DE69820449T2

DE69820449T2 - T-zell-membranprotein (tirc7), davon abgeleitete peptide und antikörper und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69820449T2
Application number: DE69820449T
Authority: DE
Inventors: Nalan Utku; R. Steven GULLANS; L. Edgar MILFORD
Original assignee: Utku Nalan Dr; Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Utku Nalan Dr 10719 Berlin De; Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2018-08-29
Also published as: AU751151C; CA2301499A1; EP1350848A3; DK0996726T3; ES2213295T3; ATE256185T1; EP0996726A1; EP1350848A2; JP2001514852A; AU751151B2; WO1999011782A1; CA2301499C; EP0996726B1; PT996726E; DE69820449D1; JP4459435B2; AU9265498A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen eine T-Zellimmunantwort cDNA 7 (TIRC7), die ein neues T-Zell-Trans-Membranprotein codiert sowie davon abgeleitete Peptide und Polypeptide und Antikörper, die diese (Poly-)Peptide erkennen. In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung TIRC7 cDNA und deren codiertes Protein. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die von besagter TIRC7 cDNA abgeleitet sind und ein Peptid oder Polypeptid codieren, das die T-Zellstimulation durch das T-Zellmembranprotein (TIRC7) inhibieren kann. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die solche Polynucleotide beinhalten und damit transformierte Wirtszellen sowie deren Verwendung bei der Produktion der oben definierten Peptide oder Polypeptide. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung (Poly-)Peptide, die von den genannten Polynucleotiden codiert werden oder durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden können. In einem anderen wichtigen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper gegen diese Peptide und Polypeptide, die die T-Zellstimulation durch das T-Zellmembranprotein (TIRC7) inhibieren können. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die die zuvor genannten Peptide, Polypeptide oder Antikörper enthalten. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Verwendungen zur Modulation von Immunantworten durch das neue TIRC7-Membranprotein sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Wirkstoffe enthalten, die auf das TIRC7-Membranprotein oder seinen Liganden einwirken. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der zuvor beschriebenen Polynucleotide, Vektoren, Peptide, Polypeptide oder Antikörper für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Anwendung bei der Organtransplantation, der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, allergischen oder infektiösen Krankheiten oder zur Behandlung von Tumoren. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur (antigenspezifischen) Modulation von T-Zellunempfindlichkeit. Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Induktion, Aufrechterhaltung oder Rückgängigmachung von T-Zellunempfindlichkeit durch inhibieren oder stimulieren einer (unempfindlichen) T-Zelle durch das neue TIRC7-Membranprotein.
Im Verlauf des Textes dieser Beschreibung werden mehrere Dokumente zitiert. Jedes der hierin zitierten Dokumente (einschließlich jeglicher Herstellerbeschreibung, Anweisungen etc.) ist hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen; dies ist jedoch kein Zugeständnis, dass irgendeines der hierin zitierten Dokumente für die vorliegende Erfindung tatsächlich Stand der Technik darstellt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Aktivierung von T-Zellen ist ein serieller Prozess mit vielen Signalwegen und aufeinander folgenden Veränderungen bei der Genexpression, der zu einer Differenzierung von T-Zellen in unterschiedliche Subpopulationen führt, d. h. Th1 und Th2, die anhand ihres Musters der Cytokinproduktion unterschieden werden können und die Art der zellulären Immunantwort charakterisieren (Abbas et al., 1996, Crabtree, 1989). Die T-Zellantwort wird initiiert durch die Interaktion des antigenspezifischen T-Zellrezeptors (TCR) mit einem Peptid, das von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) präsentiert wird. Zusätzliche Signale werden gegeben von einem Netzwerk von Rezeptor-Ligand-Interaktionen, die von einer Reihe von Membranproteinen vermittelt werden, wie CD28/CTLA4 und B7, CD40/CD40L, LFA-1 und ICAM-1 (Lenschow et al., 1996; Linsley und Ledbetter, 1993; Xu et al., 1994, Bachmann et al., 1997; Schwartz, 1992) und die kollektiv als kostimulatorische Signale bezeichnet werden (Perez et al., 1997).
