｎａｅｌ　λＣａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳλ　（Ｌ９７９１．　ヱｉ：１６ ０ｇ−１５１２゜ＰＡＲＭ８８：　Ｐａ式ｅｙ、ＳＦ、ａｒｍ　ＧＩ　Ｓｍｕ、 Ｇａ＝ａ　（１９８ｆｌ）、工１：３０５−３１８゜Ｐより４：　Ｐａｒｒｙ、 　ＬＪ、　ａｎｄ　ＲＷａｅｚａｌ、、　５ｃｉａｉｃ＝　＜１９８４）　ｒ　 ２２ｉ：５５５−７゜？ＥＲＲＦｉＧ：　Ｐａｒｒｙ、ＬＪ、ａｚｄ　ＲＷ＠ヒ ｚａｌ、Ｂｉｏｃｈａｚ　（１９８ｇ）、２Ａニア３３−３９゜ｐＯτΣ８３： 　Ｐｏｅ＠＝ｃｅ、ＬＬ、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　＋ｌり８３）、エヱλ：４０ Ｌ−４１８−ＲＡＳＣＦ３（ｒ：　Ｒａ５ｃｈａｃＬ、ｘ、ａｎｄ　Ｅ　０ｂａ ｒａ＝、Ｍｉｃ−山１ｏＩ　Ｒａｖ　（Ｌ９８ｇ＋二と４０１−４２’７゜ ＦＬＡｓＨＢ４：　Ｒｘ５ｂＪｓ、　Ａ、ヨｉａｃｈｅｍｉ岨：ｒｙ　＋１９ｓ ４）、Ｑ：５５１Ｂ。
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Ａ　Ｊｅｉｍ工５ｒ−Ｎｉｌｓｓｏｎ、ＥＧ　５ｕｅｈａ二ａ：＜、ａｆｉｄ　 Ｃｏ　Ｐａｋ＋ｏ、ヨ土ｏｃｈｅｍ（工９８６）、Ｚ旦：５９９２−９８゜Ｓロ ス７ε：　５ｃｈｘ工１ｅ＝、　＝ｌ　Ｅ　Ｂ＠Ｃｋｒ　ａｎｄ　Ｍ　１仏コ― 、　ｉ’ｌ　ｇ＋＋　ａ″Ｔｈ　ａ　、　Ｄｅｒｊｗｒ己：、　ｐ、τ、、　Ｄ 、　Ｄｒｅｇｓｌａｒ。
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ＳＣＣτ８７ａ；　Ｓｃ口ｅ：、ｘＳ、ａｓ　１４ｕｃｋａ！＝ｙ、工　Ｋユニ ：、−＋Ｊ　Ｋ”：Ｆ：、Ｍ　ＬａｓｋｏｗｓｋｉＪｒ、、Ｍ−σ　τｓａｉ　 ａｎｄ　Ｗ　Ｏ’ＭＩ！Ｌｕ＠ｖ、；　ヨシ０工　Ｃｈｅａｚ　（二９８７）。
２五、７．＋１２）５ａ９９−５９０７゜Ｓこ０Ｔ９Ｃ：　５ＣＯｅＥ＋　１７ ７：ｔ　ａｎｄ　ｃｐ　Ｓｍ工ｅｈ、５ｃｉ＝＝：ａ、（２７Ｊｕユｙｉ９９０ ）。
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（１９８５）、ユニ：１０３−１．１９゜２λ！λ８Ｓ：　Ｚａｆａｒａｌユ＆ 、ＧＣ，ＣＲａｍ土ユＯ，ＷＲＧｚｙ、Ｒｘａｒｌｓｉｅｒｏｍ、ＢＭｏｌｉｖ ｅｒｘ、　ａｎｄ　ＴＪ　Ｃｘｚ、　Ｂｉｏｃｈ仁伍ｓ；ｒｙ、（１９８８１＋ ２ヱ（ｌＥｌ］７１０２−５゜ ＺＤＩＭ８２：　Ｚｉ＋ｒａａ＝工ａ二二、１．　ＣＷａｇ：ｅｓ、ａｎｄ　Ｗ 　Ｗｉｃｌｃｚａ＝、σ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈａｍ（１９８２）、、ｉｊユニ６５２ ９−６５３６゜手続補正書防式） 平成６年９月２７日

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. １．最初のファージ遺伝子の発現の結果として、特定のキメラコートタンパク質 のコピー１個または２個以上を、表面に各々顕示するファージのライブラリーを 供給するもので、ポテンシャルエピトープ、または各キメラコートタンパク質が 前記ファージにとって初めての既知タンパク質ドメインの突然変異体であるポテ ンシャル結合ドメインからなり、前記ライブラリーは、複数のポテンシャルエピ トープまたは結合ドメインを集合的に顕示し、前記ファージのライブラリーをタ ーゲット物質と接触させ、該ターゲット物質に対する親和性に基づきファージを 分離させる、特定ターゲット物質に対する望ましい結合活性を有する新規のエピ トープまたは結合タンパク質の発生方法において、前記キメラコートタンパク質 が、前記サイト特異性のプロテアーゼによって特異的に分割可能なリンカーペプ チドを有していることを特徴とする改良された方法。
  2. ２．サイト特異性プロテアーゼが、ファクターＸａ，ＸＩａ，カイクライン、ト ロンビン、ファクターＸＩＩａ、コラーゲナーゼまたはエンタロキナーゼである 請求項１の方法。
