DE69735580T2

DE69735580T2 - An aminosaeure angereicherte speicherproteine, insbesondere an lysin angereicherte mais-gamma-zeine, und diese exprimierende pflanzen

Info

Publication number: DE69735580T2
Application number: DE69735580T
Authority: DE
Inventors: Centro de Investigacion y Dolorès LUDEVID; Centro de Investigacion y Margarita TORRENT; Centro de Investigacion y Inaki ALVAREZ; Pascual Perez
Original assignee: Biogemma SAS
Current assignee: Biogemma SAS
Priority date: 1996-01-29
Filing date: 1997-01-28
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2017-01-29
Also published as: AU1550297A; EP0877754B1; FR2744134B1; DE69735580D1; US7297847B1; CA2242903C; WO1997028247A3; EP0877754A2; WO1997028247A2; FR2744134A1; ATE321774T1; ES2262172T3; CA2242903A1

Description

Die vorliegende Übersetzung betrifft neue Mittel zur Herstellung von Pflanzen, die Speicherproteine exprimieren, die an Aminosäuren angereichert sind, welche in den normalen Speicherproteinen nur in ungenügenden Mengen vorkommen, insbesondere an Lysin angereicherte Speicherproteine. Außerdem betrifft die Erfindung die so modifizierten Speicherproteine sowie Pflanzen, die diese modifizierten Speicherproteine exprimieren. Unter diesen Speicherproteinen betrifft die Erfindung Speicherproteine aus der Familie der Zeine.
Zahlreiche Pflanzen, gegebenenfalls nach Transformation mittels chemisch-physikalischer Schritte, sind ökonomisch sehr wichtig für die menschliche oder tierische Ernährung, und das Problem der Verbesserung ihrer ernährungsphysiologischen Eigenschaft hat bereits zu Forschung verschiedener Art geführt. Insbesondere hat man, um dem Problem des Mangels an gewissen Aminosäuren in den Speicherproteinen der Pflanzen zu begegnen, ausgewählte Sorten produziert, die eine verbesserte ernährungsphysiologische Eigenschaft aufweisen, bzw. wurden unterschiedliche Modifikationen vorgeschlagen, bei denen gentechnische Methoden verwendet werden, um die Produktion von insbesondere gewissen Aminosäuren, die in ungenügenden Mengen vorkommen, jedoch für die ernährungsphysiologischen Eigenschaften der Pflanze wichtig sind, zu begünstigen oder zu erhöhen. Bei diesen Aminosäuren, die in ungenügenden Mengen vorkommen, handelt es sich zum Beispiel um Lysin oder Methionin.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung haben die Erfinder vorgeschlagen, dem Problem der züchterischen Verbesserung von Pflanzen, insbesondere der züchterischen Verbesserung ihrer ernährungsphysiologischen Eigenschaften, mit einer neuen Lösung zu begegnen, wobei man sich auf eine ökonomisch htige Pflanze, nämlich den Mais, konzentriert hat. Genauer gesagt hat man sich für die Speicherproteine des Endosperms der Maissamen interessiert, also für Proteine, die insbesondere Zeine, ganz besonders γ-Zein, umfassen.
Während der Entwicklung der Maissamen synthetisieren die Endospermzellen Speicherproteine in großen Mengen, insbesondere α-, β- und γ-Zeine. Diese Zeine werden in den vom endoplasmatischen Reticulum (ER) stammenden Proteinkörpern angereichert.
Allgemein stellen die Zeine eine komplexe Gruppe von Proteinen dar, die in mehrere Gruppen, nämlich die α-, β- und γ-Zeine eingeteilt werden (Larkins et al., 1989) und von einer Multigen-Familie codiert werden (Hagen und Rubenstein, 1980, Gene 13, 239–249). Obwohl ihre Struktur variiert, sind diesen Proteinen gewisse Merkmale gemeinsam, nämlich das Vorliegen von in Tandemanordnung wiederholten Sequenzen, die reich an prolinartigen Aminosäureresten sind, in ihrer Primärstruktur, das Vorhandensein von zahlreichen hydrophoben Resten, die die Unlöslichkeit dieser Proteine in wäßrigen Medien vermitteln, und das Fehlen von Lysinresten, die essentielle Aminosäuren für den Menschen und Monogastrier sind. Das Fehlen von Lysin in allen Hauptproteinen (die in hohen Mengen im Endosperm nachgewiesen werden), die natürlich von der Familie der Zeine gebildet werden, führt zu einer sehr unausgewogenen Aminosäurezusammensetzung in Maissamen.
Unter diesen Proteinen ist das Mais-γ-Zein ein Protein mit einem Molekulargewicht von 28 kDa, dessen Codiersequenz in Form der cDNA von Prat et al. (Nucleic Acids Research, Bd. 13, Nr. 5, 1985, S. 1494–1504) beschrieben wurde. Die vollständige Sequenz des Gens, das für das γ-Zein codiert, inklusive der nichtcodierenden Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts mit den Expressionsregulationselementen wurde von Reina, M. et al. (Nucleic Acids Research, Bd. 18, Nr. 21, 1990, S. 6426) beschrieben.
Für die Erhöhung des Lysingehalts von Proteinen der Zein-Familie hat man bis jetzt verschiedene Ansätze ins Auge gefaßt. Es wurden genetische und molekulare Ansätze verwendet. So wurden zum Beispiel Mutanten, mit denen lysinreicher Mais erhalten werden kann, wie die Mutante Opaque-2 (o2) und die Mutante floury-2 (fl-2) (Mertz et al., 1964, Science 145, 279–280, Nelson et al., 1965, Science 150, 1469–1470) vorgeschlagen und es wurden erste Versuche unternommen, um den negativen Auswirkungen des Fehlens von gewissen Zeinklassen, insbesondere der α-Zeine, auf die phenotypischen Eigenschaften entgegenzuwirken, und zwar durch Selektion von Mais, der o2-modifizierende Gene enthält (Paez et al., 1969, Plant Sci. 9, 251–252, Geetha et al., 1991, Plant Cell 3, 1207–1219).
Ein anderer Ansatz besteht darin, daß man direkt auf die Produktion von freiem Lysin einwirkt, insbesondere bei zweikeimblättrigen Pflanzen. Diese Technik wurde so bewerkstelligt, daß man auf die Deregulation von Schlüsselenzymen (DHTPS und AK), die über die Asparaginsäure am Lysin-Biosynthesezyklus beteiligt sind, eingewirkt hat. Bei Versuchen zur Transformation von Tabakplanzen mit E. coli-Bakterien, die die dapA-Gene enthalten, sowie E. coli-Bakterien, die das lysC-Gen enthalten, wurde ein beträchtlicher Anstieg des Gehalts an freiem Lysin in den Blättern, jedoch nicht in den Samen, erzielt (Shaul und Galili, 1992, Plant J. 2, 203–209 und 1993, Plant Mol. Biol. 23, 759–768; Perl, A., Schaul O., Galili, G., 1992, Plant Molecular Biology, 19, S. 815–823). In jüngster Zeit wurden dieselben Gene, dapA von Corynebacterium sowie lysC von E. coli, verwendet und unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors in Sojapflanzen exprimiert. Die Expression dieser beiden Enzyme in Soja hat zu einer fünffachen Erhöhung des Lysingehalts in den Samen geführt (Falco et al., 1995, BIO-Technology 13, 577–582).
Andere Autoren (Wallace et al., 1988, Science 240, 662–664) haben versucht, den Lysingehalt von α-Zein (19 kDa) von Maissamen dadurch zu erhöhen, daß sie punktuell Lysinreste in unterschiedlichen Positionen in das α-Zein-Molekül eingeführt haben. Die Expression dieser Konstrukte in Xenopus-Oocyten hat zu einer korrekten Assemblierung von lysinreichen Zeinen in den Vesikeln, die den Proteinkörpern entsprechen, geführt. Bei ihrer Exprimierung in Tabaksamen wurden jedoch das normale α-Zein sowie die modifizierte, lysinangereicherte Form abgebaut (Othani et al., 1991, Plant Mol. Biol. 16:117).
Es war also damals noch nichts über Mittel bekannt, mit denen die Expression eines mit Lysin angereicherten Zeins in den Zein auf natürliche Weise produzierenden Zellen in Mais, also in den Endospermzellen, ermöglicht werden könnte; ganz zu schweigen von der Expression von mit Lysin angereicherten Zeinen in anderen Pflanzenzellen.
Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung von Mitteln, mit denen ein an Lysin angereichertes Zein, insbesondere ein an Lysin angereichertes Mais-γ-Zein, erhalten werden kann, wobei dieses Protein insbesondere in Mais-Samenzellen und ganz besonders in den Endospermzellen exprimiert wird und wobei das modifizierte Protein weiterhin so exprimiert wird, daß seine Eigenschaften bezüglich der Lokalisation und Akkumulation beim endoplasmatischen Reticulum und davon stammenden Proteinkörpern erhalten bleiben.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck "an Lysin angereichert" daß das Protein eine im Vergleich zu dem natürlichen Protein, von dem es abstammt, eine erhöhte Anzahl Lysinreste aufweist, zum Beispiel aufgrund einer Modifikation der Nukleotidsequenz, die es exprimiert.
Außerdem werden in der Erfindung Mittel zur Erzielung der Expression von Proteinen, vorzugsweise von an Lysin angereicherten γ-Zeinen, in Pflanzenzellen von verschiedenen Geweben, zum Beispiel von Blattgeweben oder Wurzelgeweben, sowie gegebenenfalls in Pflanzenzellen von Pflanzen, die das Protein, insbesondere das γ-Zein, nach dessen Produktion man trachtet, nicht auf natürliche Weise exprimieren, vorgeschlagen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können außerdem andere Speicherproteine auf analoge Art und Weise mit Lysin angereichert werden, ganz besonders Speicherproteine der Familie der Zeine.
Zur Durchführung der Erfindung haben die Erfinder erstens vorgeschlagen, Sequenzen, die für an Lysin angereicherte Polypeptide codieren, in das Gen, das für das γ-Zein oder für andere Speicherproteine von Mais oder anderen Pflanzen codiert, bzw. in die Sequenz, die dieses Gen codiert, einzuführen, um zur Produktion von an Lysin angereicherten γ-Zeinen oder anderen Proteinen und damit zu an Lysin angereicherten Samen zu gelangen. Für die Herstellung von so modifizierten Nukleotidsequenzen wurden unterschiedliche Stellen der Sequenz, die für das γ-Zein-Gen codiert, als permissive Stellen (auch "neutrale Stellen" genannt) identifiziert.
In der vorliegenden Anmeldung werden daher Mittel für die Transformation des Gens, das für das Mais-γ-Zein codiert, oder für die Transformation jeglicher Nukleotidsequenz, die für das γ-Zein codiert und von diesem Gen abgeleitet ist, vorgeschlagen, um ausgehend von der Expression des modifizierten Gens oder allgemeiner ausgedruckt der modifizierten Nukleotidsequenz zu einem an Lysin angereicherten Protein zu gelangen; zu diesen Mitteln zählen insbesondere synthetische Oligonukleotide, die für eine Sequenz von Aminosäuren mit Lysinresten codieren.
Die Erfindung betrifft auch rekombinante Nukleotidsequenzen oder chimäre Sequenzen, die für ein an Lysin angereichertes γ-Zein codieren können.
Ebenfalls vom Rahmen der Erfindung umfaßt sind Wirtszellen, die mit solchen Sequenzen transformiert sind, insbesondere Pflanzenzellen, zum Beispiel Zellen, aus denen Pflanzen regeneriert werden können, sowie Pflanzen oder Pflanzenteile (Gewebe, Organe usw.), die solche Zellen enthalten und die auf stabile Art und Weise modifizierte Speicherproteine, insbesondere an Lysin angereicherte γ-Zeine, produzieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin solche modifizierten Proteine, zum Beispiel an Lysin angereicherte Proteine, sowie Antikörper gegen diese Proteine, ganz besonders an Lysin angereicherte Speicherproteine der Familie der Zeine.
Ein geeignetes Oligonukleotid für die Durchführung der Erfindung, das für die Herstellung von rekombinanten Nukleotidsequenzen verwendet werden kann, ist dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Verknüpfung umfaßt, die für ein Polypeptid der Formel (P – K)_n, in der:

– n eine ganze Zahl 2 oder darüber bedeutet,
– P einen Prolin-Aminosäurerest darstellt,
– K einen Lysin-Aminosäurerest darstellt,

Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid ist daher in einer ersten Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz umfaßt, die für eine Abfolge von Motivwiederholungen, die zwei Aminosäuren umfassen, codiert.
Die Oligonukleotid-Codons können für alle Prolinreste und/oder für alle Lysinreste identisch sein. Sie können entsprechend dem degenerierten genetischen Code auch für ein- und denselben Aminosäurerest verschieden sein.
Vorzugsweise wird dieses Oligonukleotid von einer Sequenz gebildet, die für mehr als zwei Einheiten (P – K) codiert. Vorzugsweise ist n 30 oder darunter, insbesondere unter 20, und vorteilhafterweise gleich 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 oder 15.
Die erfindungsgemäßen "Oligonukleotide" können chemisch auf jede verfügbare Art und Weise synthetisiert werden.
Der Ausdruck "Polypeptid", der sich auf die Verknüpfung (P – K)_n bezieht, bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung eine Aminosäuresequenz mit mehr als 2 Aminosäureresten, die bis zu 60 Aminosäurereste umfassen kann.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Oligonukleotid mehrere Verkettungen, die für ein Polypeptid der Formel (P – K)_n codieren, die gleich oder verschieden sind und die in Tandemordnung angeordnet sind.
Bei diesen Oligonukleotiden handelt es sich entweder um Wiederholungen von ein- und derselben Verknüpfung oder um Assoziationen von unterschiedlichen Verknüpfungen. Die Anzahl der beteiligten Verknüpfungen schwankt und kann zum Beispiel zwischen 2 und 10 Verknüpfungen betragen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das oben definierte Oligonukleotid dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Verknüpfung umfaßt, die für ein Polypeptid der Formel (P – K)_n codiert, in der die Sequenz der n Einheiten (P – K) durch einen oder mehrere Aminosäurereste, die von den Resten P oder K verschieden sind, unterbrochen ist.
Vorzugsweise werden die zusätzlichen Aminosäuren, die in die von den Einheiten (P – K) gebildete Sequenz eingebaut werden, so ausgewählt, daß sie den Aufbau des von dem Oligonukleotid codierten Polypeptids nicht modifizieren oder zumindest so, daß sie unter den Bedingungen, die die Struktur und/oder Funktion und/oder Lokalisierung dieses Proteins beeinflussen würden, keine Wechselwirkung zwischen den Aminosäuren eines Proteins, in das dieses Polypeptid eingebaut werden soll, hervorrufen.
Dies kann insbesondere dann der Fall sein, wenn die Anzahl der Einheiten (P – K) hoch ist oder wenn mehrere Verkettungen, die aus Sequenzen, die für Motive (P – K)_n codieren, gebildet werden, in Tandemanordnung angeordnet sind und wenn die Herstellung des entsprechenden Oligonukleotids es erforderlich macht, daß mehrere Nukleotidsequenzen synthetisiert werden, die anschließend zum Beispiel mittels Linker zusammengefügt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Oligonukleotid dergestalt, daß die Verkettung, die für das Polypeptid mit den n Einheiten (P – K) codiert, an seinem 5'- und/oder 3'-Ende durch ein oder mehrere Codons vervollständigt ist, die zum Beispiel für mindestens einen Lysinrest am N-terminalen Ende des Polypeptids codieren.
Beispielsweise ist ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Oligonukleotid dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Polypeptid der Formel (P – K)_n, der Formel K(P – K)₄ oder der Formel 2K(P – K)₄ entspricht.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform entspricht die Zusammensetzung dieses Oligonukleotids einer der auf den folgenden Seiten beschriebenen Sequenzen mit der Bezeichnung SEQ ID No:1 und SEQ ID No:2.
Die oben beschriebenen Oligonukleotide sind grundlegende Mittel für die Erzeugung von rekombinanten Nukleotidsequenzen, die an Lysin angereicherte pflanzliche Speicherproteine oder -polypeptide exprimieren können.
Die Erfindung betrifft daher auch eine rekombinante Nukleotidsequenz, die eine Verkettung von Nukleotiden umfaßt, die für ein pflanzliches Speicherprotein codiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid umfaßt, das so an einer Stelle der Nukleotidverknüpfung insertiert ist, daß

– man durch die Expression der Nukleotidsequenz in einer bestimmten Pflanzenzelle ein modifiziertes Speicherprotein erhält, das gleich oder ähnlich wie das normale Speicherprotein, das unter den gleichen Bedingungen in der gleichen Zelle durch die entsprechende codierende Nukleotidverknüpfung exprimiert würde, lokalisiert ist, und/oder
– das modifizierte Speicherprotein, das von der Nukleotidsequenz codiert wird, von gegen das entsprechende normale Speicherprotein erzeugten Antikörpern immunologisch erkannt wird.

Insbesondere bestehen die oben genannten Antikörper aus einem polyklonalen Serum oder werden gegen Epitope des normalen Speicherproteins erzeugt, die in dem modifizierten Speicherprotein konserviert sind.
Die oben genannten pflanzlichen Zellen umfassen jegliche pflanzliche Zelle ungeachtet ihres Ursprungsgewebes oder ihrer Art. Insbesondere ist man im Rahmen der Erfindung an Zellen von Speicherorganen, jedoch auch an Zellen von Blättern, Stengeln, Knollen usw. interessiert.
Unter dem Begriff pflanzliches "Speicherprotein" versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein während der Samenreifung synthetisiertes Protein, das während der Keimungsphase als wichtigste Nährstoffreserve verwendet wird.
Allgemein handelt es sich um ein Polypeptid, das in einem Speichergewebe unabhängig von der Lage innerhalb der Pflanze synthetisiert werden kann; bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Speicherproteinen handelt es sich insbesondere um solche, die in den Körnern oder Samen von Pflanzen der Familie Getreide, Kreuzblütler oder Leguminosen produziert werden, zum Beispiel die Prolamine und die Zeine.
Die Wahl der Insertionsstelle(n) des Oligonukleotids in der Verknüpfung, die für das Speicherprotein der Pflanze codiert, wird aufgrund der oben genannten Bedingungen bestimmt. Die Insertion kann gegebenenfalls in einer wiederholten Domäne (in bezug auf Aminosäuren) des Proteins oder an einem C- oder N-terminalen Ende erfolgen.
Der oben genannte Fall, wo die Expression der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleotidsequenz in einer pflanzlichen Zelle es ermöglicht, ein modifiziertes Speicherprotein zu gewinnen, dessen Lokalisierung gleich oder ähnlich wie die des normalen Speicherproteins ist, das unter den gleichen Bedingungen in der gleichen pflanzlichen Zelle exprimiert werden würde, umfaßt zum Beispiel bei den synthetisierten γ-Zeinen die Möglichkeit der Akkumulation im endoplasmatischen Reticulum der pflanzlichen Zellen, die diese exprimieren, insbesondere in den vom endoplasmatischen Reticulum gebildeten Proteinkörpern, wenn das Protein in den Endospermzellen exprimiert wird.
Um dies mit Hilfe der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleotidsequenzen zu erreichen, werden aufgrund ihrer Funktionsfähigkeit in dem Gewebe, das die transformierten Zellen enthält, Expressionssysteme gewählt, die an die Wirtszelle angepaßt sind, in der die gewählte Nukleotidsequenz exprimiert wird, insbesondere Regulationselemente, zum Beispiel Promoter. Tests für die Durchführung dieser Auswahl können aufgrund der verschiedenen in den Beispielen beschriebenen Konstrukte durchgeführt werden.
Um zu überprüfen, daß die immunologischen Eigenschaften des von der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz exprimierten, modifizierten Speicherproteins nicht wesentlich verändert worden sind, hat man zum Beispiel Antiseren wie das Antiserum αG2, das im Versuchsteil unten genau beschrieben wird, verwendet.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist die rekombinante Nukleotidsequenz dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgehend von einer Verkettung, die für Nukleotide codiert und die zur Expression eines normalerweise lysinarmen Speicherproteins führt, erhalten wird.
Allgemein codiert diese rekombinante Nukleotidsequenz für ein modifiziertes Speicherprotein, das von einem Speicherprotein abstammt, welches auf natürlichem Weg von einer in der tierischen oder menschlichen Ernährung verwendbaren Pflanze produziert wird.
Es handelt sich also bei den Speicherproteinen, deren Lysingehalt im Rahmen der vorliegenden Erfindung modifiziert wird, vorteilhafterweise um Speicherproteine von Pflanzen der Familie Getreide, Leguminosen oder Kreuzblütler. Besonders wichtige Speicherproteine sind diejenigen des Maises, insbesondere die Zeine, ganz besonders das Mais-γ-Zein, dessen Lysingehalt man zu erhöhen wünscht.
Eine besondere erfindungsgemäße rekombinante Nukleotidsequenz ist dadurch gekennzeichnet, daß die für das Mais-γ-Zein codierende codierende Nukleotidverknüpfung, die sie enthält, der in 9 dargestellten Sequenz entspricht.
Andere erfindungsgemäße rekombinante Nukleotidsequenzen sind dadurch gekennzeichnet, daß die codierende Nukleotidverknüpfung, die sie enthalten, für ein Speicherprotein einer Pflanze der Gruppe Soja, Sonnenblume, Tabak, Weizen, Hafer, Luzerne, Reis, Raps, Sorghum und Arabidopsis codiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist in der rekombinanten Nukleotidsequenz, die eine für das Mais-γ-Zein codierende Verknüpfung umfaßt, das erfindungsgemäße Oligonukleotid anstelle der Verkettung, die für die Pro-X-Domäne codiert, die im Mais-γ-Zein natürlich vorkommt, oder nach dieser Stelle insertiert. Die Pro-X-Domäne der Aminosäuresequenz des Mais-γ-Zeins besteht aus den Aminosäuren die zwischen den Positionen 70 und 91 der in 9 dargestellten Aminosäuresequenz liegen, was den Nukleotiden 265 bis 330 der in 9 dargestellten Sequenz entspricht.
Vorzugsweise liegt in der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz das Oligonukleotid anstelle oder nach der Pro-X-Domäne, die zwischen den Nukleotiden 276 und 357 der in 9 dargestellten Sequenz vor.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist in der rekombinanten Nukleotidsequenz, die eine für das Mais-γ-Zein codierende Verknüpfung umfaßt, das erfindungsgemäße Oligonukleotid nach der Pro-X-Domäne, die in der Sequenz des Mais-γ-Zeins konserviert ist, insertiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist in der rekombinanten Nukleotidsequenz, die eine für das Mais-γ-Zein codierende Verknüpfung umfaßt, das erfindungsgemäße Oligonukleotid in die Pro-X-Domäne, die in der Sequenz des γ-Zeins erhalten bleibt, insertiert.
Die Insertionen, um die es oben geht, können mit verfügbaren Techniken erzeugt werden, zum Beispiel mittels Rekombination von Sequenzen, mit denen zuvor ein oder mehrere enzymatische Verdauungsschritte durchgeführt wurden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird ein an einer bestimmten Aminosäure angereichertes, ausgewähltes Speicherprotein in heterologen Pflanzenzellen exprimiert. Anders ausgedrückt wird ein in einer gegebenen Pflanze natürlich vorliegendes Speicherprotein in aminosäureangereicherter Form in einer anderen Pflanze oder in einer anderen Zelle, als derjenigen, die es natürlich produziert, exprimiert.
Außer der Verknüpfung, die für ein pflanzliches Speicherprotein und das erfindungsgemäße Oligonukleotid codiert, können erfindungsgemäße rekombinante Nukleotidsequenzen auch noch einen Expressionspromotor umfassen, zum Beispiel einen Promotor, der aufgrund seiner spezifischen Eigenschaft für die Expression in gewissen Pflanzenteilen oder -geweben gewählt wurde, oder auch einen Promotor, der aufgrund seiner konstitutiven Eigenschaft gewählt wurde. So können die Promoter, wenn sie spezifisch sind, für Samen und/oder für bestimmte pflanzliche Organe oder Gewebe spezifisch sein. Sie können jedoch auch oder gleichzeitig für eine Wachstumsphase, zum Beispiel für ein bestimmtes Keimungsstadium, spezifisch sein.
Im Gegensatz dazu ermöglicht die Verwendung von konstitutiven Promotor die gleichbleibende und allgemeine Expression des Speicherproteins, was zu einem Wettbewerb zwischen der Expression des nativen Speicherproteins, falls vorhanden, und dem modifizierten Speicherprotein führt.
Beispielsweise sind Promotor, die für die Durchführung der Erfindung vorteilhaft sind, der Promotor des Mais-γ-Zeins, der in der 1,7 kb großen Sequenz enthalten ist, die stromaufwärts der in 7 dargestellten Codiersequenz vorliegt, der Promotor des Blumenkohlmosaikvirus, nämlich der CaMV35S-Promotor (EP-B-0131623), der konstitutive Promotor des Actin-1-Gens von Reis (PCT/US 9100073) oder der samenspezifische "high-molecular-weight Glutenin"-Promotor des Weizens (Colot, V. et al., 1987, EMBO Journal, Band 6, S. 3559–3564).
Gegebenenfalls werden diese Promotor durch weitere Regulationssequenzen vervollständigt, insbesondere durch Expressionsaktivatoren.
Beispielsweise sind weitere Promoter, die für die Durchführung der Erfindung verwendet werden können, der Promotor des Gens, das für das 2S-Speicherprotein von Arabidopsis thaliana-Samen codiert, oder der Lectin-Promotor der Bohne oder der β-Phaseolin-Promotor der Bohne.
Durch die zusätzliche Einführung von Expressionsaktivatoren in die Regulationssequenzen der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen kann man auch die primäre Transkriptionsrate der Nukleotidsequenz erhöhen sowie gegebenenfalls die Menge der produzierten modifizierten Speicherproteine erhöhen. Aktivatoren sind zum Beispiel Introns von einkeimblättrigen Pflanzen, wie das Intron 1 des Reis-Actingens.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er an einer für seine Replikation nicht unbedingt erforderlichen Stelle eine Nukleotidsequenz gemäß einer der oben angegebenen Definitionen umfaßt. Besonders interessante Vektoren im Zusammenhang mit der Durchführung der Erfindung sind zum Beispiel die Plasmide pP20γZ, pH30γZ oder pH45γZ. Das Plasmid pP20γZ wurde am 31. Oktober 1995 unter der Nummer I-1640 bei der CNCM (Paris, Frankreich) hinterlegt. Das Plasmid pH45γZ wurde am 31. Oktober 1995 unter der Nummer I-1639 bei der CNCM hinterlegt.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Polypeptid, wie es von einer rekombinanten Nukleotidsequenz gemäß einer der oben angegebenen Definitionen exprimiert wird.
In Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt bei dem Begriff "Polypeptid" keine bestimmte Begrenzung in bezug auf die Anzahl der Aminosäuren, die das Polypeptid bilden, vor. Es kann sich daher um Sequenzen, die nur einige Aminosäuren umfassen, handeln, wie dies üblicherweise unter dem Begriff "Peptide" verstanden wird, oder auch um wesentlich längere Sequenzen, wie Proteinsequenzen.
Diesbezüglich betrifft die Erfindung das modifizierte lysinreiche Mais-γ-Zein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es von einer oben beschriebenen rekombinanten Nukleotidsequenz codiert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das an Lysin angereicherte modifizierte Mais-γ-Zein dadurch gekennzeichnet, daß seine Aminosäuresequenz mit mindestens einem Polypeptid der Formel (P – K)_n, in der

– n eine ganze Zahl 2 oder darüber bedeutet,
– P einen Prolin-Aminosäurerest darstellt,
– K einen Lysin-Aminosäurerest darstellt,
– das Zeichen „–" eine Bindung zwischen den beiden Aminosäureresten, insbesondere eine peptidartige Bindung, symbolisiert, wobei die n Einheiten (P – K) durch Bindungen, insbesondere peptidartige Bindungen, gebunden sind, modifiziert ist.