Diese Membranproteine können die T-Zellaktivierung auf bestimmte Weise verändern (Bachmann et. al., 1997) und regulieren die Immunantwort durch die Integration von positiven und negativen Signalen, die von diesen Molekülen gegeben werden (Bluestone, 1995; Perez et al., 1997). Viele der Wirkstoffe, die eine Modulation der zellulären Immunantwort bewirken, beeinflussen entweder den T-Zellrezeptor (Cosimi et al., 1981), blockieren kostimulatorische Signalisierung (Larsen et al., 1996; Blazar et al., 1996; Kirk et al., 1997; Linsley et al., 1992; Turka et al., 1992) oder inhibieren intrazelluläre Aktivierungssignale stromabwärts dieser primären Zellmembranauslöser (Schreiber and Crabtree, 1992). Die therapeutische Verhinderung der T-Zellaktivierung bei Organtransplantationen und Autoimmunkrankheiten beruht gegenwärtig auf panimmunosuppressiven Medikamenten, die stromabwärts gelegene intrazelluläre Vorgänge beeinflussen. Die spezifische Modulation der T-Zellantwort bleibt ein dauerhaftes Ziel der Immunforschung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Polynucleotide, die ein neues T-Zellmembranprotein codieren. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung davon abgeleitete Peptide und Polypeptide ebenso wie Antikörper, die in der Lage sind, die T-Zellstimulation durch das neue T-Zellmembranprotein zu inhibieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Anwendungen im medizinischen Bereich, die sich direkt aus den erfindungsgemäßen Polynucleotiden, Peptiden, (Poly-)Peptiden und Antikörpern ergeben. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Testverfahren für Aktivatoren und Inhibitoren der T-Zellproliferation. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, Verfahren und Verwendungen sind therapeutisch nützlich in Situationen, in denen es wünschenswert ist, (antigenspezifische) Immunantworten, z. B. Induktion und Aufrechterhaltung der T-Zellunempfindlichkeit oder Wiederherstellung der (antigenspezifischen) T-Zellempfindlichkeit. Beispielsweise könnte es notwendig sein, in einem Subjekt, das eine Organ- oder Knochenmarkstransplantation erhalten hat, die T-Zellunempfindlichkeit zu induzieren oder aufrecht zu erhalten, um die Abstoßung des Transplantats durch die Inhibierung der Stimulation mittels des TIRC7-Membranproteins zu verhindern. Zusätzlich dazu kann die T-Zellunempfindlichkeit durch Blockieren der TIRC7-Stimulation in einem Subjekt aufrecht erhalten werden, das an einer Autoimmunkrankheit leidet, um die Symptome der Autoimmunkrankheit zu lindern. In diesen Fällen wird dem Subjekt ein TIRC7-inhibierender Wirkstoff in einer Menge und über einen Zeitraum verabreicht ausreichend, um die T-Zellunempfindlichkeit aufrecht zu erhalten. Alternativ kann die T-Zellunempfindlichkeit bei einem Subjekt rückgängig gemacht werden, das einen Tumor hat, um eine tumorspezifische T-Zellantwort zu stimulieren oder bei einem Patienten, der einen Impfstoff erhalten soll, um die Wirksamkeit des Impfstoffs zu verstärken. Beispielsweise kann eine Zelle (z. B. eine Tumorzelle) dahin gehend verändert werden, dass sie einen TIRC7- Liganden exprimiert oder ein TIRC7-stimulatorischer Wirkstoff kann einem Subjekt verabreicht werden, das entweder einen Tumor hat oder dem ein Tumor operativ entfernt wurde, um das Wiederauftreten des Tumors zu verhindern. Zusätzlich kann die antigenspezifische Empfindlichkeit von anergischen T-Zellen in vitro durch die Stimulation der T-Zellen mit TIRC7 wieder hergestellt werden. In vitro hergestellte empfindliche T-Zellen können einem Subjekt dann verabreicht werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Im Hinblick auf die Notwendigkeit therapeutischer Mittel für die Behandlung von Krankheiten, die mit Immunantworten des menschlichen Körpers zusammenhängen, ist es das technische Problem der Erfindung, Mittel und Verfahren zur Modulation von T-Zellen zur Verfügung zu stellen, die insbesondere bei der Organtransplantation und bei Autoimmunkrankheiten von Nutzen sind.
Die Lösung dieses technischen Problems wird erreicht durch Bereitstellen der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen, und zwar wird ein neues von der T-Zellimmunantwort cDNA7 (TIRC7) codiertes T-Zellmembranprotein beschrieben, das eine zentrale Rolle bei der in vitro und in vivo T-Zellaktivierung spielt. TIRC7 mRNA wird in der frühen Phase der T-Zellaktivierung durch einen Calcineurin-abhängigen Signalweg vorübergehend hochreguliert.
In einer ersten Reihe von Experimenten wurde die TIRC7-codierende cDNA kloniert und charakterisiert, siehe erster Teil von Beispiel 1 und 1. Des Weiteren wurde besagte cDNA einer In-vitro-Translation unterzogen und vorläufige Ergebnisse, die in MLR-Inhibitionstests mit dem in-vitro-translatierten TIRC7-Protein erhalten wurden, wiesen auf ein zu vermutendes immunosuppressives Potential des besagten Proteins hin, siehe Beispiel 2 mit 5B.
Eine zweite (unabhängige) Reihe von Experimenten, die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden (Beispiele 2 bis 4), zeigte überraschender Weise, dass eine Modulation von TIRC7-Membranprotein-vermittelten Signalen mit spezifischen anti-TIRC7-Membranprotein-Antikörpern in vitro die T-Zellproliferation und die IL-2-Sekretion, die durch exogenes IL-2 reversibel ist, effizient verhindert. Anti-TIRC7-Membranprotein-Antikörper inhibieren spezifisch die Th1-untergruppenspezifische Cytokinexpression, verschonen aber die Th2-Cytokine. Die Verabreichung besagter Antikörper an Ratten verlängert die Überlebenszeit von Nierenallotransplantaten signifikant. Die eben beschriebenen Resultate, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, beweisen, dass das TIRC7-Protein eine essentielle Rolle in der Frühphase der T-Zellaktivierung spielt. Daher stellt das Targeting des TIRC7-Membranproteins und seines codierenden Gens eine neuartige therapeutische Vorgehensweise für die Modulation der Immunantwort dar.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Polynucleotid, das ein TIRC7-Membranprotein oder ein biologisch aktives Fragment davon codiert, umfassend eine DNA-Sequenz aus der Gruppe bestehend aus

(i) DNA-Sequenzen, die eine Nucleotidsequenz enthalten, welche die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 13 dargestellten Aminosäuresequenzen von Aminosäureposition 1 bis 614 oder von Aminosäureposition 1 bis 601 codieren;
(ii) DNA-Sequenzen enthaltend die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 12 dargestellte Nucleotidsequenz;
(iii) DNA-Sequenzen enthaltend eine Nucleotidsequenz, die ein Fragment oder Derivat des Proteins des von der DNA-Sequenz aus (i) oder (ii) codierten Proteins codiert; und
(iv) DNA-Sequenzen, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen mit einem der in (i) bis (iii) definierten Polynucleotide hybridisiert, und die mindestens zu 70% mit einem dieser Polynucleotide identisch sind.