  3. ３．ファージライブラリーがターゲット物質と接触させられた後に、（１）低い 親和性のファージが除去され、（２）ターゲット物質になお結合している高い親 和性のファージがサイト特異性プロテアーゼによってリンカーでキメラコートタ ンパク質を分割することによってリリースさせ、そのリリースされた高い親和性 のファージを得る請求項１の方法。
  4. ４．最初のファージ遺伝子の発現の結果として、特定のキメラコートタンパク質 のコピー１個または２個以上を、表面に各々顕示するファージのライブラリーを 供給するもので、ポテンシャルエピトープ、または各キメラコートタンパク質が 前記ファージにとって初めての既知タンパク質ドメインの突然変異体からなって おり、前記ライブラリーは、複数のポテンシャル結合ドメインを集合的に顕示し 、該ファージライブラリーをターゲット物質と接触させ、該ターゲット物質に対 する親和性に基づきファージを分離させる、特定ターゲット物質に対する望まし い結合活性を有する新規の結合ペプチドまたは結合タンパク質の発生方法におい て、前記ポテンシャル結合ドメインが、に少なくとも１個の内部鎖の共有結合の クロスリンクをもち、これら第１ポジション、第２ポジションのアミノ酸が前記 ライブラリーによって顕示されるキメラタンパク質の全てにおいて不変であり、 低い親和性のファージがまず前記ターゲット物質から除去され、次に、高い親和 性のファージがリリース、すなわち前記クロスリンクを分割する試薬、好ましく はファージを殺すことのない試薬でファージを処理することによってターゲット 物質から溶離してより容易に与えられることを特徴とする改良された方法。
  5. ５．ドメインがアミノ酸６０個以下のミニタンパク質、より好ましくはアミノ酸 ４０個以下のマイクロタンパク質である請求項１、２、３または４の方法。
  6. ６．クロスリンクがジスルフィド結合で、第１ポジションと第２ポジションのア ミノ酸がシステインである請求項４の方法。
  7. ７．試薬がジチオトレイトールである請求項６の方法。
  8. ８．ファージが、そのファージの同族の野生型コートタンパク質をコードする第 ２ファージ遺伝子を有する請求項１、２、３、４、５、６または７の方法。
  9. ９．最初のファージ遺伝子の発現の結果として、特定のキメラコートタンパク質 のコピー１個または２個以上を、表面に各々顕示するファージのライブラリーを 供給するもので、各キメラコートタンパク質はポテンシャルエピトープを有して おり、前記ライブラリーは複数のポテンシャルエピトープを集合的に顕示し、フ ァージライブラリーをターゲット物質に接触させ、そしてターゲット物質に対す る親和性に基づきファージを分離させる、特定ターゲット物質に対する望ましい 結合活性を有する新規のエピトープの発生方法において、ファージが、そのファ ージの同族の野生型コートタンパク質をコードする第２ファージ遺伝子を有して いることを特徴とする改良された方法。
  10. １０．最初のファージ遺伝子の発現の結果として、特定のキメラコートタンパク 質のコピー１個または２個以上を、表面に各々顕示するファージのライブラリー を供給するもので、各キメラコートタンパク質が前記ファージにとって初めての 既知タンパク質ドメインの突然変異体であるポテンシャルエピトープまたはポテ ンシャル結合ドメインを有し、前記ライブラリーは、複数のポテンシャルエピト ープまたは結合ドメインを集合的に顕示し、前記ファージのライブラリーをター ゲット物質と接触させ、該ターゲット物質に対する親和性に基づきファージを分 離させる、特定ターゲット物質に対する望ましい結合活性を有する新規のエピト ープまたは結合タンパク質の発生方法において、前記キメラコートタンパク質が 、ピラス結合に責任があるコートタンパク質の部分ではなく、前記ファージのコ ートタンパク質のアッセンブリー可能なフラグメントを１個だけ含むもので、前 記ファージは、そのファージの同族の生コートタンパク質をコードする第２ファ ージ遺伝子をも有していることを特徴とする改良された方法。