Gemäß einer Ausführungsvariante der Erfindung entspricht das in die Aminosäuresequenz des γ-Zeins eingeführte Polypeptid der Formel K – (P – K)_n.
Durch die erfindungsgemäßen Polypeptide, die einer der Formeln (P – K)_n, K – (P – K)_n oder Varianten entsprechen, wird eine in normalem Mais-γ-Zein natürlich vorhandene Sequenz ersetzt, oder sie werden unter Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren der Aminosäuresequenz des normalen Mais-γ-Zeins insertiert oder sie werden in die Aminosäuresequenz des normalen γ-Zeins hinzugefügt, wobei die Insertionsstelle des Polypeptids so gewählt wird, daß,

– wenn das lysinreiche modifizierte γ-Zein in einer Wirtszelle, insbesondere einer Pflanzenzelle produziert wird, es auf gleiche oder ähnliche Weise wie das normale Mais-γ-Zein, das unter den gleichen Bedingungen in der gleichen Wirtszelle produziert würde, lokalisiert ist, und/oder
– das modifizierte Mais-γ-Zein von gegen das normale Mais-γ-Zein gerichteten Antikörpern erkannt wird.

Das Protein P20γZ, das in 11 dargestellt ist, oder die Proteine H30γZ oder H45γZ, die in 10 dargestellt sind, sind bevorzugte Beispiele für die Durchführung der Erfindung und stellen an Lysin angereicherte modifizierte Mais-γ-Zeine dar.
Außerdem betrifft die Erfindung eine rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine oben beschriebene Nukleotidsequenz umfaßt.
Interessierende Wirtszellen sind zum Beispiel Bakterienzellen, wie Zellen von E. coli oder Agrobacterium tumefaciens. Vorzugsweise wird man sich im Rahmen der Erfindung für die stabile Expression des gewünschten modifizierten Speicherproteins Wirtszellen pflanzlichen Ursprungs bedienen.
Diese Zellen pflanzlichen Ursprungs sind zum Beispiel Zellen von Samen, von Pflanzen und zum Beispiel bevorzugt Endospermzellen von Maissamen.
Die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz wird vorzugsweise stabil und unter solchen Bedingungen, daß das an Aminosäuren, insbesondere an Lysin, angereicherte exprimierte Speicherprotein dort lokalisiert ist, wo das entsprechende normale Protein in derselben Wirtszelle lokalisiert wäre, in das Genom der Wirtszelle eingeführt.
Für die Transformation von Wirtszellen sind verschiedene Techniken verfügbar. Um die Wirtszellen stabil oder vorübergehend zu transformieren, wird man zum Beispiel die Techniken Elektroporation, Beschuß mit DNA-haltigen Mikroprojektilen mit der Genkanone, über die Kultur von Explantaten mit Agrobacterium tumefaciens sowie mittels Eindringen mit Mikrofasern verwenden.
Für die Expression der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können außer den Endospermzellen von Maissamen auch Zellen von Soja, Sonnenblume, Tabak, Weizen, Hafer, Luzerne, Reis, Raps, Sorghum oder Arabidopsis verwendet werden.
Die vorliegende Anmeldung betrifft auch die Samen, die ein wie oben beschriebenes Polypeptid produzieren, sowie die Pflanzen, die dieses Polypeptid produzieren. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Pflanzen um Mais.
Die Erfindung betrifft auch die Samen, die von den transformierten Pflanzen, die das erfindungsgemäße Polypeptid, anders ausgedrückt das an bestimmten Aminosäuren angereicherte modifizierte Speicherpolypeptid, exprimieren, erhalten werden.
Gemäß einer besonders interessanten Ausführungsform der Erfindung werden die an Lysin angereicherten modifizierten γ-Zein-Proteine in Opaque 2-Maismutanten exprimiert. Bei diesen o2-Mutanten, die von Emerson, R.A. et al. (1935, Cornell Univ. Agric. Exp. Stn. Mem. 180) beschrieben und von Mertz, E.T. et al. (1964, Science 145:279–280) charakterisiert wurden, ist der Lysingehalt stark erhöht, wodurch die ernährungsphysiologischen Eigenschaften des Maises stark verbessert werden (weil sein niedriger Gehalt an dieser essentiellen Aminosäure dadurch ausgeglichen wird). Traditioneller Mais weist einen Lysingehalt von ungefähr 0,24% des Rohprodukts (Korn-Gesamtgewicht) auf, während Opaque-2-Mais ungefähr 0,5% Lysin aufweist. Sie weisen ungenügende agronomische Eigenschaften auf, weil ihr Endosperm wesentlich weniger glasig ist und sich als sehr brüchig erweist ("starchy"-Phänotyp). Aufgrund dessen sind sie äußerst anfällig für pathogene Organismen und während der Behandlungsschritte nach der Ernte sehr empfindlich. Dieser Phänotyp beruht nämlich auf der starken Erniedrigung von gewissen Speicherproteinen, insbesondere den Alpha-Zeinen. Opaque 2 codiert nämlich für einen Transkriptionsfaktor, der für die Expression von gewissen Zeingenen erforderlich ist (Schmidt, R.J. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 46–50).
Mit Hilfe der traditionellen genetischen Verbesserung wurden Opaque-2-Abkömmlinge entwickelt, die die oben genannten Nachteile nicht mehr aufweisen; es handelt sich um QPM-Mais (Quality Protein Maize). In einer in jüngster Zeit durchgeführten genetischen Analyse dieses Maises (Lopes, M.A. et al., 1995, Theor. Appl. Genet. 19, 274–281) wurde gezeigt, daß nur 2 oder 3 Loci Schlüsselelemente bei diesen günstigen Modifikationen sind. Aufgrund genauerer biochemischer und genetischer Analysen läßt sich das Postulat aufstellen, daß nur einer der 3 verantwortlichen Loci der γ-Zein-Locus ist. Alle Mais-Genotypen, die eine Duplikation dieses Gens in der Centromer-Region von Chromosom 7 tragen, sind Modifikatoren von Opaque 2 (Lopes, M.A. et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 19:247:603–613).
Mit der vorliegenden Erfindung können ausgehend von Mais, der nur ein γ-Zein-Gen am Chromosom 7 enthält, Opaque-2-Mais-Mutanten hergestellt werden, die durch Hinzufügung einer rekombinanten Sequenz, die für ein an Lysin angereichertes Mais-γ-Zein codiert, vervollständigt werden. Außer der Tatsache, daß Härteeigenschaften ähnlich denen eines nichtmutierten Opaque-2-Maises erworben werden, besteht der Vorteil, daß der Lysingehalt wesentlich erhöht wird und denjenigen von QPM-Mais übertrifft.
Mit der vorliegenden Erfindung können modifizierte Opaque-2-Maismutanten hergestellt werden, in die man eine rekombinante Nukleotidsequenz, die für ein an Lysin angereichertes Mais-γ-Zein codiert, insertiert hat.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen oder Samen, die ein modifiziertes Speicherprotein exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

a) Transformation einer Pflanzenzelle mit einer Nukleotidsequenz oder einem Vektor, wie nachstehend beschrieben, unter Bedingungen, die die stabile und funktionelle Expression des von der Nukleotidsequenz codierten modifizierten Speicherproteins gestatten;
b) Regeneration von Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle aus Schritt a) zur Gewinnung von Pflanzen, die das modifizierte Speicherprotein exprimieren, sowie
c) gegebenenfalls Gewinnung von Samen von in Schritt b) gewonnenen modifizierten Pflanzen.

In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der transformierten Pflanze um Mais und bei dem angereicherten modifizierten Speicherprotein um an Lysin angereichertes γ-Zein.
Die Erfindung betrifft auch die mit solch einem Verfahren erhaltenen Pflanzen.
Um den Gehalt an einer bestimmten Aminosäure von erfindungsgemäßen Pflanzen zu bestimmen, kann man eine quantitative Bestimmungsvorschrift wie sie bei Zarkadas et al., 1995, J. Agri. Food. Chem., Band 43: Seiten 84–93 erwähnt wird, verwenden.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus den Beispielen und Abbildungen unten hervor.
1 – Restriktionskarte des Plasmids pP20γZ.
2 – Restriktionskarte des Plasmids PH45γZ.
3 – Schematische Darstellung von Proteinen, die von den modifizierten und nichtmodifizierten γ-Zein-Genen codiert werden: Wildtyp-γ-Zein (γZ), lysinreiche γ-Zeine (P20γZ, H30γZ, H45γZ und N13γZ) aufgrund der Insertion von Oligonukleotiden, die für lysinreiche Sequenzen codieren. Die Aminosäuresequenz der insertierten Polypeptide ist mit dem Ein-Buchstaben-Code für die Darstellung von Aminosäuren angegeben. Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
Term: terminal;
ProX-DOMÄNE: Prolin-Xaa-Linker zwischen Domänen.
4 – In-vitro-Analyse von lysinreichen γ-Zeinen. (A) In-vitro-Translation sowie Translokation von Transkripten, die lysinreichen modifizierten γ-Zeinen entsprechen; Bahn 1, 5, 9 und 13: vollständige Translationsprodukte; Bahn 2, 6, 10 und 14: vollständige Translationsprodukte nach Translokation in Hunde-Mikrosomen (CM); Bahn 3, 7, 11 und 15: gegen Proteinase K (PK) resistente Translokationsprodukte; Bahn 4, 8, 12 und 16: Gesamtheit der Translationsprodukte nach Behandlung mit Proteinase K in Gegenwart von 0,5% Nonidet P40(NP40). (B) Immunfällung von in-vitro-Translationsprodukten, die den Proteinen γ-Zein sowie lysinreiches modifizierte γ-Zein entsprechen unter Verwendung von Antiserum αPL. Bahn 1: γ-Zein; Bahn 2: P20γZ; Bahn 3: H30γZ; Bahn 4: H45γZ und Bahn 5: N13γZ. (C) Legende wie bei (B), jedoch mit Antiserum αG2. Die Molekulargewichtsmarker (in Kilodalton) sind links angegeben.
5 – Gewebespezifische Aktivität des Promoters von γ-Zein. Es wurden Endosperme von Mais, Embryonen und Blätter von Mais durch Beschuß mit Partikeln transformiert, wobei die in der Abbildung (rechts) dargestellten Konstrukte verwendet wurden. Die relativen Aktivitäten der Luciferase (LUC, graue Säulen) und der β-Glucuronidase (GUS, schraffierte Säulen) wurden in Form eines Multiplikators der Werte, die mit den nackten Projektielen ± Standardabweichung der unterschiedlichen Verhältnisse ausgedrückt.
6 – Expression von lysinreichen γ-Zeinen im Endosperm unter der Aleuronschicht der Zellen. (A) Immunblot mit αPL-Antiserum, von Proteinen aus Endospermen, die mit pN13γZ (Linie 2), pH45γZ (Bahn 3), pH30γZ (Bahn 4) und pP20γZ (Bahn 5) transformiert worden waren. Die Kontrolle (Bahn 1) entspricht nichttransformierten Endospermen. Die Molekulargewichtsmarker (in Kilodalton) sind links angegeben. (B) Expression der Transkripte H45γZ und N13γZ in vorübergehend transformierten Endospermen. Die cDNAs, die aus mit pH45γZ (Bahn 2), pN13γZ (Bahn 3) und der Kontrolle (Bahn 1) transformierten Geweben erhalten wurden, wurden mittels PCR amplifiziert und mit Hilfe eines synthetischen Oligonukleotids, das für eine lysinreiche Sequenz codiert, als Sonde analysiert.
7 – Anhäufung von lysinreichen γ-Zeinen in den Proteinkörpern des Endosperms. (A) Immunblot-Analyse mittels Antiserum αPL von Proteinkörpern, die aus mit pP20γZ (Bahn 1), pH30γZ (Bahn 2), pH45γZ (Bahn 3), pN13γZ (Bahn 4) und ohne DNA (Bahn 5) transformierten Endospermen isoliert worden waren. (B) Immunblot-Analyse mittels Antiserum αPL von Proteinkörpern, die aus mit pP20γZ, pH30γZ und pH45γZ transformierten Endospermen isoliert worden waren und mit Proteinase K in Gegenwart eines isotonischen Puffers (Sacch., Bahn 1, 3 und 5) oder einem hypotonischen Puffer (H₂O, Bahn 2, 4 und 6) verdaut worden waren. Die Molekulargewichtsmarker (in Kilodalton) sind links angegeben.
8 – Gemeinsame Lokalisierung der Proteine P20γZ und der α- und γ-Zeine in den Proteinkörpern des Mais-Endosperms. Es wurde eine immuncytochemische Analyse an Ultradünnschnitten durchgeführt, und zwar mit αPL-Antikörpern (die mit Goldpartikeln mit einem Durchmesser von 15 nm markiert waren) sowie mit αZ und αG2-Antikörpern (die mit 5-nm-Goldpartikeln markiert waren). (A) Mit pP20γZ transformierte und mit dem Antikörper αPL immunmarkierte Endosperm-Proteinkörper. (B) Immunlokalisierung von P20γZ (mit 15-nm-Goldpartikeln markiert) und von α-Zein (mit 5-nm-Goldpartikeln markiert) in Proteinkörpern, die aus mit pP20γZ transformierten Endospermen isoliert wurden. (C) und (D) Immunlokalisierung von P20γZ (mit 15-nm-Goldpartikeln markiert) und von α-Zein (mit 5-nm-Goldpartikeln markiert) in Proteinkörpern, die aus mit pP20γZ transformierten Endospermen isoliert wurden. Die Pfeile geben die Tangentialschnitte der Proteinkörper an.
9 – Codiersequenz für die cDNA von Mais-γ-Zein und entsprechende Aminosäuresequenz.
10 – Codiersequenz für die cDNA von Mais-H45γZ-Zein und entsprechende Aminosäuresequenz.
Die lysinreiche Sequenz (28 Aminosäuren) wird zwischen die Aminosäurereste 92 und 119 der in 10 dargestellten Sequenz eingeführt.
11 – Codiersequenz für die cDNA von Mais-P20γZ-Zein und entsprechende Aminosäuresequenz.
Die lysinreiche Sequenz (14 Aminosäuren) wird zwischen die Aminosäurereste 92 und 119 der in 11 dargestellten Sequenz eingeführt.
12 – Restriktionskarten der Plasmide pBin 19P20γZ und pBin 19H30γZ.
13 – Endospermen von transgenen Maispflanzen, bei denen an Lysin angereichertes γ-Zein angehäuft wird.
A und B: SDS-PAGE sowie Immunblot unter Verwendung von αPL Antiserum.