Der Begriff "TIRC7-Membranprotein", so wie er gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezeichnet ein Protein, das in die Signaltransduktion der T-Zellaktivierung und/oder -proliferation involviert ist und das, vorzugsweise in löslicher Form, eine T-Zellproliferation inhibieren oder unterdrücken kann als Reaktion auf Alloaktivierung in einer gemischten Lymphozytenkultur oder als Reaktion auf Mitogene, wenn diese der Kultur exogen hinzugefügt werden. Studien, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden waren, haben gezeigt, dass lösliches in-vitro-translatiertes TIRC7-Protein in dosierungsabhängiger Weise die T-Zellproliferation als Reaktion auf Alloaktivierung in einer gemischten Lymphozytenkultur oder als Reaktion auf Mitogene effizient zu unterdrücken vermag, siehe Beispiel 2, 5B.
Der Begriff "ein biologisch aktives Fragment davon" bezieht sich auf Peptide und Polypeptide, die von besagtem TIRC7-Membranprotein abgeleitet sind und die die T-Zellproliferation wie oben definiert inhibieren können.
Vormals wurde ein cDNA-Fragment durch die Reverse-Transkriptions-„Differential-Display"-Polymerase-Kettenreaktions(DDRT-PCR)-Technik amplifiziert, das aus RNA von Zellen stammte, die in einer gemischten Lymphozytenkultur (MLC) stimuliert wurden. Es wurde berichtet, dass die so erhaltene Aminosäuresequenz des 350-Basenpaar(bp)-cDNA-Fragments zu einem neuen humanen (H+)-ATPase-Protonenpumpen-Homolog gehört, das in alloaktivierten Lymphozyten differentiell exprimiert wird, da die Aminosäuresequenz substantielle Homologie zur Ratten- bzw. Rinder-Vesikular(H+)-ATPase-Protonenpumpe hatte. Da die Funktion des Moleküls nicht bekannt war, wurde auch spekuliert, dass seine Homologie zu einem Maus-T-Zell-abgeleiteten immunosuppresiven Protein (J6B7, Lee, Molecular Immunology 27 (1990), 1137–1144) vermuten lasse, dass das korrespondierende Gen in die Immunmodulation involviert sein könne. Ein cDNA-Klon mit voller Länge wurde mittels des 350-Basenpaar-cDNA-Fragments aus einer Bibliothek von aktivierten humanen T-Zellen isoliert. Die Aminosäuresequenz der neu klonierten cDNA brachte jedoch keine weiteren Erkenntnisse über die mutmaßliche Funktion des codierten Proteins, obwohl von einigen Anfangsexperimenten, die das Expressionsmuster eines Gens, das vermutlich dem 350-Basenpaar-Fragment entsprechen sollte und dessen codiertes, in-vitro-translatiertes Protein betrafen, berichtet und somit Anlass zur Spekulation gegeben wurde. Des Weiteren schlug der Versuch fehl, das Maus-Homolog mit Hilfe von entweder dem 350-Basenpaar-Fragment oder der cDNA mit voller Länge zu klonieren.
Weitere Untersuchungen zeigten, dass die durch DDRT-PCR von RNA aus stimulierten T-Lymphozyten identifizierte Aminosäuresequenz des cDNA-Fragments einer transmembranen Region entspricht. Es konnte daher nicht ausgeschlossen werden, dass wegen der konservierten Strukturen und Aminosäuresequenzen solcher transmembraner Regionen der cDNA-Klon mit voller Länge nicht tatsächlich dem durch DDRT-PCR identifizierten Fragment entsprach. Beispielsweise gibt es 5 Unterschiede hinsichtlich der Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des TIRC7-Proteins im Vergleich zum Protein der von dem 350-Basenpaar codierten transmembranen Region. Da eine DDRT-PCR-Analyse der RNA aus humanen Lymphozyten mehrere Gene identifizierte, deren Expression durch Alloaktivierung verändert wurde, könnten des Weiteren (Multi-)Genfamilien ähnlicher Struktur und/oder Funktion existieren, wohingegen nur eines oder wenige dieser Gene tatsächlich durch die oben beschriebene Technik identifiziert werden. Daher war die Bedeutung der vorläufigen Ergebnisse und die tatsächliche biologische Funktion dieses unbekannten Proteins, zu dem kein Vorgänger existierte, absolut unklar.
