DE69007739T2

DE69007739T2 - Polypeptide verwertbar als Kalziumkanälen-Blocker.

Info

Publication number: DE69007739T2
Application number: DE69007739T
Authority: DE
Inventors: Douglas Phillips; Nicholas A Saccomano; Robert A Volkmann
Original assignee: Pfizer Corp Belgium; NPS Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Pfizer Corp Belgium; Shire NPS Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-24
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2010-09-25
Also published as: PT95424A; EG19316A; ATE103611T1; EP0425096B1; CZ470790A3; ZA907782B; EP0425096A1; ES2053118T3; DD297652A5; HU208705B; US5122596A; CA2026418A1; CN1051182A; PL164541B1; NO175208B; NO904251D0; FI96865C; RU2026866C1; IE64218B1; YU184490A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Polypeptid, das im Gift der Spinne Agelenopsis aperta gefunden wurde, und Polypeptide, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und im wesentlichen die gleiche Aktivität wie das Polypeptid haben. Die Polypeptide und die pharmazeutisch geeigneten Salze davon blockieren Calcium-Kanäle in Zellen, einschließlich der neuronalen und Muskel-Zellen von verschiedenen Organismen, einschließlich der wirbellosen Tiere und der Wirbeltiere. Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung der Polypeptide und ihrer Salze zum blockieren von Calcium-Kanälen in ZeHen, z. B. Zellen im nervösen und muskulären System eines Organismus, per se; in der Behandlung von Calcium-Kanal vermittelten Krankheiten und Bedingungen in einem Säugetier; und in der Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen. Ferner betrifft diese Erfindung Zusammensetzungen, die die Polypeptide und die Salze davon aufweisen.
Es ist berichtet worden, daß das Gift der Spinne Agelenopsis aperta mindestens zwei Toxine enthält, die Calcium-Ströme beeinflussen, Jackson, H., et al., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:1078 (1987). Diese Autoren offenbaren ein Toxin, dort AG2 bezeichnet, das ein Molekulargewicht von weniger als 1000 Dalton hat und Calcium-Ströme in einer großen Auswahl von Geweben unterdrückt. Ferner berichten Jackson, H., et al., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:730 (1986) von einem anderen Toxin aus Agelenopsis aperta, das eine Komponente von etwa 6000 M.W. aufweist. Von dem Toxin wird berichtet, daß es eine präsypaptische Blockade der Übertragung bewirkt, und es ist vermutet worden, daß das Toxin Calcium-Kanäle blockiert, die mit der Freisetzung von Neurotransmittern verbunden sind.
Bestimmte Polypeptide, die im Gift der Spinne Agelenopsis aperta vorhanden sind, sind in der am 28. April 1989 eingereichten EP-A-395 357 offenbart. Diese Polypeptide sind darin als Blocker von Calcium-Kanälen in Zellen offenbart worden.
Verbindungen, die Calcium-Antagonisten sind, haben eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Calcium-Antagonisten können unter anderem in der Behandlung von Zuständen wie Angina, Hypertonie, Kardiomyopathien, supraventrikulärer Arrhythmien, Ösophagusachalasie, vorzeitige Wehen und Raynaudscher Krankheit klinische Anwendung finden. Siehe W. G. Nayler, Calcium Antagonists, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, NY 1988, deren Lehre hier durch Querverweis aufgenommen wird. Ferner sind solche Verbindungen nützlich im Studium der Physiologie von Zellen, z. B. neuronalen und Muskel- Zellen, und in der Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen.
Diese Erfindung betrifft ein Polypeptid, das im Gift der Spinne Agelenopsis aperta vorhanden ist. Das Polypeptid dieser Erfindung und die Fraktion, in der es erfindungsgemäß vorhanden ist, ist wie folgt:

Fraktion Q:

(a) es ist vorhanden in einer Fraktion des Rohgiftes der Spinne Agelenopsis aperta, die von einer C-18 Vydac -Säule, 22 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 10 u Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 15 ml/min, mit einem Lösungsmittelsystem mit einem linearen Gradientenprogramm von 5 % -T 20 % B (0 -T 30 min), dann 20 % -T 70 % B (30 -T 55 min), wobei A 0,1 %ige wässrige Trifluoressigsäure (TFA) und B Acetonitril ist, nach etwa 41,5 Minuten eluiert;
(b) es ist vorhanden in einer Fraktion der oben in (a) beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac -Säule, 10 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 5 u Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 3,5 ml/min, mit einem Lösungsmittelsystem mit einem isokratischen System von 70 % A, 30 % B, wobei A 0,1 %ige wässrige TFA und B Acetonitril ist, nach 7,5 Minuten eluiert; und
(c) es hat eine amino-terminale Aminosäuresequenz, die aufweist:
H&sub2;N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys- arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile- met-glu-gly-leu-.
Das erfindungsgemäße Polypeptid blockiert in Zellen Calcium-Kanäle. Daher ist das Polypeptid per se brauchbar für die Blockiemng von Calcium-Kanälen in Zellen. Das Polypeptid ist auch brauchbar für die Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen und in der Behandlung von Krankheiten und Zuständen von Säugetieren, die durch die Calcium-Kanal-Funktion in Zellen bewirkt werden.
Der Schutzumfang dieser Erfindung umfaßt auch Polypeptide, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und im wesentlichen die gleiche blockierende Wirkung auf Calcium-Kanäle haben, wie die oben beschriebenen Polypeptide. Diese Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Polypeptide aufweisen, und Verfahren zum Verabreichen dieser Polypeptide.
Das Gift wird von der Spinne Agelenopsis aperta mittels Melken durch elektrische Reizung nach dem Fachmann wohlbekannten Standardverfahren erhalten. Vorzugsweise wird ein Verfahren eingesetzt, das Schutzmaßnahmen gegen eine Kontamination des Gesamtgiftes durch abdominal wieder Hervorgewürgtes oder Hämolymphe hat. Solche Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt. Das so erhaltene Gesamtgift wird im gefrorenen Zustand bei etwa - 78 ºC gelagert, bis es zur unten beschriebenen Reinigung verwendet wird.
Die Reinigung der Bestandteile des Gesamtgiftes wird durch Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen (HPLC) auf einer Vielzahl von präparativen oder semi-präparativen Säulen, z. B. C-4 und C-18 Vydac -Säulen (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachusetts 01801) erreicht. Der Peaknachweis wird monochromatisch bei 220 - 230 nm ausgeführt. Eine weitere Analyse der Fraktionen kann zum Beispiel mit polychromen UV-Daten, gesammelt mit einem Waters 990 Diodenarray-Detector (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757), erreicht werden. Die Fraktionen von den Säulen werden mit bekannten Verfahren gesammelt, z. B. durch das Verwenden eines ISCO/"FOXY"-Fraktionssammlers und eines ISCO 2159 Peak-Detectors (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Die Fraktionen werden in geeignet dimensionierten Gefäßen gesammelt, z. B. sterilen Polyäthylen-Laboratoriumsgefäßen. Die Konzentriemng der Fraktionen wird dann durch Lyophilisation des Elutionsmittels, gefolgt von einer Lyophilisation des Wassers erreicht. Die Reihheit der resultierenden Bestandteilfraktionen kann durch chromatographische Analyse unter Verwendung einer analytischen Säule mit einem Gradientensystem bestimmt werden, das isokratischer als das System ist, das für die letzte Reinigung der Fraktionen verwendet wurde.
Die Strukturen, die die jeweiligen Fraktionen aufweisen, werden nach bekannten analytischen Verfahren, z. B. durch Massenspektrometrie und magnetische Kernresonanz, bestimmt. Das Polypeptid der Fraktion Q wird nach bekannten Verfahren sequenziert. Zum Beispiel kann eine S-Pyridylethylierung der Cystin- Reste der zu untersuchenden Polypeptide in Lösung durchgeführt werden, gefolgt von einer Aminosäuresequenzierung des Polypeptids. Ein solches Verfahren zur S- Pyridylethylierung ist wie folgt. Etwa 1 - 10 ug des Polypeptids werden aufgelöst oder in bis zu 50 ul eines Puffers verdünnt, der durch Mischen 1 Teils 1 M Tris HCl, pH 8,5, enthaltend 4 mM EDTA und 3 Teile 8 M Guanidin HCl hergestellt wurde. Dann werden 2,5 ul 10 %iges wässriges 2-Mercaptoethanol zugegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Argon 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden 2 ul 4-Vinylpyridin (frisches Reagenz unter Argon bei - 20 ºC gelagert) zugegeben, und das Gemisch wird für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Argon inkubiert. Das Gemisch wird dann entsalzt, vorzugsweise durch Chromatographie auf einer kurzen Säule mit umgekehrter Phase. Die rückgewonnenen alkylierten Polypeptide werden dann nach bekannten Verfahren sequenziert.