A) 10 μg Protein pro Spur (Transformanten mit dem Konstrukt H45γZ) Spur C: Proteinextrakt von Hybrid-Endospermen B73 × A188 (Kontrolle) Spur 1: A1 Spur 2: B1 Spur 3: B2 Spur 4: C1 Spur 5: D1 Spur 6: D2
B) 1 μg Protein pro Spur (Transformanten mit dem Konstrukt P20γZ) Spur C: Kontrolle Spur 1: A1 Spur 2: A2 Spur 3: B1 Spur 4: C1 Spur 5: D1 Spur 6: E1
C) SDS-PAGE und Silberfärbung (3 P20γZ-Transformanten sowie 3 H45γZ-Transformanten)

14 – Gehalt an an Lysin angereichertem γ-Zein pro Korn (Transformante 45γZ B1 und C1).
A: Silberfärbung; 10 μg Protein pro Spur
B: Immunblot mit Antiserum αPL; 1 μg Protein pro Spur
Spur 1 bis 5: Proteinextrakte von unterschiedlichen Endospermen der Transformante 45γZ B1.
Spur 6 bis 10: Proteinextrakte von unterschiedlichen Endospermen der Transformante 45γZ C1.
15:

A) Gehalt an an Lysin angereichertem γ-Zein von 10 Körnern (Transformante 45γZ C1) mit Antiserum αPL; 1 μg Protein pro Spur. Spur 1 bis 10: Extrakt von Endospermen von 10 Nachkommen.
B) Immunblot von Proteinextrakten der Endospermen 1 bis 5 aus A), die mit Antiserum αG2 markiert waren; 2 μg Protein pro Spur.

