DE69712866T2

DE69712866T2 - Bestimmung eines analyten in einer probeflüssigkeit

Info

Publication number: DE69712866T2
Application number: DE69712866T
Authority: DE
Inventors: Ron Blonder; Yael Cohen; Eugenii Katz; Itamar Willner
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Biosensor Applications Sweden AB
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1997-01-10
Publication date: 2003-01-23
Anticipated expiration: 2017-01-11
Also published as: DE69712866D1; JP2000505890A; IL116921A; WO1997027474A1; AU1207197A; US6214205B1; NZ324815A; ATE218207T1; AU705417B2; IL116921A0; EP0876602B1; EP0876602A1; CA2244214A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der Analyse zur Bestimmung des Vorliegens und gegebenenfalls der Konzentration eines Analyten in einem flüssigen Medium. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung eine Analyse, bei der der Analyt mit Hilfe einer Veränderung des elektrischen Ansprechverhaltens einer Elektrode bestimmt wird, zu der es bei Vorliegen des Analyten kommt.

Stand der Technik

Der Stand der Technik, von dem angenommen wird, daß er als Hintergrund der vorliegenden Erfindung relevant ist, setzt sich wie folgt zusammen:
1. Electrochemical Sensors in Immunological Analysis, Ngo, T.T., Ed.; Plenum Press: New York and London, 1987.
2. Bresler, H.S.; Lenkevich, M.J.; Murdock, J.F.; Newman, A.L.; Roblin, R.O. in Biosensor Design and Application, Mathewson, P.R.; Finley, J.W., Eds.; ACS Symp. Ser. 511, Amer. Chem. Soc., Washington, DC, 1992, Seiten 89 bis 104.
3. US Patent Nr. 4,728,828
4. US Patent Nr. 4,822,566
5. US Patent Nr. 5,057,430
6. US Patent Nr. 4,893,957
7. Kanadisches Patent Nr. 1,256,944
8. Kanadisches Patent Nr. 1,259,374
9. Weber, S.G.; Purdy, W.C., Anal Lett., 1979, 12, 1-9.
10. Doyle, J.M.; Wehmeyer, K.R.; Heineman, W.R.; Halsall, H.B. in Electrochemical Sensors in Immunological Analysis, Ngo, T.T., Ed.; Plenum Press: New York and London, 1987, Seiten 87-102.
11. Di Gleria, K.; Hill, H.A. O.; McNeil, C.J.; Green, M.J., Anal. Chem. 1986, 58, 1203- 1205.
12. Di Gleria, K.; Hill, H.A. O.; Chambers, J.A., J. Electroanal. Chem. 1989, 267, 83-91.
13. Chambers, J.A.; Walton, N.J., J. Electroanal. Chem. 1988, 250, 417-425.
14. Wright, D.S.; Halsall, H.B.; Heineman, W.R. in Electrochemical Sensors in Immunological Analysis, Ngo, T.T., Ed.; Plenum Press: New York and London, 1987, Seiten 117-130.
15. Tang, H.T.; Halsall, H.B.; Heineman, W. R. Clin. Chem. 1991, 37, 245-248.
16. Wehmeyer, K.R.; Halsall, H.B.; Heineman, W.R.; Volle, C.P.; Chen, C., Anal. Chem. 1986, 58, 135,139.
17. Aizawa, M., in Electrochemical Sensors in Immunological Analysis, Ngo, T.T., Ed.; Plenum Press: New York and London, 1987, Seiten 269-291.
18. Franconi, C.; Bonori, M.; Orsega, E.F.; Scarpa, M.; Rigo, A., J Pharm. Biomed. Anal. 1987, 5, 283-287.
19. Udita de Alwis, W.; Wilson, G.S., Anal. Chem. 1985, 57, 2754-2756.
20. Tsuji, L; Educhi, H.; Yasukouchi, K.; Unoki, M.; Taniguchi, L, Biosens. Bioelectron. 1990, 87-101.
21. Gebauer, C.R., in Electrochemical Sensors in Immunological Analysis, Ngo, T.T., Ed.; Plenum Press: New York and London, 1987, Seiten 239-255.
22. Niwa, M.; Mori T.; Nishio, E.; Nishimura, H.; Higashi, N., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1992, 547-549.
23. Willner, L; Rubin, S.; Cohen, Y., J. Amer. Chem. Soc. 1993, 115, 4937-4938.
24. Willner, L; Blonder, R.; Dagan, A., J. Amer. Chem. Soc. 1994, 116, 9365-9366.
25. Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 668 502.
26. Rilclin, A., Katz, C., Willner, L, Stocker, A., Bückmann, A.F., Nature, 1995, 376, 672.
27. Morris, D.L., Buckler, R.T., in Methods in Enzymology, V. 92, Teil E (Eds. J.J. Langone, H., Van Vunakis), Acad. Press, N.Y. 1983, Seiten 415-417.

Hintergrund der Erfindung

Aufgrund ihrer Spezifität und hohen Empfindlichkeit werden Immunoassays sowohl in der täglichen klinischen Praxis wie auch in einer Vielzahl anderer Anwendungen wie der Analyse umweltverschmutzender Substanzen und der Qualität von Lebensmitteln in großem Umfang verwendet. Diese Assays beruhen auf einer spezifischen Bindung zwischen einem Antikörper und einem Antigen.
Immunoassays, die auf dem elektrochemischen Nachweis der Bindung beruhen, waren zentraler Gegenstand beträchtlicher Forschungs- und Entwicklungsaktivitäten (Ngo, T.T., Ed. 1987). Bei elektrochemischen Immunoassays wird eine Änderung in den elektrischen Eigenschaften einer Elektroden-Lösungs-Grenzfläche als Ergebnis der Bindung zwischen Antikörper und Antigen nachgewiesen, wie Änderungen der Kapazität (Bressler et al., 1992). Kapazitative Affinitätssensoren wurden in den US Patenten Nr. 4,728,822; 4,822,566 und 5,057,430, im US Patent Nr. 4,893,957 und in den kanadischen Patenten Nr. 1,256,944 und 1,259,374 offenbart. Weitere elektrochemische Immunoassayverfahren beruhen auf einer Änderung der Strom- oder Potenzialantwort als Ergebnis der Bildung von Antigen- Antikörper-Komplexen. Diese Verfahren sind jedoch auf die Gegenwart einer Redoxsonde, der am Antikörper oder am Antigen befestigt ist, angewiesen und das Ansprechen des elektrochemischen Assays ist das Ergebnis einer kompetitiven Bindung zwischen dem Analyten und dem redoxmarkierten Antikörper oder Antigen, wobei die komplementären Bestandteile des Paares an der Elektrode immobilisiert sind. Solche Methoden sind nicht sehr empfindlich, und der amperometrische Nachweis des redoxmarkierten Moleküls ist auf den mikromolaren Bereich beschränkt (Weber, et al., 1979; Doyle et al., 1987). Aktuellere Arbeiten zeigten, daß durch Verwendung einer nackten Elektrode und Koppeln der Redoxreaktion mit einem enzymatischen Verstärkungssystem (Di Gleria et al., 1986; Di Gleria et al., 1988) eine Verbesserung der Empfindlichkeit erreicht werden kann. Verwendung eines ähnlichen Ansatzes, aber mit einer Elektrode, die durch ein Redoxpolymer modifiziert war, ergab ein Immunoassay, das empfindlicher war (Chambers, et al., 1988).
Ein weiterer Ansatz umfaßt das direkte kovalente Koppeln des Antigens oder Antikörpers an biokatalytische Moleküle (gewöhnlich Redoxenzyme) zur Verstärkung des elektrochemischen Signals. Eine Reihe von Untersuchungen verwendeten einen amperometrischen oder potentiometrischen Nachweis elektroaktiver Spezies, wie NADPH (Wright, et al., 1987; Tang, et al. 1991), Phenol (Wehmeyer, et al., 1986), O&sub2; (Aizawa, et al. 1987; Franconi, et al., 1987), H&sub2;O&sub2; (Uditha, et al., 1985; Tsuji, et al., 1990), NH&sub3; (Gebauer, 1987), usw., der analytisch durch eine Enzymmarkierung an einem Antigen oder Antikörper erzeugt wurde. Die hohe Empfindlichkeit dieses Verfahrens läßt es mit dem des Radioimmunoassay in Konkurrenz treten.
Eine elektrische Technik ohne jegliche Markierung der Antigen/Antikörper-Spezies ist jedoch noch attraktiver. Solche Methoden beruhen auf einem amperometrischen Nachweis der Permeabilität von Redoxmolekülen durch eine Monoschicht, die auf der Oberfläche der Elektrode immobilisiert ist. Eine Monoschicht aus Antigenen führt zu einer sehr viel höheren Permeabilität von solubilisierten Redoxsonden als dieselbe Elektrode, umgesetzt mit einem Antikörper mit hoher Bindungsaffinität zum Antigen (zur Veranschaulichung vergleiche Fig. 1) (Niwa, et al., 1992; Willner, et al., 1993; Willner, et al., 1994; europäische Patentanmeldung Nr. 668 502).

