DE69816059T2

DE69816059T2 - Gen, das für das pyruvat dehydrogenase kinase von pflanzen kodiert

Info

Publication number: DE69816059T2
Application number: DE69816059T
Authority: DE
Inventors: Jitao Zou; C. David TAYLOR
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-02-09
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2018-02-10
Also published as: US6500670B1; AU5977798A; NZ337105A; CA2279844C; AU739075B2; ES2202805T3; CA2279844A1; EP0973905B1; DE69816059D1; EP0973905A1; US20030084472A1; WO1998035044A1; DK0973905T3; US6825039B2

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf Pflanzengene, die nützlich für die für die genetische Manipulation von Pflanzencharakteristika sind. Noch spezifischer bezieht sich diese Erfindung auf die Identifizierung, Isolierung und Einführung von Genen, die nützlich sind, z. B. zur Veränderung des Samenölgehalts, der Samengröße, der Blüte- und/oder Generationszeit oder des vegetativen Wachstums von kommerziellen Pflanzen oder Nutzpflanzen.
STAND DER TECHNIK
Durch Koordinierung der Licht- und Dunkelreaktionen der Photosynthese assimilieren Pflanzen CO₂ bei der Bildung von Zuckern. Mittels der katabolischen und anabolischen Reaktionen des Stoffwechsels bilden diese Zucker die Grundlage des Pflanzenwachstums und letztendlich der Pflanzenproduktivität. Im Verlauf des Pflanzenwachstums spielt die Atmung, die den Verbrauch von O₂ und den Katabolismus von Zucker und anderen Substraten unter Bildung von CO₂ einschließt, eine zentrale Rolle bei der Bereitstellung einer Energiequelle, von Reduktionsäquivalenten und von einer Menge von Zwischenprodukten (Kohlenstoffskelette) als Bausteine für viele essenzielle biosynthetische Verfahren. Es ist bekannt, dass jedwede zwei Pflanzen mit gleichen Photosyntheseraten sich oft sowohl in der Gesamtbiomassenproduktion als auch in dem erntefähigen Produkt unterscheiden. Daher ist die Beziehung zwischen der Atmungsrate und der Nutzpflanzenproduktivität eines der am intensivsten studierten Themen der Pflanzenphysiologie. Im biochemischen Sinne kann die Atmung als aus Glykolyse, dem oxidativen Pentosephosphatweg, dem Krebs (Trikarbonsäure, TCA)-Zyklus und dem Mitochondrienelektronentransportsystem zusammengesetzt angesehen werden. Die Zwischenprodukte der Atmung sind für das Wachstum in Meristemgeweben, zur Aufrechterhaltung der existierenden Phytomasse, zur Aufnahme von Nährstoffen und für den intrazellulären Transport von organischen und anorganischen Materialien erforderlich. Bei Sojabohnen liegen Beweise vor, dass eine Zunahme der Atmungsrate der Hülse zu einer Zunahme des Samenwachstums führen kann (Sinclair et al., 1987), während verminderte Atmung zu einem verminderten reproduktiven Wachstum führen kann (Gale, 1974). Die Atmung ist daher für sowohl für anabolische als auch für katabolische Phasen des Stoffwechsels wichtig.
Wenngleich die Kohlenstoffstoffwechselwege von Pflanzenzellen wohlbekannt sind, wird der Kohlenstofffluss durch diese Stoffwechsel-Wege in vivo gegenwärtig wenig verstanden. Der Mitochondrien-Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (mtPDC), der die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat unter Erzeugung von Acetyl-CoA katalysiert, ist der Haupteinstiegspunkt der Kohlehydrate in den Krebszyklus. Der mtPDC-Komplex verbindet den Glykolyse-Kohlenstoffstoffwechsel mit dem Krebszyklus und auf Grund der irreversiblen Natur dieser Reaktion ist der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDC) eine besonders wichtige Stelle der Regulation.
Mitochondrien-PDC wurde in Säugetier-Systemen intensiv studiert und das verfügbare Wissen über die molekulare Struktur von Pflanzen-mtPDC beruht im Wesentlichen auf Studien über Säugetier-mtPDC. Der mtPDC enthält die Enzyme E1 (EC 1.2.4.1), E2 (EC 2.3.1.12) und E3 (EC 1.8.1.4) und deren assoziierte prostethische Gruppen Thiamin PPi, Lipoinsäure bzw. FAD. Die E1- und E3-Komponenten sind um einen E2-Kern angeordnet. Die E2- und E3-Komponenten sind Einzelketten-Polypeptide. Im Gegensatz dazu besteht das E1-Enzym aus zwei Untereinheiten, E1α und E1β. Ihre genauen Rollen sind unklar. Von einer anderen Untereinheit, dem E3-Bindeprotein, wird angenommen, dass es eine Rolle bei der Anlagerung von E3 an den E2-Kern spielt. Die E1-Kinase und Phosphatase sind assoziierte regulatorische Untereinheiten (Grof et al., 1995).
Pflanzen sind einzigartig darin, dass sie PDH-Komplexe in zwei Isoformen aufweisen; eine, die auch in anderen eukaryotischen Zellen in der Mitochondrienmatrix lokalisiert ist, und eine andere, die in den Chloroplasten oder in Plastidstroma lokalisiert sind (Randall et al., 1989). Wenngleich sowohl Plastiden- als auch Mitochondrien-PDH-Komplex-Isoformen gegenüber der Produkt-Rückkopplungsregulation sensitiv sind, wird nur der Mitochondrien-PDH-Komplex durch Inaktivierung/Reaktivierung mittels reversibler Phosphorylierung/Dephosphorylierung reguliert (Miernyk and Randall, 1987; Gemel and Randall, 1992; Grof et al., 1995). Noch spezifischer wird die Aktivität von Mitochondrien-PDC (mtPDC) durch Produkt-Rückkopplungsinhibition reguliert (NADH und Acetyl-CoA) und der Phosphorylierungszustand von mtPDC wird durch die kombinierte Aktivität der reversiblen Phosphorylierung der E1α-Untereinheit durch PDC-Kinase (PDCK) und ihrer Dephosphorylierung durch PDC-Phosphatase bestimmt. PDCK phosphoryliert und inaktiviert PDC während die PDC-Phosphatase dephosphoryliert und den Komplex reaktiviert. Die maximale PDC-Aktivität scheint entwicklungsbezogen zu variieren, wobei die höchste katalytische Aktivität während der Samenkeimung und der frühen Keimlingentwicklung beobachtet wird (z. B. in post-germinativen Kotyledonen, Hill et al., 1992; Grof et al., 1995).
Acetyl-CoA, das Produkt von PDC, ist auch das Hauptsubstrat für die Fettsäuresynthese. Während es bekannt ist, dass Pflanzenfettsäurebiosynthese in Plastiden stattfindet, war die Herkunft des Acetyl-CoA, das für die Synthese von Fettsäuren in Plastiden verwendet wird, Thema von vielen Spekulationen. Es bleibt eine Hauptfrage, die noch nicht gelöst wurde. Wegen der zentralen Rolle von Acetyl-CoA bei vielen Stoffwechselwegen, ist es wahrscheinlich, dass mehr als ein Weg zur Aufrechterhaltung des Acetyl-CoA-Pools beitragen könnte (Ohlrogge und Browse, 1995).
Eine Denkschule ist der Ansicht, dass der Kohlenstoff für die Fettsäuresynthese direkt von den Produkten der Photosynthese abstammt. In diesem Szenario würde 3-Phosphoglycerat (3-PGA) Pyruvat erzeugen, das dann mittels Pyruvat-Dehydrogenase in Plastiden zu Acetyl-CoA umgewandelt werden würde (Liedvogel, 1986). Diese Hypothese hat viele ansprechende Aspekte, aber es bleiben auch einige unbeantwortete Fragen: (1) die Fettsäuresynthese findet in photosynthetischen (Chloroplasten) und nicht-photosynthetischen Plastiden statt (in der Wurzel, in sich entwickelnden Embryokotyledonen, in Endospermleukoplasten); (2) einigen Plastiden könnte es an 3-Phosphoglycerat-Mutase fehlen (Kleinig und Liedvogel, 1980), einem essenziellen Enzym zur Umwandlung von 3-PGA, dem Zwischenprodukt der CO₂-Fixierung zu Pyruvat. (3) Acetat ist das bevorzugte Substrat für die Fettsäuresynthese bei Verwendung isolierter intakter Plastiden und es gibt Beweise dafür, dass in Plastiden ein Acetyl- CoA-Syntheatase und Acetyl-CoA-Carboxylase einschließendes Multi-Enzymsystem existiert, welches Acetat in Lipide leitet (Roughan und Ohlrogge, 1996). Es ist fast sicher, dass zumindest einige der Acetyl-CoAs durch Plastiden- Pyruvat-Dehydrogenase in Plastiden gebildet wird, unter Verwendung von Pyruvat, das aus dem Zytosol importiert wurde oder das lokal durch Plastiden-Glykolyse erzeugt wurde.
Eine weitere Möglichkeit ist, insbesondere in nicht-photosynthetischen Geweben (z. B. Wurzeln und sich entwickelnden Embryos), dass Acetyl-CoA, das in Mitochondrien erzeugt wurde, ein alternatives Mittel zur Bereitstellung von Acetat-Resten für die Fettsäuresynthese darstellt (Ohlrogge und Browse, 1995). Durch Mitochondrien erzeugtes Acetyl-CoA könnte hydrolysiert werden, um freies Acetat zu ergeben, das in die Plastiden wandern könnte, zur Umwandlung in Acetyl-CoA über Plastiden-Acetyl-CoA-Synthetase, einem Enzym mit 5- bis 15-facher höherer Aktivität als die in vivo Rate der Fettsäuresynthese (Roughan und Ohlrogge, 1994). Alternativ könnte das Mitochondrien-Acetyl-CoA zu Acetylcarnitin umgewandelt werden und direkt in die Plastide transportiert werden. In der Theorie hat der Mitochondrien -Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex daher bei der Fettsäurebiosynthese eine wichtige Rolle zu spielen (siehe 1 der beigefügten Zeichnungen). Der Beweis dieser Hypothese wurde durch die Schwierigkeiten des direkten Messens der Existenz von Acetat in dem Zytosol verhindert.
Die Mitochondrien-PDC (mtPDC) ist ein strikt regulierter Multi-Untereinheiten-Komplex. Wie vorher erwähnt, ist eine der regulatorischen Schlüsseleinheiten dieses Komplexes die PDH-Kinase (PDHK). PDHK agiert über die Phosphorylierung als ein negativer Regulator bei der Inaktivierung von PDH. Durch Modulierung der PDCK kann die Aktivität von PDC genetisch verändert werden.
Es wurden verschiedene Versuche unternommen, zusätzlichen Kohlenstoff in Richtung Fettsäure-Biosynthese zu erhöhen oder zu leiten. Die Ziele schlossen die genetische Modifikation von Acetyl-CoA-Carboxylase und die Genexpression von Pyruvat-Kinase mittels Überexpression und Antisense-mRNA-Techniken ein, bei geringem oder keinem Erfolg.
Allerdings gibt es viele Beispiele von erfolgreichen Modifikationen des Pflanzenmetabolismus, die durch Gentechniken in Pflanzen unter Transfer neuer Gene oder durch Veränderung der Expression von existierenden Genen erreicht wurden. Es ist nun routinemäßig möglich, in viele Pflanzenarten von agroökonomischer Bedeutung Gene einzufügen, um das Nutzpflanzen-Leistungsverhalten zu verbessern (z. B. Samenöl oder Knollenstärkegehalt/Zusammensetzung; Mehl-Verbesserung; Herbizid-, Krankheit- oder Insektenresistenz; Schwermetall-Toleranz etc.) (Somerville, 1993; Kishore and Somerville, 1993; MacKenzie und Jain, 1997).
Zum Beispiel wurden durch Einfügen von verschiedenen Fettsäurebiosynthese- und Acetyl-Transferase-Genen bei Ölsamen-Nutzpflanzen Erhöhungen in den Anteilen einiger strategischer Fettsäuren und in der Menge des Samenöls erreicht.
Diese schließen die folgenden Beispiele ein: die Expression eines Antisense-Konstrukts der Stearoyl-ACP-Δ9-Desaturase in Brassicaceae führte zu einer Zunahme des Stearinsäuregehalts (Knutzon et al., 1992). Es wurde gezeigt, dass die Expression einer mittleren Ketten-Fettsäure-ACP-Thioesterase aus California Bay, bei Brassicaceae den Laurinsäure (12 : 0)-Gehalt erhöht (Voelker et al., 1992; 1996). Die Expression von einer Jojoba-β-Ketoacyl-CoA-Synthase in Nieder-Erucasäure Brassicaceae führte zu einer Zunahme des Erucasäurespiegels (22 : 1); die Wirkung nach Expression in Hoch-Erucasäure-Kultivatoren war vernachlässigbar (Lassner et al., 1996). Zunehmende Anteile an Oleinsäure in Brassica napus und in Sojabohnen wurden durch Abschalten der Mikrosomen-FAD2-(Δ12)-Desaturase (Hitz et al., 1995; Kinney, 1995; 1997) erreicht. Die Transformation von Arabidopsis thaliana und Rapssamen (B. napus) mit Hefe-sn-2-Acyl-Transferase ergab Saatöl mit erhöhten Anteilen von 22 : 1 und andere sehr langkettige Fettsäuren und signifikante Zunahmen des Samenölgehalts (Zou et al., 1997).