BEISPIELE
A) Herstellung von an Lysin angereicherten modifizierten γ-Zeinen und Expression dieser modifizierten Proteine nach deren Anhäufung in den Proteinkörpern der Endospermzellen von Mais
Bei dem γ-Zein handelt es sich um ein Speicherprotein des Maises mit einem Molekulargewicht von 28 kD, das reich an Schwefel ist und das in den Endospermzellen mit den α- und β- Zeinen in den Proteinkörpern des granulären endoplasmatischen Reticulums (ER) angehäuft wird (Ludevid et al., 1984, Plant Mol. Biol. 3, 227–234; Lending et al., 1984, Plant Cell 1, 1011–1023). Die von der Nukleotidsequenz der cDNA (Prat et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13, 1493–1504) und den genomischen Klonen (Boronat et al., 1986, Plant Sci. 47, 95–102) abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt, daß das γ-Zein keine Homologie mit den Polypeptiden des α-Zein-Typs aufweist. Obwohl das γ-Zein von ein bis zwei Genen pro haploidem Genom codiert wird (Boronat et al., 1986, Plant Sci. 47, 95–102), macht es 10–15% der Gesamtproteine der Endospermen des Maises aus. Die Expression des γ-Zein-Gens in heterologen Systemen, wie Xenopus-Oocyten (Torrent et al., 1994, Planta 192, 512–518) sowie in Arabidopsis thaliana (Geli et al., 1994, Plant Cell 6, 1911–1922) zeigt, daß die Polypeptide des γ-Zeins stabil sind und als solche fähig sind, Proteinkörper zu bilden, die vom endoplasmatischen Reticulum im inneren der Zelle stammen. Weiterhin haben Deletionsanalysen von verschiedenen Strukturdomänen des γ-Zeins gezeigt, daß die N-terminale Sequenz, die die wiederholte prolinreiche Domäne beinhaltet, für die Retention des γ-Zeins im endoplasmatischen Reticulum verantwortlich ist und daß die cysteinreiche C-terminale Domäne für die Bildung der Proteinkörper verantwortlich ist. Die Pro-X-Domäne schien weder mit der Stabilität des Proteins noch mit seiner zielgesteuerten Lokalisierung im Zusammenhang zu stehen (Geli et al., 1994, Plant Cell 6, 1911–1922).
Material und Methoden
Pflanzenmaterial
Körner von Mais der Selektion W64A im Stadium 17 TNB ("Tage nach der Befruchtung") wurden erst oberflächensterilisiert (1) und anschließend von Hand seziert und die Pericarp- und Aleuronschicht wurde von den Endospermen getrennt. Es wurden tangentiale Schnitte so durchgeführt, daß ein großer Teil der Oberfläche unter der Aleuronschicht freigelegt wurde. Falls erforderlich wurden die Embryonen isoliert und Blätter von Pflanzen im Alter von 7 Tagen wurden seziert, um das Epidermisgewebe zu entnehmen. Nach dem Sezieren wurden die Proben in Petrischalen auf mit MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15, 473–497) befeuchtete Papierfilter gelegt.
Plasmidkonstrukte
Es wurde eine erste Gruppe von Plasmiden, nämlich pKSG2, pHbP2, pPbP4 und pNaN1, erzeugt, um die Einführung von Restriktionsstellen in das für das γ-Zein codierende Gen zu ermöglichen. pKSG2 und pHbP2 wurden gemäß der Beschreibung in der Veröffentlichung von Torrent, M. et al. (Planta (1994) 192:512–518) beschrieben. Das Plasmid pKSG2 enthält die Codiersequenz für das γ-Zein.
Das Plasmid pHbP2 wird ausgehend von pKSG2 erhalten und enthält eine Codiersequenz für ein mutiertes γ-Zein, in der die Pro-X-Domäne des Proteins deletiert worden ist.
Das Plasmid pPbP4 wurde anschließend in zwei Klonierungsschritten erhalten: (i) das 350 Bp große SaII-PvuII-Restriktionsfragment von pKSG2 wurde in ein mit SalI und EcoRV restringiertes Bluescript-Plasmid (pBSKS, Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) (pKSC4) kloniert, und (ii) das 600 Bp große PvuII-XbaI-Restriktionsfragment von pKSG2 wurde in die SmaI- und die XbaI-Restriktionsstelle von pKSC4 kloniert. Das neue Konstrukt pPbP4 enthält knapp vor der P-X-Domäne der γ-Zein-Codiersequenz eine nützliche EcoRI-Restriktionsstelle.
Das Plasmid pNaN1 wurde ebenfalls mit Hilfe von zwei Klonierungsschritten erhalten: (i) das 250 Bp große NaeI-XbaI-Fragment von pKSG2 wurde in das mit EcoRV-XbaI restringierte Plasmid pBSKS (pKSC8) kloniert und (ii) das 700 Bp große NaeI-HindIII-Restriktionsfragment (mit glatten Enden) von pKSG2 wurde in die HindIII-Restriktionsstelle von pKSC8 kloniert. Das neue Konstrukt, pNaN1, enthält ClaI- sowie HindIII- Restriktionsstellen an einem Ort 15 Nukleotide vor dem Stop-Codon des γ-Zeins.
Es wurden zwei synthetische Oligonukleotide, die den folgenden Sequenzen entsprechen: SEQ ID No: 1:
5'CGATGAATTCAAACCAAAGCCAAAGCCGAAGCCAAAAGAATTCA3', und deren umgekehrte Sequenz, die SEQ ID No: 2 genannt wird, und deren Sequenz:
5'AGCTTGAATTCTTTTGGCTTCGGCTTTGGCTTTGGTTTGAATTCAT3' lautet, die für lysinreiche Sequenzen mit der Bezeichnung K(P – K)₄ codieren, hybridisiert, mit EcoRI verdaut und in eine EcoRI-Schnittstelle von pHbP2 und pPbP4 kloniert. Es wurden drei Klone ausgewählt, nämlich pPo2 und pHo3, die die Codiersequenz für K(P – K)₄ enthalten, sowie pHo4, das die verkürzte Form der Codiersequenz für das γ-Zein mit 2K(P – K)₄ in Tandemanordnung (in Form einer Sequenz K(P – K)₄ EF K(P – K)₄) der lysinreichen Codiersequenz. Die gleichen hybridisierten Oligonukleotide wurden mit den Enzymen ClaI-HindIII verdaut und in das mit Hilfe der gleichen Enzyme gespaltene Plasmid pNaN1 kloniert. Der ausgewählte Klon pNo1 enthielt die Codiersequenz für die lysinreiche Sequenz K(P – K)₄ am N-terminalen Ende des entsprechenden modifizierten γ-Zeins.
Für die vorübergehende Transformation des Endosperms werden die für das modifizierte γ-Zein codierenden Sequenzen von pPo2 und pHo3 in Form von HincII-NheI-Fragmenten in die SmaI- und die XbaI-Stelle von pDH51 (Pietrzah et al., 1986, Nucl. Acid Res. 14, 5857–5868), das den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) enthält, insertiert. Das Konstrukt pP20γZ, das durch die oben beschriebene Insertion von HincII-NheI-Fragmenten in das Plasmid pDH51 erhalten wurde, enthält die Codiersequenz des an Lysin angereicherten γ-Zeins (8) sowie die Signale für die 35S Sequenz des CaMV-Virus zur Bildung des 3'-Endes und der Polyadenylierung. Die chimäre Codiersequenz P20γZ wurde ausgehend von der Codierregion des γ-Zeins, die in dem Plasmid pKSG2 nach verschiedenen Klonierungsschritten enthalten ist, konstruiert. Der 1,7 kB große Promotor des γ-Zeins (Reina et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18, 6426) wurde in die stumpfen Enden eines HindII-PvuI-Fragments in pHo4 und pNo1, die mit Xho1 restringiert worden waren und mit glatten Enden erhalten wurden, insertiert. Die Konstrukte pH45γZ und pN13γZ wurden analog erhalten.
Die neuen Konstrukte mit der Bezeichnung pP20γZ, pH30γZ, pH45γZ und pN13γZ wurden in biolistischen Beschußversuchen verwendet.
Um die Spezifität von unterschiedlichen Promotor für Pflanzengewebe zu untersuchen verwendete man zwei Konstrukte, nämlich p1,7γZGUS und pCaMV35SLUC. p1,7γZGUS wurde durch Insertion des 1,7 kB großen Promotors des γ-Zeins (HindIII-PvuI) in ein von pPuC18 abgeleitetes Plasmid, das das GUS-Gen und die NOS-Signale für die 3'-Polyadenylierung von pBI 101.1 enthielt, erhalten (Jefferson et al., 1987, Embo. J. 6, 3901–3907). pCaMV35SLUC wurde durch Insertion des Luciferase (LUC)-Codiergens von pAHC18 (Bruce et al., 1989, P. H. 86, 9692–9696) in den Polylinker von pDH51 (Pietrzak et al., 1986, Nucl. Acids Res. 18, 6426) erhalten.
In-vitro Analyse
Die von pBSKS abgeleiteten Plasmide, die die Codiersequenzen für γ-Zein (pKSG2) und für das lysinreiche γ-Zein (pPo2, pHo3, pHo4 und pNo1) enthalten, wurden in-vitro nach Standard-Vorschriften transkribiert (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Hrsg., Cold Spring Harbor, New York). Eine in-vitro-Translation und eine Translokation der synthetischen Transkripte wurden nach der Methode von Torrent et al. (1994, Panta 192, 512–518) durchgeführt, nur daß Hunde-Mikrosomen (CM) verwendet wurden, die von Promega (Madison, Wis., USA) stammten. Die Immunfällung der translatierten Produkte wurde im wesentlichen nach dem Verfahren von Borgese und Gaetani (1980) mit einem Kaninchen-Anti-γ-Zeinα-G2-Serum, (Ludevid et al., 1985, Plant Sci. 41, 41–48) und einem αPL-Antiserum durchgeführt. Bei αPL handelt es sich um ein polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen das synthetische Peptid EFK(P – K)₈EF. Dieses Peptid wurde mit der von Celma et al., 1992 beschriebenen Festphasen-Synthesemethode dargestellt.
Beschuß mit Mikroprojektilen
Die Plasmid-DNA wurde nach einer von Kikkert (Plant Cell, 33:221–226, 1993) beschriebenen Vorschrift auf Goldpartikel (1,0 μm, Biod-Rad, Lab., Richmond, CA, USA) absorbiert. Alle Ziele wurden zweimal beschossen, wobei man das BioRad-Gerät Biolistic PDS-1000/He verwendete. Die Ziele befanden sich 8 cm hinter einem Schirm, der die Makroträger stoppte, die sich 1 cm unterhalb der "Rupture-Disk" mit 900 PSI befanden. Nach dem Beschuß wurden die Proben 24 Stunden bei 26°C im Dunkeln inkubiert. Kontrollen bestanden aus den Zielen, die mit DNA-freien Mikroprojektilen beschossen wurden.
Enzymtests
Die mit den Plasmiden p1,7γZGUS und pCaMV35SLUC beschossenen Gewebe wurden auf Eis in einem Puffer, der 25mM Tris, pH 7,8, 2mM DTT, 10% Glyzerin und 1% Triton X-100 enthält, homogenisiert. Nach 5-minütigem Zentrifugieren bei 12.000 xg wurden die Überstände abdekantiert und das lösliche Gesamtprotein in den Extrakten wurde mit dem Bradford-Test (Bio-Rad) quantitativ bestimmt. Die GUS-Aktivität wurde durch fluorimetrische Analyse gemäß Jefferson (1987) mit 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG) als Substrat getestet. Die LUC-Aktivität wurde mit dem Luciferase- Testsystem (Luciferase Assay System Kit), das von Promega vertrieben wird, gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Extraktion der Speicherproteine und Analyse der Proteine auf Gel
Endosperme, die mit pP20γZ, pH20γZ, pH45γZ und pN13γZ transformiert worden waren, wurden zu Mehl zermahlen und die α-Zeine wurden mit drei Reihen von Lösungsmitteln, die 70% Ethanol enthielten, extrahiert. Das verbleibende Mehl wurde an der Luft getrocknet und die Gesamtproteine wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem Puffer, der 0,25 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5% 2-Mercaptoethanol enthielt, extrahiert. Die Proteinextrakte wurden mittels SDS-PAGE und Immunblot gemäß Ludevid et al., 1985, analysiert. Nitrozelluloseblätter wurden mit dem αPL-Antiserum (Verdünnung 1:500) inkubiert, und ein ein Konjugat aus Raifort-Peroxidase mit einem zweiten Antikörper (ECL Western Blotting System, Amersham, Buckinghamshire, Großbritannien) wurde für den Nachweis des Proteins eingesetzt.
Analyse der RNA-Expression
Die Gesamt-RNA wurde gemäß Logemas et al., 1987, extrahiert. Die komplementäre DNA (cDNA) wurde mit der reversen Transkriptase und Oligo-dT von Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt, und diese RNA wurde mit einer PCR-Reaktion amplifiziert. Für die PCR verwendete Primer-Oligonukleotide waren 20 mer-Sequenzen, die dem 5'- und dem 3'-Ende des γ-Zein-Strukturgens entsprachen. Für die Herstellung von mit ³²P markierten Sonden und für die Analyse der DNA auf Gel (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Hrsg., Cold Spring Harbor, New York) mit einem synthetischen Oligonukleotid, das für eine lysinreiche Sequenz (siehe oben) codiert als Sonde wurden Standard-Protokolle verwendet.
Isolation der Proteinkörper und Behandlung mit Protease
Diese Protokolle sind bereits beschrieben worden (Torrent et al., Planta, 180:90–95, 1989).
Elektronenmikroskopie
Die Proteinkörper von Endospermen des Wildtyps und von mit pP20γZ transformierten Endospermen wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 2,5% Paraformaldehyd in 20 mM Phosphatpuffer pH 7,2 fixiert und gemäß Geli et al. (1994, Plant Cell 6, 1911–1922) transformiert, wobei jeweils ein α-PL-Antiserum und ein Colloid aus Gold und Protein A mit einem Durchmesser von 15 nm verwendet wurde. Für die Doppelmarkierung wurden Ultadünnschnitte zuerst mit α-PL inkubiert und das Colloid aus Gold und Protein A (15 nm Durchmesser) wurde für den Nachweis der Antikörper eingesetzt. Nach dem Waschen wurden die Schnitte 20 Minuten mit 0,15 mg/ml Protein A inkubiert, um die Immunglobuline abzusättigen, und schließlich wurden die Gitter mit α-G2- oder α-Z1-Seren inkubiert und für den Nachweis der Antikörper wurde das Gold/Protein-A-Colloid (Durchmesser 5 nm) eingesetzt. α-Z1 ist ein polyklonales Kaninchenantiserum gegen α-Zein, das gemäß Ludevid et al. (1985, Plant Sci. 41, 41–48) erhalten wird.
Ergebnisse
Konstruktion von lysinreichen γ-Zeinen
Die Erfinder haben die Wichtigkeit der wiederholten prolinreichen Domäne ("proline-rich repeat") und der cysteinreichen C-terminalen Domäne für die Zurückbehaltung des γ-Zeins im endoplasmatischen Reticulum und die Bildung von Proteinkörpern, die diese Proteine enthalten, in den Zellen von Arabidopsis-Blättern (Geli et al., 1994, Plant Cell 6, 1911–1922) nachgewiesen. Aufgrund dieser vorigen Ergebnisse wurde zwecks Verbesserung der ernährungsphysiologischen Eigenschaften von Mais die Möglichkeit, lysinreiche Sequenzen in verschiedene γ-Zein-Domänen zu insertieren, um ein modifiziertes, korrekt zielgesteuertes γ-Zein, das in den Endospermzellen angehäuft wird, zu erzeugen, untersucht.
Die Erfinder haben nun modifizierte γ-Zein-Gene konstruiert, und zwar durch Einführung von synthetischen Oligonukleotiden, die für lysinreiche Sequenzen codieren, an unterschiedliche Stellen der γ-Zein-Codiersequenz. Es wurden Konstrukte von modifiziertem γ-Zein so erzeugt, daß eine Plazierung von lysinreichen Codiersequenzen in den Domänen, die aus der tandemartig wiederholten Domäne und der cysteinreichen Domäne bestanden, vermieden wurden. In der Sequenz, die der Pro-X-Domäne entsprach, wurden Modifikationen der Codiersequenz des γ-Zeins durchgeführt. Weiterhin wurden, um eine Veränderung der Proteinfaltung so gering wie möglich zu halten, die lysinreichen Sequenzen (P – K)_n so definiert, daß sie die Sequenz der Pro-X-Domäne nachahmten. Wie aus 3 ersichtlich, wurde in das Protein P20γZ eine Sequenz K(P – K)₄ nach der Pro-X-Region eingeführt und in dem Protein H30γZ und in dem Protein H45γZ ersetzen Aminosäuresequenzen, die K(P – K)₄ bzw. 2K(P – K)₄ enthalten, die Pro-X-Domäne des γ-Zeins (γZ, 3). Um herauszufinden, ob es sich beim C-terminalen Ende um eine "permissive site" für die Einführung von lysinreichen Sequenzen handelte, wurde ein zusätzliches Protein, nämlich N13γZ, erzeugt, und zwar durch Insertion einer K(P – K)₄-haltigen Sequenz fünf Aminosäuren stromaufwärts des C-terminalen Endes (3).
Aktivität des γ-Zein-Promotors im Endosperm von transformiertem Mais
Um herauszufinden, ob lysinreiche γ-Zeine in den Endospermzellen exprimiert werden können, hat man zuerst nach einem wirksamen Promotor und einem Transformationssystem gesucht. Es wurden ein γ-Zein-Promotor, der eine 1,7 kB große stromaufwärtsgelegene Sequenz enthielt (Reina et al., 1990, Nucleic Acid Research, Bd. 18, S. 6426) und der CaMV-Promotor, der 625 Bp der Sequenz stromaufwärts des 35S-Proteins des Blumenkohlmosaikvirus CaMV enthält, geprüft. Bis jetzt gab es keinerlei Informationen über die Funktionsanalyse von Genfusionen mit dem γ-Zein-Promotor in transgenen einkeimblättrigen Pflanzen. Um die Aktivität und die Gewebespezifität des γ-Zein-Promotors zu analysieren, wurden zwei chimäre Gene konstruiert (siehe 5). Als Verfahren für die Transformation von Mais für die Analyse des Promotors sowie für Expressionsversuche von lysinreichen γ-Zeinen wurde die vorübergehende Expression durch Beschuß mit der Genkanone (Klein et al., 1988 PNAS 85:4305) verwendet. Es wurden Mais-Endospermen im Stadium 17 TMB (17 Tage nach der Befruchtung) (Pericarp und Zellen der Aleuronschicht waren erhöht), Embryonen (17 TMB) sowie junge Blätter (im Alter von 10 Tagen) beschossen, und zwar mit Goldprojektilen, die mit Plasmid-DNA, die die beiden Konstrukte enthielt, beschichtet waren. 5 zeigt die Aktivität der β-Glucuronidase (GUS) und der Luciferase (LUC) die in den drei Testgeweben, nämlich Endosperm, Embryo und Blatt, auftraten im Vergleich zum Kontrollversuch. Es ist anzumerken, daß die Ergebnisse dem Mittel von mindestens 3 unabhängig durchgeführten Versuchen entsprechen. Jegliche GUS-Aktivtät unter der Kontrolle des γ-Zein-Promotors war auf das Endosperm beschränkt, weil keinerlei GUS-Expression im Embryo und in den Blättern. nachgewiesen wurde. Außerdem wurden die beschossenen Endosperme histochemisch gefärbt, um die Anzahl der Zellverbände, die das GUS-Protein exprimierten, zu bestimmen. Das Färbemuster bestätigte die zuvor erhaltenen Ergebnisse, die GUS wurde in den Endospermen stark exprimiert (die durchschnittliche Anzahl Zellverbände mit GUS-Färbung betrug 150 pro Endosperm) und im Embryo und in den Blättern wurden keine blauen Flecken nachgewiesen. Im Gegensatz dazu vermittelte der CaMV-35S-Promotor eine LUC-Aktivität in allen geprüften Geweben (5), wobei trotzdem quantitative Unterschiede zwischen der relativen Aktivität des Enzyms in den Blättern und in den Embryonen im Vergleich zum Endosperm bestanden. Diese Unterschiede konnten auf eine intrinsische Variabilität der konstitutiven Aktivität des CaMV-Promotors zwischen den verschiedenen Maisgeweben oder auf ein schwaches Eindringen der mit der DNA beschichteten Partikel in die Mesophyllzellen, die ein großes Vakuolensystem enthalten, zurückgeführt werden. Im Stand der Technik gibt es Beweise dafür, daß der CaMV-Promotor üblicherweise eine schwache Aktivität in Zellen von einkeimblättrigen Pflanzen aufweist (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824–5828); trotzdem haben die Erfinder hier eine starke Aktivität des CaMV-Promoter in Endospermzellen gezeigt. Hieraus konnte geschlossen werden, daß die Aktivität des γ-Zein-Promotors und des CaMV-35S-Promotors in den Mais-Endospermen sehr stark war und daß sich daher diese beiden Promotor für die Kontrolle der Expression des Proteins in diesem Gewebe nützlich erweisen könnten.