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein elektrochemisches Verfahren zum Nachweis des Vorliegens und gegebenenfalls der Konzentration eines Analyten in einem flüssigen Medium bereitzustellen, wobei der Analyt Bestandteil eines Erkennungspaares ist.
Darüberhinaus ist es Gegenstand der Erfindung, Elektroden zur Verwendung in einem solchen Verfahren und System bereitzustellen.
Weitere Gegenstände der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung erläutert.
Im Verfahren und System der Erfindung verursacht das Vorliegen des Analyten im Medium eine Änderung eines elektrischen Ansprechverhaltens. Der Begriff "elektrisches Ansprechverhalten", der im Folgenden verwendet wird, bezeichnet das Strom- Spannungsverhalten einer Elektrode, zum Beispiel die Stromantwort oder den Ladungsfluss einer Elektrode bei einem bestimmten angelegten Potential, usw. Das elektrische Ansprechverhalten kann durch Messen des Strom- oder Ladungsflusses unter Wechsel- oder Gleichstrombedingungen gemessen werden.
Im folgenden wird der Begriff "bestimmen" oder "Bestimmung" verwendet, um sowohl die Bestimmung lediglich des Vorliegens als auch die Bestimmung des Vorliegens wie auch der Gegenwart eines Analyten in einem flüssigen Medium zu bezeichnen.
Das elektrische Ansprechverhalten im Verfahren und dem System der Erfindung ist ein Ergebnis der Übertragung von Elektronen zwischen einer Elektrode und einer Elektronenübertragungskette, die durch mindestens zwei Redoxmoleküle gebildet wird. Der Begriff "Redoxmolekül" bezeichnet ein Molekül, das zur Aufnahme oder Abgabe eines Elektrons fähig ist und dabei seinen Redoxzustand ändert. Das Redoxmolekül kann ein Elektronenvermittler sein, der dazu fähig ist, Elektronen zwischen einer Elektrode und einem Redoxmolekül oder zwischen zwei Redoxmolekülen zu übertragen. Das Redoxmolekül kann auch ein katalytisches Molekül sein, das bei Änderung seines Redoxzustandes katalytisch aktiv wird und dann auf ein Substrat einwirkt, das daraufhin in ein chemisch unterscheidbares Produkt umgewandelt wird. Ein nicht einschränkendes Beispiel eines katalytisch aktiven Redoxmoleküls ist ein Redoxenzym. Im Zusammenhang der Erfindung, wie sie im folgenden beschrieben wird, ist ein letztendliches Ergebnis des Vorliegens des Analyten im untersuchten Medium die Behinderung des Wechsels bei Elektronenübertragung und damit eine Änderung des elektrischen Ansprechverhaltens der Elektrode.
Wie vorstehend erwähnt ist der Analyt, der nachgewiesen wird ein Agens, das Bestandteil eines Erkennungspaares ist, d. h. ein Agens das spezifisch an den anderen Bestandteil des Paares, zu dem es gehört, bindet. Erkennungspaare sind beispielsweise Antigen-Antikörper-Paare, Ligand-Rezeptor-Paare, Zucker-Lecithin-Paare, Biotin-Avidin, Enzym-Substrat-Paare, Oligonucleotid-Oligonucleotid-Paare mit komplementärer Sequenz, Oligonucleotid-Protein-Paare und Oligonucleotid-Zell-Paare.
Im Verfahren und dem System der Erfindung bildet ein Teil des Erkennungspaares das Assaysystem und wird auf der Elektrode immobilisiert. Setzt man die Elektrode einem Medium aus, das den Analyten umfaßt, der den anderen Bestandteil des Paares darstellt, binden beide aneinander, so daß schließlich der Analyt auf der Elektrode assoziiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt in einem ersten Aspekt ein elektrochemisches System zur Bestimmung des Vorliegens eines Analyten in einem flüssigen Medium bereit, wobei das System umfaßt:
Redoxmoleküle, die mindestens ein erstes Redoxmolekül und mindestens ein zweites Redoxmolekül umfassen, wobei das erste Molekül Elektronen zwischen einer Elektrode und dem zweiten Molekül überträgt; und
eine Elektrode, auf der ein Bestandteil eines Erkennungspaares gebunden ist, wobei der Analyt der andere Bestandteil des Paares ist, wodurch das Vorliegen des Analyten in dem Medium die Bildung eines Paarkomplexes zur Folge hat, bei dem es sich um einen Komplex zwischen dem gebundenen Bestandteil und dem Analyten handelt;
Bildung des Paarkomplexes, der die Elektronenübertragung hemmt und Änderung des elektrischen Ansprechverhaltens als Folge davon, was das Vorliegen des Analyten in dem Medium anzeigt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind das erste und das zweite Redoxmolekül einzelne molekulare Einheiten, z. B. eine die auf der Oberfläche der Elektrode immobilisiert ist, während die andere frei im umgebenden Medium herumschwimmt. Alternativ können diese beiden Redoxmoleküle miteinander komplexiert sein, beispielsweise mit Hilfe eines chemischen Verbindungsmoleküls, oder der Komplex schwimmt vorzugsweise frei im Medium umher, das die Elektrode umgibt.
Während eine Änderung des elektrischen Ansprechverhaltens das Vorliegen des Analyten im Medium anzeigt, kann das Ausmaß der Änderung gegebenenfalls als Meßskala zur Bestimmung der Konzentration des Analyten im Medium verwendet werden. Es sollte klar sein, daß eine höhere Konzentration des Analyten die Bildung einer großen Anzahl von Paarkomplexen hervorrufen wird und damit zu einer größeren Änderung des elektrischen Ansprechverhaltens führen wird.
Die vorliegenden Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein elektrochemisches Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens eines Analyten in einem flüssigen Medium bereit, das die folgenden Schritte umfaßt:
a) bereitstellen einer Elektrode auf der ein Bestandteil eines Erkennungspaares immobilisiert ist, wobei der Analyt der andere Bestandteil des Paares ist; auf der Elektrode ist gegebenenfalls ein erstes Redoxmolekül immobilisiert, das dazu fähig ist, Elektronen zwischen der Elektrode und einem zweiten Redoxmolekül zu übertragen;
b) inkontaktbringen der Elektrode mit dem flüssigen Medium, wobei das Vorliegen des Analyten darin zur Bildung von Paarkomplexen führt, bei denen es sich um Komplexe zwischen dem immobilisierten Bestandteil des Paares und dem Analyten auf der Oberfläche der Elektrode handelt;
c) inkontaktbringen der Elektrode mit dem zweiten Redoxmolekül und, sofern das erste Redoxmolekül nicht auf der Elektrode immobilisiert ist, auch mit dem ersten Redoxmolekül;
d) einbringen von Ladungen in die Elektrode, wobei Elektronen zwischen der Elektrode und dem zweiten Redoxmolekül durch Vermittlung des ersten Redoxmoleküls übertragen werden und so ein elektrisches Ansprechen hervorgerufen wird, und eine Änderung im elektrischen Ansprechverhalten erfolgt, wenn die Elektrode dem Medium ausgesetzt wird, was das Vorliegen des Analyten im Medium anzeigt.
Die Erfindung stellt auch eine Elektrode bereit, die für das vorstehende Verfahren und System nützlich ist.
Die Erfindung eignet sich zur Untersuchung von Analyten in einer großen Vielzahl von Medien. Sie beinhalten Körperflüssigkeiten, Wasserproben, Lebensmittelproben, usw. Der Analyt, der analysiert wird, kann ein Analyt sein, der ursprünglich im analyisierten Medium vorliegt, z. B. ein Hormon in einer biologischen Flüssigkeit; er kann ein Analyt sein, der ursprünglich in einem festen Substrat enthalten ist, das sich in Zellen eines Gewebes verbirgt, usw., und die Probe, die den Analyten enthält, wird zunächst so behandelt, daß sich der Analyt im zu analysierenden Medium löst, usw. Bei dem Analyten kann es sich auch um eine Substanz handeln, die ursprünglich nicht im analysierten Medium vorlag, sondern aufgrund einer Reaktion entsteht, an der ein anderes Agens beteiligt ist, und die Bestimmung des Analyten dient in einem solchen Fall als indirekte Maßnahme zur Bestimmung des anderen Agens.
Im Verfahren und dem System der Erfindung liegt eine Elektronenübertragungskette vor, die aus der Elektrode und mindestens zwei Redoxmolekülen besteht, die das erste und zweite Molekül umfassen. Wie vorstehend dargelegt, ist es gemäß einigen Ausführungsformen der Erfindung möglich, daß die zwei Moleküle aneinander gebunden sind. Liegt kein Analyt vor, so besitzt die Elektrode eine dünne Monoschicht, die den immobilisierten Bestandteil des Paares umfaßt und es besteht damit eine im wesentlichen ungehinderte Übertragung von Elektronen entlang der Kette. Sobald der Analyt sich mit dem immobilisierten Bestandteil des Paares verbindet und Molekülkomplexe auf der Oberfläche der Elektrode entstehen, wird die Monolage dicker, wodurch es zu einer Behinderung in der Elektronenübertragungskette und einer Verringerung des elektrischen Ansprechens der Elektrode kommt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das erste Redoxmolekül ein katalytisch aktives Molekül, das bei der Übertragung von Elektronen auf das zweite Redoxmolekül eine Reaktion auslöst, durch die das zweite Redoxmolekül in ein oder mehrere Produkte umgewandelt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das erste Redoxmolekül ein Elektronenvermittler und das zweite Redoxmolekül ist ein katalytisch aktives Molekül. Gemäß dieser Ausführungsform wird noch ein drittes Substratmolekül bereitgestellt, das durch den elektrokatalytischen Redoxprozeß in ein Produkt umgewandelt wird. In diesem Fall umfaßt die Elektronenkette zwei Redoxmoleküle und ein Substrat.
In den vorgenannten zwei Ausführungsformen kann das erste Redoxmolekül zusammen mit dem immobilisierten Bestandteil des Paares auf der Elektrode immobilisiert sein. Um eine Elektronenübertragung zu erzielen, muß das zweite Redoxmolekül, das frei in der Lösung herumschwimmt, zu dem immobilisierten ersten Redoxmolekül diffundieren und mit ihm in Kontakt kommen. Wird die Elektrode dem Medium ausgesetzt, das den Analyten enthält, bilden sich in Folge Paarkomplexe an der Oberfläche der Elektrode und das Dickerwerden der Monoschicht auf der Oberfläche der Elektrode ist das Ergebnis davon, so daß eine Barriere für die Diffusion des zweiten Redoxmoleküls zum immobilisierten ersten Redoxmolekül vorliegt, was zu einer Behinderung in der Elektronenübertragungskefte führt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind das erste und das zweite Redoxmolekül komplexiert: vor der Anbindung eines Analyten an den immobilisierten Bestandteil des Paares kann der Komplex frei diffundieren und der Oberfläche der Elektrode nahe genug kommen, um eine Elektronenübertragung zu ermöglichen; sobald Paarkomplexe auf der Oberfläche der Elektrode gebildet werden, können die Redoxkomplexe die Oberfläche der Elektrode nicht erreichen, woraus sich eine Behinderung der Elektronenübertragung und eine Verringerung des elektrischen Ansprechens ergibt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Systems aus dem Stand der Technik, wie das in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 668 502 beschriebene;
