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Technisches Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft Polypeptide, die die Wirkung der spezifischen
Inhibition von Epimorphinen (hier im folgenden als Epimorphin antagonisierende
Wirkung bezeichnet) aufweisen, Substanzen, die die Morphogenese
von epithelialem Gewebe fördern,
und die nützlich
als aktiver Inhaltsstoff von Pharmazeutika sind.
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Stand der Technik
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Es
wurde vorgeschlagen, dass die normale Morphogenese von epithelialem
Gewebe durch Faktoren kontrolliert wird, die aus mesenchymalen Zellen,
die um das epitheliale Gewebe herum vorliegen, stammen. Erkrankungen,
die der abnormalen Morphogenese von epithelialem Gewebe zugeschrieben
werden, sind weitgehend auf Anomalien bei den mesenchymalen Zellen
zurückzuführen. Diese
Ergebnisse haben ein Interesse an der Klärung des Mechanismus, durch
den die mesenchymalen Zellen die Morphogenese von epithelialem Gewebe
kontrollieren, geweckt. Die Substanzen, die in die Kontrolle der
Morphogenese von epithelialem Gewebe involviert sind, werden jedoch
unter zeitlicher und räumlicher
Kontrolle in einem komplizierten System exprimiert. Es ist extrem
schwer, diese Substanzen zu isolieren und ihre Funktionen zu analysieren.
Es ist auch schwierig, ein experimentelles Modellsystem zu konstruieren,
das die Morphogenese von epithelialem Gewebe vereinfacht. Aufgrund
dieser und anderer Gründe
wurde bei den Untersuchungen auf diesem Gebiet bis heute nicht viel
Fortschritt gemacht. Daher wurde eine Analyse des Kontrollmechanismus
für die
Morphogenese von epithelialem Gewebe nachdrücklich gefordert, um den Mechanismus
des Auftretens von Erkrankungen, die mit der Morphogenese von epithelialem
Gewebe assoziiert sind, zu erhellen und Verfahren zur Behandlung
dieser Erkrankungen zu etablieren.
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Unter
diesen Umständen
wurde über
einen Erfolg bei der Isolierung von Epimorphin, das an der Kontrolle
der Morphogenese von epithelialem Gewebe teilnimmt, berichtet (
Japanische Offengelegte Patentveröffentlichung
Nr. 602529 oder
Europäische Patentanmeldung
Offengelegte Veröffentlichung
Nr. 562123 , hier im folgenden als
EPA562123 bezeichnet). Von
dieser Substanz wurde gezeigt, dass sie eine physiologisch aktive Substanz
ist, die ein Protein von 277 bis 289 Aminosäuren als das Kernprotein enthält, und
die hauptsächlich durch
mesenchymale Zellen biosynthetisiert wird. Von Epimorphin wurde
auch gezeigt, dass es die Wirkung der Förderung der Morphogenese von
epithelialem Gewebe aufweist und es wurde angedeutet, dass wenn Epimorphin
nicht funktionierte, eine normale Gewebebildung nicht stattfand.
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Als
eine Substanz, von der bekannt ist, dass sie die physiologische
Wirkung von Epimorphin (Epithelialgewebe-Morphogenese-fördernde Wirkung) inhibiert,
gibt es einen Antikörper
(M-1), der spezifisch an Epimorphin bindet, wodurch dessen Wirkung
inhibiert wird (
Japanische Offengelegte
Patentveröffentlichung
Nr. 6025295 oder
EPA562123 ;
CELL, 69, Seiten 471-481, 1992). Dieser Antikörper ist nützlich zur Klärung des Mechanismus
für die
normale Morphogenese von Epithelialgewebe durch Epimorphin und es
wird erwartet, dass er bei der Erhellung des Mechanismus des Auftretens
von Erkrankungen, die der anormalen Expression (exzessiven Expression)
von Epimorphin zugeschrieben werden, und bei der Verhinderung und
Behandlung dieser Erkrankungen nützlich
ist. Hirai et al. offenbaren, dass Epimorphin ein mesenchymales
Protein ist, das für
die epitheliale Morphogenese essenziell ist (Hirai Y. et al., Cell,
1992, Band 69, 471-481).
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Koshida
et al. offenbaren eine zelluläre
Erkennungssequenz von Epimorphin und seine Rolle bei der Wechselwirkung
bei der Lungenverzweigungsmorphogenese. Der zentrale Anteil dieses
Moleküls
(Aminosäuren
105-123) wird offenbart. (Koshida S. et al., Biochem Biophys Res
Commun. 1997, Band 234, 522-525). Epimorphin wirkt auch, um die
Morphogenese eines Haarfollikels zu fördern. So ist es wahrscheinlich,
dass der oben erwähnte
Antikörper,
der die Aktivität
von Epimorphin inhibiert, Alopezie induziert oder Haarwachstum inhibiert.
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Dieser
Antikörper
warf jedoch das Problem auf, dass er instabil war und während der
Herstellung leicht deaktiviert wurde, so dass es schwierig gemacht
wurde, ihn als ein Pharmakon oder einen Haarwachstumsinhibitor zu
entwickeln oder stabil bereitzustellen. Da sein Molekulargewicht
groß ist
(mehr als 150.000 Kd), war er darüber hinaus nicht in der Lage,
einfach durch das Keratin der Haut zu passieren und es wurde nicht
erwartet, dass er Haarwachstum ausreichend inhibiert. Aus diesen
Gründen
wurde gefordert, eine Substanz zu entwickeln, die die zuvor erwähnte Wirkung
von Epimorphin inhibiert, und die stabil ist und ein niedriges Molekulargewicht
von, sagen wir, weniger als mehreren tausend aufweist, was ihren
Durchtritt durch die Haut erlaubt. Insbesondere wird von Epimorphin-Antagonist,
einer Substanz, die an den Rezeptor auf einer epithelialen Zelle
bindet, an den Epimorphin bindet, und die in der Lage ist, die Epithelialgewebe-morphogene
Wirkung von Epimorphin zu inhibieren, erwartet, dass sie eine deutliche
Wirkung bei ihrer Nutzung als der aktive Inhaltsstoff eines Pharmakons
oder eines Haarwachstumsinhibitors und bei der Erhellung des Mechanismus
der Wirkung von Epimorphin erzielt.