Um zu bestimmen, ob die von den Konstrukten codierten Proteinmutanten für die Funktion des Transmembrantransports kompetent waren, wurden in-vitro-Transkriptions-Translations-Versuche in Gegenwart von Hunde-Pankreasmikrosomen durchgeführt. Die synthetischen Transkripte von jedem Konstrukt wurden translatiert und der Transport durch die Mikrosomenmembranen hindurch wurde durch Untersuchung des Schutzes gegen Verdauung durch Proteinase K getestet.
Diese Ergebnisse, die in 4A dargestellt sind, zeigen, daß die scheinbaren Molekulargewichte der in-vitro synthetisierten Polypeptide die eingeführten Mutationen widerspiegeln (4A, Bahn 1, 5, 9 und 13). In Gegenwart von Mikrosomen und von Proteinase K wurden keine Peptide mit niedrigem Molekulargewicht beobachtet, was zeigt, daß die vollständigen Polypeptidketten der modifizierten γ-Zeine durch die Mikrosomenmembranen hindurch transportiert worden waren (4A, Bahn 3, 7, 11 und 15). Vergleicht man das Ergebnis der Translokation der vier modifizierten γ-Zeine, so wurde beobachtet, daß das Protein H45γZ (4A, Bahn 11) das die Insertion von 10 Aminosäuren des Lysintyps enthielt, weniger stark transportiert wurde als die anderen Proteine. Es scheint, daß die negativ geladenen Reste in gewissem Ausmaß eine negative Auswirkung auf die Transportfähigkeit ausüben. Da der polyklonale Antikörper αG2, der gegen das γ-Zein gerichtet ist (Ludevid et al., 1985, Plant Sci. 41, 41–48) für die Unterscheidung zwischen dem γ-Zein des Wildtyps und den modifizierten γ-Zeinen nicht verwendet werden konnte, wurde ein Antikörper αPL gegen ein synthetisches Peptid, das die lysinreiche Aminosäuresequenz enthält, hergestellt. Anschließend wurde getestet, ob in-vitro synthetisierte modifizierte Proteine sowohl von den αG2-Antikörpern als auch von den als αPL-Antikörpern erkannt wurden. Dieser Versuch ist in 4B und in 4C dargestellt, wo die synthetischen Transkripte des γ-Zeins, nämlich P20γZ, H30γZ, H45γZ und N13γZ, in-vitro translatiert worden waren und in denen die Translationsprodukte mit αPL (4B) und mit αG2 (4C) immungefällt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die lysinreichen γ-Zeine von den beiden Antikörpern erkannt wurden (siehe 4B und C, Bahn 2 bis 5) und daß das γ-Zein nur vom αG2-Serum erkannt wurde (4B und C, Bahn 1). So ermöglicht die Spezifität der αPL-Antikörper für die modifizierten Proteine, zwischen dem lysinreichen γ-Zein und dem endogenen γ-Zein zu unterscheiden, wenn die modifizierten Gene in Endospermzellen exprimiert werden. Gemeinsam haben diese Versuche gezeigt, daß das Vorhandensein von lysinreichen Sequenzen die Funktion des Transmembrantransports oder das immunologische Verhalten des γ-Zeins nicht störte.
Expressionsanalyse von an Lysin angereicherten γ-Zeinen in Mais-Endospermen
Um zu untersuchen, ob das an Lysin angereicherte modifizierte γ-Zein in den Endospermzellen exprimiert und angehäuft wird, wurden Körner im Stadium 17 TNB mit DNA, die die Codiersequenzen für das Protein der vier Konstrukte (3) unter der Kontrolle des CaMV-Promotors (P20γZ und H20γZ) und des γ-Zein-Promotors (H45γZ und N13γZ) enthält, beschossen. Als Kontrollen wurden Konstrukte mit Antisense-Promotor oder ohne Promotor verwendet. 24 Stunden nach der Transformation der Endosperme wurden die Gesamtproteine extrahiert und die Expression der modifizierten γ-Zeine wurde mittels Immunblotting mit dem Antikörper αPL geprüft. 6A zeigt, daß die chimären γ-Zein-Gene, die die Insertion (Pro-Lys)_n nach der Domäne Pro-X (P20γZ) enthalten oder diese ersetzen (H45γZ und H30γZ) stark exprimiert wurden und daß die Translationsprodukte wirksam in den Endospermzellen angereichert wurden (6A, Bahnen 3, 4 und 5). Für jede Bahn entsprachen die Proteinextrakte ungefähr 1/3 eines beschossenen Endosperms, wodurch man abschätzen konnte, daß die Menge der modifizierten Proteine P20γZ, H30γZ und H45γZ pro Endosperm im Nanogrammbereich lag. Weiterhin wurde keinerlei quantitativer Unterschied zwischen dem Expressionsniveau der chimären Gene unter der Kontrolle des CaMV-Promotors und des γ-Zein-Promotors beobachtet, was die oben beschriebenen Ergebnisse, die mit den Markerproteinen GUS und LUC (5) erhalten wurden, bestätigt. Es wurde beobachtet, daß der Antikörper αPL ein ungefähr 30 kD großes Protein, das in den Gesamtproteinextrakten, auch in den nichttransformierten Endospermen, vorlag (siehe die schwache Bande in den vier Bahnen der 6A) erkannte. Mit einem sequentiellen Proteinextraktionsverfahren konnte man feststellen, daß es sich bei diesem Protein nicht um ein im Wäßrigen lösliches Speicherprotein handelte.
Wie aus 6A (Bahn 2) hervorgeht, wurde das Protein N13γZ nicht einmal in Spuren nachgewiesen, was anzeigt, daß das entsprechende chimäre Gen in den Endospermzellen nicht exprimiert wurde bzw. daß das Protein N13γZ abgebaut worden war. Es wurden die RNAs von Endospermen, die mit DNAs, die für die Proteine H45γZ und N13γZ codieren, transformiert worden waren, sowie die RNAs von nichttransformierten Endospermen analysiert. Ausgehend von den Gesamt-RNAs wurden die cDNAs hergestellt und mittels PCR mit Hilfe von spezifischen Primern amplifiziert. 6B ist eine Darstellung der Southern-Blot-Analyse von drei cDNA-Proben, die mit einem Oligonukleotid hybridisiert worden waren, das für eine als Sonde verwendete Sequenz K(Pro – Lys)₄ codiert. Die Ergebnisse zeigen, daß das Gen N13γZ korrekt exprimiert worden war (6B, Bahn 3). Das Vorliegen von Banden in den Proben H45γZ- und N13γZ bzw. das Fehlen dieser Banden in den nichttransformierten Endospermen hat nahegelegt, daß das Protein N13γZ während der 24-stündigen Inkubation abgebaut worden war. Aufgrund dieser Beobachtungen haben die Erfinder geschlossen, daß die Insertionsstelle der lysinreichen Sequenzen für die Stabilität des modifizierten γ-Zeins kritisch ist.
Das an Lysin angereicherte γ-Zein wird in den Proteinkörpern angehäuft
Außer dem Lysingehalt ihrer Pro-X-Sequenzen wiesen die Proteine P20γZ, H30γZ und H45γZ Eigenschaften auf, die auch beim γ-Zein des Wildtyps auftraten, es waren nämlich das Signalpeptid, die N-terminale in Tandemanordnung wiederholte Domäne und die C-Terminale cysteinreiche Region verwandt. Es schien wichtig, zu bestimmen, ob diese Domänen, die die Zielsteuerung und die Bildung der Proteinkörper aufrechterhalten, völlig funktionell bleiben oder ob die lysinreichen Sequenzen eine spezielle Umwelt erzeugten, in der diese Eigenschaften gestört werden könnten. Um diese zu prüfen hat man untersucht, ob sich die modifizierten γ-Zeine in den Proteinkörpern anhäufen konnten. Es wurde mit den transformierten Endospermen eine Fraktionierung in Zellfraktionen durchgeführt. Die Homogenate von beschossenen Endospermen wurden auf diskontinuierliche Saccharosegradienten aufgetragen (20%, 50% und 70% Saccharose), und alle gewonnenen Fraktionen wurden mittels Immunblotting analysiert. P20γZ, H30γZ und H45γZ wurden auf die Proteinkörperfraktion sedimentiert, und es wurde weder im Überstand noch in der Mikrosomenfraktion eine wesentliche Menge dieser Proteine nachgewiesen (7A, Bahnen 2, 2 und 3). Obwohl aus den vorab durchgeführten in-vitro-Versuchen (4A) hervorging, daß die neu synthetisierten modifizierten γ-Zeine in die Hunde-Mikrosomen transportiert worden waren, wurde hier geprüft, ob die in-vivo in Endospermzellen exprimierten modifizierten Proteine in die Membran des endoplasmatischen Reticulums transportiert wurden und im Inneren der vom endoplasmatischen Reticulum stammenden Proteinkörper verblieben. Aus diesem Grund wurden die isolierten Proteinkörper in isotonischen Puffern (mit 20% Saccharose) oder nach osmotischem Schock in Wasser mit Proteinase K verdaut (7B). Die gegen proteolytischen Abbau durch Enzyme geschützten Proteine können von einer Membran umgeben sein und eine Behandlung mit Detergens-Lösungen oder hypotonischen Lösungen hat zum Abbau der Proteine geführt (Walter und Blobel, 1983, Method Enzymol. 96, 84–93). Mit Hilfe eines Vergleichs der Intensität der Banden nach Abbau durch Proteinase K in saccharosehaltigen Medien oder Wasser konnte gezeigt werden, daß die Proteine P20γZ, H30γZ und H45γZ in isotonischen Puffern gegen Abbau geschützt waren, (Bahnen 1, 3 und 5), jedoch in Wasser teilweise abgebaut wurden (Bahnen 2, 4 und 6).
Aufgrund der Expression von modifizierten γ-Zein-Genen in den Zellen unter der Aleuronschicht des Endosperms mittels Beschuß mit der Genkanone konnte beobachtet werden, daß die lysinreichen γ-Zeine großteils angehäuft wurden, außer, wenn die lysinreichen Sequenzen 5 Reste stromaufwärts vom C-terminalen Ende des γ-Zein-Polypeptids lagen. Ausgehend von dieser Expression und von immuncytochemischen Untersuchungen an isolierten Proteinkörpern haben die Erfinder nachgewiesen, daß die lysinreichen γ-Zeine korrekt in diesen Organellen angehäuft werden und an der gleichen Stelle wie die endogenen γ-Zein- und α-Zein-Proteine lokalisiert sind.
Es wurden aus P20γZ-Endospermen isolierte Proteinkörper mittels Immungoldmarkierung und Elektronenmikroskopie untersucht. Bei mit dem Antikörper αP-L inkubierten Ultradünnschnitten (8A) wurde die Goldmarkierung im Inneren der Proteinkörper nachgewiesen, was anzeigt, daß das lysinreiche Protein P20γZ im Inneren dieser Organellen angehäuft wurde. In Schnitten, die nur mit dem Antikörper αP-L inkubiert wurden, erfolgte eine Immunmarkierung nur an manchen Proteinkörpern (die das lysinreiche γ-Zein enthalten), während der Großteil der isolierten Proteinkörper nicht mit dem Antikörper αP-L immunmarkiert wurde, da diese nichttransformierten Endospermzellen entsprachen. Um zu bestimmen ob das lysinreiche γ-Zein an der gleichen Stelle wie die α-Zein- und γ-Zein-Polypeptide lokalisiert war, wurde an isolierten Proteinkörpern eine immun-elektromikroskopische Doppelmarkierung mit den Antikörpern αZ und αP-L (8B) bzw. αG2 und αP-L (Abb. 8C und D) durchgeführt. 8B zeigt eine Mikrographie des Querschnitts von zwei Proteinkörpern die, mit dem Antikörper αP-L (15 nm-Goldpartikel) und dem Antikörper αZ (5 nm-Goldpartikel) markiert worden waren. Aus dem Ergebnis der Immunfärbung geht hervor, daß das Protein P20γZ im Proteinkörper angehäuft wird und an der gleichen Stelle wie α-Zein lokalisiert wird (siehe, wie sich die α-Zein-Markierung über die gesamte Oberfläche der Proteinkörper erstreckt). Außerdem wurden Tangentialschnitte (8B, siehe Pfeile) und Querschnitte (8D) von Proteinkörpern mit dem Antikörper αP-L (15 nm-Goldpartikel) und dem Antikörper αG2 (5 nm-Goldpartikel) inkubiert. In beiden Fällen war das Protein P20γZ an der gleichen Stelle wie die γ-Zein-Polypeptide lokalisiert. Es konnte beobachtet werden, daß die Tangentialschnitte des Proteinkörpers (8A, C, siehe Pfeile) insofern leicht von den Querschnitten des Proteinkörpers unterschieden werden konnten, als bei den ersteren eine stärkere Elektronendichte auftrat und sich die Markierung des γ-Zeins über den gesamten Schnitt erstreckte. Im Gegensatz dazu war die Dichte bei den Querschnitten schwächer und die Markierung des γ-Zeins war auf der Membran, die den Proteinkörper umgibt, lokalisiert. In beiden Fällen folgte die Lokalisierung der Markierung des lysinreichen γ-Zeins derjenigen des endogenen γ-Zeins.
B) Herstellung von genetisch modifizierten Pflanzen, die lysinreiche γ-Zeine exprimieren
1) Gewinnung und Verwendung von Maiskallus als Target für die genetische Transformation
Bei der genetischen Transformation des Maises ist im allgemeinen unabhängig von der verwendeten Methode (Elektroporation; Agrobacterium, Mikrofasern, Genkanone) die Verwendung von undifferenzierten Zellen mit aktiver Zellteilung, bei denen die Fähigkeit zur Regeneration von intakten Pflanzen erhalten ist, erforderlich. Aus dieser Art von Zellen setzt sich der lockere embryogene Maiskallus (auch Typ-IIKallus genannt) zusammen.
Diese Kalli erhält man ausgehend von unreifen Embryonen des Genotyps Hi II oder (A188 × B73) nach der von Armstrong (Maize Handbook; (1994) M. Freeling, V. Walbot Hrsg.; S. 665–671) beschriebenen Methode auf den in dieser Arbeit beschriebenen Medien. Die so erhaltenen Kalli werden durch wiederholtes Umsetzen alle 15 Tage auf dem Initiationsmedium vermehrt und erhalten.
Ausgehend von diesen Kalli werden anschließend Pflänzchen regeneriert, und zwar dadurch, daß man das hormonale und osmotische Gleichgewicht der Zellen nach der von Vain et al. (Plant Cell Tissue and Organ Culture (1989) 18:143–151) beschriebenen Methode modifiziert. Diese Pflanzen werden anschließend im Gewächshaus abgehärtet, wo sie gekreuzt oder geselbstet werden können.
2) Verwendung der Genkanone für die genetische Transformation von Mais
Im Absatz oben wird die Gewinnung und Regeneration der für die Transformation erforderlichen Zelllinien beschrieben; hier beschreibt man ein Verfahren für die genetische Transformation, die zur stabilen Integration der modifizierten Gene in das Genom der Pflanze führt. Diese Methode beruht auf der Verwendung einer Genkanone, die der von J. Finer (Plant Cell Report (1992) 11:323–328) beschriebenen Genkanone gleicht; bei den Target-Zellen handelt es sich um Stücke von Kalli, wie sie in Absatz 1 beschrieben wurden. Diese Stücke, die eine Oberfläche von 10 bis 20 mm² aufweisen, wurden 4 Stunden vor dem Beschiessen in einer Anzahl von 16 Stücken pro Schale in die Mitte einer Petrischale gelegt, welche ein Kulturmedium enthält, das mit dem Initiationsmedium identisch ist, jedoch zusätzlich 0,2 M Mannit + 0, 2 M Sorbit enthält. Die Plasmide, die die einzuführenden Gene enthalten, werden auf einer Qiagen^®-Säule nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Anschließend werden sie auf Wolframpartikel (M10) niedergeschlagen, wobei man wie bei Klein (Nature (1987) 327:70–73) beschrieben vorgeht. Die so beschichteten Partikel werden mit Hilfe der Kanone und der Vorschrift, wie sie bei J. Finer (Plant Cell Report (1992) 11:323–329) beschrieben sind, auf die Target-Zellen geschossen.
Die so beschossenen Kallusschalen werden anschließend mit Scellofrais^® dicht verschlossen und dann bei 27°C im Dunkeln kultiviert. Ein erstes Umsetzen erfolgt 24 Stunden nachher und anschließend wird 3 Monate lang alle 15 Tage auf ein Medium umgesetzt, das mit dem Initiationsmedium identisch ist, jedoch zusätzlich ein Selektionsmittel enthält, dessen Art und Konzentration von dem verwendeten Gen abhängt (siehe Absatz 3). Die Selektionsmittel, die verwendet werden können, bestehen im allgemeinen aus Wirkstoffen von gewissen Herbiziden (Basta^®, Round up^®) oder gewissen Antibiotika (Hygromycin, Kanamycin usw. ...).