Fig. 1A veranschaulicht das System und das elektrische Ansprechen vor der Bildung von Paarkomplexen;
Fig. 1B veranschaulicht das System und das elektrische Ansprechen nach der Bildung von Paarkomplexen.
Fig. 2 veranschaulicht allgemein ein System gemäß einer Ausführungsform, in der die Elektrode eine gemischte Monoschicht ist, die den immobilisierten Bestandteil des Paares zusammen mit einem immobilisierten katalytisch aktiven Redoxmolekül beinhaltet:
Fig. 2A zeigt ein System, bevor es einem Analyten ausgesetzt wird;
Fig. 2B zeigt ein System, nachdem es dem Analyten ausgesetzt wurde und sich Paarkomplexe gebildet haben.
Fig. 3 veranschaulicht allgemein ein System gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung, in der die Elektrode eine gemischte Monoschicht trägt, die den immobilisierten Bestandteil des Paares und ein immobilisiertes Elektronenvermittelndes Redoxmolekül umfaßt:
Fig. 3A veranschaulicht das System, bevor es dem Analyten ausgesetzt wurde;
Fig. 3B veranschaulicht das System, nachdem es dem Analyten ausgesetzt wurde und sich Paarkomplexe gebildet haben.
Fig. 4 veranschaulicht allgemein ein System gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, in dem zwei Redoxmoleküle, von denen eines ein elektronenvermittelndes Molekül und das andere ein katalytisch aktives Redoxmolekül ist, komplexiert oder aneinander gebunden sind:
Fig. 4A veranschaulicht das System, bevor es dem Analyten ausgesetzt wurde;
Fig. 4B veranschaulicht das System, nachdem die Elektrode dem Analyten ausgesetzt wurde und sich Paarkomplexe gebildet haben.
Fig. 5 veranschaulicht die Art und Weise der Modifizierung einer cystaminbedeckten Goldelektrode mit einer gemischten Monoschicht, die aus 2,6-Dinitrophenollysin und Mikroperoxidase besteht:
Fig. 5A veranschaulicht die Schritte der Modifikation;
Fig. 5B veranschaulicht die Struktur der Mikroperoxidase (MP).
Fig. 6 veranschaulicht die Funktion des ersten Redoxmoleküls (MP) auf den erhaltenen Elektroden und bei der elektrokatalytischen Reduktion des zweiten Redoxmoleküls (S&sub2;O&sub8;²&supmin;) wie in Abb. 5 gezeigt:
Fig. 6A veranschaulicht die Funktion und die schematische Wiedergabe der Stromantwort der Elektrode, bevor sie Antikörpern ausgesetzt war;
Fig. 6B veranschaulicht das System und die schematische Wiedergabe der Stromantwort der Elektrode, nachdem sie Antikörpern ausgesetzt war und sich Paarkomplexe gebildet haben.
Fig. 7 zeigt Cyclovoltammogramme, die mit Hilfe einer modifizierten Goldelektrode des Typs erhalten wurden, wie sie in Fig. 5 und 6 gezeigt sind:
(a) in einer Kontrolllösung, die 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0 und 0,1 M Na&sub2;SO&sub4; enthält;
(b) in Gegenwart von 50 mM K&sub2;S&sub2;O&sub8;;
(c) in der selben Lösung nach 20minütiger Inkubation der modifizierten Elektrode in einer Lösung, die 50 mg/ml Anti-Dinitrophenol Antikörper umfaßt. Potential-Ablastgeschwindigkeit ±10 mV/s; Temperatur ±25ºC.
Fig. 8 veranschaulicht die Art und Weise der Modifikation einer cystaminbedeckten Goldelektrode mit einer gemischten Monoschicht, die aus 2,6-Dinitrophenollysin und PQQ besteht.
Fig. 9 veranschaulicht die Funktion einer modifizierten Elektrode, die wie in Fig. 8 gezeigt erhalten wurde, wobei das erste Redoxmolekül, PQQ, als Elektrokatalysator für die Oxidation des zweiten Redoxmoleküls NADPH wirkt:
Fig. 9A veranschaulicht das System und eine schematische Wiedergabe der Stromantwort, bevor es einem Antikörper ausgesetzt wurde;
Fig. 9B veranschaulicht das System und eine schematische Wiedergabe der Stromantwort, nachdem es Antikörpern ausgesetzt war und sich Paarkomplexe gebildet haben.
Fig. 10 zeigt Cyclovoltammogramme, die mit Hilfe einer modifizierten Goldelektrode des Typs erhalten wurden, die in den Fig. 8 und 9 gezeigt sind:
(a) einer Kontrolllösung, die 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0 enthält;
(b) in Gegenwart von 10 mM NADPH und 20 mM Kalzium 2+;
(c) in derselben Lösung nach 20minütiger Inkubation der modifizierten Elektroden in einer Lösung, die 50 mg/ml Anti-Dinitrophenol Antikörper umfaßt. Potentialabtastgeschwindigkeit 2 mV/s; Temperatur 25ºC.
Fig. 11 zeigt die Beziehung zwischen dem Strom und der Antikörperkonzentration in Experimenten, die in der in Fig. 10(c) gezeigten Art und Weise mit unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen durchgeführt wurden.
Fig. 12 veranschaulicht die Art und Weise der Modifikation einer cystaminbedeckten Goldelektrode mit einer gemischten Monoschicht, die aus 2,6-Dinitrophenollysin und einer Ferrocengruppe besteht:
Fig. 13 veranschaulicht die Funktion einer Elektrode, die wie sie in Fig. 12 gezeigt erhalten wird, wobei das Ferrocen als das erste Redoxmolekül wirkt, Glukoseoxidase (GOD) als zweites Redoxmolekül und mit Glukose als Substrat:
Fig. 13A veranschaulicht das System und eine schematische Wiedergabe der Stromantwort, bevor die Elektrode Antikörpern ausgesetzt wurde;
Fig. 13B veranschaulicht das System und eine schematische Wiedergabe der Stromantwort, nachdem es Antikörpern ausgesetzt wurde und Paarkomplexe gebildet wurden;
Fig. 13C veranschaulicht die Funktion des elektrischen Ansprechverhaltens wie in Fig. 13A nach Zugabe von freier, d. h. nicht immobilisierter Ferrocenmonocarbonsäure.
Fig. 14 zeigt Cyclovoltammogramme, die mit Hilfe einer modifizierten Goldelektrode erhalten wurden, wie sie in den Fig. 12 und 13 gezeigt ist:
(a) in einer Kontrolllösung, die 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0 umfaßt;
(b) in derselben Lösung, die dazu 5 mg/ml GOD und 50 mM Glukose umfaßt;
(c) in derselben Lösung nach 20minütiger Inkubation der modifizierten Elektrode in einer Lösung, die 50 mg/ml Anti-Dinitrophenol Antikörper umfaßt;
(d) wie in (c), aber mit Zugabe von 0,5 mM Ferrocenmonocarbonsäure. Potentialabtastgeschwindigkeit 2 mV/s; Temperatur 35ºC.
Fig. 15 veranschaulicht die Art und Weise der Modifikation einer Goldelektrode, um eine Einkompenenten-2,6-Dinitrophenollysin-Monoschicht zu erhalten.
Fig. 16 veranschaulicht die Art und Weise des "elektrischen Verdrahtens" des Enzyms Glukoseoxidase (GOD) mit einer Vielzahl zufällig plazierter Ferrocengruppen.
Fig. 17 veranschaulicht die Funktionen eines Systems, das eine Elektrode umfaßt, wie sie in Fig. 15 gezeigt ist und ein "elektrisch verdrahtetes" GOD, das wie in Fig. 16 gezeigt hergestellt ist:
Fig. 17A veranschaulicht das System und eine schematische Wiedergabe der Stromantwort, bevor es Antikörpern ausgesetzt wurde;
Fig. 17B veranschaulicht das System und eine schematische Wiedergabe der Stromantwort, nachdem es Antikörpern ausgesetzt wurde und Paarkomplexe gebildet wurden;
Fig. 17C veranschaulicht die Wiederherstellung des elektrischen Ansprechverhaltens von Fig. 17A nach Zugabe freier Ferrocenmonocarbonsäure.
Fig. 18 veranschaulicht Cyclovoltammogramme, die mit Hilfe einer modifizierten Goldelektrode des in Fig. 17 gezeigten Typs erhalten wurden:
(a) in einer Kontrolllösung, die 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0 umfaßt;
(b) in derselben Lösung, die 5 mg/ml "verdrahtetes" GOD und 50 mM Glukose umfaßt;
(c) in derselben Lösung nach 20minütiger Inkubation der modifizierten Elektrode in einer Lösung, die 50 mg/ml Anti-Dinitrophenol Antikörper umfaßt;
(d) gleiche Elektrode in Lösung wie in (c), aber unter Zugabe von 0,5 mM Ferrocenmonocarbonsäure. Potentialabtastgeschwindigkeit 2 mV/s; Temperatur 35ºC.
Fig. 19 zeigt Änderungen der elektrokatalytischen Ströme in Experimenten, die wie in Fig. 15C durchgeführt wurden, nach 6minütiger Inkubation in einer Antikörperlösung, die unterschiedliche Antikörperkonzentrationen umfaßt.
Fig. 20 veranschaulicht den letzten Syntheseschritt bei der Herstellung eines FAD- Analogons, das kovalent mit einer Ferrocengruppe verbunden ist (FAD-Fc).
Fig. 21 veranschaulicht die Herstellung eines GOD Apoenzyms und seine Rekonstitution mit dem FAD-Fc, das wie in Fig. 20 gezeigt erhalten wurde.
Fig. 22 veranschaulicht die Funktion eines Systems, das eine Elektrode, wie in Fig. 15 gezeigt, umfaßt und ein rekonstituiertes Enzym, das wie in Fig. 21 erhalten wurde:
Fig. 22A veranschaulicht die Funktion des Systems und eine schematische Darstellung der Stromantwort, bevor es Antikörpern ausgesetzt wurde;
Fig. 22B veranschaulicht ein System und eine schematische Darstellung der Stromantwort, nachdem es Antikörpern ausgesetzt wurde und sich immobilisierte Paarkomplexe gebildet haben;
Fig. 22C veranschaulicht die Wiederherstellung des elektrischen Ansprechverhaltens nach Zugabe freier Ferrocenmoleküle.
Fig. 23 zeigt Cyclovoltammogramme, die mit Hilfe einer modifizierten Elektrode des Typs wie in Fig. 22 gezeigten Typs erhalten wurden:
(a) in einer Hintergrundlösung, die 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0 umfaßt;
(b) in derselben Lösung mit 5 mg/ml GOD, rekonstituiert mit FAD-Fc und 50 mM Glukose;
(c) in derselben Lösung wie in (b) nach 20minütiger Inkubation der modifizierten Elektrode in einer Lösung, die 50 mg/ml Anti-Dinitrophenol Antikörper umfaßt;
(d) wie in (c) aber unter Zugabe von 0,5 mM Ferrocenmonocarbonsäure. Potentialabtastgeschwindigkeit 2 mV/s; Temperatur 35ºC.
Fig. 24 veranschaulicht die Funktion eines Systems, umfassend eine modifizierte Elektrode, die mit einer Einkomponenten-2,6-Dinitrophenollysin-Monoschicht der Fig. 15 bedeckt ist und D-Alanin und D-Aminosäureoxidase (amino acid oxidase, AAO) rekonstituiert mit FAD-FC umfaßt:
Fig. 24A veranschaulicht das System und eine schematische Darstellung der Stromantwort, bevor die Elektrode einem Antikörper ausgesetzt wurde;
Fig. 24B veranschaulicht das System und eine schematische Darstellung der Stromantwort, nachdem es einem Antikörper ausgesetzt wurde und immobilisierte Paarkomplexe gebildet wurden.
Fig. 24C veranschaulicht die Wiederherstellung des in Fig. 24A erhaltenen elektrischen Ansprechverhaltens nach Zugabe freier Ferrocenmonocarbonsäure.
Fig. 25 zeigt ein Cyclovoltammogramm, das in einem System erhalten wurde, wie es durch Fig. 24 veranschaulicht wird:
(a) in eine Kontrolllösung, die 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0 umfaßt;
(b) wie in (a) unter Zugabe von 5 mg/ml AAO rekonstituiert mit FAD-Fc und 50 mM D-Alanin;
(c) dieselbe Lösung wie in (b), aber nach Inkubation der modifizierten Elektrode in einer Lösung, die 50 mg/ml Anti-Dinitrophenol Antikörper enhält;
(d) gleiche Elektrode und Lösung wie in (c), aber unter Zugabe von 0,5 mM Ferrocenmonocarbonsäure. Potentialabtastgeschwindigkeit 2 mV/s; Temperatur 35ºC.