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Zusätzlich war
es das gewöhnliche
Vorgehen, bei der Entfernung von Haar an dem Arm oder Bein, es direkt
mit Hilfe eines Klebestreifens oder einer Pinzette auszuzupfen oder
auf den Ort eine Lösung
aufzubringen, die einen Inhaltsstoff, wie eine Lauge für die Lyse
des Haares enthielt. Das erstere Verfahren ruft Schmerz hervor,
während
das letztere Verfahren die Haut schädigt. Wenn es möglich wäre, eine
Substanz bereitzustellen, die durch die Inhibition der Funktion
von Epimorphin wirkt und ein Molekulargewicht aufweist, das für die perkutane
Absorption niedrig genug ist, würde
daher von einer solchen Substanz erwartet werden, dass sie als der
aktive Inhaltsstoff eines Haarwachstumsinhibitors, der die obigen
Probleme vermeidet, nützlich
wäre. Das
bedeutet, das Haarwachstum kann für eine lange Zeit durch Aufbringen
einer Substanz mit solchen Charakteristiken nach dem Rasieren unterdrückt werden.
Diese Substanz ist als ein Haarwachstumsinhibitor verwendbar, der
die Nachteile eines konventionellen Haarentferners überwindet.
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Offenbarung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Substanz für die Inhibition
der Wirkung von Epimorphin bereitzustellen. Genauer zielt die Erfindung
darauf, eine Substanz bereitzustellen, die als ein Epimorphin-Antagonist
nützlich
ist, der spezifisch die morphogene Aktivität von Epimorphin an epithelialem
Gewebe inhibiert. Weiter zielt die Erfindung darauf, einen Epimorphin-Antagonisten
bereitzustellen, der eine solch charakteristische Wirkung, ein niedriges
Molekulargewicht und Stabilität
aufweist.
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Eine
andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Pharmakon bereitzustellen,
das als den aktiven Inhaltsstoff einen Epimorphin-Antagonisten enthält, der
die morphogene Wirkung von Epimorphin auf Epithelialgewebe inhibiert
und der nützlich
für die
Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die der exzessiven Expression
von Epimorphin zuzuschreiben sind, nützlich ist.
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Noch
eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, einen Haarwachstumsinhibitor
bereitzustellen, der als den aktiven Inhaltsstoff den oben beschriebenen
Epimorphin-Antagonisten enthält.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine Mikrofotografie der histologischen Form eines Maus-Pulmonalprimordiums
zu Beginn der Kultur, wenn seine Organkultur in der Gegenwart des
Epimorphin-Antagonisten der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.
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2 ist
eine Mikrofotografie der histologischen Form nach 3 Tagen der Kultivierung,
wenn die Organkultur des Maus-Pulmonalprimordiums in der Gegenwart
des Epimorphin-Antagonisten der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird;
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3 ist
eine Mikrofotografie der histologischen Form eines Maus-Pulmonalprimordiums
zu Beginn der Kultur, wenn seine Organkultur in der Abwesenheit
des Epimorphin-Antagonisten der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde;
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4 ist
eine Mikrofotografie der histologischen Form nach 3 Tagen der Kultivierung,
wenn die Organkultur des Maus-Pulmonalprimordiums in der Abwesenheit
des Epimorphin-Antagonisten der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde;
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5 ist
eine Mikrofotografie der histologischen Form einer Maus-Maxillarhaut
zu Beginn der Kultivierung, wenn ihre Organkultur in der Gegenwart
des Epimorphin-Antagonisten der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde;
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6 ist
eine Mikrofotografie der histologischen Form nach 3 Tagen der Kultivierung,
wenn die Organkultur der Maus-Maxillarhaut in der Gegenwart des
Epimorphinantagonisten der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde;
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7 ist
eine Mikrofotografie der histologischen Form einer Maus-Maxillarhaut
zu Beginn der Kultivierung, wenn ihre Organkultur in der Abwesenheit
des Epimorphin-Antagonisten der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde
und
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8 ist
eine Mikrofotografie der histologischen Form nach 3 Tagen der Kultivierung,
wenn die Organkultur der Maus-Maxillarhaut in der Abwesenheit des
Epimorphin-Antagonisten der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.
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Bestes Verfahren zur Durchführung der
Erfindung
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Um
die zuvor erwähnten
Aufgaben zu erfüllen,
haben die Erfinder ausgedehnte Studien durchgeführt, wobei sie herausfanden,
dass ein partielles Sequenzpolypeptid, das in der funktionellen
Domäne
von Epimorphin enthalten ist, die Wirkung der deutlichen Inhibition
der morphogenen Aktivität
von Epimorphin auf Epithelialzellen aufweist und als ein Epimorphin-Antagonist
wirkt. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf diesen Ergebnissen
erreicht.
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Ausführlicher
stellt die Erfindung einen Epimorphin-Antagonisten bereit, der eine Epimorphin-antagonistische
Wirkung der deutlichen Inhibition der morphogenen Wirkung von Epimorphin
auf Epithelialzellen aufweist und als ein Epimorphin-Antagonist
wirkt, und der ein Polypeptid ist, das die folgende Aminosäuresequenz
umfasst:
H-X1-Gly-Asn-Arg-Thr-Ser-Val-Asp-Leu-Arg-Ile-Arg-Arg-Thr-Gln-His-Ser-Val-Leu-OH
wobei
X1 Ser oder Asn darstellt.
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Die
Erfindung stellt auch einen Epimorphin-Antagonisten bereit, der
eine Epimorphin-antagonistische Wirkung der deutlichen Inhibition
der morphogenen Wirkung von Epimorphin auf Epithelialzellen aufweist
und als ein Epimorphin-Antagonist
wirkt, und der ein Polypeptid ist, das die folgende Aminosäuresequenz,
die von der ersten Aminosäure
bis zu der nten Aminosäure
reicht (n bezeichnet eine ganze Zahl von 20 bis 83), aufweist:
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Die
Erfindung stellt auch einen Epimorphin-Antagonisten bereit, der
eine Epimorphin-antagonistische Aktivität der deutlichen Inhibition
der morphogenen Wirkung von Epimorphin auf Epithelialzellen aufweist
und als ein Epimorphin-Antagonist
wirkt, und der ein Polypeptid ist, das die folgende Aminosäuresequenz,
die von der ersten Aminosäure
bis zur der nten Aminosäure
reicht (n bezeichnet eine ganze Zahl von 20 bis 83), aufweist:
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Die
Erfindung stellt auch einen Epimorphin-Antagonisten bereit, der
die oben beschriebene Aminosäuresequenz
umfasst, von der, in der oder zu der eine oder mehrere Aminosäuren deletiert,
ersetzt oder zugefügt wurden
und die auch eine Epimorphin-antagonistische Wirkung der deutlichen
Inhibition der morphogenen Wirkung von Epimorphin auf Epithelialzellen
aufweist und als ein Epimorphin-Antagonist funktioniert.