Die vorläufigen Ergebnisse wurden umso mehr in Frage gestellt hinsichtlich der jüngsten Veröffentlichung von Lee, Biochem. Biophys. Res. Communications 218 (1996), 813–821, worin über die Klonierung und Charakterisierung einer humanen Osteoclasten-spezifischen 116 kDa-Protonenpumpen-Untereinheit berichtet wurde, deren cDNA eine Nucleotid- und eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die im Wesentliche identisch mit denen des aus aktivierten humanen T-Zellen geklonten Gens ist. Folglich schien es, als spiegelten die vorläufigen Ergebnisse ein Artefakt wieder und/oder wären auf Grund der Aktivität eines Pseudo-Gens des von Lee, supra, beschriebenen Gens erhalten worden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein Polynucleotid mit der Nucleotidsequenz der codierenden Region wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt identifiziert, das ein Protein von 614 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2) mit einem Molekulargewicht von 75 kDa codiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigten, dass das TIRC7-Membranprotein in allen lymphoiden Geweben exprimiert wird, mit niedriger Expression nur in der Thymusdrüse, im Knochenmark und in der fetalen Leber, und in den Lymphozyten nach der Stimulation des T-Zellrezeptors vorübergehend hochreguliert wird, siehe Beispiel 1, 3. Das TIRC7-codierende Gen wurde durch die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-Methode (FISH) auf dem langen Arm des humanen Chromosoms 10 (13.4–13.5 q) lokalisiert, das nahe bei der Bruchstellenregion des bcI-Gens liegt, welches mit Leukämie assoziiert wird. Das TIRC7-Membranprotein wird vorwiegend auf der Zellmembran exprimiert, übereinstimmend mit einem Target für einen externen Liganden, siehe Beispiel 1, 4. Die 7- Transmembran-Domän-Struktur sagt drei extrazelluläre Schleifen und einen extrazellulär orientierten Carboxy-Terminus voraus, siehe 2.
Aus dem Vorangegangenen ergibt sich, dass die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nucleotidsequenz eine neue Klasse von T-Zellmembranproteinen codiert. Durch die Bereitstellung dieser Nucleotidsequenz ist es nunmehr möglich, identische oder ähnliche Polynucleotide, die Proteine mit der biologischen Aktivität von TIRC7 codieren, aus anderen Spezies oder Organismen zu isolieren. Allgemein übliche Arbeitsweisen zur Identifikation und Isolation solcher verwandter Sequenzen sind beispielsweise die Isolation aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken, wobei die offenbarte Sequenz ganz oder teilweise als Sonde verwendet wird oder die Amplifikation von korrespondierenden Polynucleotiden durch eine Polymerasen-Kettenreaktion unter Verwendung von spezifischen Primern. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein weiteres ein TIRC7-Membranprotein codierendes Polynucleotid isoliert unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das die codierende Sequenz aus SEQ ID NO: 1 als Sonde enthielt. Die Nucleotidsequenz besagten Polynucleotids wird in SEQ ID NO: 12 angegeben und codiert ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 13. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen besagten TIRC7-Membranproteins sind im Wesentlichen identisch mit denen des von SEQ ID NO: 1 codierten TIRC7-Membranproteins, außer bei Aminosäureposition 121 (Arg → Gln), und stellen daher vermutlich allelische Varianten dar.
Folglich betrifft die Erfindung auch Polynucleotide, die mit den oben beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren und sich im Vergleich zu diesen an einer oder mehreren Positionen unterscheiden, solange sie ein TIRC7-Membranprotein wie oben definiert codieren. Solche Moleküle umfassen jene, die durch beispielsweise Deletion(en), Insertion(en), Veränderungen) oder andere dem Stand der Technik bekannte Modifikationen im Vergleich zu den oben beschriebenen Polynucleotiden entweder einzeln oder in Kombination verändert wurden. Verfahren zur Einführung solcher Modifikationen bei den erfindungsgemäßen Polynucleotiden sind dem Fachmann hinreichend bekannt, siehe z. B. Sambrook et al. (Molecular cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Die Erfindung betrifft auch Polynucleotide, deren Nucleotidsequenz sich von der von irgendeinem der oben beschriebenen Polynucleotide auf Grund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.
Im Hinblick auf die oben unter (iv) gekennzeichneten DNA-Sequenzen bezieht sich der Begriff "Hybridisierung" in diesem Zusammenhang auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise so wie bei der Hybridisierung in 50% Formamid/6 × SSC/0.1% SDS/100 μg/ml ssDNA, worin die Temperaturen für die Hybridisierung über 37°C und die Temperaturen zum Waschen in 0.1 × SSC/0.1% SDS über 55°C liegen. Meist bevorzugt bezieht sich der Begriff "Hybridisierung" auf stringente Hybridisierungsbedingungen wie beispielsweise beschrieben bei Sambrook, supra.
Besonders bevorzugt sind Polynucleotide, die zu 70%, vorzugsweise zu mindestens 85%, mehr bevorzugt zu 90–95% und besonders bevorzugt zu 96–99% sequenzidentisch mit einem der oben genannten Polynucleotide sind und die gleiche biologische Aktivität aufweisen. Solche Polynucleotide beinhalten auch jene, die beispielsweise durch Nucleotiddeletion(en), -insertion(en), -substitution(en), -addition(en) und/oder -rekombination(en) und/oder durch (eine) andere dem Stand der Technik bekannte Modifikationen) entweder einzeln oder in Kombination im Vergleich zu den oben beschriebenen Polynucleotiden verändert sind. Verfahren zur Einführung solcher Modifikationen in die Nucleotidsequenzen der erfindungsgemäßen Polynucleotide sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Daher umfasst die vorliegende Erfindung jedes Polynucleotid, das von den oben beschriebenen Polynucleotiden durch Gentechnik abgeleitet werden kann und das bei der Expression ein TIRC7-Membranprotein oder ein biologisch aktives Fragment davon codiert.