Beschreibung der Erfindung im Einzelnen

Im Folgenden wird die Erfindung teilweise unter Bezugnahme auf einige nicht einschränkende spezielle Ausführungsformen beschrieben, die in den anliegenden Zeichnungen veranschaulicht sind. Es sollte selbstverständlich sein, daß diese spezielle Beschreibung nicht dazu gedacht ist, den Schutzbereich der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken, sondern nur durch Anführen eines Beispiels für die Art und Weise, in der sie ausgeführt werden kann, zu veranschaulichen.
Gemäß der Erfindung wird eine Elektrode verwendet, die durch eine Monoschicht bedeckt ist, welche Bestandteile eines Bindungspaares umfaßt, die darauf immobilisiert sind. Die Elektrode wird zur Bestimmung eines Analyten in einem Medium verwendet, das den anderen Bestandteil desjenigen Bindungspaares darstellt, das den immobilisierten Bestandteil des Paares einschließt. Gemäß einigen Ausführungsformen der Erfindung besteht die immobilisierte Schicht auf der Elektrode im Wesentlichen nur aus immobilisierten Bestandteilen des Paares. Gemäß anderen Ausführungsformen der Erfindung ist die Schicht immobilisierter Moleküle auf der Oberfläche der Elektrode eine gemischte Schicht, die sowohl den immobilisierten Bestandteil des Paares als auch immobilisierte Redoxmoleküle umfaßt.
Für das Verständnis der vorliegenden Erfindung wird zuerst auf Fig. 1 Bezug genommen, die ein System gemäß des Standes der Technik veranschaulicht, wie es in der europäischen Patentanmeldung Nr. 668 502 beschrieben wird. In diesem System ist eine Elektrode 2 von einer Monoschicht bedeckt, die aus einer Vielzahl von immobilisierten Bestandteilen des Paares 4 besetzt. Das System enthält darüber hinaus Redoxmoleküle (R), die entweder in einem oxidierten Zustand (Rox) oder in einem reduzierten Zustand (Rred) vorliegen können. Wird der Elektrode Energie zugeführt, so werden Elektronen zwischen der Elektrode und dem Redoxmolekül übertragen und abhängig von der Art der Übertragung der Elektronen verläuft das System auf einem Oxidations- oder Reduktionspfad. Das elektrische Ansprechverhalten der Elektrode ist schematisch auf der rechten Seite gezeigt.
Wird die Elektrode einem Medium ausgesetzt, das den Analyten enthält, wobei der Analyt in diesem Beispiel der Antikörper 6 ist, wie er in Fig. 1B gezeigt wird, bilden sich auf der Elektrode immobilisierte Paarkomplexe, die die immobilisierte Monoschicht dicker machen und die Diffusion der Redoxmoleküle zur Oberfläche der Elektrode hemmen. Aufgrund dieser behinderten Diffusion kommt es zu einem verringerten elektrischen Ansprechen, wie dies auf der rechten Seite schematisch zu sehen ist. In diesem System nach dem Stand der Technik ist der Wechsel der Elektronenübertragung mit einem Übertragungssschritt zwischen der Elektrode und dem Redoxmolekül verbunden. Im Unterschied dazu umfaßt der Elektronenübertragungspfad gemäß der Erfindung mindestens zwei Elektronenübertragungsschritte. Diese längere Kette der Elektronenübertragung erhöht die Empfindlichkeit und verringert Ungenauigkeiten, die als Ergebnis einer nicht perfekten immobilisierten Monoschichtstruktur auftreten. Die erhöhte Empfindlichkeit der Erfindung zeigt sich insbesonders, wenn eines der Redoxmoleküle auf der Elektrode immobilisiert ist und das andere ein verhältnismäßig großes Molekül mit einem verhältnismäßig hohen Molekulargewicht ist.
Der allgemeine Vorteil des Verfahrens gemäß der Erfindung liegt in einer beträchtlichen Verstärkung des Signal-Hintergrund-Verhältnisses verglichen mit dem Stand der Technik.
Eine schematische Veranschaulichung einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der Erfindung wird in Fig. 2 gezeigt. Gemäß dieser Ausführungsform trägt eine Elektrode 10 eine darauf immobilisierte Monoschicht 12, die immobilisierte Bestandteile des Paares 14 und ein katalytisches Redoxmolekül 16 umfaßt. Ein katalytisches Molekül 16 ist zum Austausch von Elektronen mit der Elektrode 10 fähig und verändert so seinen Redoxzustand. Durch Veränderung seines Redoxzustandes wird es katalytisch aktiv, wodurch es eine Änderung im Redoxzustand des Redoxmoleküls R auslöst. Die Elektrode 10 ist Teil eines Stromkreises, der eine Stromquelle 18 und eine Gegenelektrode 20 umfaßt.
Zusätzlich umfaßt das System typischerweise auch eine Referenzelektrode wie dies in elektrochemischen Systemen üblich ist, z. B. eine gesättigte Calomelelektrode (nicht gezeigt).
Fig. 2B zeigt das System, nachdem die Elektrode Analytmolekülen 22 ausgesetzt wurde, die beispielsweise ein Antikörper sein können, der bei Bindung zur Bildung von immobilisierten Paarkomplexen 24 führt, die eine Barriere für die Diffusion der Redoxmoleküle zum immobilisierten katalytischen Redoxmolekül 16 bilden. Infolgedessen kommt es zu Behinderungen in der Elektronenübertragungskette und zu einer beträchtlichen Verringerung des elektrischen Ansprechens des Systems. Da jedoch einige "Schlupflöcher" in der Monoschicht vorliegen, besteht die Möglichkeit einer gewissen Diffusion des Redoxmoleküls zur Oberfläche der Elektrode und demgemäß bleibt ein gewisses elektrisches Ansprechen sogar nach einer Sättigungsbindung der Analyten 22 am immobilisierten Bestandteil des Paares 14 vorhanden.
In den Fig. 3 und 4 werden zwei weiter bevorzugte Ausführungsformen beschrieben. Zur Erleichterung der Beschreibung wurden gleichen Elementen in diesen Ausführungsformen gleiche Bezugsziffern gegeben, die den in Fig. 2 verwendeten entsprechen, und der Leser wird auf die Beschreibung der Fig. 2 zur Erklärung der Funktion der jeweiligen Komponenten verwiesen.
Im System der Ausführungsform der Fig. 3 umfaßt die Monoschicht 25, die auf der Oberfläche der Elektrode 10 immobilisiert ist, immobilisierte Bestandteile des Paares 14 und elektronenvermittelnde Redoxmoleküle 26. Vermittlermoleküle 26 sind dazu fähig, Elektronen zwischen Elektrode 10 und einem löslichen, katalytischen aktiven Redoxmolekül 28 zu übertragen, das beispielsweise ein Enzym sein kann. Wird der Elektrode 10 Energie zugeführt, so werden Elektronen zwischen der Elektrode und Molekül 28 übertragen und Molekül 28 katalysiert daraufhin eine Reaktion, bei der ein Substrat S zu einem Produkt P umgewandelt wird, oder umgekehrt (abhängig von der Richtung der Redoxreaktion).
Die ordnungsgemäße Elektronenübertragung hängt von der Diffusion des Moleküls 28 zur Oberfläche der Elektrode ab, um in die Nähe des elektronenvermittelnden Moleküls 26 zu kommen. Bei Bindung der Analytmoleküle 22 und der Bildung von Paarkomplexen mit einer gewissen Größe wird die freie Diffusion des Moleküls 28 zur Oberfläche der Elektrode eingeschränkt und damit kommt es zu einer Behinderung der Elektronenübertragung und einer beträchtlichen Verringerung des elektrischen Ansprechens des Systems auf fast null.