  11. １１．最初のファージ遺伝子の発現の結果として、特定のキメラコートタンパク 質のコピー１個または２個以上を、表面に各々顕示するファージのライブラリー を供給するもので、各キメラコートタンパク質が１つのポテンシャルエピトープ を有し、前記ライブラリーが複数のポテンシャルエピトープを集合的に顕示し、 前記ファージのライブラリーをターゲット物質と接触させ、該ターゲット物質に 対する親和性に基づきファージを分離させる、特定ターゲット物質に対する望ま しい結合活性を有する新規のエピトープの発生方法において、前記ファージの同 族の野生型コートタンパク質が、そのファージの主要なコートタンパク質である ことを特徴とする改良された方法。
  12. １２．第２ファージ遺伝子の開始コドンがロイシンである請求項８〜１１の方法 。
  13. １３．第１ファージ遺伝子が、該ファージに感染された細菌宿主細胞の内膜に直 接の発現産物を向けるシグナルペプチドをコードする細胞質分泌シグナル配列を 有するもので、前記シグナルペプチドを除去するようにプロセスされ、ポテンシ ャル結合ドメインと少なくとも前記ファージのｇｅＶＩＩＩ様タンパク質の１部 分とを有する成熟キメラコートタンパク質を生成するもので、分泌シグナルがｐ ｈｏＡ．ｂｌａおよびｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子のシグナル配列からなるグループか ら選択されるシグナル配列によってコードされ、野生型コートタンパク質でファ ージコート中にアッセンブリーされる前記キメラタンパク質である、請求項１〜 １２の方法。
  14. １４．最初のファージ遺伝子の発現の結果として、特定のキメラコートタンパク 質のコピー１個または２個以上を、表面に各々顕示するファージのライブラリー を供給するもので、各キメラコートタンパク質が前記ファージにとって初めての 既知タンパク質ドメインの突然変異体であるポテンシャルエピトープまたはポテ ンシャル結合ドメインを有し、前記ライブラリーは、複数のポテンシャルエピト ープまたは結合ドメインを集合的に顕示し、前記ファージのライブラリーをター ゲット物質と接触させ、該ターゲット物質に対する親和性に基づきファージを分 離させる、特定ターゲット物質に対する望ましい結合活性を有する新規のエピト ープまたは結合タンパク質の発生方法において、前記ファージが、そのファージ の同族の生コートタンパク質をコードする第２ファージ遺伝子をも有し、該第２ ファージ遺伝子の開始コドンがロイシンコドンであることを特徴とする改良され た方法。
  15. １５．複数の異なるポテンシャル結合ドメイン間における相違が、予め決定して ある２個以上のアミノ酸の１セットに属するアミノ酸を各ポジションにランダム に得るため前記既知ドメインの予め決定しておいた１または２個以上のアミノ酸 ポジションの少なくとも部分的にランダムなバリエーションを通して発生するも ので、前記１セットのアミノ酸は予め決定しておいた所定の比率で前記ポジショ ンに発生することを特徴とする請求項１〜１４の方法。
  16. １６．ライブラリーのポテンシャル結合ドメイン間の相違が、配列の予め決定し てあるアミノ酸残基約２０個以下に限定されている請求項１５の方法。
  17. １７．各セットにとって、最も好ましいアミノ酸の発生確率が最も好ましくない アミノ酸発生確率に比し約２．６以下である請求項１５の方法。
  18. １８．ポテンシャル結合ドメインをポテンシャルにコードしたものにとって、そ のポピュレーション中の少なくとも１パケッジにより顕示される確率が少なくと も５０％、より好ましくは少なくとも９０％ある請求項１〜１７の方法。
  19. １９．ポピュレーションが少なくとも１０５の異なるポテンシャル結合ドメイン を顕示することを特徴とする請求項１〜１８の方法。
  20. ２０．最初に選択される親ポテンシャル結合ドメインが、（ａ）ウシ膵臓トリプ シンインヒビター、クランビン、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍａｘｉｍａトリプシンイ ンヒビターＩＩＩ、Ｅｘｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの熱安定エンテロトキシ ン、α−、μ−、またはω−のコノトキシン、アパミン、チャリブドトキシン、 分泌白血球プロテアーゼインヒビター、シスタチン、ニグリン、オオムギプロテ アーゼインヒビター、オボムコイド、Ｔ４リゾチーム、ニワトリ卵白リゾチーム 、リボヌクレアーゼ、アズリン、腫瘍壊死因子、そしてＣＤ４、の結合ドメイン 、および（ｂ）少なくとも融点５０℃を有する前記ドメインのいずれかと少なく とも実質的に相同のドメインからなるグループから選択される請求項１〜１９の 方法。