Bei der Durchführung dieser Erfindung und beim Anwenden des oben umrissenen allgemeinen Verfahrens wurde gefunden, daß eine geeignete Säule für die Anfangsfraktionierung des Giftes eine C-18 Vydac -Säule, 22 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 10 u Teilchengröße, ist. Diese Säule wird mit einer Flußrate von 15 ml/min unter Verwendung eines linearen Gradientenprogramms von 95 % -- -> 80 % A, 5 % -T 20 % B (0 -T 30 min), dann 80 % -T 30 % A, 20 % -T 70 % B (30 -T 55 min), wobei A 0,1 %ige wässrige Trifluoressigsäure (TFA) und B Acetonitril ist, eluiert. Die Fraktionen werden wie oben beschrieben gesammelt. Eine so erhaltene Fraktion, bezeichnet Q', wurde für die weitere Reinigung gewählt. Die Elutionszeit der Fraktion Q' war etwa 41,5 Minuten.
Fraktion Q' wurde einer weiteren Reinigung unter Verwendung einer C-18 Vydac - Säule, 10 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 5,0 u Teilchengröße, einer Flußrate von 3,5 ml/min und unter Verwendung eines isokratischen Systems aus 70 % 0,1 %iger wässriger TFA, 30 % Acetonitril unterworfen. Fraktionen wurden wie oben beschrieben gesammelt. Fraktion Q eluierte von der Säule nach etwa 7,5 Minuten. Es wurde auch gefunden, daß eine Fraktion, die nach etwa 8,3 Minuten eluierte, (Fraktion K) ein Polypeptid enthielt.
Fraktion Q enthielt ein Polypeptid mit einer amino-terminalen Aminosäuresequenz, aufweisend:
H&sub2;N-lys-lys-lys-cys-ile-aka-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys- arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile- met-glu-gly-leu-.
Durch den Offenbarungsvorteil hinsichtlich der in Fraktion Q des Giftes von Agelenopsis aperta vorhandenen Verbindung, ist es nun möglich, diese Verbindung durch andere Verfahren als durch Isolierung/Reinigung des Gesamtgiftes zu erhalten. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken durch das Klonieren einer codierenden Sequenz für das Polypeptid oder Teile davon hergestellt werden Zum Beispiel können Hybridisierungssonden, die aus der nun bekannten Aminosäuresequenz-Information des Polypeptids Nutzen ziehen, gemäß Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann zum Klonieren einer codierenden Sequenz für das vollständige Polypeptid wohlbekannt sind. Eine Kombination von rekombinanten DNA-Techniken und in vitro Proteinsynthese kann auch eingesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide herzustellen. Solch ein in vitro Proteinsynthese-Verfahren beinhaltet, ist jedoch nicht darauf beschränkt, die Verwendung eines ABI 430 A Festphasen-Peptid-Synthesizers (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) unter Einsatz der Standard-Merrifield-Chemie oder anderer Festphasen-Chemien, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
In der Technik ist es wohlbekannt, daß bestimmte Aminosäure-Substitutionen in Polypeptiden ausgeführt werden können, die die Funktion der Polypeptide nicht oder nicht wesentlich beeinflussen. Die genauen Substitutionen, die möglich sind, variieren von Polypeptid zu Polypeptid. Die Bestimmung der erlaubten Substitutionen kann durch Verfahren erreicht werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Daher liegen alle Polypeptide mit einer im wesentlichen gleichen Aminosäuresequenz und einer im wesentlichen gleichen blockierenden Wirkung auf Calcium- Kanäle im Schutzumfang dieser Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide blockieren irreversibel Calcium-Kanäle, die in einer Vielzahl von Zellen vorhanden sind, z. B. in Zellen im nervösen und muskulären System von wirbellosen Tieren und Wirbeltieren.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide, Calcium-Kanäle zu blockieren wird durch das folgende Verfahren demonstriert. Zerebelläre Körnerzellen werden aus dem Zerebellum von 8 Tage alten Ratten hergestellt (Wilkin, G. P. et al., Brain Res.: 115: 181-199 1976). Quadrate (1 cm²) aus Aclar (Proplastics Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, N.J., 07719) werden mit poly-L-Lysin beschichtet und in Schalen mit 12 Vertiefungen, die 1 ml Eagles-Basal-Medium enthalten, untergebracht. Die Zellen werden dissoziiert und aliquote Teile, enthaltend 6,25 x 10&sup6; Zellen, werden in jede Aclar-Quadrate enthaltende Vertiefung gegeben. Cytosin- beta-D-arabinofuranosid (Endkonzentration 10 uM) wird 24 Stunden nach dem Plattieren zugegeben Die Zellen werden für die Fura2-Analyse nach 6, 7 und 8 Tagen der Kultivierung verwendet Die Zellen (an den Aclar-Quadraten haftend) werden in eine Schale mit 12 Vertiefungen überführt, die 1 ml 2 uM Fura2/AM (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, 97402) in HEPES-Puffer (enthaltend 0,01 % Rinderserumalbumln, 0,01 % Dextrose, pH 7,4, magnesium-frei) enthalten. Die Zellen werden 40 min bei 37 ºC inkubiert; der Fura2/AM-enthaltende Puffer wird entfernt und ersetzt durch 1 ml des gleichen Puffers ohne Fura2/AM. In eine Quarzküvette werden 2,0 ml vorgewärmter (37 ºC) Puffer gegeben. Die Zellen auf dem Aclar werden in der Küvette untergebracht, und die Küvette wird in einen thermostatisierten (37 ºC) Halter, ausgerüstet mit einem Magnetrührer, gesteckt und die Fluoreszenz wird mit einem Fluoreszenzspektrophotometer (Biomedical Instrument Group, University of Pennsylvania) gemessen. Das Fluoreszenzsignal wird etwa 2 min stabilisiert. Dann werden 5 - 20 ul einer Stammlösung der zu untersuchenden Verbindung in phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in geeigneten Konzentrationen in die Küvette gegeben. Die Kalibration des Fluoreszenzsignals und die Fura2/AM-Leckkorrektur wurden unter Verwendung der eingeführten Verfahren von Nemeth et al., J. Biol. Chem. 262: 5188 (1987) nach dem Abschluß jedes Versuchs durchgeführt, der maximale Fluoreszenzwert (Fmax) wird durch die Zugabe von Ionomycin (35 uM) bestimmt, und der minimale Fluoreszenzwert (Fmin) wird durch die anschließende Zugabe von EGTA (12 mM), um Calcium zu chelatisieren, bestimmt.