Nun wird auf Fig. 4 Bezug genommen. In dieser Ausführungsform umfaßt die Monoschicht 30 auf der Elektrode 10 im Wesentlichen nur den immobilisierten Bestandteil des Paares 14. Das katalytisch aktive Molekül 32 ist an das elektronenvermittelnde Redoxmolekül 34 gebunden oder mit ihm komplexiert, so daß sie beide den Komplex 36 bilden. Wenn der Komplex 36 der Oberfläche der Elektrode 10 nahe kommt, ist das elektronenvermittelnde Molekül 34 bei Zufuhr von Energie zur Elektrode dazu fähig, Elektronen zwischen der Elektrode 10 und dem katalytischen Zentrum des Moleküls 32 zu übertragen. Bei Änderung des Redoxzustandes katalysiert Molekül 32, das beispielsweise ein Enzym sein kann, eine Reaktion, in der das Substrat in ein Produkt umgewandelt wird, oder umgekehrt.
Durch Bindung des Analytmoleküls 32 mit den immobilisierten Bestandteilen des Paares 14 wird, wie in Fig. 4B gezeigt, die Diffusion des Komplexes 36 an die Oberfläche der Elektrode eingeschränkt und demgemäß kommt es zu einer Behinderung der Elektronenübertragung zwischen Elektrode 10 und Molekül 32 und damit zu einer Verringerung des elektrischen Ansprechens des Systems.
Das elektrische Ansprechverhalten des Systems kann direkt bestimmt werden, indem die Elektrode mit dem passenden Potential geladen wird und alternativ durch eine Vielzahl elektrochemischer Methoden, wie Cyclovoltammetrie, Chronoamperimetrie, usw.. Es ist jedoch auch möglich, das elektrische Ansprechverhalten auf andere Weise zu messen, z. B. durch Messen des Ladungsflusses. Darüberhinaus ist es in Fällen, in denen die Reaktion zur Bildung eines Produkts führt, manchmal möglich das elektrische Ansprechverhalten indirekt durch Messung der Geschwindigkeit zu bestimmen, mit der sich das Produkt ansammelt.
Die Elektrode kann aus einer elektrisch leitenden Substanz hergestellt oder mit ihr beschichtet sein, wie beispielsweise Gold, Platin, Silber, leitendes Glas, wie Indiumzinnoxid (indium tin oxide, ITO), mit funktionalisiertem Alkoxysilan auf der äußeren Oberfläche (die Silanisierung einer ITO-Elektrode kann beispielsweise durch Erhitzen der Elektrode unter Rückfluß in einer Argonatmosphäre mit 3-Aminopropyltriethoxysilan in trockenem Toluol und anschließendem Trocknen in einem Ofen durchgeführt werden).
Der immobilisierte Bestandteil des Paares oder ein immobilisiertes Redoxmolekül können auf der Oberfläche der Elektrode mit Hilfe einer Verbindungsgruppe immobilisiert werden, die typischerweise die folgende allgemeine Formel (I) aufweisen kann:
Z-R¹-Q (I)
wobei
Z in Fällen, wo das Elektrodenmaterial eines der vorstehend erwähnten Metalle ist, eine Schwefel enthaltende Gruppierung darstellt, die dazu fähig ist, sich mit dem Metall chemisch zu assoziieren, zu verbinden oder darauf zu chemisorbieren; und in Fällen in denen das Elektrodenmaterial Glas ist Methoxy- oder Alkoxysilanreste darstellt, die dazu fähig sind, sich mit dem Glas chemisch zu assoziieren, zu verbinden oder darauf zu chemisorbieren;
R¹ eine verbindende Gruppe darstellt;
Q eine funktionelle Gruppe darstellt, die dazu fähig ist, eine kovalente Bindung mit einer Gruppierung des immobilisierten Bestandteils des Paares oder des ersten Redoxmoleküls auszubilden.
Ist das Elektrodenmaterial ein Metall, kann Z beispielsweise ein Schwefelatom, erhalten aus einer Thiolgruppe oder einer Disulfidgruppe, einer Sulfonat- oder Sulfatgruppe, sein.
R¹ kann eine kovalente Bindung sein oder ein Peptid oder Polypeptid, oder kann ausgewählt werden aus einer breiten Vielfalt passender Reste wie Alkylen-, Alkenylen-, Alkinylenresten, Phenyl enthaltenden Ketten und vielen anderen.
Besondere Beispiele von R¹ sind eine chemische Bindung oder ein Rest der folgenden Formeln (IIa), (IIb), (IIc) oder (IId)
wobei
R² oder R³ gleich oder unterschiedlich sein können, und lineare oder verzweigte Alkylen-, Alkenylen-, Alkinylenreste mit 1-16 Kohlenstoffatomen darstellen oder eine kovalente Bindung darstellen,
A und B gleich oder unterschiedlich sein können und O oder S darstellen können,
Ph ein Phenylrest ist, der gegebenenfalls zum Beispiel durch einen oder mehrere SO&sub3;- oder Alkylreste substituiert ist.
Q kann beispielsweise eine funktionelle Gruppe sein, die dazu fähig ist, an eine Carboxylgruppe eines Bestandteiles eines Erkennungspaares zu binden, wie eine Amingruppe, eine Carboxylgruppe, die dazu fähig ist an einen Aminrest eines Bestandteils eines Erkennungspaares zu binden; eine Isocyanat- oder Isothiocyanatgruppe oder ein Acylrest, der/die dazu fähig ist an einen Aminrest eines Bestandteiles eines Erkennungspaares zu binden; oder ein Halogenatom, das dazu fähig ist, an Hydroxygruppen des Proteins oder eines Polypeptids zu binden. Spezielle Beispiele sind die Gruppen NH&sub2;; -COOH; -N=C=S; -N=C=O; oder ein Acylrest der Formel -Ra-CO-G wobei G ein Wasserstoff-, ein Halogenatom, wie Cl, oder OH, ORb, eine
Gruppe oder eine N-O-O-Gruppe ist; Ra und Rb sind unabhängig voneinander ein C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkenyl-, Alkenyalrest oder eine Kette, die einen Phenylrest enthält, der gegebenenfalls, beispielsweise durch Halogenatom(e) substituiert ist. Besondere Beispiele von Verbindungsgruppen sind jene der folgenden Formeln (III) bis (VII)
HS-(CH&sub2;)n-NH&sub2; (III)
HS-(CH&sub2;)n-N=CH-(CH&sub2;)n (V)
in denen n eine ganze Zahl zwischen 1 und 6 ist.
Die Empfindlichkeit des Systems der Erfindung kann durch Verwendung von Analytmolekülen erhöht werden, die mit einem großen Molekül oder mit einer Gruppe von Molekülen konjugiert oder komplexiert sind (hier manchmal als "komplexierter Analyt" bezeichnet). Durch Binden mit dem immobilisierten Bestandteil des Paares behindern die komplexierten Analyten sterisch den Zutritt der Redoxmoleküle zum Elektrodenmaterial. In einer Ausführungsform gelingt dies durch Verwendung von Analyten, die mit einem großen Molekül oder einem Molekülkomplex konjugiert sind, wie beispielsweise ein Anti-Antikörper gegen einen Analytenantikörper, ein Antikörper gegen einen Proteinanalyten und dergleichen.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Elektrode Agentien ausgesetzt, die dazu fähig sind, an den gebunden Analyten zu binden, nachdem der Analyt an den immobilisierten Bestandteil des Paares binden konnte, wobei die Agentien, die mit dem gebundenen Analyten komplexieren, ein sterisches Hindernis erzeugen. Um das sterische Hindernis nach der Bildung eines anfänglichen Komplexes zu erhöhen, wird die Elektrode mit Anti-Agentien umgesetzt, die an den Agentien, die bereits mit dem immobilisierten Analyten verbunden oder komplexiert sind, binden oder komplexieren, beispielsweise ein Anti-Antikörper, und dies verursacht eine Erhöhung der Größe des Komplexes und damit auch eine Erhöhung des sterischen Hindernisses.
Durch Erhöhung der Empfindlichkeit des Systems auf die oben beschriebene Art und Weise kann teilweise eine Veränderung des elektrischen Ansprechverhaltens der Elektrode nach Anbindung von nur einigen wenigen Analytmolekülen an der Elektrode gemessen werden.