Es ist dem Fachmann auch unmittelbar offensichtlich, dass dem erfindungsgemäßen Polynucleotid regulatorische Sequenzen hinzugefügt werden können. Beispielsweise können Promotoren, Transkriptionsenhancer und/oder Sequenzen, die eine induzierte Expression des erfindungsgemäßen Polynucleotids ermöglichen, verwendet werden. Ein geeignetes induzierbares System ist beispielsweise die Tetracyclin-regulierte Genexpression wie beispielsweise beschrieben von Gossen und Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547–5551) und Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58–62).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle von mindestens 15 Nucleotiden Länge, die spezifisch mit einem Polynucleotid wie oben beschrieben oder mit einem komplementären Strang davon hybridisieren. Die spezifische Hybridisierung erfolgt vorzugsweise unter stringenten Bedingungen und impliziert keine oder nur sehr geringe Cross-Hybridisierung mit Nucleotidsequenzen, die keine oder gänzlich unterschiedliche Proteine codieren. Solche Nukleinsäuremoleküle können als Sonden und/oder zur Kontrolle der Genexpression verwendet werden. Die Nukleinsäure-Sonden-Technologie ist dem Fachmann hinreichend bekannt, der ohne Weiteres anerkennen wird, dass solche Sonden in der Länge variieren können. Bevorzugt sind Nukleinsäure-Sonden von 17 bis 35 Nucleotiden Länge. Natürlich kann es auch angebracht sein, Nukleinsäuren von bis zu 100 und mehr Nucleotiden Länge zu verwenden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sonden sind für verschiedene Anwendungen von Nutzen. Einerseits können sie als PCR-Primer zur Amplifikation von erfindungsgemäßen Polynucleotiden verwendet werden. Eine andere Anwendung ist die als Hybridisierungssonde zur Identifikation von Polynucleotiden, die mit den erfindungsgemäßen Polynucleotiden durch Homologie-Screening genomischer DNA-Bibliotheken hybridisieren. Nukleinsäuremoleküle gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die komplementär zu einem Polynucleotid sind, wie es oben beschrieben wurde, können auch zur Repression oder Expression eines solch ein Polynucleotid enthaltenden Gens verwendet werden, beispielsweise auf Grund eines Antisense- oder Tripelhelix-Effekts, oder zur Konstruktion von geeigneten Ribozymen (siehe, z. B., EP-B1 0 291 533, EP-A1 0 321 201, EP-A2 0 360 257), die spezifisch die (prä-)mRNA eines ein Polynucleotid enthaltenden Gens spalten. Die Auswahl geeigneter Targetstellen und korrespondierender Ribozyme kann erfolgen wie beispielsweise beschrieben in Steinecke, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds Academic Press, Inc. (1995), 449–460. Standardverfahren zur Antisense-Technologie wurden ebenfalls beschrieben (Melani, Cancer Res. 51 (1991), 2897–2901). Des Weiteren ist sich der Fachmann durchaus der Tatsache bewusst, dass es ebenfalls möglich ist, eine solche Nukleinsäure-Sonde mit einem geeigneten Marker für spezifische Anwendungen zu markieren, wie beispielsweise zum Nachweis der Präsenz eines erfindungsgemäßen Polynucleotids in einer aus einem Organismus entnommenen Probe.
Die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle können entweder DNA oder RNA oder ein Hybrid davon sein. Des Weiteren können besagte Nukleinsäuremoleküle beispielsweise Thioester-Bindungen und/oder Nucleotidanaloge, wie sie bei Oligonucleotid-Antisense-Arbeitsweisen gebräuchlich sind, enthalten. Besagte Modifikationen können bei der Stabilisierung der Nukleinsäuremoleküle gegen Endo- und/oder Exonukleasen in der Zelle von Nutzen sein. Besagte Nukleinsäuremoleküle können von einem geeigneten Vektor transkribiert werden, welcher ein chimeres Gen enthält, das die Transkription besagten Nukleinsäuremoleküls in der Zelle ermöglicht. Solche Nukleinsäuremoleküle können des Weitern Ribozymsequenzen wie oben beschrieben enthalten.