Durch das Verwenden des vorerwähnten Verfahrens wird das Auftreten der Calcium-Kanal-Blockierung durch eine Versuchsverbindung durch eine Abnahme der Fluoreszenz nach Zugabe der Versuchsverbindung angezeigt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind per se als Calcium-Kanal-Blocker in Zellen verwendbar. Diese Verbindungen sind z. B. auch verwendbar in der Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen und in der Behandlung von Krankheiten und Zuständen, die durch die Funktion der Calcium-Kanäle in den Zellen eines Säugetiers bewirkt werden, z. B. Angina, Hypertonie, Kardiomyopathien, supraventrikuläre Arrhythmien, Ösophagusachalasie, vorzeitige Wehen und Raynaud's Krankheit. Ferner sind diese Verbindungen nützlich zum Studium der Physiologie von Zellen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Zellen des nervösen und muskulären Systems.
Im Schutzumfang dieser Erfindung liegen auch die pharmazeutisch geeigneten Salze der erfindungsgemäßen Polypeptide. Solche Salze werden durch Verfahren gebildet, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Zum Beispiel können Basensalze der Polypeptide nach konventionellen Verfahren hergestellt werden.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid einem Säugetier verabreicht werden soll, kann es allein oder in Verbindung mit pharmazeutisch geeigneten Trägern oder Streckmitteln in einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach pharmazeutischer Standardpraxis verabreicht werden. Die Polypeptide können oral oder parenteral verabreicht werden, wobei ihre Verabreichung auf parenteralem Weg bevorzugt wird. Die parenterale Verabreichung beinhaltet die intravenöse intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane und topische Verabreichung.
Für die orale Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide kann die Verbindung zum Beispiel in Form von Tabletten oder Kapseln oder als wässrige Lösung oder Suspension verabreicht werden. Im Fall von Tabletten zur oralen Verwendung werden üblicherweise Trägerstoffe zugegeben, die üblicherweise Lactose und Maisstärke und Gleitmittel, z. B. Magnesiumstearat, beinhalten. Für die orale Verabreichung in Kapselform sind Lactose und getrocknete Maisstärke verwendbare Verschnittmittel. Wenn wässrige Suspensionen für die orale Verwendung erforderlich sind, wird der wirksame Inhaltsstoff mit Emulgatoren und Suspensionsmitteln kombiniert. Wenn gewünscht, können bestimmte Süßungsmittel und/oder Geschmacksstoffe zugegeben werden.
Für die intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane oder intravenöse Verwendung werden üblicherweise sterile Lösungen des wirksamen Inhaltsstoffes hergestellt, und der pH der Lösungen sollte geeignet eingestellt und gepuffert sein. Für die intravenöse Verwendung sollte die Gesamtkonzentration an gelösten Stoffen gesteuert werden, um die Präparation isotonisch zu machen.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon in einem menschlichen Patienten verwendet wird, wird die tägliche Dosierung normalerweise durch den verordnenden Arzt bestimmt. Überdies wird die Dosierung mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des individuellen Patienten, sowie mit der Schwere der Symptome des Patienten und der Wirksamkeit der verabreichten speziellen Verbindungen variieren.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder ein Salz davon zur Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen verwendet wird, wird das Polypeptid dem wirbellosen Tier direkt verabreicht, oder die Umwelt des wirbellosen Tieres wird damit versehen. Zum Beispiel kann eine erfindungsgemäße Verbindung als Lösung auf das wirbellose Tier gesprüht werden. Die Menge an Verbindung, die erforderlich ist, um dieses wirbellose Tier zu bekämpfen, wird mit dem wirbellosen Tier und den Umweltbedingungen variieren und wird von der Person bestimmt, die die Verbindung anwendet.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon für physiologische Studien an Zellen verwendet wird, wird das Polypeptid den Zellen nach Verfahren verabreicht, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Zum Beispiel wird das Polypeptid den Zellen in einem geeigneten physiologischen Puffer verabreicht. Eine geeignete Konzentration der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Verwendung in solchen Studien ist 100 uM. Jedoch kann die Konzentration des Polypeptids in solchen Studien größer oder viel kleiner als 100 uM sein. Die Menge an zu verabreichender Verbindung wird durch den Fachmann nach wohlbekannten Verfahren bestimmt.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und dürfen nicht als Beschränkung des Schutzumfangs dieser Erfindung verstanden werden.