Die Stärkeablagerung wurde ebenfalls gentechnisch verändert: Durch Expression eines mutierten E. coli-glgC16-Gens, das für eine ADP-Glukosepyrophosphorylase in Kartoffelknollen kodiert, wurde eine Zunahme der Stärkeakkumulation erzielt (Stark et al., 1992).
Da allerdings bisher kein PDHK-Gen in irgendeiner Pflanze kloniert worden war, haben keine der genetischen Veränderungen die Möglichkeit angegangen, den Kohlenstofffluss, die Zunahme der Fettsäuresynthese, den Ölgehalt oder die Samengröße, die Veränderung der Blüte und/oder die Generationszeit, das vegetative Wachstum oder die Pflanzenrespiration/-produktivität durch Verändern der Pflanzenmitochondrien PDH-Aktivität zu verändern.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDHK) (Gen und cDNA)-Sequenz aus Arabidopsis zu isolieren und zu charakterisieren und diese Sequenz zur genetischen Veränderung von Pflanzen einzusetzen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, einen Vektor bereitzustellen, der die Volllängen-PDHK-Sequenz oder einen signifikanten Teil der PDHK-Sequenz aus Arabidopsis in einer Antisense-Orientierung unter Kontrolle von entweder einem konstitutivem oder einem Samen-spezifischen Promotor zur Wiedereinführung in Arabidopsis oder zur Einführung in andere Pflanzen enthält.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Konstruktion eines Vektors bereitzustellen, der die Gesamtlängen-PDHK-Sequenz oder einen signifikanten Teil der PDHK-Sequenz aus Arabidopsis in einer Sense-Orientierung unter Kontrolle von entweder einem konstitutivem oder einem Samen-spezifischen Promotor zur Wiedereinführung in Arabidopsis oder zur Einführung in anderen Pflanzen enthält.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Modifikation von Arabidopsis und anderen Pflanzen bereitzustellen, um ihren Samenöl-Gehalt zu verändern.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Modifikation von Arabidopsis und anderen Pflanzen bereitzustellen, um ihre) durchschnittliche Samengröße oder ihr -gewicht zu verändern.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Modifikation von Arabidopsis oder anderen Pflanzen bereitzustellen, um ihre Atmungsrate während der Entwicklung zu verändern.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Modifikation von Arabidopsis und anderen Pflanzen bereitzustellen, um ihre vegetativen Wachstumscharakteristika zu verändern.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Modifikation von Arabidopsis und anderen Pflanzen bereitzustellen, um ihre Blütezeit oder ihr -muster generativen Wachstums zu verändern.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Modifikation von Arabidopsis und anderen Pflanzen bereitzustellen, um die Zeitdauer zu verändern, die benötigt wird, um Samenreife zu erreichen.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte und gereinigte Desoxyribonukleinsäure (DNA) der SEQ ID NO: 1 (pYA5; ATCC No 209562) bereitgestellt.
Gemäß einer weiteren Aufgabe der Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der die SEQ ID NO: 1 oder einen Teil davon zum Einführen des Gens in einer Antisense-Orientierung (z. B. pAsYA5; ATCC No 209561) in eine Pflanzenzelle enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors enthaltend SEQ ID NO: 1 oder eines Teils davon zur Einführung des Gens in Sense-Orientierung in eine Pflanzenzelle.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf transgene Pflanzen und Pflanzensamen, die ein Genom haben, das eine eingeführte DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1 enthält und bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen und Pflanzensamen.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf im Wesentlichen homologe DNA-Sequenzen aus Pflanzen mit abgeleiteten Aminosäuresequenzen von 25% oder größerer Identität und 50% oder größerer Ähnlichkeit, die mittels bekannter Verfahren isoliert und/oder charakterisiert wurden, unter Verwendung der Sequenzinformation von SEQ ID NO: 1, wie es von den Fachleuten anerkannt sein wird, und auf Teile reduzierter Länge, die noch in der Lage sind, als Inhibitoren der Genexpression bei Verwendung in einer Antisense- oder Co-Suppression (Transwitch; Jorgensen und Napoli 1994)-Anwendung zu fungieren. Es wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass kleine Veränderungen der Identität der Nukleotide in einer spezifischen Gensequenz zu reduzierter oder verstärkter Effektivität der Gene führen können und dass in einigen Anwendungen (z. B. Antisens- oder Co-Suppression) Teilsequenzen häufig genauso effektiv arbeiten wie die Volllängen-Versionen. Die Wege, auf denen die Gensequenz verändert oder verkürzt werden kann, sind den Fachmännern allgemein bekannt, wie auch die Wege des Testens der Effektivität der veränderten Gene. Alle diese Variationen der Gene werden daher als Teil der vorliegenden Erfindung beansprucht.
Noch allgemeiner ausgedrückt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Isolation, Reinigung und Charakterisierung eines Mitochondrien-Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDHK)-Gens aus den Brassicaceae (insbesondere Arabidopsis thaliana) und zeigt ihre Anwendung bei der Regulation der Fettsäuresynthese, des Samenölgehalts, der Samengröße/-gewichts, der Blütezeit, des vegetativen Wachstums, der Atmungsrate und der Generationszeit. Bisher waren keine konkreten Daten zur Genstruktur der regulatorischen Untereinheiten der Pflanzen-PDC (PDCK und PDC-Phosphatase) erhältlich.
Das PDHK-Gen wurde im Verlauf der Experimente kloniert und charakterisiert, die so gestaltet waren, eine E. coli Mutante JC201 (Coleman, 1990) mit einer Pflanzen (A. thaliana)-cDNA-Bibliothek zu ergänzen. Durch Expression der cDNA als ein
Fusionsprotein in E. coli wurde ihre Funktion als eine PDHK in einem Proteinkinase-Test etabliert, wo sie spezifisch die Säugetier-PDH-E1α/E1β-Untereinheiten (den spezifischen Substraten von PDHK) phosphorylierte. Die A. thaliana PDHK-Struktur ist zu ihrem Säugetier-Gegenstück signifikant homolog, insbesondere unter den funktionalen Domänen.
Die PDHK der Erfindung ist zur Manipulation der PDH-Aktivität und der Atmungsrate in Pflanzen nützlich. Zum Beispiel kann durch Transformieren von Pflanzen mit einem Konstrukt, welches das partielle PDHK-Gen in einer Antisense- oder in einer Sense-Orientierung unter Kontrolle von entweder konstitutiven oder Gewebs-spezifischen Promotoren enthält, die Expression von Mitochondrien-PDHK bis zu einem gewissen Grad durch das Antisense- bzw. Co-Supression (Transwitch)-Phänomen abgestellt werden (De Lange et al., 1995; Mol et al., 1990; Jorgensen und Napoli, 1994; Kinney, 1995). Dies kann zu einer erhöhten Mitochondrien-PDH-Aktivität führen und daher zu einer erhöhten Produktion oder Erhältlichkeit von von Mitochondrien erzeugtem Acetyl-CoA oder zu einer erhöhten Atmungsrate.
Alternativ kann durch Überexpression des Volllängen-PDHK-Gens in Gewebs-spezifischer Weise selektiv die Aktivität von Mitochondrien-PDH negativ reguliert werden, was zu verminderten Atmungsraten in Geweben wie Blättern oder Knollen führt, um den Erhaltungsstoffwechsel zu vermindern und dadurch die Akkumulation von Biomasse zu erhöhen.
Einige der Manipulationen und Belieferungen (engl. deliverables), die unter Verwendung des PDHK-Gens oder Teilen davon möglich sind, schließen, aber sind nicht darauf beschränkt, die folgenden ein: Samen mit erhöhtem oder vermindertem Fettsäure- und Ölgehalt; Pflanzen, die frühe oder verzögerte Blütezeiten zeigen (gemessen in Tagen nach dem Pflanzen oder der Samenaussaat); Pflanzen mit erhöhtem oder vermindertem vegetativen Wachstum (Biomasse); Pflanzen mit Wurzelsystemen, die besser in der Lage sind, geringeren Bodentemperaturen oder Frost zu widerstehen; Pflanzen mit Geweben, die entweder höhere oder niedrigere Atmungsraten zeigen; Pflanzen, die eine erhöhte Kapazität zur Akkumulation von Speicherverbindungen in anderen Speicherorganen (z. B. Knollen) zeigen; Pflanzen, die eine erhöhte Kapazität zur Akkumulation von Biopolymeren zeigen, die auf Acetylresten als Vorläufern wie Polyalkylhydroxyalkanoidsäuren oder Polyhydroxybutteräuren beruhen (Padgette et al., 1997).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die zentrale Rolle, die von Acetyl-CoA bei der Mitochondrienrespiration und bei der Plastiden-Fettsäurebiosynthese gespielt wird. Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDC) decarboxyliert Pyruvat oxidativ, um Acetyl-CoA zu ergeben. Pflanzen sind einzigartig darin, dass sie sowohl Mitochondrien als auch Plastiden-Isoformen des PDCs besitzen. Der Mitochondrien-Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulation von Acetyl-CoA-Erzeugung und bei der Erhältlichkeit von Acetylresten für vielerlei katabolische und anabolische Reaktionen in Pflanzenzellen. Der Mitochondrien-PDC wird durch Phosphorylierung der E1α-Untereinheit durch Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDCK = PDHK) negativ reguliert und wird durch Dephosphorylierung des PDC durch Pyruvat-Dehydrogenase-Phosphatase (PDCP) positiv reguliert. Von Mitochondrien erzeugte Acetylreste finden ihren Weg in den respiratorischen Tricarbonsäure (TCA)-zyklus, aber auch in das Plastidenkompartiment, wo schließlich Acetateinheiten von Enzymen des Fettsäuresynthese (FAS)-Wegs zur Synthese von Fettsäuren verwendet werden. Diese werden schließlich in die Membran inkorporiert und speichern auch Glycerinfipide. Andere Abkürzungen: PDC, Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex; OAA, Oxalacetat; ACS, Acetyl-CoA-Synthetase; ACH, Acetyl-CoA-Hydrolase; DHAP, Dihydroxyacetonphosphat.
2 zeigt die Nukleotidsequenz [SEQ ID NO: 1] und die abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 2] von der Arabidopsis thaliana PDH-Kinase (PDHK) cDNA (Klon YA5).
3 zeigt das Aminosäuresequenzalignment der Arabidopsis PDH-Kinase (Ya5p) [SEQ ID NO: 2] mit anderen Säugetiermitochondrien-Ketosäure-Dehydrogenase-Kinasen: Pdhk 1, Schweine-PDH-Kinaseuntereinheit 1 [SEQ ID NO: 3]; PDHK II, Schweine-PDH-Kinase-Untereinheit II [SEQ ID NO: 4]; und Bckdhk, Schweine-verzweigte Ketten-α-Ketosäure-Dehydrogenase-Kinase [SEQ ID NO: 5]. Punkte zeigen Lücken an. Identische Aminosäurereste sind in Fettgedruckten Großbuchstaben hervorgehoben.
4 zeigt die vorher gesagte helikale Radstruktur (Winkel = 100°) der 24 Aminosäurereste an dem N-Terminus des YA5 (Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase, PDHK)-Proteins. Die N-terminate Leader-Sequenz des YA5-Proteins entspricht den meisten Mitochondrienzielsequenzen gut (Rosie und Schatz, 1988), die aus einer Strecke von Aminosäuren besteht, die mit hydrophoben Resten und gegenüberliegenden positiv geladenen Resten angereichert ist. Die hydrophoben (V₃, F₁₀, L₁₄, V₁₆ und W₂₁) und positiv geladenen (K₅, K₁₂ und H₁₉) Schlüsselreste finden sich auf gegenüberliegenden Seiten des helikalen Radmotivs in dieser Mitochondrienzielsequenz und werden durch einen • auf dem Rest selbst und durch ein ? neben der Restzahl hervorgehoben.
5 zeigt die Ergebnisse einer DNA-Gel-Blotanalyse (Southern, 1975) des Arabidopsis thaliana YA5 (PDHK)-Gens. Die genomische DNA wurde mit PstI + XbbaI (Bahn 1), XbaI (Bahn 2), PstI (Bahn 3), Pvull + SpeI (Bahn 4), SpeI (Bahn 5) und Pvull (Bahn 6) verdaut. Keines dieser Enzyme hat eine interne Restriktionsschnittstelle auf der YA5 (PDHK) cDNA. Die verdaute DNA wurde mit ³²P-markierter YA5 cDNA (≈ 1,5 Kb) unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert. Alle Verdaus zeigen nur ein Hybridisierungsfragment, was belegt, dass das PDHK-Gen mit größter Wahrscheinlichkeit ein Einzelkopie-Gen von Arabidopsis thaliana darstellt.
6 zeigt eine RNA (Northern) Gel-Blot-Analyse von YA5 (PDHK) mRNA-Häufigkeits-/Gewebsverteilung in A. thaliana. Die RNA wurde aus Blüten (F), vegetativem Gewebe (Keimlingblätter (L)), jungen, sich entwickelnden Schoten (YS) und reifenden Schoten (MS) extrahiert. Die Analyse zeigt, dass in allen Geweben eine RNA-Hybridisierungsbande von ungefährt 1,5 Kb beobachtet wurde, aber die Häufigkeit der YA5 mRNA variierte beträchtlich von Gewebe zu Gewebe. Junge Keimlingsblätter (L) zeigten die höchsten Spiegel von YA5-Expression, während signifikant, aber geringere Spiegel der Expression in sich entwickelnden Schoten (Samen) beobachtet wurden.