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Die
Erfindung stellt auch einen Epimorphin-Antagonisten bereit, der
ein Polypeptid umfasst, das die oben beschriebene Aminosäuresequenz
als eine partielle Sequenz davon enthält und das im wesentlichen eine
Epimorphin-antagonistische Wirkung der deutlichen Inhibition der
morphogenen Wirkung von Epimorphin auf Epithelialzellen aufweist
und als ein Epimorphin-Antagonist funktioniert.
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Die
Erfindung stellt auch einen Epimorphin-Antagonisten bereit, der
die oben beschriebene Aminosäuresequenz
umfasst, in der eine oder mehrere Aminosäuren mit Zuckern oder Lipiden
modifiziert wurden und der auch die Epimorphinantagonistische Wirkung
aufweist.
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Die
Erfindung stellt auch einen Epimorphin-Antagonisten bereit, der
die oben beschriebene Aminosäuresequenz
umfasst, in der eine oder mehrere Aminosäuren phosphoryliert wurden
und die auch die Epimorphin-antagonistische Wirkung der deutlichen
Inhibition der morphogenen Wirkung von Epimorphin auf Epithelialzellen
aufweist und als ein Epimorphin-Antagonist
funktioniert.
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Die
Erfindung stellt auch einen Epimorphin-Antagonisten bereit, dessen
Epimorphin-antagonistische Wirkung die morphogene Aktivität von Epimorphinen
auf einen Haarfollikel inhibiert.
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Die
Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit,
die den oben beschriebenen Epimorphin-Antagonisten als den aktiven
Inhaltsstoff enthält.
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Die
Erfindung stellt auch die oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung
für die
Verwendung bei der Behandlung und/oder Prävention von Erkrankung, die
der exzessiven Expression von Epimorphin zugeschrieben wird, bereit.
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Die
Anmeldung beschreibt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die als ein Haarwachstumsinhibitor verwendet wird.
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Die
Erfindung stellt auch ein Polynukleotid bereit, das das zuvor erwähnte Polypeptid
codiert.
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Die
oben beschriebenen Polypeptide, die durch die Erfindung bereitgestellt
werden, weisen die Wirkung der Inhibition der morphogenen Aktivität von Epimorphinen
auf Epithelialzellen auf.
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Bei
der vorliegenden Patentschrift bezeichnet das Naturtyp-Epimorphin Epimorphin,
das durch mesenchymale Zellen von, sagen wir, Säugetieren, biosynthetisiert
wurde. Beispiele für
das Naturtyp-Epimorphin beinhalten Epimorphin, das von Tieren stammt,
z.B. vom Menschen, Affen, Rind, Pferd, Schaf, Hund, Katze, Kaninchen,
Ratte und Maus, vorzugsweise vom Menschen stammendes Epimorphin.
Unter dem Naturtyp-Epimorphin kann es eine Vielzahl von Isoformen
geben, die durch genetisches Splicen hervorgerufen werden. Unter
den menschlichen Epimorphinen gibt es z.B. menschliches Epimorphin,
das aus 288 Aminosäuren
besteht, und die Isoformen A und B von menschlichem Epimorphin,
die aus 287 bzw. 277 Aminosäuren
zusammengesetzt sind, wie in der
Japanischen
offengelegten Patentveröffentlichung
Nr. 6025295 beschrieben wird. Das Maus-Epimorphin beinhaltet
Maus-Epimorphin, das aus 289 Aminosäuren besteht und die Isoformen
A und B von Maus-Epimorphin,
die aus 288 bzw. 279 Aminosäuren
bestehen. Der Begriff "Naturtyp-Epimorphin" wird in der vorliegenden
Anmeldung verwendet, um ein Konzept auszudrücken, das all diese Isoformen
beinhaltet.
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Bei
der vorliegenden Anmeldung wird ein Epimorphin als ein Polypeptid
offenbart, das im wesentlichen dieselbe physiologische Wirkung wie
das Naturtyp-Epimorphin aufweist (z.B. Zelladhäsion an Epithelialzellen und
Morphogeneseförderung
für Epithelialzellen)
und das entweder eine partielle Polypeptidsequenz ist, die von der
Polypeptidsequenz des Naturtyp-Epimorphins stammt (normalerweise
ein Polypeptid, das 277 bis 289 Aminosäuren umfasst), oder als seine
partielle Sequenz die partielle Polypeptidsequenz enthält, die
von der Polypeptidsequenz des Naturtyp-Epimorphins stammt. Das Naturtyp-Epimorphin
weist einen superspiralisierten alpha-Helixbereich (1) auf der N-terminalen
Seite, eine funktionelle Domäne
(2) in der Mitte, einen superspiralisierten alpha-Helixbereich (3)
auf der C-terminalen Seite und einer hydrophoben Bereich an dem
C-Ende auf und bindet an die Zellemembran an dem C-terminalen hydrophoben
Bereich. Ein Verfahren zur Entfernung des C-terminalen hydrophoben Bereiches wurde
mit Blick auf die Solubilisierung des Naturtyp-Epimorphins vorgeschlagen
(
Japanische Offengelegte Patentveröffentlichung
Nr. 6025295 ). Ein Polypeptid, das durch solch ein Verfahren
hergestellt wird, ist eine typische Verbindung, die in die Kategorie
des modifizierten Epimorphins fällt,
aber ist nicht Teil der Erfindung.
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Bei
der vorliegenden Beschreibung bezeichnet eine Aminosäurevariante
des Naturtyp-Epimorphins oder des modifizierten Epimorphins ein
Polypeptid, das im wesentlichen dieselbe physiologische Wirkung
wie das Naturtyp-Epimorphin aufweist und bei dem ein oder mehrere
der Aminosäuren,
die die Polypeptidkette des Naturtyp-Epimorphins oder des modifizierten
Epimorphins bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden oder bei
dem ein oder mehrere dieser konstituierenden Aminosäuren deletiert
wurden, und/oder bei dem ein oder mehrere willkürliche Aminosäuren in
diese Polypeptidkette inseriert wurden, aber es ist nicht Teil der
Erfindung.
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Konkreter
wird das Naturtyp-Epimorphin z.B. in der
Japanischen Offengelegten Patentveröffentlichung Nr.