Beispiele

Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen weiter veranschaulicht. In diesen Beispielen waren die Elektroden mit einer Monoschicht bedeckt, die das Antigen Dinitrophenyl (DNP) umfassen, an das dann Anti-DNP Antikörper gebunden wurden. Es sollte klar sein, daß es sich dabei um lediglich ein Beispiel aus einer unermeßlichen Vielfalt von Antigenen handelt, die auf der Oberfläche der Elektrode immobilisiert sein können. Darüber hinaus ist es klar, daß das Antikörper-Antigen-Erkennungspaar ebenfalls ein Beispiel einer Vielzahl von weiteren solcher Paare ist, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wobei einer/eines von beiden auf der Elektrode immobilisiert ist und der/das andere den analysierten Analyten darstellt.
Die gleiche vorstehende allgemeine Bemerkung gilt auch für alle anderen speziellen Reagentien, Enzyme, Katalysatoren, Redoxmoleküle, usw., die nachfolgend in den speziellen Ausführungsformen gezeigt sind.

1. Charakterisierung der Elektrode und elektrochemischer Aufbau

Eine Goldelektrode (Golddraht von 0,5 mm Durchmesser mit einer geometrischen Fläche von etwa 0,2 cm²) wurde für alle Modifikationen und Messungen verwendet. Ein Cyclovoltammogramm, das in 0,5 molarer H&sub2;SO&sub4; aufgenommen wurde, wurde zur Bestimmung der Reinheit der Elektrodenoberfläche unmittelbar vor der Modifizierung verwendet. Die tatsächliche Elektrodenoberfläche und der Rauheitskoeffizient (ca. 1,1) wurden aus demselben Cyclovoltammogramm durch Integration des Kathodenpeaks der elektrochemischen Reduktion der Oxidschicht auf der Elektrodenoberfläche abgeschätzt.
Elektrochemische Messungen wurden unter Verwendung eines Potentiostaten (EG&G VersaStat) durchgeführt, der an einen Personal Computer (EG&G research electrochemistry software model 270/250) angeschlossen war. Alle Messungen wurden in einer elektrochemischen Zelle mit drei Kompartimenten durchgeführt, die die chemisch modifizierte Elektrode als Arbeitselektrode umfaßte, eine verglaste Kohlenstoffhilfselektrode, durch eine Glasfritte isoliert, und eine gesättigte Calomelelektrode (SCE), die mit dem Arbeitsvolumen durch eine Lugginkapillare verbunden war. Alle Potentiale werden in Bezug auf diese Referenzelektrode (SCE) angegeben. Durchspülen mit Argon wurde zur Entfernung des Sauerstoffs aus den Lösungen in der elektrochemischen Zelle verwendet. Während der Messungen wurde die Temperatur der Zelle durch fließendes Wasser in einer Ummantelung der Zelle geregelt.

2. Schritte, die der Elektrodenmodifizierung vorangehen

2.1 Reinigung der Elektrodenoberfläche

Um die vorher vorliegende organische Schicht zu entfernen und eine blanke Metalloberfläche wiederherzustellen, wurde die Elektrode durch einstündiges Kochen in einer 2 M KOH-Lösung behandelt, anschließend mit Wasser gespült und in konzentrierter Schwefelsäure gelagert. Unmittelbar vor der weiteren Modifizierung wurde die Elektrode mit Wasser gespült, 10 Minuten in konzentrierter Salpetersäure getränkt und dann nochmals mit Wasser gespült.

2.2 Modifizierung der Elektrode mit Cystamin

Eine gereinigte, blanke Goldelektrode wurde 2 Stunden lang in einer 0,02 M Cystaminlösung (2,2'-Diaminodiethylsulfid, Aldrich) in Wasser getränkt (vgl. den ersten Schritt im Verfahren, das in Fig. 15 veranschaulicht ist). Die Elektrode wurde dann gründlich mit Wasser gespült, um überschüssiges Cystamin zu entfernen.

3. Elektroden mit einer gemischten Monoschicht bestehend aus einer Antigenkomponente und einer Katalysator(Elektronenübertragungsvermittler)komponente

3.1 Dinitrobenzolderivat als Antigen und Mikroperoxidase als Katalysator

Eine Goldelektrode, die mit einer Cystaminmonoschicht modifiziert war, wurde 1 Stunde mit einer 0,01 M HEPES Pufferlösung, pH 7,3 getränkt, die 3 mM 2,6-Dinitrophenyllysin (als Antigen), 1 mM des Katalysators Mikroperoxidase MP-11 (Aldrich) und 10 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, Aldrich), das als Kopplungsreagenz diente, enthielt. Danach wurde die modifizierte Elektrode gründlich mit Wasser gespült, um von ihrer Oberfläche nicht gekoppelte, physikalisch absorbierte Komponenten zu entfernen. Das Modifizierungsschema ist in Fig. 5 veranschaulicht. Ein Cyclovoltammogramm wurde im Potentialfenster von 0 V bis -0,6 V mit einer Potentialabtastgeschwindigkeit von 0,1 V/s&supmin;¹ aufgenommen und der elektrochemisch reversible Redoxprozeß der immobilisierten Mikroperoxidase wurde verwendet, um ihre Oberflächendichte auf der Elektrodenoberfläche zu bestimmen. Der erhaltene Wert von ungefähr 3·10&supmin;¹¹ war ungefähr halb so groß wie derjenige, der für eine Einkomponentenmonoschicht erhalten wird, die ausschließlich durch Mikroperoxidase gebildet wird.
Die Funktionsweise der erhaltenen Elektrode ist aus Fig. 6 ersichtlich. Wenn die Elektrode 40 immobilisierte 2,6-Dinitrophenyllysin-Moleküle 42 (das Dreieck stellt die Dinitrophenyl(DNP)gruppierung dar) und Mikroperoxidase(MP)moleküle umfaßt. Wird der Elektrode 40 Energie zugeführt, so werden Elektronen auf das MP-Molekül übertragen und in Folge davon katalysiert das MP-Molekül die Reduktion von S&sub2;O&sub8;²&supmin; zu SO&sub4;²&supmin;. Wird die Elektrode dann einem Anti-DNP-Antikörper 44 ausgesetzt, der an die immobilisierten DNP- Gruppierungen auf der Elektrode bindet, wie es in Fig. 6B gezeigt ist, wird die Monoschicht auf der Oberfläche der Elektrode dicker und hemmt so die Diffusion des S&sub2;O&sub8;²&supmin; und des SO&sub4;²&supmin; zu den immobilisierten MP-Molekülen hin, bzw. von ihnen weg. Im Ergebnis zeigt sich nach Anbindung der Antikörper eine Verringerung des elektrischen Ansprechens des Systems.
Cyclovoltammogramme, die in diesem System erhalten wurden (bei 25ºC) sind in Fig. 7 gezeigt. Die Kurve b zeigt das Cyclovoltammogramm, das in Gegenwart von 50 mM K&sub2;S&sub2;O&sub8; erhalten wurde (anschließend elektrisch reduziert durch Mikroperoxidase), 0,01 M Phosphatpuffer und 0,1 M Na&sub2;SO&sub4;. Kurve a zeigt zum Vergleich ein Cyclovoltammogramm, das in Abwesenheit von K&sub2;S&sub2;O&sub8; aufgenommen wurde. Der erhebliche Anstieg des Kathodenstroms zwischen Kurve a und Kurve b ergibt sich aus der elektrokatalytischen Reduktion von K&sub2;S&sub2;O&sub8;. Kurve c zeigt ein Cyclovoltammogramm, das unter denselben Bedingungen erhalten wurde, wie das Cyclovoltammogramm der Kurve b, aber nach Tränken der Elektrode über 20 Minuten in einer Lösung, die 50 mg/ml DNP-Antikörper (monoklonales Maus IgE Anti-DNP, Sigma, St. Louis) enthält und anschließendem Spülen in Wasser, um überschüssige Antikörper zu entfernen. Die signifikante Verringerung des elektrokatalytischen Kathodenstroms ergibt sich aus dem blockierenden Effekt des Antikörpers, der an die Elektrodenoberfläche gebunden ist.
In Kontrollversuchen erzielte ein nicht spezifisch adsorbiertes Protein, wie Albumin, oder eine Elektrode, die ausschließlich mit Mikroperoxidase beschichtet war (ohne das Antigen) keinerlei Verringerung des Kathodenstromes nach Aussetzen an Anti-DNP- Antikörper.