In dieser Hinsicht ist es auch zu verstehen, dass das erfindungsgemäße Polynucleotid für "Gen-Targeting" und/oder "Gen-Ersetzung", für die Wiederherstellung eines mutanten Gens oder für die Herstellung eines mutanten Gens mittels homologer Rekombination verwendet werden kann, siehe beispielsweise Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712–4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuremoleküle markiert. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren sind dem Stand der Technik hinreichend bekannt, d. h. Southern- und Northern-Blot, PCR- oder Primerextension. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können besagte Nukleinsäuremoleküle zur Unterdrückung der TIRC7-Expression verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Polynucleotid, das das oben beschriebene TIRC7-Membranprotein oder biologisch aktive Fragmente davon codiert, kann beispielsweise DNA, cDNA, RNA oder synthetisch hergestellte DNA oder RNA oder ein rekombinant hergestelltes chimeres Nukleinsäuremolekül sein, das jedes beliebige dieser Polynucleotide entweder allein oder in Kombination enthält. Vorzugsweise ist besagtes Polynucleotid Teil eines Vektors. Solche Vektoren können weitere Gene enthalten, wie z. B. Markergene, die die Selektion besagten Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen ermöglichen.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polynucleotid funktionell mit Expressions-Kontroll-Sequenzen verknüpft, die die Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ermöglichen. Die Expression des besagten Polynucleotids umfasst die Transkription der Polynucleotide in eine translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryotischen Zellen, vorzugsweise in Säugerzellen, sicher stellen, sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Üblicher Weise enthalten sie regulatorische Sequenzen, die die Initiierung der Transkription sicher stellen und wahlweise Poly-A-Signale, die die Termination der Transkription und die Stabilisierung des Transkripts sicher stellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können transkriptionale wie auch translationale Enhancer und/oder naturgemäß verbundene oder heterologe Promotor-Regionen umfassen. Mögliche regulatorische Elemente, die die Expression in prokaryotischen Wirtszellen erlauben, umfassen beispielsweise die P_L, lac, trp oder tac Promotoren in E. coli; Beispiele für regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryotischen Wirtszellen erlauben sind die AOX1- oder GAL1-Promotoren in Hefe oder die CMV-, SV40-, RSV-Promotoren (Roussarcoma-Virus), der CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Zellen von Säugern oder anderen tierischen Zellen. Neben den für die Initiierung der Transkription verantwortlichen Elementen können solche regulatorischen Elemente auch Transkriptions-Terminations-Signale, so wie die SV40-Poly-A-Stelle oder die tk-Poly-A-Stelle, stromabwärts des Polynucleotids umfassen. Des Weiteren, abhängig vom angewandten Expressionssystem können Leadersequenzen, die das Polypeptid in ein zelluläres Kompartiment dirigieren können oder es in das Medium sekretieren können, zu der codierenden Sequenz des erfindungsgemäßen Polynucleotids hinzugefügt werden und sie sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Die Leadersequenz(en) wird (werden) in einer geeigneten Phase zusammengesetzt mit Translations-, Initiierungs- und Terminationssequenzen und, vorzugsweise, einer Leadersequenz, die die Sekretion von translatiertem Protein, oder eines Anteils davon, in den periplasmischen Raum oder das extrazelluläre Medium dirigieren kann. Optional kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, umfassend ein C- oder N-Terminal-Identifikations-Peptid, das die gewünschten Charakteristika, z. B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts, vermittelt. In diesem Zusammenhang sind im Stand der Technik geeignete Expressionsvektoren bekannt, so wie die Okayama-Berg-cDNA- Expressionsvektoren pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (InVitrogen), oder pSPORT1 (GIBCO BRL).
Vorzugsweise sind die Expressionskontrollsequenzen eukaryotische Promotor-Systeme in Vektoren, die eukaryotische Wirtszellen transformieren oder transfizieren können, jedoch können Kontrollsequenzen für prokaryotische Wirte ebenfalls verwendet werden. Ist der Vektor erst in den geeigneten Wirt integriert, wird der Wirt unter geeigneten Bedingungen für eine Expression der Nucleotidsequenzen in großen Mengen gehalten und, wie gewünscht, kann die Entnahme und Reinigung des erfindungsgemäßen Proteins folgen, siehe beispielsweise die Beispiele im Anhang.
In Übereinstimmung mit dem Vorherigen betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, insbesondere üblicherweise in der Gentechnik verwendete Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen, die ein erfindungsgemäßes Polynucleotid enthalten. Dem Fachmann hinreichend bekannte Verfahren können zur Herstellung rekombinanter Vektoren verwendet werden, siehe beispielsweise die Techniken wie beschrieben in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1989). Alternativ können die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Vektoren in Liposome rekonstituiert werden für die Verbringung zu den Targetzellen. Die die erfindungsgemäßen Polynucleotide enthaltenden Vektoren können durch hinreichend bekannte Verfahren, die sich je nach der Art des zellulären Wirts unterscheiden können, in die Wirtszelle eingebracht werden. Zum Beispiel wird die Kalziumchlorid-Transfektion üblicherweise für prokaryotische Zellen verwendet, während eine Kalziumphosphat-Behandlung oder Elektroporation für andere zelluläre Wirte verwendet wird, siehe Sambrook, supra.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, die das Polynucleotid oder den Vektor wie oben beschrieben enthält. Vorzugsweise ist diese Zelle eine eukaryotische, am besten eine Säugerzelle, wenn therapeutische Verwendungen des Proteins vorgesehen sind. Natürlich können Hefe und weniger bevorzugt prokaryotische Zellen, z. B. Bakterienzellen, ebenso verwendet werden, insbesondere wenn das produzierte Protein als diagnostisches Mittel verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Polynucleotid oder der erfindungsgemäße Vektor, das/der in der Wirtszelle anwesend ist kann entweder in das Genom der Wirtszelle integriert werden oder extrachromosomal gehalten werden.
Der Begriff "prokaryotisch" soll alle Bakterien einschließen, die zur Expression eines erfindungsgemäßen Proteins mit einer DNA oder einer RNA transformiert oder transfiziert werden können. Prokaryotische Wirte können gramnegative ebenso wie grampositive Bakterien einschließen, wie z. B. E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis. Der Begriff "eukaryotisch" soll einschließen Hefezellen, höhere Pflanzenzellen, Insektenzellen und vorzugsweise Säugerzellen. Abhängig von dem Wirt, der bei einem rekombinanten Produktionsverfahren zum Einsatz kommt, kann das von dem Polynucleotid der vorliegende Erfindung codierte Protein glykosyliert werden oder auch nicht. Erfindungsgemäße TIRC7-Proteine können auch einen anfänglichen Methionin-Aminosäurerest beinhalten. Ein erfindungsgemäßes Polynucleotid kann dazu verwendet werden, den Wirt mittels einer beliebigen der dem Fachmann üblicherweise bekannten Techniken zu transformieren oder zu transfizieren. Des Weiteren sind Verfahren zur Herstellung von fusionierten miteinander verknüpften Genen in Fachkreisen hinreichend bekannt (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Die hierin beschriebenen genetischen Konstruktionen und Verfahren können zur Expression des erfindungsgemäßen TIRC7-Proteins in eukaryotischen oder prokaryotischen Wirten verwendet werden. Im Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotor-Sequenzen enthalten, welche die effiziente Transkription des eingefügten Polynucleotids fördern, in Verbindung mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischer Weise einen Replikationsausgangsort, einen Promotor und einen Terminator ebenso wie spezifische Gene, die für die phänotypische Selektion der transformierten Zellen sorgen können. Des Weiteren können transgene Tiere, vorzugsweise Säuger, die erfindungsgemäße Zellen beinhalten, für eine groß angelegte Produktion des erfindungsgemäßen TIRC7-Proteins verwendet werden.