7a, 7b, 7c und 7d zeigt die Ergebnisse der Experimente, in denen die YA5 PDHK cDNA als ein Fusionsprotein in E. coli exprimiert wurde und Tests durchgeführt wurden, um ihre Funktion als eine PDH-Kinase zu bestätigen. Die YA5 cDNA wurde als ein Fusionsprotein in E. coli wie in 7a gezeigt, exprimiert. Die Analyse mittels SDS-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zeigte, dass Lysate von E. coli, die mit A. thaliana PDHK (YA5) transformiert wurden, ein stark reduziertes Fusionsprotein von M_r ≈ 45 kDa (?) haben, was die vorhergesagte Masse des A. thaliana PDHK-Genfusionsprodukts (42 kD + 3 kD His TAG) darstellt. 7b zeigt den Säugetier E1α/E1β PDH-Untereinheiten-Komplex (freundlicherweise erhalten von Dr. M. Patel von der University of Buffalo). Die Proteine wurden in E. coli co-exprimiert, um ein Substrat zum Testen der Kapazität von PDHK, die E1-Untereinheit des PDH-Komplexes zu phosphorylieren, bereitzustellen. 7c und 7d sind Autoradiogramme der radioaktiven Inkorporation von ³²P (aus γ-³²P-ATP) in die E1-Untereinheit des E1α/E1β PDH-Komplexes. Die Tafeln 7c und 7d auf der linken Seite zeigen die zeitabhängige (Inkubationszeit von 2, 5, 10, 15 oder 20 min) in vitro Phosphorylierung des E1α/E1β PDH-Komplexes auf Grund der Wirkung der Pflanzen PDHK (Produkt von Klon YA5 exprimiert in E. coli), was ihre Funktion als Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase, die als erstes in Pflanzen kloniert wurde, bestätigt. In 7c enthält die Kontrollreaktion (Tafeln auf der rechten Seite) YA5-Lysat + Kontroll E. coli-Lysat ohne E1α/E1β-Substrat. Es gibt keine Hinweise auf Phosphorylierung des E1α/E1β-Komplexes. In 7d enthält die Kontrollreaktion (Tafeln der rechten Seite) Kontroll E. coli-Lysat (ohne YA5 Insert) + das E1α/E1β-Substrat. Erneut gibt es keinen Hinweis auf Phosphorylierung des E1α/E1β-Komplexes.
8 zeigt die Mitochondrien-Pyruvat-Dehydrogenase (PDC)-Aktivität in Blättern aus A. thaliana nicht-transformierten Wildtyp (n-WT)-Pflanzen und T₂-transgenen Pflanzen, die konstitutiv exprimierte Antisense-Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDHK) enthielt, die als YA5-Linien bezeichnet werden. Mitochondrien, die aus Blättern von A. thaliana YA5-transgenen Linien, die konstitutiv exprimiertes Antisense-PDHK-Konstrukt enthalten, isoliert wurden, zeigen erhöhte PDC-Aktivität verglichen mit Mitochondrien, die aus Blättern von nicht-transformierten Kontrollpflanzen isoliert wurden.
9 zeigt die Mitochondrien-Citrat-Synthaseaktivität in Blättern von A. thaliana von nicht-transformierten Wildtyp (n-WT)-Pflanzen und von T₂-transgenen Pflanzen, die konstitutiv exprimierte Antisense-Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDHK) enthielten und als YA5-Linien bezeichnet werden. Mitochondrien, die aus Blättern von A. thaliana transgenen Linien, die mit einem konstitutiv exprimierten Antisense-PDHK-Konstrukt transformiert wurden, haben zusätzlich zu erhöhter PDC auch erhöhte Aktivitäten an Citrat-Synthase, verglichen mit Mitochondrien, die aus Blättern von nicht-transformierten Kontrollpflanzen isoliert wurden.
10 zeigt den Ölgehalt (ausgedrückt als μg Gesamt-Fettsäuren pro 100 Samen) in Samen, die aus A. thaliana nicht-transformierten Kontrollen (nt-WT Con) isoliert wurden und in T₂-Samen von pBI121-Plasmid Nur-Kontroll (pBI121 Con)-Transgenen und Antisense-Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDHK)-Transgenen, die als YA5-Linien bezeichnet werden. Die A. thaliana YA5-Samenlinien, die mit einem konstitutiv exprimierten Antisense-PDHK-Konstrukt transformiert wurden, haben erhöhten Fettsäure- und Ölgehalt, verglichen mit Samen von nicht-transformierten Kontrollpflanzen oder Transformanden, die nur ein selektierbares Markierungsgen (transformiert mit pBI121) enthalten, aber ohne Antisense-PDHK.
11 zeigt die Zeit (ausgedrückt in Tagen nach dem Pflanzen) bis zum Erreichen der Blüteninitiations (generative) -phase in A. thaliana nicht-transformierten Kontrollen (nt-WT) und in T₂-Generation von pBI121-Plasmid Nur-Kontroll (pBI121)-Transgenen und in Antisense-Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDHK)-Transgenen, die als YA5-Linien bezeichnet werden. Die Zeit zum Erreichen des generativen (Blüteninitiations-) Stadiums ist in A. thaliana-YA5-Linien, die mit einem konstitutiv exprimierten Antisense-PDHK-Konstrukt transformiert wurden, vermindert, verglichen mit nicht-transformierten Kontrollen oder Transformanden, die nur ein selektierbares Markierungsgen (transformiert mit pBI121) enthielten, aber ohne Antisense PDHK.
12 zeigt vegetative Schößlingsgewebe-Trockengewichte bei 31 Tagen nach dem Pflanzen in A. thaliana nicht-transformierten Kontrollen (WT) und die T₂-Generation von pBI121-Plasmid-Nur-Kontroll (pBI121)-Transgenen und in Antisense-Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDHK)-Transgenen, die als YA5-Linien bezeichnet werden. Schößlingsgewebewachstum ist in A. thaliana YA5-Linien, die mit einem konstitutiv exprimierten Antisense-PDHK-Konstrukt transformiert wurden, vermindert, verglichen mit nicht-transformierten Kontrollen oder Transformanden, die nur ein selektierbares Markierungsgen (transformiert mit pBI121) enthalten, aber ohne Antisense PDHK.
13 zeigt die durchschnittliche Anzahl von Rosettenblättern, die beim Eintritt in die generative Phase bei A. thaliana nicht-transformierten Kontroll-(WT)-Pflanzen vorhanden sind und bei T₂-Generation von pBI121-Plasmid-Nur-Kontroll (pBI121)-Transgenen und bei Antisense-Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDHK)-Transgenen, die als YA5-Linien bezeichnet werden, vorhanden sind. Die durchschnittliche Anzahl von Rosettenblättern pro Pflanze ist in A. thaliana YA5-Linien, die mit einem konstitutiv exprimierten Antisense-PDHK-Konstrukt transformiert wurden, reduziert verglichen mit nicht-transformierten Kontrollen oder Transformanden, die nur ein selektierbares Markierungsgen (transformiert mit pBI121) enthielten, aber ohne Antisense-PDHK. Die gestörte vegetative Wachstumsphase in den Antisense-PDHK-Transgenen (siehe auch 12) korreliert gut mit den früher blühenden Phänotypen (siehe auch 11).
BESTE MODI ZUM AUSFÜHREN DER ERFINDUNG
Die besten Modi zum Ausführen der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den Ergebnissen der Tests und Experimente, die von den Erfindern durchgeführt wurden, ersichtlich.
Die Erfinder wählten das wohl akzeptierte Modellpflanzensystem Arabidopsis thaliana zum Klonieren von PDHK als ein Wirtssystem für die Gentechnik zum Verändern der PDHK-Expression und zum Studium der Wirkungen der Veränderung der PDHK-Expression auf verschiedene Pflanzenentwicklungs- und Stoffwechselprozesse aus.
Dies beruht darauf, dass über mehrere vergangene Jahre Arabidopsis thaliana, eine typische blühende Pflanze, an zunehmender Popularität als Modellsystem zum Studium der Pflanzenbiologie gewonnen hat. Als Ergebnis der Einfachheit, mit der sich diese Pflanze für Arbeiten in sowohl klassischer als auch molekularer Genetik anbietet, entwickelte sich Arabidopsis zum vielfach eingesetzten Modellorganismus der Pflanzenmolkulargenetik, der Entwicklung, der Physiologie und der Biochemie (Meyerowitz und Chang, 1985; Meyerowitz, 1987; Goodman et al., 1995). Diese zweikeimblättrige Modellpflanze ist nah verwandt mit den Brassica-Nutzpflanzenspezies und es wird zunehmend klar, dass die Information bezüglich der genetischen Kontrolle von grundlegenden biologischen Prozessen in Arabidopsis auf andere Spezies übertragbar sein wird (Lagercrantz et al., 1996).
In der Tat gibt es eine Vielzahl von Beispielen, bei denen Studien der Molekularbiologie und der Biochemie eines bestimmten Stoffwechselwegs oder Entwicklungsprozesses und der Möglichkeit, eine Pflanze gentechnisch zu verändern, um Änderungen der genannten Stoffwechselwege oder -prozesse hervorzubringen, zuerst in der Modellpflanze Arabidopsis getestet wurden und es dann gezeigt wurde, dass ähnliche Phänotypen in anderen Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen, erzielt werden.
Zum Beispiel wurde das Extraplastidenmembran-assoziierte Oleat (18 : 1) Δ12(ω – 6) Desaturase-Gen, FAD2, ursprünglich in Arabidopsis thaliana studiert und schließlich kloniert, indem in einer A. thaliana-Mutante eine Läsion gefunden wurde, die defekt war beim Desaturieren von Oleat zur Produktion von Linoleat (18 : 2) auf dem Phosphatidylcholin-Rückgrat. Dies führte bei dem A. thaliana-Samenöl zu einem Hoch-Oleinsäure-Phänotyp (Okuley et al., 1994). Gentechnische Veränderung des Abschaltens der indigenen FAD2-Gene) in einer Samenspezifischen Weise mittels Antisense- oder Co-Suppresions-Ansätzen sowohl von der Sojabohne (Glycine max.) als auch von der Rapsart Canola B. napus führte zu ähnlich hohen Oleinsäure-Samenöl-Phänotypen (Kinney, 1995; 1997).
Die transgene Expression eines Hefe-sn-2-Acetyl-Transferase (SLC1-1)-Gens zum Erzielen verbesserten Samenöls und sehr langkettigem Fettsäuregehalt wurde zuerst in Arabidopsis durchgeführt und später wurde gezeigt, dass es zu ähnlichen Phänotypen in transgenen Rapssamen (B. napus)-Experimenten (Zou et al., 1997) führte. Arabidopsis thaliana erwies sich wiederholt als nützliches Modellsystem für Stoffwechsel-Engineering der Stoffwechselwege (z. B. Lipidbiosynthese, Photosynthese) oder für Prozesse (Organogenese, reproduktive Entwicklung etc.), die allen höheren Pflanzen gemein sind.
Auf dem Gebiet des sekundären Metabolismus/der Signaltransduktion wurde ein Anthocyanin-Weg-spezifischer transkriptionaler Aktivator des als R bezeichneten Monokotolye Mais (der myc-Transkriptionsfaktor, der in die Aktivierung von biosynthetischen Genen für die Anthocyanin-Produktion in den Aleuronzellen von Maiskörnern involviert ist) in der Dikotyle Arabidopsis exprimiert und verursachte vermehrte Anthocyanin-Pigmentierung in den Infloreszenzen. Darauf folgende Expression in einer weiteren Dikotyle, Tabak (Nicotiana tabacum) führte zu ähnlichen Pigmentierungsänderungen der Blüten (Lloyd et al., 1992). Dieses Experimente zeigen, dass vollständige Stoffwechselwege, die allen blühenden Pflanzen gemein sind, durch das Einfügen von Transkriptionsregulatoren koordiniert kontrolliert werden kann und dass die Mechanismen diversen Pflanzenspezies gemein sind.
Im Zusammenhang mit der aktuellen Endung durchlaufen alle Pflanzenzellen Mitochondrienrespiration und dieser ubiquitäre Prozess wird von der Aktivität des PDCs und seiner Regulatoren PDCK und PDCP, wie vorher erklärt, beeinflusst. Es kann daher erwartet werden, dass viele der Wirkungen, die in Folge der gentechnischen Veränderung zur Veränderung der PDCK-Expression in Arabidopsis beobachtet wurden, zu ähnlichen Phänotypen führen, wenn sie in allen anderen Pflanzen ausgeführt werden.
Es gibt eine Vielzahl von Wegen, durch die Gene und Genkonstrukte in Pflanzen eingefügt werden können und eine Kombination von Pflanzentransformation und Gewebekultur-Techniken wurden erfolgreich zu wirksamen Strategien zur Erzeugung transgener Nutzpflanzen integriert. Diese Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wurden anderswo ausführlichst zusammengefasst (Potrykus, 1991; Vasil, 1994; Walden und Wingender, 1995; Songstad et al., 1995) und sind den Fachleuten allgemein bekannt. Zum Beispiel wird ein Fachmann sicherlich wissen, dass zusätzlich zu Agrobacterium-vermittelter Transformation von Arabidopsis mittels Vakuum-Filtration (Bechtold et al., 1993) oder Wunden-Inokulation (Katavic et al., 1994) es ebenfalls möglich ist, andere Pflanzen und Nutzpflanzenspezies unter Verwendung von Agrobacterium Ti-Plasmid-vermitteltem Transformationsverfahren (z. B. Hypocotyle (DeBlock et al., 1989) oder von Kotyledonarblattstiel-Verfahren (Moloney et al., 1989) Wundeninfektion), von Teilchenbombardierungsverfahren/biolistischen Verfahren (Sanford et al., 1987; Nehra et al., 1994; Becker et al., 1994) oder von Polyethylenglykol-unterstützten Protoplasten-Transformationsverfahren (Rhodes et al., 1988; Shimamoto et al., 1989) zu transformieren.