Beispiel 1

Anfangsfraktionierung des Gesamtgiftes von Agelenopsis aperta.

Das Gesamtgift von Agelenopsis aperta, erhalten von Natural Product Science Inc., Salt Lee City, Utah 84108, das im gefrorenen Zustand bei etwa -78 ºC gelagert worden war, wurde aufgetaut, und 10 - 60 ul-Mengen davon, verdünnt auf 200 ul, wurden auf eine C-18 Vydac -Säule (22 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 10 u Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Flußrate von 15 ml/min mit einem Lösungsmittelsystem mit einem linearen Gradientenprogramm von 5 % -- -> 20 % B, 95 % -T 80 % A (0 -T 30 min), dann 20 % -T 70 % B, 80 % -T 30 % A (30 -T 55 min), wobei A 0,1 %ige wässrige TFA und B Acetonitril ist, eluiert. Der Peaknachweis wurde monochromatisch bei 220 - 230 nm ausgeführt, und Fraktionen wurden mit einem ISCO/"FOXY"-Fraktionssammler und einem ISCO 2150 Peak-Detektor gesammelt. Fraktionen wurden von 20 Minuten bis 60 Minuten gesammelt. Fraktion Q' wurde nach etwa 41,5 Minuten gesammelt.

Beispiel 2

Unterfraktionierung der Fraktion Q' und Bestimmung der Strukturen darin.