Alternativ kann eine tierische Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle, in deren Genom natürlicherweise ein erfindungsgemäßes Polynucleotid anwesend ist, verwendet und derart verändert werden, so dass besagte Zelle das endogene Gen entsprechend dem erfindungsgemäßen Polynucleotid mit der Steuerung eines heterologen Promotors exprimiert.
Die Einführung des heterologen Promotors, der nicht naturgemäß die Expression des erfindungsgemäßen Polynucleotids steuert, kann gemäß Standardverfahren erfolgen, siehe supra. Geeignete Promotoren beinhalten die hierin zuvor genannten.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Produktion eines TIRC7-Membranproteins oder eines biologisch aktiven Fragments davon, umfassend:

(a) Kultivierung eines erfindungsgemäßen Wirts unter die Expression des Proteins ermöglichenden Bedingungen; oder
(b) in-vitro-Translation des erfindungsgemäßen Polynucleotids; und

Die transformierten Wirte können in Fermentern gezüchtet und gemäß in Fachkreisen bekannten Techniken derart kultiviert werden, so dass ein optimales Zellwachstum erreicht wird. Das erfindungsgemäße TIRC7-Protein kann dann vom Wachstumsmedium, von zellulären Lysaten oder zellulären Membranfraktionen isoliert werden. Einmal exprimiert, kann das erfindungsgemäße Protein aufgereinigt werden gemäß in Fachkreisen bekannten Standardtechniken einschließend Ammonium-Sulfat-Präzipitation, Affinitäts-Säulen, Säulenchromatographie, Gel-Elektrophorese und ähnlichen; siehe Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N. Y. (1982). Im Wesentlichen reine Proteine von einer Homogenität von mindestens ca. 90 bis 95% sind bevorzugt, solche von 98 bis 99% Homogenität sind am meisten bevorzugt für pharmazeutische Verwendungen. Einmal aufgereinigt, je nach Wunsch partiell oder bis zur Homogenität, können die Proteine sodann entweder therapeutisch (einschließlich extrakorporell) eingesetzt werden oder für die Entwicklung und Durchführung von Assay-Verfahren verwendet werden.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein TIRC7-Membranprotein oder ein biologisch aktives Fragment davon, das von dem erfindungsgemäßen Polynucleotid codiert wird oder hergestellt wird durch eines der oben beschriebenen Verfahren. Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, dass das erfindungsgemäße Protein weiter an andere Reste wie oben beschrieben gekoppelt werden kann, beispielsweise für Medikamenten-Targeting und Imaging-Anwendungen. Eine solche Kopplung kann chemisch nach der Expression des Proteins zur Stelle der Anfügung erfolgen oder das Kopplungsprodukt kann auf dem DNA-Level in das erfindungsgemäße Protein konstruiert werden. Die DNAs werden dann in ein geeignetes Wirtssystem exprimiert und die exprimierten Proteine werden gesammelt und renaturiert, sofern es nötig ist. Des Weiteren ermöglicht die Bereitstellung des TIRC7-Proteins der vorliegenden Erfindung die Produktion von TIRC7-spezifischen Antikörpern. In dieser Hinsicht ermöglicht die Hybridomtechnologie die Herstellung von Zelllinien, die Antikörper gegen im Wesentlichen jede gewünschte Substanz sekretieren, die eine Immunantwort erzeugt. Die die leichten und schweren Ketten des Immunglobulins codierende RNA kann dann aus dem Zytoplasma des Hybridoms erhalten werden. Das 5'-Endstück der mRNA kann zur Bereitung von cDNA zur Insertion in einen Expressionsvektor verwendet werden. Die den Antikörper oder seine Immunglobulinketten codierende DNA kann nachfolgend in Zellen, vorzugsweise in Säugerzellen, exprimiert werden.