6025295 als ein vom Menschen oder von der Maus stammendes
Epimorphin und Isoformen davon offenbart. Typische Beispiele für das modifizierte
Epimorphin sind, zusätzlich
zu dem oben erwähnten
modifizierten Epimorphin (
Japanische
Offengelegte Patentveröffentlichung
Nr. 6025292 oder
EPA562123 ),
modifiziertes Epimorphin, das durch Zugabe eines hydrophilen Polypeptids,
das 5 bis 99 Aminosäuren
umfasst, zu mindestens einem Ende eines Polypeptids, das die funktionelle
Domäne
von Epimorphin enthält,
hergestellt wird (
Japanische
Offengelegte Patentveröffentlichung
Nr. 8325293 oder
Europäische Offengelegte
Patentveröffentlichung
Nr. 698666 (hier im folgenden als
EPA698666 bezeichnet)), und
modifiziertes Epimorphin, das ein Polypeptid mit der Struktur umfasst,
bei der der hydrophobe Bereich an dem C-Ende von der gesamten Länge des
Epimorphins mit dem superspiralisierten alpha-Helixbereich (1) auf der N-terminalen
Seite, der funktionellen Domäne
(2) in der Mitte, dem superspiralisierten alpha-Helixbereich (3)
auf der C-terminalen
Seite und dem hydrophoben Bereich an dem C-Ende deletiert wurde,
und bei dem mindestens einige Aminosäuren von mindestens einer terminalen
Seite der superspiralisierten alpha-Helixbereiche (1) und (3) deletiert
wurden (
Japanische Offengelegte
Patentveröffentlichung
Nr. 9065885 oder
EPA698666 ),
aber es ist nicht Teil der Erfindung.
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Verfahren
zur Herstellung der Aminosäurevariante
des Naturtyp-Epimorphins oder des modifizierten Epimorphins werden
konkret z.B. in der
Japanischen
Offengelegten Patentveröffentlichung
Nr. 832529 und der
Japanischen
Offengelegten Patentveröffentlichung
Nr. 9065885 oder
EPA698666 erklärt, aber
sie ist nicht Teil der Erfindung. Sie sind jedoch nicht auf diese
Verfahren beschränkt
und Aminosäurevarianten,
die durch jedes beliebige Verfahren hergestellt werden, sind erhältlich.
Die Testung der physiologischen Wirkung dieser modifizierten Epimorphine
oder ihrer Aminosäurevarianten
kann in Übereinstimmung
mit dem Testverfahren für
die physiologische Wirkung des Naturtyp-Epimorphins durchgeführt werden, das ausführlich in
der
Japanischen Offengelegten Patentveröffentlichung
Nr. 25295 oder
EPA562123 beschrieben
wurde. Konkret reicht es aus, die morphogene Wirkung, wie die Verzweigungsmorphogenese
einer fötalen
Mauslunge oder eine fötale Maus-Hautmorphogenese
zu bestätigen,
die in den Beispielen der vorliegenden Patentschrift beschrieben wird.
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Der
Epimorphin-Antagonist der vorliegenden Erfindung weist die Eigenschaft
der Inhibition der morphogenen Wirkung der oben beschriebenen Epimorphine
auf Epithelialzellen auf (hier im folgenden kann diese Eigenschaft
als "Epimorphinantagonistische
Wirkung" bezeichnet
werden). Als der Epimorphin-Antagonist der vorliegenden Erfindung
wird ein Epimorphin-Antagonist bereitgestellt, der einen Teil der
funktionellen Domäne von
Epimorphin umfasst und im wesentlichen die Epimorphin-antagonistische
Wirkung aufweist. Als eine Ausführungsart
davon wird Polypeptid (I) bereitgestellt, welches durch die folgende
Aminosäuresequenz
spezifiziert wird:
H-Ser(Asn)-Gly-Asn-Arg-Thr-Ser-Val-Asp-Leu-Arg-Ile-Arg-Arg-Thr-Gln-His-Ser-Val-Leu-OH
(wobei der Aminosäurerest
an dem N-Ende durch den eingeschobenen Aminosäurerest ersetzt werden kann,
jeder Aminosäurerest
vorzugsweise einen L-Aminosäurerest
darstellt; diese Sequenz wird als H-S(N)GNRTSVDLRIRRTQHSVL-OH gemäß der Ein-Buchstaben-Bezeichnung bezeichnet).
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Das
Polypeptid (I) ist eine partielle Sequenz der funktionellen Domäne von Epimorphin
(eine Aminosäuresequenz,
die von den 104ten bis zu den 187ten Aminosäuren reicht, gezählt von
dem N-Ende im Falle von menschlichem Naturtyp-Epimorphin, eine Aminosäuresequenz,
die von den 105ten bis zu den 188ten Aminosäuren reicht, gezählt von
dem N-Ende in dem Fall von Maus-Naturtyp-Epimorphin; siehe
Japanische Offengelegte Patentveröffentlichung
Nr. 8325293 oder
EPA698666 ),
und korrespondiert zu einer Aminosäuresequenz, die von der ersten
bis zu der 19ten Aminosäure
der funktionellen Domäne
reicht. Von dieser funktionellen Domäne wurde bisher gezeigt, dass
sie Adhäsion
an und Morphogeneseförderung
für Epithelialzellen zeigt,
aber es wurde nicht berichtet, dass sie Epimorphin-antagonistische
Wirkung zeigt. Noch gibt es irgendeinen Bericht über die Produktion dieses Polypeptids.
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Der
Epimorphin-Antagonist der vorliegenden Erfindung beinhaltet das
Polypeptid (I), aber beschreibt auch eine Aminosäurevariante des Polypeptids
(I), bei der eine oder mehrere ihrer konstituierenden Aminosäuren durch
andere Aminosäuren
ersetzt wurden, oder bei der eine oder mehrere dieser konstituierenden Aminosäuren deletiert
wurden, und/oder bei der eine oder mehrere willkürliche Aminosäuren in
die Polypeptidkette davon inseriert wurden, und die ein Polypeptid
ist, das im wesentlichen Epimorphinantagonistische Aktivität aufweist.
Die Arten der einen oder mehreren Aminosäuren, die ersetzt und/oder
inseriert werden sollen, sind nicht beschränkt, aber sie sind vorzugsweise
L-Aminosäuren.
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Der
Epimorphin-Antagonist der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein
Polypeptid, das das Polypeptid (I) enthält. Das Polypeptid der vorliegenden
Erfindung, das in jeder der Ausführungsarten
beschrieben wurde, kann in freier Form vorliegen, aber es kann als
ein Säureadditionssalz,
wie als Hydrochlorid, Acetat oder p-Toluolsulfonat, oder als ein
Basen-Additionssalz, wie Ammoniumsalz oder organisches Aminsalz,
zur Verfügung gestellt
werden. Daher sollte das Polypeptid bei der vorliegenden Patentschrift
als das Polypeptid in der Form des Salzes einschließend interpretiert
werden. Die Beispiele der vorliegenden Patentschrift beschreiben
konkret die Testverfahren für
typische Beispiele von Epimorphin-antagonistischer Aktivität, sprich
die Aktivität
der Inhibition der Morphogenese von dem Bronchus einer fötalen Mauslunge
und die Wirkung der Inhibition der Morphogenese einer fötalen Maus-Maxillarhaut,
in Bezug auf das Polypeptid (I) als eine bevorzugte Ausführungsart
des Epimorphin-Antagonisten der vorliegenden Erfindung. Daher können Fachleute
auf dem Gebiet einfach sicherstellen, indem sie auf diese Testbeispiele
Bezug nehmen oder durch eine geeignete Änderung oder Modifikation dieser
Verfahren, das jedes der Polypeptide, das oben definiert wird, die
erwünschte
Epimorphin-antagonistische Wirkung aufweist. Die Morphogenese-fördernde
Wirkung von Epimorphin auf Epithelialgewebe wird detailliert z.B.
in den Beispielen der
Japanischen
Offengelegten Patentveröffentlichung
Nr. 6025295 oder
EPA562123 beschrieben.