3.2 Dinitrobenzolderivate als Antigen und Pyrrolochinolinchinon als Katalysator

Eine Goldelektrode, die so mit einer Cystaminmonoschicht modifiziert wurde, wurde 3 Stunden in einer 0,01 M HEPES Pufferlösung, pH 7,3 getränkt, die 3 mM 2,6- Dinitrophenollysin (Aldrich) (als Antigen), 1 mM des Katalysators Pyrrolochinolinchinon (PQQ) (Aldrich) und 10 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, Aldrich) (als Kopplungsreagenz) enthielt. Danach wurde die modifizierte Elektrode gründlich mit Wasser gespült, um von ihrer Oberfläche nicht gekoppelte, physikalisch adsorbierte Komponenten zu entfernen. Das Modifikationsschema wird in Fig. 8 veranschaulicht. Ein Cyclovoltammogramm wurde im Potentialfenster von +0,1 V bis -0,5 V mit einer Potentialabtastgeschwindigkeit von 0,05 V/s&supmin;¹ aufgenommen und der elektrochemisch reversible Redoxprozeß des immobilisierten PQQ wurde zur Bestimmung seiner Oberflächendichte auf der Elektrodenoberfläche verwendet. Der erhaltene Wert von ungefähr 3·10&supmin;¹¹ mol·cm&supmin;² war etwa viermal geringer als der, der für eine Einkomponentenmonoschicht erhalten wird, die ausschließlich durch PQQ gebildet wird.
Die Funktion der erhaltenen Elektrode wird in Fig. 9 veranschaulicht. Den Komponenten der Fig. 6 entsprechende Komponenten wurden mit denselben Bezugsziffern versehen, und der Leser wird auf die Beschreibung der Fig. 6 für eine vollständige Erklärung verwiesen. In diesem Beispiel ist im Unterschied zu dem in Fig. 6 veranschaulichten der Katalysator PQQ, der durch Reduktion katalytisch aktiv wird und NADPH zu NADP&spplus; oxidiert. NADPH ist ein vergleichsweise großes Molekül, und das Anbinden des Antikörpers 44 an das immobilisierte Antigen 42 blockiert den Zutritt von NADPH zum immobilisierten PQQ sehr viel effektiver als dies für das Blockieren der Diffusion von S&sub2;O&sub8;²&supmin; im Beispiel der Fig. 6 der Fall ist.
Cyclovoltammogramme, die mit diesem System erhalten wurden, sind in Fig. 10 gezeigt (alle wurden bei 25ºC durchgeführt). Kurve b zeigt ein Cyclovoltammogramm, das in Gegenwart von 10 mM NADPH (dabei handelt es sich um ein Substrat, das durch PQQ elektrokatalytisch oxidiert wird), 20 mM Calzium²&spplus; (das einen Aktivator für die Elektrooxidation von NADPH durch PQQ darstellt), 0,1 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0 erhalten wurde. Kurve a wurde zum Vergleich in Abwesenheit von NADPH aufgenommen, was zeigt, daß der hohe Kathodenstrom der Kurve b ein Ergebnis der elektrokatalytischen Oxidation von NADPH ist. Tränken der Elektrode über 20 Minuten in derselben Anti-DNP Antikörperlösung wie in Abschnitt 3.1 ergab eine vollständige Hemmung der elektrokatalytischen Oxidation von NADPH (Kurve c).
Fig. 11 zeigt, daß der anodische elektrokatalytische Strom von der Antikörperkonzentration abhängt und sich bei Zunahme der Antikörperkonzentration einem Sättigungswert nähert.

3.3 Dinitrobenzolderivat als Antigen und Ferroceneinheiten als Elektronenübertragungsvermittler

Eine Goldelektrode, die mit einer Cystaminmonoschicht modifiziert war, wurde über drei Stunden in einer 0,01 M HEPES Pufferlösung, pH 7,3 getränkt, die 3 mM 2,6-Dinitrophenollysin (Aldrich) (als Antigen), 1 mM eines Ferrocencarbonsäurederivats mit einem langen Spacer zwischen der Ferroceneinheit und der Carbonsäuregruppe (als Elektronenübertragungsvermittler) und 10 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, Aldrich), das als Kopplungsreagenz diente, enthielt. Danach wurde die modifizierte Elektrode gründlich mit Wasser gespült, um von ihrer Oberfläche nicht gekoppelte, physikalisch adsorbierte Komponenten zu entfernen. Das Modifikationsschema wird in Fig. 12 veranschaulicht. Ein Cyclovoltammogramm wurde im Potentialfenster von - 0,1 V bis +0,55 V mit einer Potentialabtastgeschwindigkeit von 0,1 V/s&supmin;¹ aufgenommen und der elektrochemisch reversible Redoxprozeß des immobilisierten Ferrocens wurde zur Bestimmung seiner Oberflächendichte auf der Elektrodenoberfläche verwendet. Der erhaltene Wert von ungefähr 2,5·10&supmin;¹&sup4; mol·10&supmin;² war ungefähr viermal geringer als derjenige der für eine Einkomponentenmonoschicht erhalten wird, die ausschließlich durch Ferrocen gebildet wird.
Nun wird Bezug genommen auf Fig. 13, die ein System veranschaulicht, das die vorstehende Elektrode enthält. Das System umfaßt eine Elektrode 50 mit einer immobilisierten Schicht 51, die immobiliserte Ferrocenmoleküle und Antigene 52 umfaßt. Das System umfaßt darüber hinaus eine Glukoseoxidase (GOD) 54, die eine Reaktion katalysieren kann, in der Glukose zu Glukonsäure oxidiert wird. Unter normalen Bedingungen kann das GOD sich der Elektrode nähern, wobei eine Übertragung von Elektronen zwischen dem GOD und dem ersten Redoxmolekül (dem immobilisierten Ferrocen) möglich ist und aufgrund dieser Übertragung katalysiert das GOD die Oxidationsreaktion und es kommt zu einem vergleichsweise starken elektrischen Ansprechen, wie dies im schematischen Cyclovoltammogramm gezeigt ist, das auf der rechten Seite gezeigt wird.
Durch Anbinden der Antikörper 56 an die Antigene 52 wird der Zugang der GOD- Moleküle zu den immobilisierten Ferrocen-Molekülen blockiert, und in Folge davon kommt es nicht zu einer Elektronenübertragung und zu keiner Oxidation von Glukose. Dies gibt ein ausgesprochen geringes elektrisches Ansprechen, wie dies schematisch im Cyclovoltammogramm dargestellt wird, das auf der rechten Seite gezeigt ist. Die Elektronenübertragungskette kann durch Zugabe von freien Ferrocenmonocarbonsäuremolekülen zu dem System wieder hergestellt werden, wie dies in Fig. 13C gezeigt ist.
Cyclovoltammogramme, die in solchen Systemen, bei (35ºC) erhalten werden, werden in Fig. 14 gezeigt. Das Cyclovoltammogramm der Kurve b wurde in Gegenwart von 5 mg/ml Glukoseoxidase (GOD) aus Aspergillus niger, EC 1.1.3.4, Sigma und 50 mM Glukose (ein Substrat, das durch GOD elektrokatalytisch oxidiert wird), 0,01 M Phosphatpuffer und 0,1 M Na&sub2;SO&sub4; erhalten. Zum Vergleich wurde Kurve a in Abwesenheit von Glukose aufgenommen und der sehr starke Anstieg des Anodenstroms ist ein Ergebnis der elektrokatalytischen Oxidation von Glukose durch das GOD. Dieser biokatalytische Prozeß läuft ausschließlich in Gegenwart von Ferroceneinheiten ab, die die Elektronenübertragung vom solubilisierten GOD auf die Elektrode erleichtern. Wurde die modifizierte Elektrode für 20 Minuten in einer Lösung getränkt, die 50 mg/ml Anti-DNP-Antikörper enthielt, kam es zu einem im Wesentlichen vollständigen Verschwinden des Anodenstromes (Kurve c), was die Tatsache anzeigt, daß die elektrokatalytische Oxidation von Glukose durch die Antikörpermonoschicht vollständig blockiert wird. Wie aus Kurve d ersichtlich wird, wurde durch Zugabe von solubilisierter Ferrocenmonocarbonsäure (Aldrich) in einer Konzentration von 5·10&supmin;³, die dann als in seiner Diffusion bewegliche Elektronenübertragungsvermittler dient, der Anodenstrom fast auf seinen Normalwert wiederhergestellt.

4. Elektroden mit einer Monoschicht, die nur aus einer Antigen-Komponente besteht

4.1 Dinitrobenzolderivat als in einer Monoschicht immobilisiertes Antigen auf einer Elektrodenoberfläche und Glukoseoxidase, die mit vielen Ferroceneinheiten modifiziert ist, als solubilisierte biokatalytischer Sonde

Eine Goldelektrode, die mit einer Cystaminmonoschicht modifiziert war, wurde für drei Stunden in einer 0,01 molaren HEPES Pufferlösung, pH 7,3, getränkt, die 3 mM 2,6-Dinitrophenollysin (Aldrich) (als Antigen) und 10 mM 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, Aldrich) (als Kopplungsreagenz) enthielt. Danach wurde die modifizierte Elektrode gründlich mit Wasser gespült, um von ihrer Oberfläche nicht gekoppelte, physikalisch adsorbierte Komponenten zu entfernen. Das Modifikationsschema ist in Fig. 15 veranschaulicht. Glukoseoxidase (GOD) wurde mit vielen Ferroceneinheiten durch Koppeln der Aminogruppen der Lysinreste mit dem Ferrocencarbonsäurederivat in Gegenwart eines Carbodiimid-Kopplungsreagenz (EDC) kovalent modifiziert, danach wurde das modifizierte Enzym gemäß einem bekannten Verfahren gereinigt. Das Schema der Enzymmodifikation und die Struktur des modifizierten Enzyms sind in Fig. 16 veranschaulicht.
Die Funktion eines Systems, das die vorstehende Elektrode umfaßt, ist in Fig. 17 veranschaulicht. Ähnlich wie in Fig. 13 kann unter normalen Bedingungen das modifizierte Enzym 64 sich der Oberfläche einer Elektrode 60 nähern und Elektronen können zwischen dem Redoxzentrum des Enzyms und den daran gebundenen Ferrocengruppen übertragen werden und von dort auf die Oberfläche der Elektrode, was zur Glukoseoxidation führt. Binden Antikörper 66 an die immobilisierten Antigene 62, dann kann das modifizierte Enzym 64 der Oberfläche der Elektrode nicht nahekommen und demgemäß wird das elektrische Ansprechen des Systems im wesentlichen vollständig eliminiert. Die Elektronenübertragungskette kann durch Zugabe von freien Ferrocencarbonsäuremolekülen zum Medium wiederhergestellt werden, wie in Fig. 17C gezeigt.
Fig. 18 zeigt Cyclovoltammogramme, die in dem in Fig. 17 veranschaulichten System erhalten wurden. Alle Cyclovoltammogramme wurden bei 35ºC durchgeführt. Cyclovoltammogramme wurden in Gegenwart von 5 mg/ml ferrocenmodifiziertem GOD, 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 und 0,1 M Na&sub2;SO&sub4; aufgenommen. Unter diesen Bedingungen zeigte sich im Wesentlichen kein Anodenstrom (Kurve a). Sobald Glukose zugeben wurde (50 mM), zeigte sich ein sehr starkes Anwachsen des Anodenstroms (Kurve b). Nach Tränken der Elektrode in einer Anti-DNP Antikörperlösung (50 mg/ml) über 20 Minuten, gefolgt von Spülen mit Wasser, war der Anodenstrom im Wesentlichen vollständig verschwunden (Kurve c). Der elektrokatalytische Prozeß konnte zu einem gewissen Ausmaß wiederhergestellt werden, indem 5·10&supmin;³ M freie Ferrocenmonocarbonsäure zugegeben wurden (Kurve d).
Fig. 19 zeigt die Ergebnisse aus unterschiedlichen Experimenten, die wie oben durchgeführt wurden, bei unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen. Wie zu sehen ist, hängt die Änderung des Anodenstromes von der Antikörperkonzentration ab.