Wie es den Fachleuten auch bekannt sein wird, und wie es ausführlich anderswo zusammengefasst wurde (Meyer, 1995; Datla et al., 1997), ist es möglich, Pflanzenpromotoren einzusetzen, um irgendeine beabsichtigte Hoch- oder Herunterregulation der transgenen Expression unter Verwendung von konstitutiven Promotoren (z. B. jene, die auf CaMV35S basieren) oder durch Verwendung von Promotoren, die die Gen-Expression auf bestimmte Zellen, Gewebe anzielen können (z. B. Napin-Promotor zur Expression von Transgenen in sich entwickelnden Samen-Cotyledonen), Organe (z. B. Wurzeln) anzielen können, auf ein spezielles Entwicklungsstadium anzielen können oder als Antwort auf einen speziellen externen Stimulus (z. B. Hitzeschock) zu steuern.
Besonders bevorzugte Pflanzen zur Modifikation gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Borage (Borago spp.), Rapsart Canola, Rizinen (Ricinus communis), Kakaobohne (Theobroma cacao), Mais (Zea mays), Baumwolle (Gossypium spp.), Crambe spp., Cuphea spp., Flachs (Linum spp.), Lesquerella und Limnanthes spp., Linola, Kapuzinerkresse (Tropaeolum spp.), Oenothera spp., Olive (Olea spp.), Palme (Elaeis spp.), Erdnuss (Arachis spp.), Rapssamen, Öldistel (Carfhamus spp.), Sojabohne (Glycine und Soja spp.), Sonnenblume (Helianthus spp.), Tabak (Nicotiana spp.), Vemonia spp., Weizen (Triticum spp.), Gerste (Hordeum spp.), Reis (Oryza spp.), Hafer (Avena spp.), Hirse (Sorghum spp.), Roggen (Secale spp.) oder andere Mitglieder der Gramineae ein.
ERGEBNISSE
cDNA-Klonierung und Sequenz-Analyse des Klons YA5 (Pflanzen-PDHK).
Eine als YA5 bezeichnete Pflanzen-PDHK-cDNA-Sequenz wurde während der Experimente identifiziert und kloniert und gestaltet, um eine E. coli-Mutante JC201 (Coleman, 1990) mit einer Arabidopsis thaliana-cDNA-Bibliothek zu ergänzen. Die E. coli-Mutante JC201 ist Berichten zufolge eine Mutante, der Lysophosphatidsäureacyltransferase (LPAT; EC 2.3.1.51)-Aktivität fehlt und die einen Temperatur-sensitiven Wachstums-Phänotyp besitzt (Coleman, 1990). Plasmide, die aus einer A. thaliana λ-YES-Expressionsbibliothek erzeugt wurden (Elledge et al., 1991) wurden zum Transformieren von E. coli-Mutante JC201 verwendet. Eine Einschränkungstemperaturbedingung (44°C) wurde angewandt, um die überlebenden Kolonien auszuwählen. Die cDNAs wurden von den Temperatur-insensitiven Transformanden isoliert. Der Klon YA5 erwies sich als in der Lage, die Temperatur-Sensitivität von JC201 zu ergänzen oder zu retten, aber es konnte keine erhöhte LPAT-Aktivität in den Lysaten des Transformanden detektiert werden. Daher bleibt der Mechanismus, der der Fähigkeit zur Ergänzung der Temperatur-Sensitivität von JC201 unterliegt, unklar. Es wurden allerdings eine Reihe anderer Ergänzungsklone gefunden, die den Temperatur-sensitiven Phänotyp von JC201 retten, was anzeigt, dass die Temperatur-Ergänzung nach Transformation mit cDNA auftreten kann, die Funktionen haben, die nicht zu LPAT in Beziehung stehen (Taylor et al., 1992a; Zou and Taylor, 1994).
Die YA5-cDNA wurde von beiden Strängen mittels eines Applied-Biosystems-Modell 373A DNA-Sequenzierungssystems unter Verwendung des Taq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc.) sequenziert. Die Nukleotidsequenz der 1.457 kb YA5-cDNA (pYA5; ATCC 209562) [SEQ ID NO: 1] und ihre abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 2] sind in 2 gezeigt. Eine Probe der YA5-cDNA (pYA5) wurde am 18. Dezember 1997 bei der American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA unter der Zugangsnummer ATCC 209562 hinterlegt. Die Sequenz zeigte eine 103 Nukleotid 5' untranslatierte Region und eine 235 Nukleotid 3' untranslatierte Region, gefolgt von einem Poly-A-Schwanz. YA5 hat einen offenen Leserahmen von 1098 Basenpaaren, die ein Polypeptid von 366 Aminosäuren kodieren, mit einem berechneten Molekulargewicht von 41,37 kDa. Die Sequenzen um das Initiationskodon AUG stehen in guter Übereinstimmung zu den Konsensus-Sequenzen, die von anderen Pflanzenspezies abgeleitet wurden (Lutcke et al., 1987). Es gibt ein In-Frame-Stopkodon, das stromaufwärts von dem Startkodon liegt, was darauf hinweist, dass YA5 eine Volllängen-cDNA ist. Der berechnete isoelektrische Punkt des YA5-Proteins beträgt 6,68 und seine Nettoladung bei pH 7,0 ist auf –1,48 berechnet.
Aminosäuresequenz-Alignment
Wie in 3 gezeigt, zeigen die Vergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 1] des YA5-Proteins (Ya5p) der NCBI-Datenbank einen hohen Homologiegrad mit Säugetiermitochondrien-Kinasen, die für die Phosphorylierung und Inaktivierung von α-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexen verantwortlich sind (Harris et al., 1992), einschließlich des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (PDC) des α-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes (KGDC) und der verzweigten Kette des α-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexes (BCKDHC). Diese Säugetier-Komplexe sind in dem Mitochondrienmatrixraum lokalisiert (Damuni et al., 1984) und sind sowohl in Struktur als auch in der Funktion ähnlich (Nobukuni et al., 1990). Die cDNAs, die für die Säugetier-Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDHK) und die verzweigte Kette α-Ketosäure-Dehydrogenase-Kinase (BCKDHK) kodieren, sind kloniert worden und die Aminosäuresequenzen dieser Proteinkinasen sind zueinander hoch homolog (Popov et al., 1992; 1993; 1994).
Das YA5-Protein (Ya5p) ist mit PDKI 28,6% identisch und 83,7% ähnlich (Popov et al., 1993) und mit PDKII 32,3% identisch und 88,4% ähnlich (Popov et al., 1994), beides Untereinheiten der Schweine-PDH-Kinase. Ya5p ist ebenfalls mit BCKDHK 28,8% identisch und 84,1% ähnlich (Popov et al., 1992). Die Sequenz-Ähnlichkeit erstreckt sich über die gesamte Sequenz, aber es kommen Sequenzunterschiede und Alignment-Lücken überall, insbesondere in Richtung des Amino- und Carboxylterminus vor.
Die SEQ ID NO: 1 der vorliegenden Erfindung und die Säugetier-PDHK und die BCKDHK zeigen keine signifikante Homologie mit bekannten Serin/Threonin-Protein-Kinasen. Schon eher wurde ein viel höherer Grad der Sequenzhomologie mit Mitgliedern der prokaryotischen Protein-Histidin-Kinasefamilie gefunden. Wie in 3 gezeigt fallen die meisten homologen Regionen auf konservierte Motive, die funktionalen Domänen der Histidin-Kinase definieren. Die Mitglieder der Protein-Histidin-Kinase-Familie haben fünf Regionen, die hoch konserviert sind (Parkinson und Kofoid, 1992). Alle fünf Motive sind in der YA5-abgeleiteten Aminosäuresequenz leicht zu identifizieren, mit der gleichen Ordnung und dem gleichen Abstand, die (der) in Bakterien-Proteinen konserviert ist. An dem C-Terminus, der katalytischen Domäne (Block V) mit einer Glycin-reichen Loop von Gly³²⁰-X-Gly³²²-X-Gly³²⁴ [SEQ ID NO: 7] als auch in der sie umgebenden Sequenz befindet sich die längste Strecke von Aminosäuren, die hohe Identität zeigen. Block III mit der Konsensus-Sequenz Asp²⁷⁸-X-Gly²⁸⁰-X-Gly²⁸² [SEQ ID NO: 8], die für Adenosintriphosphat (ATP)-bindende Proteine charakteristisch ist und Block IV mit einem nicht-variierendem Phe²⁹² sind an Positionen lokalisiert, die als zentraler Kern der katalytischen Domäne definiert sind. Eine als Block II definierte Region (Glu²³⁸-Leu-X-Lys-Asn²⁴²-X-X-Arg-Ala²⁴⁶) [SEQ ID NO: 9] der katalytischen Domäne wird auch in angemessener Nähe zu dem N-Terminus gefunden. Der Histidin-Rest (His¹²¹), der unter YA5, PDKI und PDKII konserviert ist, würde vermutlich Block 1 darstellen, für den vorgeschlagen wurde, dass er in die Autophosphorylierung involviert ist.
Die N-terminate Leader-Sequenz des YA5-Proteins korrespondiert gut mit den meisten Mitochondrien-Zielsequenzen (Rosie und Schatz, 1988), die aus einer Strecke von Aminosäuren bestehen, die angereichert sind mit hydrophoben und positiv geladenen Resten mit einer vorhergesagten helikalen Radstruktur (Winkel = 100°) (4). Die hydrophoben (V₃, F₁₀, L₁₄, V₁₈ und W₂₁) und die positiv geladenen (K₅, K₁₂ und N₁₉) Schlüssel-Reste finden sich an gegenüberliegenden Seiten des Helix-Radmotivs in dieser Mitochondrien-Zielsequenz. Dem YA5-Protein fehlen offensichtliche Zielmotive, die typischerweise in Proteinen gefunden werden, die für die Peroxisomen bestimmt sind (z. B. extremes C-Terminus nicht-gespaltenes Ser-Lys-Leu (SKL) Peroxisomen-Zielsequenzmotiv; Mullen et al., 1997).
Genomische Organisation und Expression des YA5-Gens in A. thaliana
Die genomische DNA wurde mit [XbaI + PstI], XbaI, PstI, [Pvull + SpeI], SpeI, und Pvull verdaut (auf der YA5-cDNA gibt es für diese Enzyme keine internen Restriktionsschnittstellen). Die verdaute DNA wurde dann einem DNA-Gelblot (Southern, 1975) unterzogen und mit der ³²P-markierten YA5-cDNA unter hoch-stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Wie in 5 gezeigt, ergaben alle Verdauungsreaktionen lediglich ein Hybridisierungsfragment (Gelband), womit angezeigt wird, dass das YA5-Gen mit größter Wahrscheinlichkeit nur als Einzelkopie in dem Arabidopsis-Genom vorhanden ist.
Zur Bestimmung der relativen Häufigkeit und der Gewebeverteilung des YA5-Gentranskripts wurde eine RNA-Gelblot (Northern Blot)-Hybridisierungsanalyse, die in 6 gezeigt wird, mit RNA durchgeführt, die aus A. thaliana-Keimlingen in Fluoreszenzen (Blüten), jungen Schoten und reifenden Schoten extrahiert wurde. In allen Geweben wurde ein RNA-Hybridisierungsband von ungefähr 1,5 kb beobachtet; allerdings schwankte die Menge der YA5-mRNA von Gewebe zu Gewebe beträchtlich. Junge Keimlinge zeigten die höchsten YA5-Expressionsspiegel, während signifikante, aber niedrigere Expressionsspiegel in sich entwickelnden Schoten (Samen) beobachtet wurden.
Die Expression von YA5 in E. coli und Bestätigung seiner Funktion als eine PDH-Kinase
Die YA5-Volllängen-cDNA (YASF) wurde in pBluescript SK in 5'- nach 3'-Orientierung von T7-T3 kloniert. Ein Primer, der die mutmaßliche translationale Initiationsstelle OMpdk einschließt (AGGAGAGACTCGAGGCTTATGGCAGTGAAG) [SEQ ID NO: 6] wurde synthetisiert, um eine Xhol-Restriktionsschnittstelle einzuschließen. Die Primer OMpdk und T3-Primer wurden in einer PCR-Reaktion eingesetzt, um die YA5-kodierende Region von YASF zu amplifizieren. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit HindIII (HindIII-Restriktionsschnittstelle ist 3' von dem Stopkodon vorhanden) und XhoI verdaut und in pTrcHisB-Vektor (Clontech) kloniert, um das Konstrukt pZTa5 zu erzeugen. Eine SDS-PAGE-Analyse mit Lysaten von IPTG-induziertem E. coli-enhaltenden pZTa5 und pTrcHisB-Kontrollvektor (7a), Bahnen 1 („YA5") bzw. 2 („Kontrolle") zeigten, dass der pZTa5-Transformand (7a, Bahn 1 „YA5") ein sehr stark induziertes Fusionsprotein von M_r ≈ 45 kD zeigte, was die vorhergesagte Masse des A. thaliana-PDHK-Genfusionsproduktes ist (≈ 42 kD + 3 kD His TAG).