Die Anwendung des dort beschriebenen Testsystems ermöglicht es, die
Epimorphinantagonistische Wirkung zu bestätigen.
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Die
Beispiele in der vorliegenden Patentschrift demonstrieren, dass
das Polypeptid (I), eine besonders bevorzugte Ausführungsart
der vorliegenden Erfindung, Zelladhäsionseigenschaften aufweist,
die denjenigen von Epimorphin ähnlich
sind. Durch Bezugnahme auf diese Testbeispiele oder Zugabe einer
geeigneten Änderung
oder Modifizierung zu diesem Verfahren wird es möglich, einfach zu bestätigen, dass
jedes dieser Polypeptide Zelladhäsionseigenschaften
besitzt. Die Erfinder halten sich nicht an irgendeine bestimmte
Theorie, aber der Epimorphin-Antagonist
der Erfindung besitzt die Eigenschaft der Bindung an einen Epimorphin-Rezeptor,
der auf der extrazellulären
Oberfläche
einer Epithelialzelle vorliegt. Dieser Antagonist zeigt die gleiche Zelladhäsion wie
es Epimorphine tun, aber bei der Bindung an den Rezeptor zeigt er
keine Morphogenesefördernde
Wirkung, wie sie durch Epimorphine gezeigt wird, oder er kann diese
Wirkung nicht vollständig
zeigen. Daher kann der Epimorphin-Antagonist der Erfindung als ein
kompetitiver Inhibitor für
Epimorphine wirken.
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Die
Epimorphin-antagonistische Wirkung des Epimorphin-Antagonisten der
Erfindung ist von der Stärke
seiner inhibitorischen Wirkung her gesehen nicht beschränkt, solange
dieser Antagonist die morphogenetische Wirkung von Epimorphinen
auf Epithelialgewebe substanziell inhibieren kann. Vorzugsweise
sollte der Antagonist jedoch eine Epimorphin-antagonistische Wirkung
aufweisen, die z.B. mit der des Polypeptids (I) vergleichbar ist.
Die Beispiele in der vorliegenden Patentschrift beschreiben typische
Beispiele für
Epimorphin-antagonistische Aktivität. Die Epimorphinantagonistische
Aktivität
ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt, sondern sollte allgemeiner
interpretiert werden. Jede Wirkung, die die Morphogenesefördernde
Wirkung von Epimorphinen auf Epithelialzellen durch irgendeinen
Mechanismus inhibiert, ist, unnötig
zu sagen, in die Epimorphin-antagonistische Wirkung des Epimorphin-Antagonisten der
vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
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Der
Epimorphinantagonist der Erfindung kann durch eine chemische Technik
in der üblichen
Praxis für Peptidsynthese,
wie das Festphasen- oder Flüssigphasenverfahren,
synthetisiert werden. Die Schutzgruppe für eine Aminogruppe oder dergleichen
und der Kondensationswirkstoff für
eine Kondensationsreaktion beinhalten bei der Peptidsynthese z.B.
diejenigen, die in Suzuki, K.: "Protein
Engineering – Basis
and Application" (1992,
Maruzen Co., Ltd.); Pondanski et al.: "Peptide Synthesis" (1976, John Wiley & Sons, N.Y.); und Stewart et al.: "Solid Phase Peptide
Synthesis" (1969,
W.H. Freeman und Co., San Francisco) beschrieben werden. Bei dem
Festphasenverfahren können
verschiedene kommerziell erhältliche
Peptidsynthetisierer verwendet werden. Die Beispiele bei der vorliegenden
Patentschrift beschreiben ein konkretes Verfahren zur Herstellung des
Polypeptids (I) mit Hilfe eines Peptidsynthetisierers.
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Ein
gewöhnliches
biologisches Verfahren, wie ein Genexpressionsverfahren, ist auch
erhältlich.
In diesem Falle wird ein rekombinanter Vektor, der eine DNA-Sequenz
enthält,
die die Polypeptidkette des Epimorphin-Antagonisten der vorliegenden
Erfindung codiert, verwendet, um einen Mikroorganismus, der mit
diesem Vektor transformiert wurde (Transformante) herzustellen.
Das erwünschte
Polypeptid, der Epimorphin-Antagonist, kann aus einer Kultur der
Transformante separiert und gereinigt werden. Natürlich ist
das Herstellungsverfahren für
den Epimorphin-Antagonisten der Erfindung nicht auf die oben beschriebenen
Verfahren beschränkt.
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DNA,
die für
das Verfahren der Herstellung durch Genexpression verwendbar ist,
beinhaltet z.B. DNA, die durch das erste Nukleotid bis zu dem 57ten
Nukleotid in der folgenden Basensequenz spezifiziert wird:
oder DNA,
die durch das erste Nukleotid bis zu dem (3 × kth)-Nukleotid (k bezeichnet eine ganze Zahl
von 20 bis 83) in der obigen Basensequenz spezifiziert wird (es
wird nur der Sinnstrang gezeigt und die komplementäre Basensequenz
ausgelassen). Diese DNA korrespondiert zu den ersten bis 249ten
Nukleotiden der DNA, die die Basensequenz umfasst, die als SEQ ID
NO: 6 in dem Sequenzprotokoll bezeichnet wird, die ein Polypeptid
als die funktionelle Domäne
des menschlichen Naturtyp-Epimorphins codiert.
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Ähnlich kann
von der DNA, die zu den 1ten bis 249ten Nukleotiden der DNA korrespondiert,
die die Basensequenz umfasst, die als SEQ ID NO: 7 in dem Sequenzprotokoll
bezeichnet wird, die ein Polypeptid als die funktionelle Domäne des Maus-Naturtyp-Epimorphins
codiert, DNA verwendet werden, die durch das erste Nukleotid bis
zu dem 57ten Nukleotid spezifiziert wird; oder DNA, die durch das
erste Nukleotid bis zu dem (3 × mth)-Nukleotid
(m bezeichnet eine ganze Zahl von 20 bis 83) spezifiziert wird.