Nach 3 Monaten oder manchmal auch früher erhält man Kalli, deren Wachstum nicht von dem Selektionsmittel gehemmt wird und die üblicherweise und hauptsächlich aus Zellen bestehen, die aus der Teilung einer Zelle hervorgehen, die in ihr genetisches Material eine oder mehrere Kopien des Selektionsgens integriert hat. Die Häufigkeit, mit der solche Kalli erhalten werden, beträgt ungefähr 0,8 Kalli pro beschossener Schale.
Diese Kalli werden identifiziert, vereinzelt, vermehrt und anschließend so kultiviert, daß Pflänzchen regeneriert werden (vgl. Absatz 1). Um jegliche Wechselwirkung mit nichttransformierten Zellen zu vermeiden, werden alle diese Arbeitsschritte auf Kulturmedien durchgeführt, die das Selektionsmittel enthalten.
Die so regenerierten Pflanzen werden abgehärtetet und anschließend im Gewächshaus herangezogen, wo sie gekreuzt oder geselbstet werden können.
3) Verwendung des Bar-Gens für die Herstellung von genetisch modifizierten Maispflanzen, die das Gen H45γZ integriert haben und dieses exprimieren
Das Bar-Gen von Streptomyces hygroscopicus codiert für eine Phosphinothricin-Acyltransferase (PAT), die durch Acetylierung des Phosphinothricin-Moleküls, das den Wirkstoff des Herbizids Basta^® darstellt, inaktiviert ist. Die Zellen, die dieses Gen tragen, werden dadurch resistent gegen dieses Herbizid gemacht und können auf diesem Weg selektiert werden. Für die Transformation von Getreiden steht die Codiersequenz des Bar-Gens unter der Kontrolle einer Regulationsregion, die eine starke konstitutive Expression in den Pflanzenzellen ermöglicht. Solch eine Region stellt vorteilhafte Promotor und das erste Intron des Actin-Gens aus Reis dar, wie sie von Mc Elroy (Mol. Gen. Genet. (1991) 231:150–160) beschrieben werden.
Dieses chimäre Gen wird in ein Plasmid kloniert, das seine Amplifikation durch Escherichia coli ermöglicht. Dieses Plasmid (pDM 302 Cao (Plant Cell Report (1992) 11:586–591) kann nach seiner Amplifikation und anschließender Reinigung auf einer Qiagen^®-Säule für die genetische Transformation von Mais verwendet werden, wobei man zum Beispiel wie in der oben beschriebenen Methode vorgeht. Hier werden die Kulturmedien für die Selektion der transformierten Zellen mit 2 mg/l Phosphinothricin versetzt.
Für die Einführung des Gens H45γZ verwendet man vorteilhaft die sogenannte Cotransformationstechnik:
das Selektionsgen (Bar) und das interessierende Gen (H45γZ) befinden sich auf unabhängigen Plasmiden. Hier geht man bei der Verwendung der Genkanone so vor, daß man die Plasmide gemeinsam auf die Wolframpartikel fällt, wobei die Gesamtmenge der auf die Partikel gefällten DNA gleich wie in der Standardvorschrift ist (5 μg DNA pro 2,5 mg Partikel) und jedes Plasmid ungefähr die Hälfte des verwendeten DNA-Gesamtgewichts ausmacht.
Die Erfahrung hat gezeigt, daß das (mit einer Größenordnung von 90%) häufigste Ereignis bei dieser Methode die Cointegration der Plasmide in die Pflanzenzellen ist, das heißt, daß praktisch jede Pflanze, die das Bar-Gen integriert hat und auf diesem Weg selektiert wurde, auch das H45γZ-Gen trägt. Das Coexpressionsniveau (Prozentsatz der selektierten Pflanzen), die das Gen H45γZ exprimieren) liegt üblicherweise in einer Größenordnung von 70%.
Die so eingeführten Gene sind im allgemeinen genetisch gekoppelt; das Gen H45γZ kann daher vorteilhaft aufgrund der Resistenz gegen das Herbizid, mit der es eng gekoppelt ist, in den Nachkommenschaften verfolgt werden.
Die Menge des modifizierten Proteins wird nach den in Beispiel A beschriebenen Methoden bestimmt, insbesondere durch Immunblotting anhand von Proteinextrakten von unreifen oder reifen Maiskörnern, die in gepoolter Form von Basta-resistenten Pflanzen entnommen werden.
4) Beispiel für den Schritt der Einführung von Transgenen, insbesondere des Gens, das für H45γZ codiert, für die Modifikation des Opaque-2-Phänotyps von Mais
Züchterische Verbesserung von Opaque-2-Mais durch Introgression des Gens für an Lysin angereichertes γ-Zein.
Es werden die in dem obigen Beispiel beschriebenen transformierten Pflanzen, die gleichzeitig eine Resistenz gegen Basta und die Expression eines an Lysin angereicherten γ-Zeins aufweisen, verwendet. Mit ihrem Pollen werden Opaque-2-Maispflanzen der Bahn W64Ao2, die nur ein einziges γ-Zein-Gen enthält, befruchtet. Diese Bahn wurde vom Maize Stock Center erhalten. Die Pflanzen dieser F1-Nachkommenschaften werden auf ihre Resistenz gegen Basta selektiert und anschließend geselbstet. Die so produzierten F2-Körner werden auf einem Leuchttisch auf ihren "Opaque"-Phänotyp untersucht, und die "Opaque"-Körner oder die glasigen Körner werden ausgesät und auf ihre Resistenz gegen Basta ausgewertet. Dort, wo die "Opaque"-Körner nicht gegenüber Basta empfindlich sind, ist der Beweis erbracht, daß die Einführung des Gens für an Lysin angereichertes γ-Zein in die jeweiligen Pflanze den "Opaque-2"-Phänotyp vervollständigt.
Anschließend werden bei diesen basta-resistenten Pflanzen Einzelpflanzen mit dem Genotyp o2/o2, die nur eine einziges γ-Zein-Gen auf dem Chromosom 7 aufweisen, mit Hilfe von Molekularsonden, die für das Gen Opaque 2 und für das γ-Zein codieren, selektiert. Mit diesen molekularen Sonden werden polymorphe Restriktionsfragmente identifiziert, und nur diejenigen Einzelpflanzen, die das Muster der Bahn W64o2 aufweisen, werden ausgewählt. (Lopes, M.A. et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 19:247, 603–613).
Diese Einzelpflanzen weisen einen Lysingehalt auf, der im Mittel dem des o2-Maises entspricht oder auch höher ist. Ausgehend von diesen Einzelpflanzen wird jegliche Introgression des Merkmals "hoher Lysingehalt" in Elite-Sorten mittels der Bestimmung der Basta-Resistenz und des Vorhandenseins des Allels o2, das mittels RFLP nachgewiesen wird, beobachtet.
5) Expression von an Lysin angereicherten γ-Zeinen in Arabidopsis thaliana
Um zu einer stabilen Transformation zu gelangen wurden die Plasmidkonstrukte P20γZ und pH30γZ, die in das Plasmid Bluescript KS (–) kloniert worden waren, in Form von HincII/XbaI-Fragmenten in den binären Vektor pBin19 (Bevan, M. Nucl. Acids Res. 12:8711–8721 (1984)), der den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) und die Signale für die Bildung des 3'-Endes und für die Polyadenylierung aus dem Octopin-Synthetasegen (ocs) enthält, insertiert. Die neuen Plasmide wurden p19P20γZ und p19H30γZ genannt (12).
Die binären Vektoren, die die Codiersequenzen für die Proteine P20γZ und H30γZ enthalten (p19P20γZ und p19H30γZ) wurden in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 eingefügt. Arabidopsis-Pflanzen des Ökotyps RLD wurden mit der von Valvekens, D., Van Montagu, M. et Van Lijsebettens, M. ((1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5536–5540) beschriebenen Methode transformiert. Für jedes Konstrukt wurden 10 transgene Pflanzen mittels Immunblot-Analyse unter Verwendung eines gegen γ-Zein erhaltenen Antiserums (αG2, Ludevid et al. 1985) durchmustert. Zur Gewinnung der F2-Generation wurden die Pflanzen, die den höchsten Gehalt an transgenen Produkten der F1-Generation enthielten, ausgewählt (dieser Gehalt entsprach ungefähr 0,1% der Gesamtmenge der in den Blättern von Arabidopsis vorhandenen Proteine). Diese Pflanzen wurden auch für die Expression des gewünschten Proteins selektiert.
Intakte transgene Pflanzen, die auf einem kanamycinhaltigen Medium selektiert worden waren, wurden in flüssigem Stickstoff homogenisiert. Die transgenen Proteine wurden selektiv mit einer Lösung, die Ethanol/Salzsäure HCl 0,125 N im Verhältnis 3:1 (v/v) mit 5% Mercaptoethanol und Proteasehemmern enthielt, extrahiert. Die mit dieser Lösung extrahierten Proteine wurden in 5 Volumina Aceton gefällt und mittels SDS-PAGE und Immunblotting analysiert. Als Kontrollen wurden die Proteinextrakte von nicht-transgenen Pflanzen verwendet. Die Proteine, die aufgrund der Insertion der K(P – K) ₄-Sequenzen in das γ-Zein auftraten, wurden dadurch, daß man den konstitutiven CaMV-35S-Promotor verwendete, korrekt in den Arabidopsis thaliana-Pflanzen exprimiert. Auf den Immunblots erkannten die Antikörper αG2 und αPL die Elektrophoresebanden, die den Proteinen P20γZ und H30γZ entsprachen. Diese Banden wanderten mit scheinbaren Molekulargewichten, die denjenigen entsprachen, die man zuvor in den in-vitro-Translations/Translokationsversuchen beobachtet hatte (30 kD bzw. 26 kD). Wie dies bei den transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die das γ-Zein exprimieren, beobachtet wurde (Geli et al. Plant Cell 6:1911–1922 (1994)) wanderten die Proteine P20γZ und H30γZ in Form von zwei Elektrophoresebanden, nämlich bei P20γZ den Banden, die 36 und 30 kD entsprachen und bei H30γZ den Banden, die 32 und 26 kD entsprachen. Die höheren Banden könnten Produkten entsprechen, die aufgrund von posttranslationellen Modifikationen entstanden sind. Keine solche posttranslationelle Modifikation wurde in den transformierten Maisendospermen nachgewiesen. Dieses Ergebnis legt nahe, daß die Modifikation dann erscheinen dürfte, wenn diese Proteine in einem heterologen System wie Arabidopsis thaliana exprimiert werden.
6) Expression von rekombinanten an Lysin angereicherten γ-Zeinen in Mais
Methode:
Nach der Gewinnung der transgenen Pflanzen werden diese mit einer nichttransformierten männlichen Linie gekreuzt. Bei einer Ein-Locus-Insertion werden also 50% der geernteten Körner transgen sein. Um die an Lysin angereicherten α-Zeine in den transgenen Pflanzen zu analysieren werden die Proteine aus 6 Körnern pro Transformante extrahiert.
Die Endosperme werden dadurch herauspräpariert, daß man die Embryonen und Pericarpe von den Körnern entfernt. Die Endosperme werden gemahlen und 50 mg Mehl werden für die selektive Extraktion eingesetzt. Zuvor werden die α-Zeine dreimal mit 70%igem Ethanol extrahiert. Nach dem Zentrifugieren wird das Ethanol im Vakuum abgedampft. Die in Ethanol unlöslichen Proteine (hauptsächlich die γ-Zeine und die an Lysin angereicherten γ-Zeine) werden von dem Pellet mit einem Laemmli-Puffer, der 10% Mercaptoethanol enthält, extrahiert (100 μl Puffer pro 10 mg Mehl). Anschließend werden die Gesamtproteine mittels Silberfärbung analysiert (Morrissey, J.H., 1981, Ann. Biochem. Band 117, S. 307–310). Die γ-Zeine und die an Lysin angereicherten γ-Zeine werden mittels Immunblotting mit den Antikörpern αG2 (Verdünnung 1/2000) bzw. αPL (Verdünnung 1/500) analysiert. Als Sekundärantikörper im Immunblot wird ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter Antikörper gegen Antikörper aus dem Kaninchen verwendet. Die Extrakte werden verdünnt, um auf die SDS-PAGE nach dem verwendeten Analyseverfahren aufgetragen werden zu können.
Ergebnisse:
Anhäufung von an Lysin angereicherten γ-Zeinen in den transgenen Maispflanzen 20γZ und 45γZ:
13 zeigt den Immunblot der Proteinextrakte nach Nachweis mit Antiserum αPL (A, B) und die Gesamtproteine nach Silberfärbung (C). Wie aus 13A ersichtlich, wurden 6 transgene 20γZ-Pflanzen mit dem Antiserum αPL geprüft, und an Lysin angereichertes γ- Zein wird in den transgenen Pflanzen A1 und D2 exprimiert (Bahn 1 bzw. 6). Bei der Pflanze C1 (Bahn 4) werden nur Spuren von an Lysin angereichertem γ-Zein beobachtet. Wenn die Extrakte der 6 transgenen Pflanzen 45γZ auf das Gel aufgetragen werden und mit dem Antiserum αPL markiert werden (13B), so beobachtet man bei den Transformanten B1 und C1 eine starke Reaktion mit dem Antikörper (Bahn 3 bzw. 4).
Es ist anzumerken, daß die Antikörperreaktion bei den Extrakten von Endospermen der Pflanzen 45γZ B1 und C1 stärker ist als bei den Extrakten der Pflanzen 20γZ A1 und D2. Dieses Ergebnis wird nach Anfärbung der Gele mit Silber bestätigt (13C), wo die beiden γ-Zein-Typen, nämlich endogenes und an Lysin angereichertes Zein, angefärbt werden. Das an Lysin angereicherte γ-Zein weist ein scheinbares Molekulargewicht von 30 kDa und das endogene γ-Zein ein scheinbares Molekulargewicht von 28 kDa auf. Die Expression des an Lysin angereicherten γ-Zeins ist in der Pflanze 45γZ B1 schwächer als bei C1 (Bahn 2 bzw. 3). Bei den Bahnen 1 bis 6 in 13C wurde eine identische Verdünnung der Proteine von Extrakten der Endosperme der Pflanzen 45γZ und 20γZ auf das Gel aufgetragen. Bei dieser Verdünnung wird die Expression des an Lysin angereicherten γ-Zeins nur bei den Endospermen der Pflanzen 45γZ B1 und C1 nachgewiesen. Wird jedoch ein höher konzentrierter Extrakt der 20γZ-Proteine auf das Gel aufgetragen (40μg Protein pro Bahn), so wird bei den Endospermen 20γZ A1 und D2 eine schwache Bande (siehe Pfeil), die dem an Lysin angereicherten γ-Zein entspricht, nachgewiesen. Aus diesem Ergebnis geht hervor, daß die 45γZ-Pflanzen wesentlich mehr erfindungsgemäße Proteine anhäufen als die 20γZ-Pflanzen. Dies beruht vermutlich auf den unterschiedlichen Promotoraktivitäten. Die 45γZ-Pflanzen waren mit einem Konstrukt transformiert worden, das das erfindungsgemäße γ-Zein unter der Kontrolle des γ-Zein-Promotors (1,7 kb) enthält, während die 20γZ-Pflanzen mit der gleichen Codiersequenz, jedoch unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors, transformiert worden waren. Die Silberfärbung ist eine allgemeine Proteinfärbetechnik, die dunkelbraune Farbe wird jedoch in erster Linie beim Vorhandensein von basischen Proteinen beobachtet. Da die α-Zeine wie oben beschrieben aus Mehl extrahiert worden waren, fehlen sie in der SDS-PAGE-Analyse von 13C.
Aufspaltung
Da im Fall eines einzigen Locus bei allen transgenen Pflanzen 50% Aufspaltung auftritt, wurde eine Einzelkornanalyse durchgeführt, um den Gehalt an an Lysin angereichertem γ-Zein für jede Transformante quantitativ zu bestimmen. Die Analyse wurde nur mit den 45γZ-Transformanten, die das höchste Expressionsniveau aufwiesen, durchgeführt. In 14 sind die Silberfärbung (A) und der Immunblot mit αPL (B) von 5 unterschiedlichen Endospermen von 45γZ B1 und C1 dargestellt. Die in allen Bahnen vorhandene schwache elektrophoretische Bande (siehe A, Bahn 1 bis 10) entspricht dem endogenen γ-Zein. Wie aus 14A ersichtlich wird bei 2 der 5 Endosperme an Lysin angereichertes γ-Zein angehäuft siehe Bahn 3, 4 und 6, 7). Es werden also bei ungefähr der Hälfte der Körner beträchtliche Mengen an an Lysin angereicherten Proteinen angehäuft. Angesichts der Tatsache, daß gleiche Proteinmengen auf das Gel aufgetragen wurden, wird beobachtet, daß die Transformante 45γZ C1 mehr an Lysin angereichertem γ-Zein angehäuft hat als B1. Dieses Ergebnis stimmt also mit den Beobachtungen bei der Silberfärbung der Endosperm-Mischextrakte überein (13C, Bahn 3). Der Beweis dafür, daß an Lysin angereichertes γ-Zein in diesen Endospermen vorliegt, wird in 14B verdeutlicht. Der Immunblot mit dem Antiserum αPL zeigt, daß 2 Endospermextrakte von 45γZ B1 (Bahn 3 und 4) sowie von 45γZ C1 (Bahn 4 und 6) an Lysin angereichertes γ-Zein anhäufen. Um diesen Prozentsatz der transgenen Körner zu bestätigen wurden 10 weitere Körner der Transformante 45γZ C1 mittels Immunblot unter Verwendung des Antiserums αPL analysiert (15A). Wie erwartet werden ungefähr die Hälfte der Körner als transgen nachgewiesen. In den Endospermextrakten wurde eine immunreaktive Bande nachgewiesen (Bahn 1, 2, 9 und 10).
Quantitative Schätzung der an Lysin angereicherten γ-Zeine in den Endospermen der 45γZ-Transformanten:
Bei αG2 handelt es sich um ein polyklonales Antiserum, das die endogenen γ-Zeine und die an Lysin angereicherten γ-Zeine erkennt. Die Reaktionsfähigkeit dieses Antiserums mit den Extrakten der Endosperme 45γZ C1 wurde für die quantitative Bestimmung der erfindungsgemäßen an Lysin angereicherten γ-Zeine in den Endospermen der transformierten Pflanzen eingesetzt.
15B ist eine Darstellung des Immunblots von 5 Proteinextrakten, die 5 45γZ-C1-Endospermen entsprechen (Bahn 1 bis 5). Wie erwartet wiesen nur 2 Endosperme ein für die transgenen Körner charakteristisches Immunreaktionsprofil auf. Die obere Bande mit 30 kDa entspricht dem an Lysin angereicherten γ-Zein (Pfeil in Bahn 1 und 2) und die untere Bande entspricht dem endogenen γ-Zein. Es ist festzustellen, daß bei den Endospermen von nichttransgenen Pflanzen die obere Bande fehlt (Bahn 3, 4 und 5). Überraschenderweise scheint es, daß der endogene γ-Zein-Gehalt in den Extrakten von transgenen Pflanzen niedriger ist als bei den nichttransgenen Pflanzen (siehe Pfeile in Bahn 1 und 5).
Auf den ersten Blick wurde also folgendes beobachtet:

i) in den transgenen Endospermen 45γZ C1 beträgt das Verhältnis zwischen an Lysin angereichertem γ-Zein und endogenem Zein 7/3. Die Menge an erfindungsgemäßem modifiziertem Protein ist daher mindestens zweimal höher als die Menge an endogenem Protein.
ii) die Menge an endogenem γ-Zein in den nichttransgenen Endospermen (siehe Bahn 3, 4 und 5) entsprach derjenigen des an Lysin angereicherten γ-Zeins in den transgenen Endospermen (siehe Bahn 1 und 2).

7) Expression von rekombinanten an Lysin angereicherten γ-Zeinen in Weizen
Wie in Beispiel 6) kann das Vorliegen von erfindungsgemäßen an Lysin angereicherten γ-Zeinen in Weizen gezeigt werden.
Die Transformation von Weizen kann insbesondere nach der bei Weeks et al., 1993, Plant Physiol., Band 102:
Seiten 1077–1085 beschriebenen Methode oder nach der in EP-709462 beschriebenen Methode durchgeführt werden.
Sequenzprotokoll

Claims

Rekombinante Nukleotidsequenz, die eine Verknüpfung von Nukleotiden, die für ein Speicherprotein der Familie der Zeine codieren, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin ein Oligonukleotid umfaßt, das aus der Reihe a) Oligonukleotid, das mindestens eine Verknüpfung, die für ein Polypeptid der Formel (P – K)n, in der – n eine ganze Zahl 2 oder darüber bedeutet, – P einen Prolin-Aminosäurerest darstellt, – K einen Lysin-Aminosäurerest darstellt, das Zeichen „–" eine Bindung zwischen den beiden Aminosäureresten, insbesondere eine peptidartige Bindung, symbolisiert, wobei die n Einheiten (P – K) untereinander ebenfalls durch solche Bindungen, zum Beispiel peptidartige Bindungen, gebunden sind, codiert, umfaßt, b) Oligonukleotid gemäß a), in dem n eine ganze Zahl 3 oder darüber, vorzugsweise 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 15, bedeutet, c) Oligonukleotid gemäß a) oder b), in dem die Sequenz der n Einheiten (PK) durch einen oder mehrere Aminosäurereste, die von den Resten P oder K verschieden sind, unterbrochen ist, d) Oligonukleotid gemäß a), b) oder c), das an seinem 5'- und/oder 3'-Ende durch ein oder mehrere Codons vervollständigt ist, e) Oligonukleotid gemäß a), b), c) oder d), das an seinem 5'- und/oder 3'-Ende durch einen Lysinrest am N-terminalen Ende des gebildeten Polypeptids vervollständigt ist, f) Oligonukleotid gemäß e), das für ein Polypeptid der Formel (P – K)n, der Formel K(P – K)₄ oder der Formel 2K(P – K)₄ codiert, stammt, wobei das Oligonukleotid an einer Stelle der Nukleotidverknüpfung insertiert ist, die so gewählt ist, daß – man durch die Expression der Nukleotidsequenz in einer bestimmten Pflanzenzelle ein modifiziertes Speicherprotein der Familie der Zeine erhält, das gleich oder ähnlich wie das normale Speicherprotein, das unter den gleichen Bedingungen in der gleichen Zelle durch die entsprechende codierende Nukleotidverknüpfung exprimiert würde, lokalisiert ist, und/oder – das modifizierte Speicherprotein der Familie der Zeine, das von der rekombinanten Nukleotidsequenz codiert wird, von gegen das entsprechende normale Speicherprotein erzeugten Antikörpern immunologisch erkannt wird.
Rekombinante Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid am N- oder C-terminalen Ende der Nukleotidverknüpfung insertiert ist.
Rekombinante Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid an den prolinreichen in Tandemanordnung wiederholten Sequenzen der Nukleotidverknüpfung insertiert ist.
Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidverknüpfung für das Mais-γ-Zein codiert.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Mais-γ-Zein codierende Nukleotidverknüpfung der in 9 dargestellten Sequenz entspricht.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid an der Stelle oder nach der Pro-X-Domäne oder in der Pro-X-Domäne, die im Mais-γ-Zein natürlich vorkommt, insertiert ist.
Rekombinante Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 unter der Kontrolle eines ExpressionsPromotors umfaßt.
Rekombinante Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie sich bei dem Promotor um einen für ein bestimmtes Zellgewebe spezifischen Promotor, zum Beispiel um einen für die Expression in den Samenkörnern und/oder in den Blättern von Pflanzen spezifischen Promotor, handelt.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ExpressionsPromotor um den des Mais-γ-Zeins handelt.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ExpressionsPromotor um den CaMV35S-Promotor handelt.
Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eines der Polypeptide P20yZ oder H45yZ, die den in 11 bzw. 10 beschriebenen Sequenzen entsprechen, codiert.
Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er an einer für seine Replikation nicht unbedingt erforderlichen Stelle eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfaßt.
Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eines der Plasmide pP20yZ (CNCMN I-1640) oder pH45yZ (CNCMNI-1639) handelt, oder dadurch, daß er ein für das in 3 dargestellte Polypeptid H30yZ codierendes Oligonukleotid, umfaßt.
Polypeptid, das von einer Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert wird.
An Lysin angereichertes modifiziertes Mais-γ-Zein, dadurch gekennzeichnet, daß es von der Nukleotidsequenz nach Anspruch 5 codiert wird.
An Lysin angereichertes modifiziertes Mais-γ-Zein, dadurch gekennzeichnet, daß seine Aminosäuresequenz mit mindestens einem Polypeptid der Formel (P – K)n oder der Formel K – (P – K)n, in der – n eine ganze Zahl 2 oder darüber bedeutet, – P einen Prolin-Aminosäurerest darstellt, – K einen Lysin-Aminosäurerest darstellt, – das Zeichen „–" eine Bindung zwischen den beiden Aminosäureresten, insbesondere eine peptidartige Bindung, symbolisiert, wobei die n Einheiten (P – K) untereinander ebenfalls durch solche Bindungen, zum Beispiel peptidartige Bindungen, gebunden sind, modifiziert ist, wobei das Polypeptid der Formel (P – K)n oder K(P – K)n so in die Aminosäuresequenz des normalen Mais-γ-Zein insertiert ist, daß – wenn das lysinreiche modifizierte γ-Zein in einer Wirtszelle, insbesondere einer Pflanzenzelle produziert wird, es auf gleiche oder ähnliche Weise wie das normale Mais-γ-Zein, das unter den gleichen Bedingungen in der gleichen Wirtszelle produziert würde, lokalisiert ist, und/oder – das modifizierte Mais-γ-Zein von gegen das normale Mais-γ-Zein gerichteten Antikörpern erkannt wird.
An Lysin angereichertes modifiziertes Mais-γ-Zein nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß durch dieses Polypeptid eine in normalem Mais-γ-Zein natürlich vorhandene prolinreiche in Tandemanordnung wiederholte Sequenz ersetzt wird.
An Lysin angereichertes modifiziertes Mais-γ-Zein nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid unter Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren einer prolinreichen in Tandemanordnung wiederholten Sequenz des normalen γ-Zeins insertiert ist.
An Lysin angereichertes modifiziertes Mais-γ-Zein nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid einer prolinreichen in Tandemanordnung wiederholten Sequenz des normalen γ-Zeins hinzugefügt ist.
An Lysin angereichertes modifiziertes Mais-γ-Zein nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid in den N- oder C-terminalen Teil der Aminosäuresequenz des normalen Mais-γ-Zeins insertiert ist.
Modifiziertes Mais-γ-Zein nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um das Protein P20yZ, 11, oder das Protein H30yZ, 3, oder das Protein H45yZ, 10, handelt.
Rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfaßt.
Wirtszelle nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Bakterium, z.B. um E. coli oder Agrobacterium tumefaciens, handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine pflanzliche Zelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Pflanzensamenzelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Maissamen-Endospermzelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 5 stabil in ihr Genom integriert enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein lysinreiches modifiziertes Mais-γ-Zein nach einem der Ansprüche 16 bis 21 produziert.
Wirtszelle nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Soja-, Sonnenblumen-, Tabak-, Weizen-, Hafer-, Luzerne-, Reis-, Raps-, Arabidopsis- oder Maiszelle handelt.
Samen, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 21 produzieren.
Pflanze, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 21 produziert.
Pflanze nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Mais handelt.
Samen, die ein modifiziertes Polypeptid exprimieren und die von Pflanzen nach Anspruch 31 oder 32 erhalten werden.
Verwendung eines Oligonukleotids, das aus der Reihe: a) Oligonukleotid, das mindestens eine Verknüpfung, die für ein Polypeptid der Formel (P – K) n, in der – n eine ganze Zahl 2 oder darüber bedeutet, – P einen Prolin-Aminosäurerest darstellt, – K einen Lysin-Aminosäurerest darstellt, das Zeichen „–" eine Bindung zwischen den beiden Aminosäureresten, insbesondere eine peptidartige Bindung, symbolisiert, wobei die n Einheiten (P – K) untereinander ebenfalls durch solche Bindungen, zum Beispiel peptidartige Bindungen, gebunden sind, codiert, umfaßt, b) Oligonukleotid gemäß a), in dem n eine ganze Zahl 3 oder darüber, vorzugsweise 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 15, bedeutet, c) Oligonukleotid gemäß a) oder b), in dem die Sequenz der n Einheiten (PK) durch einen oder mehrere Aminosäurereste, die von den Resten P oder K verschieden sind, unterbrochen ist, d) Oligonukleotid gemäß a), b) oder c), das an seinem 5'- und/oder 3'-Ende durch ein oder mehrere Codons vervollständigt ist, e) Oligonukleotid gemäß a), b), c) oder d), das an seinem 5'- und/oder 3'-Ende durch einen Lysinrest am N-terminalen Ende des gebildeten Polypeptids vervollständig ist, f) Oligonukleotid gemäß e), das für ein Polypeptid der Formel (P – K)n, der Formel K(P – K)₄ oder der Formel 2K(P – K)₄ codiert, stammt, zur Gewinnung eines an Lysin angereicherten Speicherproteins aus der Familie der Zeine.
Verfahren zur Herstellung von Pflanzen oder Samen, die ein modifiziertes Speicherprotein aus der Familie der Zeine exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt a) Transformation einer Pflanzenzelle mit einer Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder einem Vektor nach einem der Ansprüche 12 oder 13 unter Bedingungen, die die stabile und funktionelle Expression des von der Nukleotidsequenz codierten modifizierten Speicherproteins gestatten; b) Regeneration von Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle aus Schritt a) zur Gewinnung von Pflanzen, die das modifizierte Speicherprotein exprimieren, sowie c) gegebenenfalls Gewinnung von Samen von in Schritt b) gewonnenen modifizierten Pflanzen.
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Pflanze um Mais und bei dem Speicherprotein um γ-Zein handelt.