Die Proteinkinaseaktivität des E. coli-exprimierten YA5-Proteins wurde getestet, wie im Wesentlichen von Liu et al., (1995) beschrieben. Die Proteinphosphorylierungssubstrate, humanes E1α und E1β, die in E. coli M15 koexprimiert und gereinigt wurden, wurden von Dr. M. S. Patel der Fakultät für Biochemie, School of Medicines and Biomedical Sciences, State University of New York at Buffalo, Buffalo, New York (7b) erhalten. Dieses koexprimierte E1α und E1β-System wurde extensiv in der Studie zur Regulation von PDC E₁-Phosphorylierung in Säugetier-Systemen verwendet (Korotchkina und Patel, 1995). Für Phosphorylierungsexperimente (gezeigt in 7c und 7d) wurden 20–25 μg E1α/E1β mit ungefähr 10 μg YA5-akkumuliertem E. coli-Zytosol-Protein in einem Gesamtvolumen von 100 μl, enthaltend 20 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, 1 mM Magnesiumchlorid, 2 mM Dithiothreitol, 0,1 mM EDTA und 200 μM kaltes ATP kombiniert. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 min präinkubiert und dann wurden 5 μCi-³²P-γ-ATP zum Starten des Tests hinzugefügt. Nach 2, 5, 10, 15 und 20 Minuten wurden 20-μl Aliquots abgezogen und die Reaktion wurde mit 20 μl SDS-denaturierendem Gemisch gestoppt. Die Proben wurden auf 10% SDS-PAGE aufgetrennt und autoradiographiert.
Die 7c und 7d stellen Autoradiogramme der radioaktiven Inkorporation von ³²P (aus γ-³²P-ATP) in die E1-Untereinheit des E1α/E1β-Komplexes dar. Die Tafeln der linken Seite der 6(c) und 6(d) zeigen die Zeit-abhängige (Inkubationszeiten von 2, 5, 10, 15 oder 20 min) in vitro Phosphorylierung des E₁α/E₁β-Komplexsubstrats durch die Wirkung des Pflanzen-PDHK (Klon YA5)-Fusionsproteins, wodurch dessen Funktion als der ersten in Pflanzen klonierten Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase bestätigt wird, In 7c enthält die Kontrollreaktion (Tafeln der rechten Seite) YA5-Lysat + Kontroll E. coli-Lysat ohne PDH-E1α/E1β-Substrat. Es gibt keinen Beweis der Phosphorylierung des E1α/E1β-Substrats. In 7d enthält die Kontrollreaktion (Tafel der rechten Seite) Kontroll-E. coli-Lysat (ohne YA5-Insert) + das E1α/E1β-PDH-Komplexsubstrat. Es gibt auch keinen Hinweis auf die Phosphorylierung des E1α/E1β-Komplexes in dieser Kontrolle.
Synthese von YA5-Pflanzen-Transformations-Konstrukten:
Antisense YA5 (Antisense-PDHK)-Konstrukt für die konstitutive Expression:
Die YA5-cDNA enthält interne BamHI (nt 628) und Ncol (nt 1176) Restriktionsschnittstellen. Das BamHI- und NcoI-Fragment wurde von YASF befreit und in die entsprechende Schnittstelle in pBI524 (Datla et al., 1993) in Antisense-Orientierung kloniert und lokalisierte zwischen dem Tandem-Blumenkohl-Mosaik-Virus 35S-Promotor und den Nopalin-Synthase-Terminator. Die YA5-Antisense-Kassette wurde dann aus pBI524 mittels HindIII und EcoRI ausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen des Vektors pRD400 (Datla et al., 1992) kloniert. Der abschließende binäre Antisense-Vektor pAsYA5/pRD400 (von dem eine Probe am 18. Dezember 1997 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection (ATCC) in 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA unter der Zugangsnummer ATCC 209561 hinterlegt wurde) wurde in das Agrobacterium tumefasciens Stamm GV3101 (der das Helferplasmid pMP90 trägt; Koncz und Schell, 1986) mittels Elektroporation eingeführt.
Antisense und partielle Sense YA5(PDHK)-Konstrukte für Samen-spezifische Expression:
Ein 875bp Fragment der YA5-cDNA wurde mittels eines BamHI (Pharmacia)-Verdaus ausgeschnitten und das Fragment wurde in den Vektor pdH1 ligiert, welcher den Samen-spezifischen Napin-Promotor (pDH1 wurde freundlicherweise von Dr. P. S. Covello, NRC/PBI bereitgestellt) enthält. Die Kassette und das Insert (in entweder Sense- oder Antisense-Orientierung) wurden durch partiellen Verdau mit HindIII und EcoRI ausgeschnitten und die DNA-Fragmente wurde auf Agarose-Gelen getrennt und unter Verwendung des Geneclean-II-Kit (Bio 101 Inc.) gereinigt. Die Fragmente wurden dann in HindIII/EcoRI-verdautem pRD400 ligiert. Die endgültigen binären Vektoren pNAsYAS/pRD400 (Antisense-Konstrukt) oder pNSYAS/pRD400 (partielles Sense-Konstrukt) wurden in Agrobacterium tumefasciens Stamm GV3101 (der das Helfer-Plasmid pMP90 trägt; Koncz und Schell, 1986) mittels Elektroporation eingeführt.
Konstitutive Expression von Antisense YA5 (Antisense-PDHK)-Gen in Arabidopsis thaliana:
Agrobacterium enthaltend das pAsYA5/pRD400 wurde zum Transformieren von Arabidopsis mittels Vakuum-Infiltration eingesetzt (Bechtold et al., 1993). Zusätzlich wird es den Fachleuten bewusst sein, dass die Transformation von Arabidopsis auch durch Wundeninokulation (Katavic et al., 1994) erreicht werden kann. In ähnlicher Weise wird ein Fachmann sich sicherlich bewusst sein, dass die Transformation von anderen Pflanzenspezies durch Einsatz von Agrobacterium Ti-Plasmid-vermittelter Transformation (z. B. Hypokotylen (DeBlock et al., 1989) oder von Kotyledonenblattstiel-Verfahren (Moloney et al., 1989) Wundinfektion), von Teilchenbombardementverfahren/biolistische Verfahren (Sanford et al., 1987; Nehra et al., 1994; Becker et al., 1994) oder von Polyethylenglykol-unterstützten Protoplasten-Transformations-Verfahren (Rhodes et al., 1988; Shimamoto et al., 1989) möglich ist. Die Konstrukte können durch konstitutive oder Gewebs-spezifische (z. B. Samen, Wurzel etc.) Promotoren gesteuert sein, wie es den Fachleuten auch bewusst sein wird.
Als Kontrollen waren die Pflanzen entweder nicht transformiert (nt), oder mit pBI121-Vektor allein transformiert (Jefferson et al., 1987; ohne Antisense-PDHK-Insert, aber enthaltend den Kanamycin-Selektionsmarker und das β-Glucuronidase-Reportergen). Die Kontroll- und transgenen Pflanzen wurden bei gleicher Zeit und unter identischen Bedingungen in Aufzuchtkammern, wie von Katavic et al., 1995, beschrieben, aufgezogen.
Die Ergebnisse der DNA-Gel-Blot (Southern, 1975)-Analysen bestätigten, dass alle Antisense-PDHK-transgenen Linien (bezeichnet als YA5-Linien 23, 31, 32, 52, 95, 104) mindestens ein Insert pro Genom des PDHK-Gens in Antisense-Orientierung enthalten. Die nicht-transformierte Wildtyp-Kontrolle und die pBI121 (Nur-Plasmid)-transgenen Kontrollen haben wie erwartet nur ein Insert pro Genom, was mit der ursprünglichen Southern-Analyse (siehe 5) übereinstimmt.
Analyse der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH)-Aktivität in Mitochondrien, die aus A. thaliana
Antisense PDHK-transgenen Pflanzen isoliert wurden
Schotengewebe wurde aus A. thaliana-transgenen Pflanzen, die das Antisense-PDHK-Konstrukt enthielten, und aus nicht-transformierten Kontrollpflanzen gesammelt, und es wurden intakte Mitochondrien isoliert. Die Pyruvat-Dehydrogenase (PDH)-Aktivität wurde mittels des Verfahrens von Reid et al., (1997) bestimmt. Wie in 8 gezeigt, war die PDH-Aktivität in Mitochondrien, die aus Blättern von Antisense-PDHK-transgenen Pflanzen isoliert wurden, verglichen mit der PDH-Aktivität in Mitochondrien, die aus nicht-transformierten Kontrollen isoliert wurden, um 20 bis 350% erhöht.
Analyse der Krebszyklus-Enzymaktivitäten in Mitochondrien, die aus A. thaliana Antisense-PDHK-transgenen Pflanzen isoliert wurden
Die Aktivitäten der Krebszyklus-Enzyme Citrat-Synthase, Fumarase und Succinat-Dehydrogenase fielen in Mitochondrien, die aus Blättern von Antisense-PDHK-transgenen Pflanzen isoliert wurden, signifkant erhöht aus, verglichen mit den entsprechenden Aktivitäten in Mitochondrien, die aus nicht-transformierten Wildtyp (n-WT)-Kontrollen isoliert wurden. Die Citrat-Synthase-Aktivitäten waren ungefährt 160–240% höher (9), während Fumarase-Aktivitäten ungefähr 65–120 % höher und Succinase-Dehydrogenase-Aktivitäten ungefähr 10–65% höher in den Antisense-PDHK-Transgenen ausfielen, verglichen mit den entsprechenden n-WT-Aktivitätssätzen bei 100%. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Mitochondrienrespiration in den Antisense-PDHK-Taansgenen aufgrund einer erhöhten Verfügbarkeit von Acetyl-CoA, das durch verstärkte PDC-Aktivität erzeugt wird (aufgrund der Herunterregulation der Expression von PDHK, einem negativen Regulator von PDC), erhöht ist.
Analyse der Fettsäurezusammensetzung aufgrund des Ölgehalts und der durchschnittlichen Samengewichte in T₂-Samen aus A. thaliana Antisense-PDHK und pBI121-Kontroll-transgenen Pflanzen
Gereifte Schoten und Samen wurden aus Antisense-PDHK-Transformanden und anderen Kontrollen, entweder nicht-transformierte oder pBI121-Transformanden (ohne Antisense-PDHK, aber mit einem Kanamycin-Resistenz-Gen) isoliert und es wurden die entsprechenden Ölgehalte, Fettsäurezusammensetzungen des Samenöls, durchschnittliche Samengewichte und Anzahl von Schoten pro 15 cm Segment des Stamms bestimmt.
Wie in 10 gezeigt, war der Gesamt-Ölgehalt in den Antisense-PDHK-Transformanden, ausgedrückt als μg Gesamt-Fettsäuren/100 Samen, um 8,5–26,5% und um 15,4–34,6% signifikant erhöht, verglichen mit pBI121-Transformanden bzw. nicht-transformierten Kontrollen. Dies wies darauf hin, dass der Gesamtfluss von Acetylresten zu den Samenspeicher-Lipiden durch einen größeren Beitrag von Mitochondrien-erzeugtem Acetat verstärkt war. Letzterer wurde durch erhöhte Mitochondrien-PDH-Aktivität aufgrund der Herunterregulation des negativen Regulators PDHK in den Antisense-PDHK-Transformanden ermöglicht.
Tabelle 1 zeigt den Ölgehalt und das durchschnittliche Gewicht der Samen, die aus A. thaliana-Linien isoliert wurden und die mit einem konstitutiv exprimierten Antisense-PDHK-Konstrukt transformiert wurden, verglichen mit Samen von Nur-Plasmid (pBI121)-Transformanden und nicht-transformierten Kontrollen. Sowohl die Ölmenge als auch das durchschnittliche Samengewicht sind in den Antisense-PDHK-Transformanden höher.
Tabelle 1
Durchschnittlicher Samenölgehalt und Samengewicht in nicht-transformierten Kontrollen und T₂-Samen von pBI121-Kontrolle und Antisense YA5 (A/S PDHK)-transgenen Pflanzen.
Die durchschnittliche Zahl der Schoten pro 15 cm Segment des geschossenen Stamms (engl. bolted stem) war in den A. thaliana-Linien, die mit einem konstitutiv exprimierten Antisense-PDHK-Konstrukt transformiert waren (bezeichnet als YA5-Linien), im Vergleich zu Nur-Plasmid (pBI121)-Transformanden und nicht-transformierten Kontrollpflanzen nicht signifikant beeinträchtigt. Im Anschluss an die Vermehrung der T₂-Generation der Samen, produzierten nicht-transformierte Wildtyp und pBI121-Kontrolltransgene A. thaliana-Pflanzen 30 ± 3 Schoten bzw. 31 ± 4 Schoten pro 15 cm Segment des geschossenen Stamms. Die Antisense-PDHK-transgenen YA5-Linien 31, 32, 52, 95 und 104 produzierten 26 ± 3, 27 ± 3, 27 ± 3, 26 ± 3 bzw. 24 ± 3 Schoten pro 15 cm Segment des geschossenen Stamms. Die durchschnittliche Zahl der T₃-Samen pro Schote war auch nicht signifikant beeinträchtigt. Zum Beispiel produzierten pBI121-Kontrolltransformanden 49,4 ± 6,6 T₃-Samen pro Schote und die Antisense-PDHK-Linie YA5 95 Produzierte 50,1 ± 8,5 T₃ Samen pro Schote (n = 5 – 6 reife Schoten gesammelt von vier einzelnen transgenen Pflanzen pro Linie). Dies zeigte, dass der Samenertrag (Ernteindex) in den Antisense-PDHK-Transformanden nicht negativ beeinträchtigt war.