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Unter
Verwendung dieser DNAs können
Aminosäurevarianten
einfach durch das gebräuchliche
Verfahren hergestellt werden. Als ein solches Verfahren verwendbar
ist z.B. das rekombinante PCR-Verfahren, das auf den Seiten 155-160
von "PCR Experimental
Manual" (1991, HJB
Publishing Bureau) beschrieben wird, oder das PCR-basierte Verfahren
zur Herstellung eines mutanten Gens, das auf den Seiten 63-67 von "Experimental Medicine,
Special Issue, Band 8, Nr. 9" (1990,
Shodo-sha) beschrieben wird. Um das erwünschte Polypeptid herzustellen,
kann das Verfahren zur Genexpression das Verfahren sein, dass detailliert
in den Beispielen der
Japanischen
Offengelegten Patentveröffentlichung
Nr. 9065885 oder
EPA698666 beschrieben wird,
aber es ist nicht darauf beschränkt.
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Der
Epimorphin-Antagonist der vorliegenden Erfindung ist gegen die exzessive
Expression von verschiedenen morphogenetischen Faktoren, die durch
Naturtyp-Epimorphin typisiert werden, nützlich und besonders nützlich als
der aktive Inhaltsstoff eines Pharmakons für die Behandlung und/oder Verhinderung
von Erkrankungen, die mit der exzessiven Expression von Naturtyp-Epimorphin
assoziiert sind, oder als der aktive Inhaltsstoff eines Pharmakons
für die
Diagnose solcher Erkrankungen. Der Epimorphin-Antagonist der vorliegenden
Erfindung ist auch nützlich
als der aktive Inhaltsstoff eines Pharmakons für die Behandlung von Hyperepimorphinismus,
der durch Epimorphine induziert wird, die für die Behandlung und/oder Prävention
von Erkrankungen verabreicht werden, die mit der minimalen Expression
von Naturtyp-Epimorphin assoziiert sind. Überdies ist der Epimorphin-Antagonist
der vorliegenden Erfindung nützlich
als der aktive Inhaltsstoff eines Pharmakons für die Verwendung als ein Haarwachstumsinhibitor.
Der Begriff "Pharmakon" bei der vorliegenden
Patentschrift wird in seinem weitesten Sinne verwendet, einschließlich in
dem Sinn für
die Verwendung bei der Prävention,
Behandlung und Diagnose von Erkrankungen bei Säugetieren, einschließlich Menschen,
wie auch als Haarwachstumsinhibitoren, die normalerweise als Quasimedikamente
klassifiziert werden.
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Es
wird vorgeschlagen, dass als morphogenetische Faktoren verschiedene,
einschließlich
Naturtyp-Epimorphin, existieren. Erkrankungen, die durch die exzessive
Expression von einem oder mehrerer dieser Faktoren hervorgerufen
werden, beinhalten z.B. Rheumatoide Arthritis, Karzinome, wie Nierenkarzinom
oder Hautkrebs, Arteriosklerose, Kollagenose, hämatopoetische Erkrankung, Nierenerkrankung,
Muskeldystrophie, Osteoporose, Neurofibromatose, Sturge-Weber-Syndrom, tuberöse Sklerose,
gestörten
Neuralrohrverschluss, segmentale Störung, vagale Störung, kallöse Agenese,
Porencephalie und Hydrocephalus. Von dem Pharmakon der Erfindung
kann erwartet werden, dass es sich als nützlich für die Behandlung und/oder Prävention,
wie auch für
die Diagnose dieser Erkrankungen herausstellt. Jedoch sind die Aufgaben,
auf die das Pharmakon der Erfindung angewendet wird, nicht auf diese
Erkrankungen beschränkt.
Es sollte verstanden werden, dass Erkrankungen, die mit der exzessiven
Expression von einem oder mehreren morphogenetischen Faktoren, insbesondere
Epimorphin, assoziiert sein können,
alle in den Umfang der Ziele für
die Anwendung dieses Pharmakons der Erfindung mit eingeschlossen
sind. Die Verwendungen eines Haarwachstumsinhibitors, der den Epimorphin-Antagonist
als den aktiven Inhaltsstoff enthält, eine Ausführungsart
des Pharmakons der Erfindung, sollten in ihrem weitesten Sinne interpretiert
werden, einschließlich
denjenigen für
Alopezie, Inhibition des Haarwachstums und Inhibition von Trichogenese.
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Als
das Pharmakon der Erfindung können
eine oder mehrere Substanzen, die aus den Epimorphin-Antagonisten
ausgewählt
werden, die die zuvor erwähnten
Polypeptide sind, als solche verwendet werden. Normalerweise wird
es jedoch vorgezogen, dass ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable
pharmazeutische Zusatzstoffe verwendet werden, um eine pharmazeutische
Zusammensetzung herzustellen, die eine oder mehrere der obigen Substanzen
als den aktiven Inhaltsstoff enthält, und diese Zusammensetzung
für die
Behandlung und/oder Prophylaxe der zuvor erwähnten Erkrankungen verwendet
wird. Von den Standpunkten der Löslichkeit,
der Pharmakokinetik wie Absorption und Exkretion und/oder des Herstellungsverfahrens
können diese
Polypeptide in der Form von pharmazeutisch akzeptablen Salzen vorliegen.
Der Weg der Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung beinhaltet
z.B. systemische Verabreichung, wie intravenöse, rektale oder orale Verabreichung,
wie auch lokale Verabreichung, wie externe Anwendung, ophthalmische
Instillierung, nasale Instillierung, Ohreninstillierung oder lokale
Injektion.
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Zum
Beispiel sind Medikamente für
die systemische Verabreichung, wie intravenöse Injektionen oder Tropfeninfusionen,
oder Medikamente für
die lokale Verabreichung, wie Salben, Cremes, Pflaster oder lokale Injektionen,
bevorzugte Formen der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung. Die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung,
die den aktiven Inhaltsstoff verkapselt in Liposom oder dergleichen
enthält,
oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit Antikörpern oder
dergleichen, die daran gebunden sind, kann in der Lage sein, ihre
Affinität
oder Selektivität
für das
Zielorgan zu verbessern. Natürlich
kann der Verabreichungsweg passend zu dem Typ der Erkrankung, auf
die abgezielt wird, dem Zweck der Behandlung oder Prävention,
der Art der Läsion
und dem Zustand des Patienten ausgewählt werden. Die Dosierungsform,
die für
den Verabreichungsweg vorgezogen wird, kann auch passend ausgewählt werden.
Die Form der pharmazeutischen Zusammensetzung, wenn sie als ein
diagnostisches Reagenz verwendet wird, ist nicht beschränkt und
beinhaltet ihre in vivo-Verabreichung an den Patienten und ihre
in vitro-Verwendung
an Proben, die von dem Patienten genommen werden.