  21. ２１．最初のファージ遺伝子の発現の結果として、特定のキメラコートタンパク 質のコピー１個または２個以上を、表面に各々顕示するファージのライブラリー を供給するもので、各キメラコートタンパク質が前記ファージにとって初めての 既知タンパク質ドメインの突然変異体であるポテンシャルエピトープまたはポテ ンシャル結合ドメインを有し、前記ライブラリーは、複数のポテンシャルエピト ープまたは結合ドメインを集合的に顕示し、前記ファージのライブラリーをター ゲット物質と接触させ、該ターゲット物質に対する親和性に基づきファージを分 離させる、特定の結合タンパク質ターゲット物質に対する望ましい親和性をもっ た新規のエピトープの発生方法において、複数の異なるポテンシャル結合ドメイ ン間における相違が、予め決定してある２個以上のアミノ酸の１セットに属する アミノ酸１個を各ポジションにランダムに得るため前記既知ドメインの予め決定 しておいた１または２個以上のアミノ酸ポジションの少なくとも部分的にランダ ムなバリエーションを通して発生するもので、前記１セットのアミノ酸は予め決 定しておいた所定の比率で前記ポジションに発生し、かつ、実質的に全部のセッ トで、最も好ましいアミノ酸の発生頻度率が最も好ましくないアミノ酸発生頻度 率に比し約２．６以下である方法。
  22. ２２．少なくとも１個の可変アミノ酸のポジションがＮＮＴ，ＮＮＧ，ＲＮＧ， ＲＭＧ，ＶＮＴ，ＲＲＳ，およびＳＮＴからなるグループから選択された単に多 様化されたコドンによってコードされいる請求項２１の方法。
  23. ２３．可変アミノ酸ポジションのどれひとつとしてＮＮＮ，ＮＮＫ，およびＮＮ Ｓからなるグループから選択される簡単に多様化されたコドンによってはコード されていない請求項２１の方法。
  24. ２４．少なくとも１個の可変アミノ酸ポジションが、複雑に多様化されたコドン によってコードされている請求項２１の方法。
  25. ２５．最初のファージ遺伝子の発現の結果として、特定のキメラコートタンパク 質のコピー１個または２個以上を、表面に各々顕示する顕示ファージのライブラ リーで、各キメラコートタンパク質が前記ファージにとって初めての既知タンパ ク質ドメインの突然変異体であるポテンシャルエピトープまたはポテンシャル結 合ドメインを有し、前記ライブラリーは、複数のポテンシャルエピトープまたは 結合ドメインを集合的に顕示し、前記ファージのライブラリーをターゲット物質 と接触させ、該ターゲット物質に対する親和性に基づきファージを分離させるも ので、複数の異なるポテンシャル結合ドメイン間における相違が、予め決定して ある２個以上のアミノ酸の１セットに属するアミノ酸１個を各ポジションにラン ダムに得るため前記既知ドメインの予め決定しておいた１または２個以上のアミ ノ酸ポジションの少なくとも部分的にランダムなバリエーションを通して発生す るもので、前記１セットのアミノ酸は予め決定しておいた所定の比率で前記ポジ ションに発生し、かつ、実質的に全部のセットで、最も好ましいアミノ酸の発生 頻度率が最も好ましくないアミノ酸発生頻度率に比し約２．６以下であるもの。
  26. ２６．最初のファージ遺伝子の発現の結果として、特定のキメラコートタンパク 質のコピー１個または２個以上を、表面に各々顕示する顕示ファージのライブラ リーで、各キメラコートタンパク質が前記ファージにとって初めての既知タンパ ク質ドメインの突然変異体であるポテンシャルエピトープまたはポテンシャル結 合ドメインを有し、前記ライブラリーは、複数のポテンシャルエピトープまたは 結合ドメインを集合的に顕示し、前記ファージのライブラリーをターゲット物質 と接触させ、該ターゲット物質に対する親和性に基づきファージを分離させるも ので、前記キメラコートタンパク質がサイト特異性のプロテアーゼによって特異 的に分割可能なリンカーペプチドを有しているもの。
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