Tabelle 2 zeigt die Fettsäurezusammensetzung der Samenöle, die aus A. thaliana-Linien, die mit einem konstitutiv exprimierten Antisense-PDHK-Konstrukt transformiert wurden, im Vergleich zu Öl aus Samen mit Nur-Plasmid (pBI121)-Transformanden und nicht-transformierten Kontrollen. Die Antisense-PDHK-Konstrukte beeinträchtigen einen Zeitpunkt, der sehr früh in dem Fettsäure-Biosynthese-/Lipid-Biozusammensetzungsweg (engt. lipid bioassembly pathway) liegt, d. h., es ermöglicht eine größere Verfügbarkeit von Acetylresten zur Plastiden-Fettsäurebiosynthese. Während der Gesamt-Kohlenstofffluss über den Lipidweg zu Speicherlipiden in Samen der Antisense-PDHK-transgenen Pflanzen verstärkt war, war die Fettacyl-Zusammensetzung der Öle, die sich akkumulierten, nicht merkbar verändert (Tabelle 2).
Analyse der Blütezeiten von A. thaliana Antisense-PDHK und p8I121-Kontroll-transgenen Pflanzen
Die Antisense-PDHK-transgenen Pflanzen zeigten einen signifikanten früheren Übergang von der vegetativen in die generative Phase des Wachstums, d. h. frühere Einleitung der generativen (Blütenentfaltungs-) Phase (aufgezeichnet durch Überwachen der Zeit als Tage nach dem Pflanzen: d.a.p.) verglichen mit nicht-transformierten Wildtyp und pBI121-Nur-Plasmid-Kontrollen. Wie in 11 gezeigt, blühten 30–50% der Antisense-PDHK-Transgenen schon 31 d.a.p. verglichen mit nur 1–4% der Kontrollen. Dieser frühe Blütenentfaltungsphänotyp fiel noch dramatischer aus bei 34 d.a.p., bei dem 50–75% der Antisense-PDHK-Pflanzen in der generativen Phase waren , verglichen mit nur 4–8% der Kontrollpflanzen. Die meisten der Antisense-PDHK-Pflanzen blühten vollständig (90% oder mehr der Blüteninitiation) bei 39 d.a.p., aber die nicht-transformierten Kontrollpflanzen und die pBI121-Nur-Plasmid-Kontrollpflanzen erreichten dieses Stadium nicht vor 46 d.a.p.
Die Zeit zum Erreichen der Reife fiel in den Antisense-PDHK-A. thaliana-Transgenen ebenfalls kürzer aus. Zum Beispiel hatten bei 68 Tagen nach dem Pflanzen alle Antisense-PDHK-transgenen Linien vollständig entwickelte Schoten, mehr als die Hälfte davon waren braun gefärbt und reif. Die wenigen Blüten, die übrig blieben, alterten zu dieser Zeit. Im Gegensatz dazu zeigten die nicht-transformierten Wildtyp-Kontrollpflanzen und die pBI121-Kontroll-Transformanden immer noch signifikante Blütenentwicklung, vorwiegend grüne unreife Schoten und nur einige wenige Schoten, die zu dieser Zeit braun und reif waren. Unter den Aufzuchtbedingungen, die von den Erfindern eingesetzt wurden, betrug der Unterschied der Reifezeit ungefähr 68–70 Tage für die Antisense-PDHK-transgenen Linien, verglichen mit ungefähr 57–77 Tagen für die Kontrollpflanzen. Angesichts der Tatsache, dass die Generationszeit in Arabidopsis-Kontrollpflanzen den von den Erfindern eingesetzten Aufzuchtbedingungen bei ungefähr 75 Tagen unter liegt, stellt ein 5–8 Tage früherer Blütenentfaltungs- und früherer Reifungs-Phänotyp bei den Antisense-PDHK-Pflanzen eine Verkürzung der Generationszeit um ungefähr 10 dar. Ähnliche Veränderungen der Blütezeit zum Ausdehnen der geographischen Reichweite der Kultivierung sind ein wichtiges Ziel für Brassica-Nutzpflanzen (Lagercrantz et al., 1996). In verwandten Brassicaceae (z. B. Canola) würde dieser Vorteil eine frühere Ernte erlauben (z. B. in den kanadischen Prärien) und würde eine noch nördlichere Kultivierung erlauben (Murphy und Scarth, 1994). Frostschäden zu später Saison in gemäßigten Klimata könnten durch frühere Reifung vermieden werden, und dies könnte ferner die mit dem Abbau von Chlorophyll aus dem reifen Samen in der Spätsaison assoziierten Probleme signifikant mildern (welche zu „grünem Öl" während der Verarbeitung führen können und teure Bleichungsschritte erforderlich machen).
Die Daten der Erfinder zeigen, dass erhöhte Atmung den Übergang von der vegetativen in die generative Phase des Pflanzenwachstums beschleunigen kann. Es ist interessant festzustellen, dass der gegenteilige Effekt, d. h. eine Verzögerung der Blütezeit, in transgenen Pflanzen beobachtet wurde, bei denen die Citrat-Synthase durch Antisense-Technologien herunterreguliert wurde, was zu einer verminderten Atmungsrate im vegetativen Gewebe führte (Landschütze et al., 1995). Daher kann die Blütezeit durch erhöhte Atmung beschleunigt werden und durch verminderte Atmung verzögert werden.
Analyse des vegetativen Wachstums von A. thaliana Antisense-PDHK und pBI121-Kontroll-transgenen Pflanzen
Der früh blühende Phänotyp der Antisense-PDHK-Transgenen wurde mit einem veränderten Muster vegetativen Wachstums korreliert. Eine verminderte Akkumulation vegetativer Sprossgewebemasse (12) korrelierte mit einer verminderten Anzahl von Rosettenblättern, die in den Antisense-PDHK-Transgenen zu der Zeit produziert wurden, bei der die Pflanzen zu der generativen (Blüteninitiations-) Phase des Wachstums wechselten (13).
Zusammenfassend zeigen A. thaliana-Linien, die mit einem konstituv exprimierenden Antisense-PDHK-Konstrukt (als YA5-Linien bezeichnet) transformiert wurden sowohl verändertes vegetatives Wachstum als auch frühe Blütenentfaltungs-Phänotypen, verglichen mit nicht-transformierten Kontrollen oder Transformanden, die nur das selektierbare Markierungsgen (transformiert mit pBI121) enthielten, aber ohne Antisense-PDHK. Der Unterschied bezüglich des veränderten vegetativen Wachstumsmuster-Phänotyps der Antisense-PDHK (YA5)-Transgenen (kleinere Pflänzchen mit weniger Rosettenblättern, verglichen mit n-WT und pBI121-Kontrollen) war ungefährt 3,5 Wochen nach dem Pflanzen klar ersichtlich und ungefähr eine Woche später noch offensichtlicher (30–31 Tage nach dem Pflanzen). Ungefähr 31 Tage nach dem Pflanzen war der Frühblütenentfaltungs-Phänotyp auch in YA5-Antisense-PDHK-transgenen Linien ersichtlich.
Viele der Pflanzen begannen zu schießen oder sichtbare Blütenmeristeme (Blütenknospen)-Initiation zu zeigen, während es keinen Beleg solcher Entwicklung in den n-WT und pBI121-Kontrollen gab. 40 bis 42 Tage nach dem Pflanzen war der Frühblütenentfaltungs-Phänotyp der YA5-Antisense-PDHK-transgenen Linien sehr offensichtlich, wobei die meisten oder alle Transgenen vollständig geschossen waren mit offenen Blüten, während die n-WT und pBI121-Kontrollen eine sehr viel geringere Frequenz des Schießens zeigen.
Während die Blütenentfaltungs- und Generationszeit in den YA5-Linien verkürzt ausfiel, war die durchschnittliche Anzahl der Schoten, das Samengewicht und der Ölgehalt nicht negativ beeinträchtigt. Vielmehr waren sowohl das durchschnittliche Samengewicht als auch der Fettsäure-/Ölgehalt pro Samen in den YA5-Linien verstärkt, wie in Tabelle 1 und 10 gezeigt.
EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Allgemeine molekularbiologische Techniken:
Die Isolation von Plasmid-DNA, Restriktionsverdaus, Modifikation und Ligation von DNA, PCR, Agarose und Polyacrylgelelektrophorese, Transformation und Kultur von E. coli-Stämmen, DNA-Gel-Blot-Analysen (Southern, 1975) und RNA-Gel-Blot-Analysen wurden nach Standardverfahren, wie von Sambrook et al., (1989) beschrieben durchgeführt.
Das Klonieren von YA5:
Eine Arabidopsis thaliana (Ökotyp Columbia) λ YES cDNA-Expressions-Bibliothek (Elledge et al., 1991) wurde von Dr. Ronald Davis (Fakultät für Biochemie, Stanford University School of Medicine, Stanford CA 94305) erhalten. Plasmide wurden mittels automatischer Subklonierungsverfahren, wie von Elledge et al. (1991) beschrieben, erzeugt. Eine mutmaßliche Escherichia coli-Lyso-Phosphatidinsäureacyltransferase (LPAT, EC 2.3.1.51)-Mutante, JC201 (Coleman 1990) wurde von Dr. Jack Coleman (Fakultät für Biochemie und Molekularbiologie, Louisiana State University Medical Center, New Orleans, LA 70112) erhalten. JC201 wurde mit den Plasmiden transformiert, die aus der λ YES-Bibliothek erzeugt wurden und bei der nicht-permissiven Temperatur von 44°C (Coleman, 1992) selektiert wurden. Die YA5-cDNA aus den Temperatur-insensitiven Transformanden wurde mit einem Applied Biosystems Model 373A DNA Sequencing System unter Verwendung des Taq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc.) sequenziert. Die Nukleotid- und die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen des Klons YA5 wurden unter Verwendung des FASTA-Programms (Pearson und Lipman, 1988) mit Sequenzen verglichen, die in Datenbanken erhältlich waren.
Die Expression des YA5-Proteins in E. coli:
Die YA5-Volllängen-cDNA (YA5F) wurde in pBluescript SK (+/-) in 5'- nach 3'-Orientierung von T7-T3 kloniert. Es wurde ein Primer synthetisiert, der die mutmaßliche translationale Initiationsstelle OMpdk (AGGAGAGACTCGAGGCTTATGGCAGTGAAG) [SEQ ID NO: 6] einschließt, um eine XhoI-Restriktionsschnittstelle einzuschließen. Der Primer OMpdk und ein T3-Primer wurden in einer PCR-Reaktion zur Amplifikation der YA5-kodierenden Region aus YA5F verwendet. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit HindIII (HindIII-Schnittstelle ist 3' von dem Stopkodon vorhanden) und XhoI verdaut und in einen pTrcHisB-Vektor (Clontech) zur Erzeugung des Konstruktes pZTa5 kloniert. Die SDS-PAGE-Analyse mit Lysaten von IPTG-induzierten E. coli-enthaltendendem pZTa5- und der pTrcHisB-Kontrollvektor bestätigte, dass ein neues Protein von ungefähr 45 kDa synthetisiert worden war.
Protein-Kinase-Test mit YA5-exprimierendem E. coli-Lysat:
Die Proteinkinase-Aktivität des von E. coli exprimierten YA5-Proteins wurde im Wesentlichen bestimmt wie beschrieben (Liu et al., 1995). Die Proteinphosphorylierungs-Substrate, Humane E₁α- und E₁β-Untereinheiten, die in E. coli M15 koexprimiert und daraus gereinigt wurden, wurden von Dr. Mulchand S. Patel der Fakultät für Biochemie, School of Medicine and Biomedical Sciences, State University of New York at Buffalo, Buffalo, New York, erhalten. Dieses koexprimierte E₁α- und E₁β-System wurde vielfach in der Studie zur Regulation von PDC E₁-Phosphorylierung in Säugetier-Systemen verwendet (Korotchkina und Patel, 1995). Für Phosphorylierungsexperimente wurden 20–25 μg E₁α/β mit ungefähr 10 μg YA5-akkumulierenden E. coli-Zytosolprotein in einem Gesamtvolulmen von 100 μl enthaltend 20 μM Kaliumphosphat, pH 7,0, 1 mM Magnesiumchlorid, 2 mM Dithiothreitol, 0. MM EDTA und 200 μM kaltes ATP kombiniert. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten präinkubiert und dann wurden 5 μCi ³²P-γ-ATP zum Starten des Tests zugesetzt. Bei 2, 5, 10, 15 und 20 Minuten nach Starten des Tests wurden 20 μl Aliquots von dem Reaktionsgemisch abgezogen und die Reaktion wurde mit 20 μl SDS-denaturierendem Gemisch gestoppt. Die Proben wurden auf 10% SDS-PAGE aufgetrennt und autoradiographiert, um ³²P-markierte Proteine zu zeigen.