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Ein
Haarwachstumsinhibitor, der ein oder mehrere Substanzen enthält, die
aus den Epimorphin-Antagonisten der Erfindung als die zuvor erwähnten Polypeptide
ausgewählt
wird, wird vorzugsweise als ein Präparat in der Form zur Verfügung gestellt,
die für
den Zweck der Verwendung als ein Haarwachstumsinhibitor bevorzugt
wird, wie eine Creme, ein Spray, eine Einstreichungslösung oder
ein Pflaster. Das Polypeptid kann in der Form eines pharmazeutisch
akzeptablen Salzes vorliegen. Es wird auch vorgezogen, dass ein
geeigneter oberflächenaktiver
Wirkstoff oder ein fettlösliches
Material mit seiner Creme vermischt wird, um die effiziente perkutane
Absorption des Epimorphin-Antagonisten,
spricht des aktiven Inhaltsstoffes, durch die Keratinschicht der
Haut zu ermöglichen.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird weiter konkret durch die folgenden Beispiele
beschrieben, aber der Umfang der Erfindung ist nicht darauf begrenzt:
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Beispiel 1
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Herstellung
von Epimorphin-Antagonist der Erfindung Es wurde ein Polypeptid
mit einer Aminosäuresequenz
von 19 Aminosäuren,
reichend von der ersten (N-terminalen) Aminosäure zu der 19ten Aminosäure in der
funktionellen Domäne
(die Aminosäuresequenz,
die als SEQ ID NO: 8 in dem Sequenzprotokoll beschrieben wird) in
der Mitte des Maus-Naturtyp-Epimorphins,
chemisch unter Verwendung eines Peptid-Synthetisierers (Advanced Chemtech 396
Synthetisierer) synthetisiert. Dieses Material wurde mit Hilfe von
Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen gereinigt, um
Polypeptid A mit einer Reinheit von mehr als 90 % zu erhalten.
| Säule: | Umkehrphasen-Perseptive
Biosystems Poros R2 |
| Adsorptionspuffer: | 0,1
% wässrige
Lösung
von Trifluoressigsäure |
| Elutionspuffer: | Lösung A (0,1
% wässrige
Lösung
von Trifluoressigsäure) |
- Lösung
B (Acrylnitril, das 0,1 % wässrige
Lösung
von Trifluoressigsäure
inkorporiert)
- Elution mit 76,2 % Lösung
A + 23,8 % Lösung
B in 2,015 Minuten.
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Ähnlich wurde
Polypeptid B mit einer Aminosäuresequenz
von 39 Aminosäuren,
reichend von der ersten (N-terminalen) Aminosäure bis zu der 39ten Aminosäure, und
Polypeptid C mit einer Aminosäuresequenz von
41 Aminosäuren,
reichend von der ersten (N-terminalen) Aminosäure bis zu der 41ten Aminosäure, in
der funktionellen Domäne
(die Aminosäuresequenz,
die als SEQ ID NO: 8 in dem Sequenzprotokoll beschrieben wird) in
der Mitte des Maus-Naturtyp-Epimorphins durch Synthese und Reinigung
mit Hilfe der gleichen Umkehrphasen-HPLC erhalten. Jedes Polypeptid
besaß eine
Reinheit von mehr als 90 %.
- Polypeptid B: Elution mit 93,7
% Lösung
A + 6,3 % Lösung
B in 9,27 Minuten
- Polypeptid C: Elution mit 93,8 % Lösung A + 6,2 % Lösung B in
9,18 Minuten
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Beispiel 2: Herstellung von modifiziertem
Epimorphin
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cDNAs,
die ein Fragment von von Maus stammendem Epimorphin, dem der hydrophobe
Bereich am dem C-Ende entzogen wurde, und die funktionelle Domäne in der
Mitte des Epimorphins (Fragment (123) bzw. Fragment (2), beschrieben
in dem Beispiel der
Japanischen
Offengelegten Patentveröffentlichung
Nr. 9065885 oder
EPA698666 ),
codieren, wurden durch PCR in Übereinstimmung
mit dem Verfahren, das in dem Beispiel der
Japanischen Offengelegten Patentveröffentlichung
Nr. 9065885 oder
EPA698666 beschrieben
wird, hergestellt. Dann wurden sie in die NdeI- und NheI-Orte von
pET3C-Vektor, von dem der Bereich zwischen den zwei Eco RV-Orten
deletiert wurde, integriert, um einen Expressionsvektor zu konstruieren.
Dann wurde dieser Expressionsvektor in E. coli BL21-Stamm, der in
kompetente Zellen durch das Hanahan-Verfahren ("Lab Manual Genetic Engineering", Maruzen Co., Ltd.)
umgewandelt wurde, eingeführt.
Die Einführung
des Vektors wurde durch die Zugabe einer Expressionsvektorlösung (1
mg/ml Lösung,
1 μl) in
eine Lösung
(100 μl)
der kompetenten Zellen auf Eis durchgeführt, wobei man die Mischung
für 10
Minuten auf Eis stehen ließ,
die Mischung in einem Inkubator für 2 Minuten bei 42°C stehen
ließ und
dann das System für
30 Minuten auf Eis stehen ließ.
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Dann
wurden die E. coli-Zellen auf einer LB-Platte (1 % Bacto Trypton,
0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 1 % NaCl, 1,5 % Bacto-Agar), die 50 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert
und Kolonien, die wuchsen, wurden selektiert. Diese Transformanten
wurden durch das PCR-Verfahren auf DNA, die das erwünschte modifizierte
Epimorphin codiert, untersucht. Es wurde bestätigt, dass 9 von 10 Stämmen die
erwünschten
Transformanten, die den Expressionsvektor bewahrten, waren. Die
resultierenden Transformanten wurden durch 37°C Schüttelkultur in einem flüssigen LB-Kulturmedium
(1 % Bacto Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 1 % NaCl), das 50 μg/ml Ampicillin
enthielt, massenkultiviert. Dann wurde IPTG, ein Material für die Induktion
von Expression, zu dem Kulturmedium bis zu einer endgültigen Konzentration
von 1 mM zugegeben. Die Schüttelkultur
wurde für
2 Stunden bei 37°C
weiter fortgesetzt, um die modifizierten Epimorphine (Fragment (123)
und Fragment (2)) in den E. coli-Zellen zu exprimieren.
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Die
Analyse des Gesamtproteins in den E. coli-Zellen durch SDS-Polyacrylamidelektrophorese
zeigte, dass die erwünschten
modifizierten Epimorphine in nahezu gleichen Mengen produziert wurden.