4.2 Fluoresceinderivat als in einer Monoschicht immobilisiertes Antigen auf einer Elektrodenoberfläche und Glukoseoxidase, die mit vielen Ferroceneinheiten modifiziert ist, als solubilisierter biokatalytische Sonde

Eine Goldelektrode, die mit einer Cystaminmonoschicht modifiziert war, wurde für drei Stunden in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung, pH 8,9, getränkt, die 5 mM Fluorescein isothiocyanat (Isomer 1, Aldrich) (als Antigen) enthielt. Die kovalente Verknüpfung der Fluoresceineinheiten mit der Cystaminmonoschicht war das Ergebnis einer spontanen Umsetzung der auf der Oberfläche vorliegenden Aminogruppen und der Isothiocyanatgruppen, durch die Thioamidbindungen entstanden. Danach wurde die modifizierte Elektrode gründlich mit Wasser gespült, um von ihrer Oberfläche nicht gekoppelte, physikalisch adsorbierte Komponenten zu entfernen. Die mit dem Antigen modifizierte Elektrode wurde in einem elektrochemischen Immunoassay verwendet, wie es in Abschnitt 4.1 beschrieben ist, mit dem einzigen Unterschied dass der zugegebene Antikörper ein Anti-Fluorescein (FITC) monoklonaler Antikörper (Sigma) war. Alle elektrochemischen Messungen wurden bei 35ºC durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind den für das vorstehend beschriebene Beispiel 4.1 sehr ähnlich.

4.3 Dinitrobenzolderivat als in einer Monoschicht immobilisiertes Antigen auf einer Elektrodenoberfläche und Glukoseoxidase, rekonstituiert mit halbartifiziellem FAD das kovalent mit einer Ferroceneinheit verknüpft ist

Eine Goldelektrode, die mit einer Cystaminmonoschicht modifiziert war, wurde zusätzlich wie vorstehend beschrieben mit 2,6-Dinitrophenollysin modifiziert. Ein GOD Apoenzym wurde mit Hilfe eines bekannten biochemischen Verfahrens erhalten. Ein halbartifizielles FAD (N&sup6;-(2-Aminoethyl)-FAD), das eine primäre Aminogruppe aufwies, die durch zwei Methylengruppen vom FAD-Molekül getrennt war, wurde mit einem Ferrocencarboxylderivat unter Verwendung eines Carbidiimid-Kopplungsreagens kovalent verbunden, das eine Amidbindung zwischen den beiden Komponenten erzeugt. Das FAD- Derivat, das kovalent mit der Ferroceneinheit verbunden war (FAD-Fc) wurde verwendet, um das GOD Apoenzym zu rekonstituieren. Der letzte Syntheseschritt bei der Herstellung des FAD-Fc, die Herstellung des GOD Apoenzyms und seine Rekonstitution mit FAD-Fc sind in Fig. 21 bzw. 22 veranschaulicht.
Das System, das diese Elektrode umfasst, wird schematisch in Fig. 22 veranschaulicht. Das System ist grundsätzlich dem in Fig. 17 gezeigten ähnlich, und dementsprechend wurden gleiche Ziffern verwendet, um gleiche Komponenten zu bezeichnen. Der einzige Unterschied besteht darin, dass die Ferrocengruppe hier an das FAD-Derivat anstatt an das Enzym gebunden ist.
Ergebnisse für die Cyclovoltammetrie, die unter ähnlichen Bedingungen erhalten wurden wie die in Abschnitt 4.2 beschriebenen, sind in Fig. 23 gezeigt. Wie zu sehen ist, sind die Ergebnisse qualitativ denen der Fig. 18 ähnlich: im Wesentlichen kein Strom in Abwesenheit von Glukose (Kurve a), ein starker Anstieg des Anodenstromes nach Zugabe von Glukose (Kurve b), im Wesentlichen vollständiges Verschwinden des Stromes nach Zugabe von Anti-DNP Antikörpern zu der Elektrode (Kurve c) und danach Wiederherstellung des elektrischen Ansprechverhaltens in Folge der Zugabe von freien Ferrocenmonocarbonsäuremolekülen (Kurve d).

4.4 Dinitrobenzolderivat als in einer Monoschicht immobilisiertes Antigen auf einer Elektrodenoberfläche und Aminosäureoxidase, rekonstituiert mit halbartifiziellem FAD das kovalent mit einer Ferroceneinheit verknüpft ist

Das vorliegende Beispiel ist fast mit dem von 4.3 identisch, mit dem einzigen Unterschied das D-Aminosäureoxidase (AAO, EC 1.4.3.3, Sigma), rekonstituiert mit FAD-Fc und das entsprechende Substrat (D-Alanin) statt der rekonstituierten GOD bzw. Glukose verwendet wurden. Das System, das im wesentlichen dem der Fig. 22 entspricht, wird in Fig. 24 veranschaulicht (in dieser Figur werden die selben Bezugsziffern wie in Fig. 22 verwendet). Die für dieses System erhaltenen Ergebnisse werden in Fig. 25 veranschaulicht und sind qualitativ denen der Fig. 23 ähnlich: Hintergrund (Kurve a), nach Zugabe von Glukose (Kurve b), nach Aussetzen an Anti-DNP Antikörper (Kurve c) und nach Zugabe von löslicher Ferrocenmonocarbonsäure (Kurve d).

Claims

1. Elektrochemisches System zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einem flüssigen Medium, wobei das System umfaßt:

Redox-Moleküle, die mindestens ein erstes Redox-Molekül und mindestens ein zweites Redox-Molekül umfassen, wobei das erste Molekül Elektronen zwischen einer Elektrode und dem zweiten Molekül transportiert; und

an die Elektrode ein Element eines Erkennungspaares gebunden ist, wobei der Analyt das andere Element des Paares ist, wodurch das Vorhandensein des Analyten in dem Medium die Bildung eines Paarkomplexes zur Folge hat, wobei es sich um einen Komplex zwischen dem gebundenen Element und dem Analyten handelt;

Bildung des Paarkomplexes, der den Elektronentransfer hemmt, und Änderung des elektrischen Ansprechverhaltens des Systems als Folge davon, was das Vorhandensein des Analyten in dem Medium anzeigt.

2. System nach Anspruch 1, wobei das erste Redox-Molekül ein katalytisch aktives Molekül ist, welches beim Transfer von Elektronen zum zweiten Redox-Molekül eine Reaktion bewirkt, bei der das zweite Redox-Molekül in ein oder mehrere Produkte umgewandelt wird.

3. System nach Anspruch 1, wobei das erste Redox-Molekül ein elektrischer Vermittler ist und das zweite Redox-Molekül ein katalytisch aktives Molekül ist, das System weiter ein drittes Redox-Molekül umfaßt, welches durch das zweite Redox-Molekül in ein Produkt umgewandelt wird.

4. System nach Anspruch 2 oder 3, wobei das erste Redox-Molekül an die Elektrode gebunden ist.

5. System nach Anspruch 2 oder 3, wobei das erste und das zweite Redox-Molekül aneinander komplexiert sind.

6. Elektrochemisches Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einem flüssigen Medium, wobei das Verfahren umfaßt:

a) Bereitstellen einer Elektrode, an die ein Element eines Erkennungspaares gebunden ist, wobei es sich bei dem Analyten um das andere Element des Paares handelt; wobei an die Elektrode gegebenenfalls ein erstes Redox- Molekül gebunden ist, das in der Lage ist, Elektronen zwischen der Elektrode und einem zweiten Redox-Molekül zu transportieren;

b) Kontaktieren der Elektrode mit dem flüssigen Medium, wodurch das Vorhandensein des Analyten darin die Bildung von Paarkomplexen an der Oberfläche der Elektrode zur Folge hat, bei denen es sich um Komplexe zwischen dem gebundenen Element und dem Analyten handelt;

c) Kontaktieren der Elektrode mit dem zweiten Redox-Molekül und, wenn das erste Redox-Molekül nicht an die Elektroden gebunden ist, auch mit dem ersten Redox-Molekül;

d) Laden der Elektrode, wodurch Elektronen durch Vermittlung des ersten Redox- Moleküls zwischen der Elektrode und dem zweiten Redox-Molekül transportiert werden, was ein elektrisches Ansprechverhalten bewirkt, wobei eine Änderung des elektrischen Ansprechverhaltens im Anschluß daran, daß die Elektrode dem Medium ausgesetzt wurde, das Vorhandensein des Analyten in dem Medium anzeigt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erste Redox-Molekül ein katalytisch aktives Molekül ist, das beim Transfer von Elektronen zum zweiten Redox-Molekül eine Reaktion bewirkt, bei der das zweite Redox-Molekül in ein oder mehrere Produkte umgewandelt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erste Redox-Molekül ein elektrischer Vermittler ist und das zweite Redox-Molekül ein katalytisch aktives Molekül ist, das eine Reaktion katalysiert, bei der ein drittes Redox-Molekül in ein Produkt umgewandelt wird, und Schritt (c) auch das Kontaktieren der Elektrode mit dem dritten Redox- Molekül umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, wobei das erste Redox-Molekül an die Elektrode gebunden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, wobei das erste Redox-Molekül und das zweite Redox-Molekül aneinander komplexiert sind.