Die Konstruktion des YA5-Antisense-Pflanzentransformationsvektors zurkonstitutiven Expression:
Die YA5-cDNA enthält interne BamHI (nt628) und NcoI (nt1176) Restriktionsschnittstellen. Das BamHI- und NcoI-Fragment wurde von YA5 befreit und in die entsprechenden Schnittstellen in pBI524 (Datla et al., 1993) in Antisense-Orientierung unter Kontrolle des Tandem 35S-Promotors kloniert. Die YA5-Antisense-Kassette wurde dann aus pBI524 mittels HindIII und EcoRI ausgeschnitten und in den Pflanzentransformations-Vektor pRD400 kloniert (Datla et al., 1992).
Die Konstruktion von YA5-Antisense- und partiellen Sense-Pflanzentransformations-Vektoren für Samen-spezifische Expression
Die YA5-Volllängen cDNA (YASF; 1,5 kb) wurde in pBluescript SK (+/-)-Plasmid (Stratagene) in 5'- nach 3'-Orientierung des T7-T3 kloniert. Ein 875 bp-Fragment wurde mittels BamHI (Pharmacia)-Verdau ausgeschnitten und in das Plasmid pDH1, das vorher mit BamHI geschnitten und dephosphoryliert worden war (behandelt mit 1/10 Einheit Kälberieingeweide-Alkalische Phosphatase für 1 Stunde bei 37°C), ligiert. Das Plasmid pDH1 (von Dr. P. Covello PBI/NRC bereitgestellt) ist das Plasmid PE35SNT, das so manipuliert wurde, dass der konstitutive Tandem-35S-Promotor ausgeschnitten war und durch den Samen-spezifischen Napin-Promotor, der aus dem Plasmid pUC19 erhalten wurde, ersetzt wurde. Die Ligationen wurden bei 4–12°C über Nacht in einem Wasserbad gemäß den Instruktionen, die von dem Hersteller bereitgestellt wurden, durchgeführt. Kompetente E. coli-Zellen (DH5α, Gibco BRL) wurden mittels des Heat-Shock-Verfahrens mit 50–100 ng der transformierenden DNA transformiert, auf einem selektiven Medium ausplattiert (LB mit 50 μg/ml Ampicillin) und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Bluescript-Plasmid-DNA (10 ng) wurde als positive Kontrolle für die Transformation verwendet. Einzelne transformierte Zellen wurden über Nacht (37°C, 225 U.p.m.) in 5 ml LB mit 50 μg/ml Ampicillin kultiviert. DNA-Extraktion und -reinigung wurden mit einem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) durchgeführt. Die Restriktionsverdaue wurden mit HindIII durchgeführt, um das Vorhandensein und die Orientierung der Inserts in dem Plasmid zu überprüfen. Im Falle, dass das YA5-Insert in Antisense-Orientierung vorlag, wurden zwei Fragmente von ungefähr 1,0 und 1,4 Kb erhalten, während ein YA5-Insert, das in Sense-Orientierung vorlag, zwei Fragmente von ungefähr 1,8 und 0,6 Kb ergab. Die Kassette und das Insert (entweder in Sense- oder in Antisense-Orientierung) wurden mittels eines partiellen Doppelverdaus mit HindIII und EcoRI ausgeschnitten (1 Einheit/20 μl Reaktion für 10 min bei 37°C). Die DNA-Fragmente, die der Kassette entweder mit dem Sense- oder dem Antisense-Insert entsprachen, wurden auf einem Agarosegel unter Verwendung eines Geneclean-II-Kits (Bio 101, Inc.) gereinigt und an ein HindIII/EcoRI-verdautes pRD400-Plasmid ligiert. Die besten Ligationsergebnisse wurden mit einem 1 : 10 Plasmid zu Insertverhältnis in einem 10 μl Reaktionsvolumen unter Verwendung von 1 μl T4-Ligase und Puffer (New England Biolabs) bei 4°C über Nacht erhalten. Das Reaktionsgemisch wurde auf 45 °C für 5 min erhitzt und vor Zugabe der Ligase eisgekühlt. Am folgenden Tag wurden 1 μl T4-Ligase zugesetzt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für weitere 3 –4 Stunden stehen gelassen. Die Identität eines jeden Konstrukts wurde durch DNA-Sequenzierung vor der Pflanzentransformation erneut überprüft.
Transformation von Arabidopsis thaliana:
Das Transformationsprotokoll, das von Bechtold et al., (1993) beschrieben wurde, wurde angepasst. Pflanzen des Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia wurden in feuchter Erde bei einer Dichte von 10–12 Pflanzen pro Topf aufgezogen, in 4-Quadrat-Inch-Töpfen, und mit einem Nylonschirm bedeckt und mit einem elastischen Band am Platz fixiert. Sobald die Pflanzen das Stadium erreicht hatten, bei dem die Sprossen gerade erschienen, wurden die Pflanzen gegossen, die Sprossen und einige der Blätter abgeschnitten und die Agrobacterium-Suspension wurde, wie weiter oben beschrieben, auf den Pflanzen einsickern gelassen.
Um das Agrobacterium zu züchten, wurde ein 25 ml-Suspension in LB-Medium, enthaltend Kanamycin, bei einer Konzentration von 50 μg/ml für 2 bis 3 Tage vor der Zeit kultiviert. Am Tag vor der Einsickerung (engl. infiltration) wurde diese „Impf-Kultur" zu 400 ml LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, zugesetzt. Sobald die Absorption bei 600 nm > 2,0 war, wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet (5.000 × g, 10 min in einem GSA-Rotor bei Raumtemperatur) und in 3 Volumina des Einsickerungsmediums (1/2 × Murashige und Skoog-Salzen, 1 × B5 Vitamine, 5,0% Saccharose, 0,044 μM Benzylaminpurin) zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,8 suspendiert. Die Agrobacterium-Suspension wurde dann in ein Becherglas geschüttet und die eingetopften Pflanzen wurden umgedreht in das Becherglas gesetzt, so dass die Sprossen und die ganzen Rosetten untergetaucht waren. Das Becherglas wurde dann in ein großes glockenförmiges Gefäß (engt. Bell jar) platziert und es wurde unter Verwendung einer Vakuumpumpe ein Vakuum angelegt, bis sich auf den Blättern und auf den Stammoberflächen Blasen bildeten und die Lösung ein bisschen Blasen zu bilden begann und dann wurde das Vakuum schnell abgelassen [Anmerkung: Die notwendige Zeit und der Druck wird von einem Labor-Aufbau zum nächsten variieren, doch ist gutes Einsickern offensichtlich erkennbar anhand des einheitlich verdunkelten Wasser-aufgesaugt habenden Gewebes.] Die Töpfe wurden aus dem Becherglas entfernt in einem Plastiktablett auf ihre Seiten gelegt und mit einer Plastikglocke zur Erhaltung der Feuchtigkeit bedeckt.
Am folgenden Tag wurden die Pflanzen aufgedeckt, aufrecht hingestellt und sie wurden für ungefähr 4 Wochen in einer Aufzuchtkammer unter kontinuierlichen Lichtbedingungen, wie von Katavic et al., (1995) beschrieben, wachsen gelassen. Als die Schoten reif und trocken waren, wurden die Samen geerntet und auf positive Transformanden hin selektiert.
Die Selektion von mutmaßlichen Transformanden (Transgene Pflanzen) und Aufzucht und Analyse der transgenen Pflanzen:
Die aus den Vakuum-Einsickerungs-Transformations-Experimenten geernteten Samen wurden durch Behandlung für 1 Minute in Ethanol und darauf folgenden 5 Minuten in 50% Bleiche/0,05% Tween 20^TM in sterilem destilliertem Wasser sterilisiert. Dann wurden die Samen einige Male mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Die Samen wurden plattiert, indem sie in steriler 0,1% Agarose bei Raumtemperatur (ungefähr 1 ml Agarose für je 500–1.000 Samen) resuspendiert wurden und dann ein ungefähr 2.000–4.000 Samen entsprechendes Volumen auf 150 × 15 mm Selektionsplatten aufgebracht wurde (1/2 × Murashige und Skoog-Salze, 0,8% Agar, Autoklavieren, Kühlen und Zusetzen von 1 × B5-Vitaminen und Kanamycin zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml). Die Platten wurden in einer Laminarfluss-Haube getrocknet, bis die Samen nicht mehr trieben, wenn die Platten angetippt werden. Die Platten wurden dann für 2 Nächte bei 4°C im Dunkeln vernalisiert und dann in eine Aufzuchtkammer umgesetzt (Bedingungen wie von Katavic et al., 1995, beschrieben). Nach 7–10 Tagen waren die Transformanden als dunkelgrüne Pflanzen mit gesunden grünen Sekundärblättern und Wurzeln, die sich über und in das Selektionsmedium erstreckten, identifizierbar.
Die Keimlinge wurden in Erde transplantiert und die Pflanzen wurden bis zur Reife wachsen gelassen (T₂-Generation, wie in Katavic et al., 1994, definiert) und reife Samen gesammelt und analysiert. T₂-Samen wurden fortgepflanzt. Die vegetativen Wachstumsmuster wurden durch Messen der Sprossgewebe-Trockengewichte und/oder durch Zählen der Zahl der Rosettenblätter, die zum Zeitpunkt, an dem die Pflanzen begannen in das generative (Blütenentfaltungs-) Stadium einzutreten, überprüft. Die Blütenentfaltung (Beginn der generativen Phase des Wachstums) wurde analysiert durch tägliche Aufnahme der Prozentzahl der Pflanzen, bei denen eine Blütenknospe erstmals erschien und/oder der Prozentzahl der Pflanzen, die schossen (wie von Zhang et al. 1997 beschrieben). Die Daten wurden als Prozentzahl der blühenden Pflanzen/schießenden Pflanzen an einem gegebenen Tag nach dem Pflanzen (d.a.p.) ausgedrückt.
Zubereitung von Mitochondrien aus A. thaliana nicht-transformierten Kontroll- und Anti-YA5-transgenen Pflanzen
Alle Extraktionen wurden bei 4°C durchgeführt. Eine angereicherte Mitochondrien-Fraktion wurde nach einem Verfahren zubereitet, das von dem von Ap Rees et al., (1993) abgewandelt wurde. Ungefähr 30 g frisch geerntete Sprossen wurden unter Verwendung eines gekühlten Waring Bleder in 4 Volumina Extraktionspuffer homogenisiert (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 300 mM Mannitol, 5 mM EDTA, 0,1% Rinderserumalbumin, 1% PVPP (Polyvinylpolypyrrolidon) und 9 mM 2-Mercaptoethanol. Das Homogenisat wurde durch vier Schichten Käsestoff (engt. cheesecloth) und eine Schicht Miracloth gefiltert und bei 2.000 × g für 10 min zentrifugiert. Das Sediment wurde verworfen und der Überstand bei 10.000 × g für 30 min zentrifugiert. Das Sediment wurde in Extraktionspuffer minus PVPP resuspendiert und als „angereicherte" Mitochondrien-Präparation eingesetzt. Für die Succinat-Dehydrogenase-Aktivitätsmessungen wurde diese Präparation direkt eingesetzt. Für Messungen der PDC, Fumarase und Citrat-Synthase wurden die frisch zubereiteten Mitochondrien zuerst in Gegenwart von 0,1% (v/v) Triton X-100 zur Freisetzung der Mitochondrien-Enzyme lysiert. Das Triton-Lysat wurde durch Zentrifugation bei 27.000 × g aufgeklart und der Überstand enthaltend die gelösten Enzyme wurde mit einem Centricon-30-Filterkonzentrator (Amicon) konzentriert. Das resultierende Konzentrat wurde als Enzymquelle in einem PDC-Test eingesetzt. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels des Verfahrens von Bradford (1976) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard und nach Normalisierung vor dem Test bestimmt.
Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex-Test:
Zur Bestimmung der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH)-Komplex-Aktivität, die in Mitochondrien-Proteinpräparationen vorhanden ist, wurde das Verfahren von Reid et al., (1977) angepasst. Das Test-Gemisch bestand aus 0,1 mM TPP, 5 mM MgCl₂, 1,5 mM NAD⁺, 0,1 mM Coenzym A, 3,0 mM Cystein-HC und 1,5 mM Pyruvat in 100 mM Tricin pH 8,0 in einem Endvolumen von 2 ml. Die Reaktionen wurden durch Zusetzen von Mitochondrienlysatkonzentrat eingeleitet. Kontrollreaktionen enthielten alle Komponenten außer Pyruvat. Das Reaktionsgemisch wurde bei 30°C inkubiert und die Bildung von NADH wurde bei einer Wellenlänge von 340 nm in 15-Sekunden-Intervallen für 3 Minuten unter Verwendung eines Beckman DU74-Spektrophotometers überwacht.
Der Citrat-Synthase-Test:
Zur Messung der Citrat-Synthase-Aktivität, die in Mitochondrien-Proteinpräparationen vorhanden ist, wurde das Verfahren von Srere (1969) angepasst. Das Reaktionsgemisch enthielt 0,2 mM 5',5'-Dithiobis-2-nitrobenzolsäure (DTNB), 0,1 mM Acetyl-CoA, und Mitochondrien-Lysat-Protein, in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, in einem Endreaktionsvolumen von 2 ml, inkubiert bei 30°C. Die Absorption bei 412 nm wurde für 3 min verfolgt, um mögliche Acetyl-CoA-Deacylase-Aktivität zu messen. Die Citrat-Synthase-Reaktion wurde dann durch Zusetzen von 0,5 mM Oxalacetat (OAA) eingeleitet und die Freisetzung des Coenzyms A (CoASH), der SH-Gruppe, die mit dem DTNB (Ellman's Reagens) reagiert, wurde bei 412 nm überwacht. Das resultierende Mercaptid-Ion hat eine starke Absorption (E = 13.600) bei 412 nm. Die Kontrollreaktionen enthielten alle Komponenten außer OAA.