Die oben erwähnten
Transformanten, die die modifizierten Epimorphine exprimierten,
wurden in einem Lysepuffer [50 mN Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA,
100 mM NaCl] suspendiert und gewaschen und zentrifugiert, um die
Zellen auszufällen.
Die Zellen wurden in dem Lysepuffer suspendiert und dann wurde ein
Lysozym (SIGNA, L-6876) zu einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben.
Es wurde dreimal Gefrier/Auftau wiederholt, um die E. coli zu lysieren.
Nach Ultraschallbehandlung wurde der Überstand durch Zentrifugation
entfernt. Das Präzipitat
wurde 4mal mit 2M Harnstoff/Lysepuffer gewaschen. Dann wurde das
Präzipitat
erneut in 8M Harnstoff/Lysepuffer suspendiert und zentrifugiert,
um eine Überstandsfraktion
zu erhalten (Reinheit: mehr als 90 %), die die erwünschten
modifizierten Epimorphine enthielt.
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Beispiel 3 Zelladhäsion
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Die
Polypeptide A, B und C der vorliegenden Erfindung, die in Beispiel
1 erhalten werden, und die modifizierten Epimorphine (Fragment (123)
und Fragment (2), wovon jedes dieselbe Zelladhäsionskapazität aufweist,
wie die von Naturtyp-Epimorphin)
wurden auf Suspensions-Kulturmediumschalen geschichtet. Nach der Trocknung
wurden die Schalen einmal mit 8M Harnstoff/Lysepuffer gewaschen.
Dann wurden die Schalen 5mal mit PBS- gewaschen
und der Zellstamm C3H/10T1/2Klon8 (Dainippon Pharmaceutical Co.,
Ltd., 08-226) wurde auf die Schalen unter Verwendung von D-MEM/F-12-Kulturmedium
(GIBCO BRL, 12400-024; hier im folgenden "DH-Medium" genannt), das 20 mg/ml Rinderserumalbumin
(SIGMA, A-7030) enthielt, gesprenkelt. Eine Stunde später wurden
die Schalen 3mal mit PBS- gewaschen und
dann wurden die Zellen unter Verwendung von 0,5 N NaOH gesammelt.
Es wurde die O.D. bei 260 nm gemessen, um die Anzahl der Zellen,
die an die Schalen gebunden waren, zu bestimmen. Die Zellzählung wurde
als ein Indikator für
die Zelladhäsion
von jeder Probe verwendet. Die gefundenen O.D.'s betrugen 1,5237 für Polypeptid A, 1,4251 für Polypeptid
B, 1,4697 für
Polypeptid C, 1,4959 für
Fragment (123), 1,4478 für
Fragment (2) und 0,0194 für
die Kontrolle (unbehandelt). So wurde für alle Polypeptide A, B und
C bestätigt,
dass sie Zelladhäsion
zeigten, die mit derjenigen der modifizierten Epimorphine vergleichbar
war.
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Beispiel 4 Inhibitorische Wirkung auf
die Morphogenese von Bronchus
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Ein
pulmonales Primordium wurde aus dem Fötus der ICR-schwangeren Maus (Nippon Charles River, 12
Tage Gestation) unter einem stereoskopischen Mikroskop entfernt.
Das entnommene pulmonale Primordium wurde auf einen Nuclepor-Membranfilter (SN
110419), der auf einem Kulturmedium (DH-Medium oder 0,35 mg/ml Polypeptid A-enthaltendes
DH-Medium) schwamm, platziert. Die Organkultur wurde in 5 % CO2 bei 37°C
durchgeführt,
um den Effekt des Polypeptids A auf die Morphogenese des Bronchus
zu untersuchen. Wie in den 3 und 4 gezeigt
wird, schritt, wenn die Organkultur DH-Medium verwendete, die Morphogenese
des Bronchus normal fort und eine feinverzweigte Bronchusbildung
wurde nach Beendigung der Kultur bestätigt. Als auf der anderen Seite
das pulmonale Primordium in dem Kulturmedium, das Polypeptid A enthielt, kultiviert
wurde, wurde die Morphogenese des Bronchus deutlich inhibiert (1 und 2).
Diese Art der Inhibition der Morphogenese war genau die gleiche
wie bei der Behandlung mit MC-1, sprich mit Antikörpern, die die
Funktion von Epimorphin inhibieren. Daher ist es klar, dass das
Polypeptid A der vorliegenden Erfindung die morphogene Wirkung von
Epimorphin auf ein pulmonales Primordium inhibiert.
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Beispiel 5 Inhibitorische Wirkung auf
die Morphogenese von Maxillarhaut
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Es
wurde eine Maxillarhaut aus dem Fötus der ICR-schwangeren Maus
(Nippon Charles River, 13 Tage Gestation) unter einem stereoskopischen
Mikroskop entfernt. Die entnommene Maxillarhaut wurde auf einem
Nuclepor-Membranfilter (SN 110419), der auf einem Kulturmedium (DH-Medium
oder 0,35 mg/ml Polypeptid A-enthaltendes DH-Medium) schwamm, platziert.
Die Organkultur wurde in 5 % CO2 bei 37°C durchgeführt, um
den Effekt von Polypeptid A auf die Morphogenese des Haarfollikels
zu untersuchen. Wie in den 7 und 8 gezeigt
wird, schritt, wenn die Organkultur DH-Medium verwendete, die Morphogenese
von normalen Haarfollikeln aus der Maxillarhaut fort und die Bildung
einer Vielzahl von Haarfollikeln wurde bestätigt. Als auf der anderen Seite
die Maxillarhaut in dem Kulturmedium, das Polypeptid A enthielt,
organkultiviert wurde, wurde die Morphogenese der Haarfollikel deutlich
inhibiert (5 und 6). Diese
Art der Inhibition der Morphogenese war genau die gleiche wie bei
der Behandlung mit MC-1, sprich mit Antikörpern, die die Funktion von
Epimorphin inhibieren. Daher ist es klar, dass das Polypeptid A
der vorliegenden Erfindung die Haarfollikel-morphogenetische Wirkung
von Epimorphin auf eine Maxillarhaut inhibiert.
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Gewerbliche Anwendbarkeit
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Der
Epimorphin-Antagonist der vorliegenden Erfindung weist die Wirkung
der spezifischen Inhibition der morphogenen Wirkung von Epimorphinen
auf Epithelialgewebe auf. Daher ist er als der aktive Inhaltsstoff eines
Pharmazeutikums für
die Behandlung und/oder Prävention
von Erkrankungen, die der exzessiven Expression von Epimorphin zugeschrieben
werden, oder als der aktive Inhaltsstoff eines Haarwachstumsinhibitors
nützlich.
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