Fraktion Q', erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde auf eine C-18 Vydac - Säule (10 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 5 u Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Flußrate von 3,5 ml/min und eines isokratischen Lösungsmittelsystems aus 70 % A, 30 % B, wobei A 0,1 %ige wässrige TFA und B Acetonitril ist, eluiert. Der Peaknachweis wurde unter Verwendung eines Waters 990 Diodenarray-Detektors ausgeführt, und die Fraktionssammlung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Zwei Fraktionen wurden wie folgt erhalten: Fraktion Elutionszeit Minuten
Die Fraktionen Q und K, die Polypeptide enthalten, wurden dann nach wohlbekannten Verfahren durch Lyophylisation des Elutionsmittels, gefolgt von einer Lyophilisation des Wassers, für die Sequenzierung vorbereitet.
Die Aminosäureanalyse der alkylierten Polypeptide der Fraktionen Q und K wurde durch die Verwendung des Waters Pico-Tag-Verfahrens gemäß den Herstellerangaben erhalten. Die Sequenzdaten wurden mit einem Applied Biosystems Model 470A Protein/Peptid-Sequenzer (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) mit wässriger TFA-Umwandlung gesammelt. Die Analyse der resultierenden Phenylthiohydantoin-Ariinosäuren erfolgte on-line mit einem Applied Biosystems Model 120A PTH-Analysator oder off-line auf einer DuPont Zorbax PHT-Säule (Biomedical Product Department, Chromatography Products, E. L duPont de Nemours and Co., Inc., 1007 Market Street, Wilmington, Delaware 19898).
Als Resultat der Ariinosäureanalyse wurde die amino-terminale Aminosäuresequenz eines Teils des in der Fraktion Q enthaltenen Polypeptids bestimmt als:
H&sub2;N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys- arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile- met-glu-gly-leu-.

Claims

1. Im wesentlichen reines Polypeptid mit den folgenden identifizierenden Kennzeichen:

(a) es ist vorhanden in einer Fraktion des Rohgiftes der Spinne Agelenopsis aperta, die von einer C-18 Vydac -Säule, 22 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 10 u Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 15 ml/min, mit einem Lösungsmittelsystem mit einem linearen Gradientenprogramm von 5 % -T 20 % B, 95 % -T 80 % A (0 -T 30 min), dann 20 % -T 70 % B, 80 % -T 30 % A (30 -T 55 min), wobei A 0,1 %ige wässrige TFA und B Acetonitril ist, nach etwa 41,5 Minuten eluiert;

(b) es ist vorhanden in einer Fraktion der oben in (a) beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac -Säule, 10 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 5 u Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 3,5 ml/min und eines isokratischen Lösungsmittelsystems aus 70 % A, 30 % B, wobei A 0,1 %ige wässrige TFA und B Acetonitril ist, nach etwa 7,5 Minuten eluiert; und (c) es hat eine amino-terminale Aminosäuresequenz, die aufweist:

H&sub2;N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys- arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile- met-glu-gly-leu-;

oder ein Polypeptid mit einer im wesentlichen gleichen Aminosäuresequenz und einer im wesentlichen gleichen blockierenden Wirkung auf Calcium-Kanäle wie das Polypeptid und die pharmazeutisch geeigneten Salze davon.

2. Polypeptid nach Anspruch 1 mit den folgenden Kennzeichen:

(a) es ist vorhanden in einer Fraktion des Rohgiftes der Spinne Agelenopsis aperta die von einer C-18 Vydac -Säule, 22 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 10 u Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 15 ml/min, mit einem Lösungsmittelsystem mit einem linearen Gradientenprogramm von 5 % -T 20 % B, 95 % -T 80 % A (0 -T 30 min), dann 20 % -T 70 % B, 80 % -T 30 % A (30 -T 55 min), wobei A 0,1 %ige wässrige TFA und B Acetonitril ist, nach etwa 41,5 Minuten eluiert;

(b) es ist vorhanden in einer Fraktion der oben in (a) beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac -Säule, 22 mm x 250 mm, 300 Å Porengröße, 5 u Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 3,5 ml/min und eines isokratischen Lösungsmittelsystems aus 70 % A, 30 % B, wobei A 0,1 %ige wässrige TFA und B Acetonitrii ist, nach etwa 7,5 Minuten eluiert; und

(c) es hat eine amino-terminale Aminosäuresequenz, die aufweist:

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Blockieren der Calcium-Kanäle in einer Zelle in einem Säugetier, die eine Calcium-Kanäle blockierende Menge eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder einen solchen Träger umfaßt.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Blockieren der Calcium-Kanäle in einer Zelle in einem Säugetier. die eine Calcium-Kanäle blockierende Menge eines Polypeptids gemäß Anspruch 2 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon und ein pharmazeutisch annehmbares Yerdünnungsmittel oder einen solchen Träger umfaßt.

5. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Verwendung als Arzneimittel.

6. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon für die Herstellung eines Arzneimittels zum Blockieren von Calcium-Kanälen in einer Zelle in Nervensystem eines Säugetieres.

7. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon für die Herstellung eines Arzneimittels zum Blockieren der Calcium-Kanäle in einer Zelle im Muskelsystem eines Säugetieres.

8. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Verwendung bei der Bekämpfung wirbelloser Schädlinge.