Der Fumarase-Test:
Die Fumarase-Aktivität, die in Mitochondrien-Proteinpräparationen vorhanden ist, wurde nach dem Verfahren von Hill und Bradshaw (1969) bestimmt. Das Reaktionsgemisch enthielt 25 mM Natriummalat und Mitochondrien-Lysat-Protein in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, bei einem Reaktions-Endvolumen von 1 ml. Die Reaktionen wurden bei 28°C inkubiert. Die Fumarase-Aktivität, die aus der Bildung von Fumarat gemessen wurde, wurde spektrophotometrisch durch Überwachen der Zunahme der Absorption bei 250 nm in 15-Sekunden-Intervallen für 2 Minuten überwacht.
Der Succinct-Dehydrogenase-Test:
Die Mitochondrien-Succinat-Dehydrogenase-Aktivität wurde unter Verwendung des Verfahrens von Veeger et al., (1969) gemessen. Das Reaktionsgemisch enthielt ein 1 mM KCN, 40 mM Succinat, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 3 mM K₃Fe(CN)₆, 0,1% Triton X-100 und unlysierte Mitochondrien in 100 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,5 in einem Reaktions-Endvolumen von 1 ml. Die Reaktionsgemische wurden bei 28°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von Mitochondrien in Sauerstoff-freiem Phosphatpuffer eingeleitet. Die Änderung der Absorption bei 455 nm wurde spektrophotometrisch in 20-Sekunden-Intervallen für 2 Minuten überwacht. Die Kontrollreaktionen enthielten alle Komponenten außer Succinat.
Die Samen-Lipid-Analysen der Samen aus A. thaliana-nicht-transformierten Kontroll- und Antisense-PDHK (AsYA5)-Transgenen:
Reife Schoten und T₂- oder T₃-Samen wurden aus Antisense-PDHK-Transformanden (bezeichnet als YA5-Linien) isoliert oder es wurden auch pBI121-Kontroll-Transformanden (ohne Antisense-PDHK aber mit einem Kanamycin-Resistenzgen) und Schoten und Samen aus nicht-transformierten Wildtyp-Kontrollpflanzen isoliert und ihre entsprechenden Samenöl-Gehalte, Fettsäurezusammensetzungen der Samenöle, durchschnittliche Samengewichte, Zahl der Schoten pro 15 cm Segment des schießenden Stamms und Zahl der Samen pro Schote wurden wie von Zou et al., (1997) beschrieben bestimmt. Alle Pflanzen wurden in der gleichen Aufzuchtkammer zur gleichen Zeit und unter identischen Licht- und Temperaturbedingungen, wie bereits beschrieben (Katavic et al., 1995; Zou et al., 1997), gezogen. Wegen der (des) extrem kleinen Samengröße und -gewichts wurden die Analysen mit 100–400 Samenreplikaten (engl. seed replicates), die unter einem Präpariermikroskop vorsichtig ausgezählt wurden, durchgeführt. Die Samenproben wurden unter Verwendung eines Polytrons in Chloroform : Isopropanol (2 : 1, [v/v]), enthaltend 0,2% w/v butyliertes Hydroxytoluen und Tripentadecanoin als internen Standard gemahlen. Alle weiteren Bedingungen der Isolation und Analyse des Samen-Gesamtfettsäuregehalts und der Fettsäurezusammensetzung (ausgedrückt in Gew.-% der Gesamt-Fettsäuren) wurden mittels Gaschromatographie, wie vorher detailliert ausgeführt, durchgeführt (Taylor et al., 1992b; Taylor et al., 1995; Katavic et al., 1995; Zou et al., 1997). Der Ölgehalt wurde entweder ausgedrückt als μg der Gesamtfettsäuren pro Probengröße (siehe 10) oder als mg Öl pro Probengröße (siehe Tabelle 1) und berechnet unter der Annahme, dass 3 Mol Fettsäuren auf 1 Mol Triacylglycerin (Öl) kommen, wie von Zou et al., (1997) beschrieben.
SEQUENZPROTOKOLL
FÜR DIE AKTUELLE ERFINDUNG RELEVANTE REFERENZEN:

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Claims

Isolierte und gereinigte Desoxyribonukleinsäure (DNA), dadurch gekennzeichnet, daß die DNA i) eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 (ATCC 209562), ii) einen Teil der Sequenz i) mit reduzierter Länge, der immer noch befähigt ist, als ein Genexpression-Inhibitor durch Verwendung in einer Antisense- oder Co-Suppressionsanwendung zu wirken, iii) eine Sequenz, welche ein Protein mit 50% oder mehr Aminosäureidentität gegenüber dem durch die SEQ ID Nr. 1 kodierten Protein kodiert, wobei die Identität über die vollständige Sequenz der Sequenz, welche ein Protein mit 50% oder mehr Aminosäureidentität gegenüber dem durch SEQ ID Nr. 1 kodierten Protein kodiert, gemessen wird, und wobei die Sequenz, welche ein Protein mit 50% oder mehr Aminosäureidentität gegenüber dem durch SEQ ID Nr. 1 kodierten Protein kodiert, immer noch befähig ist, als ein Genexpression-Inhibitor durch Verwendung in einer Antisense- oder Co-Suppressionsanwendung zu wirken, oder iv) einen Teil der Sequenz gemäß iii) mit reduzierter Länge, wobei der Teil mit reduzierter Länge ein Protein mit 50% oder mehr Aminosäureidentität gegenüber dem durch SEQ ID Nr. 1 kodierten Protein kodiert, wobei die Identität über die vollständige Sequenz der Sequenz, welche für ein Protein mit 50% oder mehr Aminosäureidentität gegenüber dem durch SEQ ID Nr. 1 kodierten Protein kodiert, gemessen wird, und der Teil der Sequenz gemäß iii) mit reduzierter Länge, welcher ein Protein mit 50% oder mehr Aminosäureidentität gegenüber dem durch SEQ ID Nr. 1 kodierten Protein kodiert, immer noch befähig ist, als ein Genexpression-Inhibitor durch Verwendung in einer Antisense- oder Co- Suppressionsanwendung zu wirken, einschließt.
Isolierte und gereinigte Desoxyribonukleinsäure (DNA), dadurch gekennzeichnet, daß die DNA für die Polypeptide gemäß SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 9 kodierende Nukleinsäuresequenzen einschließt und ein Pyruvat-Dehydrogenase-Kinaseprotein kodiert.
Vektor zur Transformation von Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor die Desoxyribonukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 enthält.
Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz in dem Vektor in einer Antisense-Orientierung vorliegt.
Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz in dem Vektor in einer Sense-Orientierung vorliegt.
Plasmid pYA5(ATCC 209562).
Plasmid pAsYA5(ATCC 209561).
Pflanze mit einem Genom, dadurch gekennzeichnet, daß das Genom eine eingeführte Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 enthält.
Pflanzensamen mit einem Genom, dadurch gekennzeichnet, daß das Genom eine eingeführte Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 enthält.
Genetisch transformierte Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß das Genom durch einen Vektor nach Anspruch 3 transformiert worden ist.
Genetisch transformierter Pflanzensamen, dadurch gekennzeichnet, daß der Samen durch einen Vektor nach Anspruch 3 transformiert worden ist.
Pflanze nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen einer veränderten Atmungsrate verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps.
Pflanzensamen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Samen eine Pflanze erzeugt, welche eine veränderte Atmungsrate verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps aufweist.
Pflanze nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen eines veränderten Samenölgehalts verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps.
Pflanzensamen nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch das Aufweisen eines veränderten Samenölgehalts verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanzensamen desselben Genotyps.
Pflanze nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen einer veränderten Blühzeit verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps.
Pflanzensamen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Samen eine Pflanze erzeugt, welche eine veränderte Blühzeit verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps aufweist.
Pflanze nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen einer erhöhte Resistenz gegen kalte Temperaturen verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps.
Pflanzensamen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Samen eine Pflanze erzeugt, welche eine erhöhte Resistenz gegen kalte Tem peraturen verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps aufweist.
Pflanze nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen einer erhöhten Biomasse verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps.
Pflanzensamen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Samen eine Pflanze erzeugt, welche eine erhöhte Biomasse verglichen. mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps aufweist.
Pflanze nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen einer erhöhten Kapazität zur Ansammlung von Biopolymeren verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps.
Pflanzensamen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Samen eine Pflanze erzeugt, welche eine erhöhte Kapazität zur Ansammlung von Biopolymeren verglichen mit einer genomisch unveränderten Pflanze desselben Genotyps aufweist.
Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen durch Einführen einer Nukleotidsequenz in ein Genom der Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz eine Sequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze ein Mitglied der Brassicaceae ist.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze ein Mitglied der Gruppe, bestehend aus Borretsch (Borago spp.), Rapsart Canola, Rizinen (Ricinus communis), Kakaobohne (Theobroma cacao), Mais (Zea mays), Baumwolle (Gossypium spp.), Crambe spp., Cuphea spp., Flachs (Linum spp.), Lesquerella und Limnanthes spp., Linola, Kapuziner kresse (Tropaeolum spp.) Oenothera spp., Olive (Oleg spp.), Palme (Elaeis spp.), Erdnuß (Arachis spp.) Rapssamen, Öldistel (Carfhamus spp.) Sojabohne (Glycin und Soja spp.), Sonnenblume (Helianthus spp.), Tabak (Nicotiana spp.), Vemonia spp., Weizen (Triticum spp.), Gerste (Hordeum spp.), Reis (Oryza spp.), Hafer (Avena spp.), Hirse (Sorghum spp.), Roggen (Secale spp.) oder anderen Mitgliedern der Gramineae, ist.
Verfahren zur Änderung des Ölgehalts eines Pflanzensamens durch das Einführen eines Sense- oder Antisense-Nukleinsäurekonstrukts in einen Pflanzentransformationsvektor unter Verwendung des Vektors, um das Genom einer Pflanze oder eines Pflanzensamens zu transformieren, und dann das Wachsen der Pflanze oder des Pflanzensamens und das Extrahieren des Öls aus dem Pflanzensamen, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz die Sequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 ist.
Verfahren zur Änderung des Biopolymeranteils einer Pflanze oder eines Pflanzenspeicherorgans durch das Einführen eines Antisense- oder Sense-Konstrukts in einen Pflanzentransformationsvektor unter Verwendung des Vektors, um das Genom einer Pflanze oder eines Pflanzenspeicherorgans zu transformieren, und dann das Wachsen der Pflanze oder des Pflanzenspeicherorgans und das Extrahieren des Biopolymers aus der Pflanze oder dem Pflanzenspeicherorgan, dadurch gekennzeichnet, daß das Konstrukt die Sequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 enthält.
Verfahren zur Modulierung des PDHK-Protein-Niveaus in einer Pflanze, umfassend a) das stabile Transformieren einer Pflanzenzellen mit einem Pflanzen PDHK-Polynukleotid, welches mit einem Promotor funktionsfähig verknüpft ist, wobei das Polynukleotid in einer Sense- oder Antisense-Orientierung ist, b) das Wachsen der Pflanzenzelle unter Pflanzenwachstumsbedingungen um eine regenerierbare Pflanze zu erzeugen, welche das Polynukleotid für eine Zeitdauer, die ausreichend ist das PDHK-Protein-Niveau in der Pflanze zu modulieren, exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das PDHK-Polynukleotid eine Sequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 einschließt.
Verfahren nach Anspruch 29 oder Anspruch 30, wobei das PDHK-Protein-Niveau erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 29 oder Anspruch 30, wobei das PDKH-Protein-Niveau erniedrigt ist.
Verfahren zur Kontrolle des Kohlenstoffflusses in den Krebszyklus in Pflanzen, welches das Modulieren des PDKH-Proteinexpression-Niveaus durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32 umfaßt.
Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts in einer Pflanze durch Modulieren des PDKH-Proteinexpression-Niveaus durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32.
Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze ein Mitglied der Gruppe, bestehend aus Borretsch (Borago spp.), Rapsart Canola, Rizinen (Ricinus communis), Kakaobohne (Theobroma cacao), Mais (Zea mays), Baumwolle (Gossypium spp.), Crambe spp., Cuphea spp., Flachs (Linum spp.), Lesquerella und Limnanthes spp., Linola, Kapuzinerkresse (Tropaeolum spp.) Oenothera spp., Olive (Olea spp.), Palme (Elaeis spp.), Erdnuß (Arachis spp.) Rapssamen, Öldistel (Carfhamus spp.). Sojabohne (Glycin und Soja spp.), Sonnenblume (Helianthus spp.), Tabak (Nicotiana spp.), Vemonia spp., Weizen (Triticum spp.), Gerste (Hordeum spp.), Reis (Oryza spp.), Hafer (Avena spp.), Hirse (Sorghum spp.), Roggen (Secale spp.) oder anderen Mitgliedern der Gramineae, ist.