Abhängig von der Wirtszelle können Renaturierungstechniken zur Erlangung einer exakten Konformation des Antikörpers erforderlich sein. Nötigenfalls können zur Bindungsoptimierung punktuelle Substitutionen in der DNA vorgenommen werden unter Anwendung von konventioneller Kassetten-Mutagenese oder einer anderen Methodik zur Konstruktion von Protein, wie hierin offenbart.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Antikörper, der das erfindungsgemäße Peptid oder Polypeptid spezifisch erkennt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, die dahin gehend modifiziert wurde, dass sie ein erfindungsgemäßes TIRC7-Protein oder einen erfindungsgemäßen Antikörper exprimiert. Diese Ausführungsform kann gut dazu geeignet sein, z. B. die T-Zellempfindlichkeit zu einem Antigen wieder herzustellen, insbesondere wenn der erfindungsgemäße Antikörper, der die T-Zellproliferation stimulieren kann, in einer Form exprimiert wird, in der er geeignet ist, auf der Zelloberfläche präsentiert zu werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend ein Peptid oder Polypeptid, das die T-Zellstimulation durch ein TIRC7-Membranprotein inhibieren kann und/oder von einem Antikörper erkannt wird, der die T-Zellstimulation durch ein von einem Fragment der oben beschriebenen Polynucleotide codiertes TIRC7-Membranprotein inhibieren kann oder von einem Antikörper, der besagtes Peptid oder Polypeptid spezifisch erkennt. Der Begriff "die T-Zellstimulation durch das TIRC7-Membranprotein inhibieren können" beschreibt die Fähigkeit, die T-Zellproliferation als Reaktion auf Alloaktivierung in einer gemischten Lymphozytenkultur oder als Reaktion auf Mitogene zu unterdrücken mittels Blockieren oder Antagonisieren der biologischen Aktivität des TIRC7-Membranproteins, welches hierin auch TIRC7-Protein oder TIRC7 genannt wird. Die Begriffe "die T-Zellstimulation durch das TIRC7-Membranprotein inhibieren können" und "die TIRC7-Aktivität inhibierend" sind hierin gegeneinander austauschbar verwendet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführte Studien zeigten überraschender Weise, dass die gegen die extrazelluläre Domäne gerichteten anti-TIRC7-Antikörper, nicht jedoch die, welche vorhergesagte intrazelluläre Domänen des Proteins erkennen, die T-Zellproliferation als Reaktion auf Alloaktivierung in einer gemischten Lymphozytenkultur oder als Reaktion auf Mitogene in effizienter Weise unterdrücken können; siehe Beispiel 2, 5. Ähnliche Resultate wurden mit in-vitro-translatiertem löslichen TIRC7-Protein erhalten. Der inhibitorische Effekt von anti-TIRC7-Antikörpern auf von mehreren verschiedenen stimulatorischen Signalwegen induzierte T-Zellen legt nahe, dass TIRC7 eine essentielle Rolle bei der T-Zellaktivierung spielt. Des Weiteren legt die Inhibition der T-Zellproliferation in MLR durch Antikörper-Targeting von TIRC7 die Existenz eines Liganden nahe, der spezifisch mit TIRC7 interagiert. Eine Untermauerung dieser Hypothese liefert die Dosis-abhängige Inhibition der T-Zellproliferation in MLR in Gegenwart eines löslichen in-vitro-translatierten TIRC7-Proteins.
Des Weiteren konnte gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass Antikörper-Targeting von TIRC7 einen selektiven inhibitorischen Effekt auf die Th1-Lymphozyten-Untergruppe hat, wie bewiesen durch die Inhibition der IL-2- und IFN-γ-, nicht jedoch der IL- 4-, Cytokinproduktion; siehe Beispiel 3, 5. Mit Anti-TIRC7-Antikörper-Behandlung scheinen die Zellen in einem unempfindlichen aber funktionellen Zustand zu bleiben, da exogenes rekombinantes IL-2 den antiproliferativen Effekt der anti-TIRC7-Antikörper umkehrte.
Während die oben beschriebenen Resultate versprechen, dass das neue TIRC7-Protein und dessen Antikörper von therapeutischem Nutzen sein könnten, kam der Beweis für das Konzept der Erfindung, nämlich die Nützlichkeit der oben beschriebenen Zusammensetzungen für die Modulation der Immunantwort wie auch für davon abgeleitete Ausführungsformen, die nachstehend gekennzeichnet werden, erst durch weitere gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente, in denen die Fähigkeit eines anti-TIRC7-Antikörpers, die Allotransplantat-Abstoßung zu verhindern im in-vivo-Modell einer Rattennieren-Transplantation gezeigt wurde; siehe Beispiel 4, 6 und 7. Darüber hinaus konnte gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass vorteilhafter Weise die Effekte des Antikörper-Targeting von TIRC7 denen, die beim Targeting kostimulatorischer Moleküle beobachtet wurden, sehr ähnlich sind. Es wurde gezeigt, dass Antikörper-Blockierung von kostimulatorischen Molekülen die humane T-Zellproliferation inhibiert (Linsley et al., 1992; Walunas et al., 1994). Des Weiteren verursachte eine Unterbrechung der CD28/B7-Interaktion mit dem löslichen Protein CTLA41g eine Inhibition der T-Zellproliferation (Linsley et al., 1992; Lenschow et al., 1992; Larsen et al., 1996). Eine weitere Analogie zum Effekt von TIRC7-Antikörper-Targeting stellt CTLA41g dar, das selektiv die Th1-Lymphozyten-Antworten blockiert während es die von Th2 verschont (Mohammed et al., 1995). Es wurde gezeigt, dass die Verabreichung von CTLA41g in einem in-vivo-Modell einer Nieren-Allotransplantats-Transplantation die durchschnittliche Überlebenszeit des Transplantats steigerte (Mohammed et al., 1995), was ähnlich beim TIRC7-Antikörper-Targeting in den vorliegenden Beispielen beobachtet wurde. Wenngleich diese Ähnlichkeiten eine kostimulatorische Funktion vermuten lassen, so weist TIRC7 keine strukturelle oder sequenzielle Homologie mit irgendwelchen der bekannten T-Zell-akzessorischen Molekülen auf. Daher mag TIRC7 an einem bestimmten Signalweg teilnehmen, der im frühen Verlauf der T-Zellaktivierung induziert wird. Die Möglichkeit wird von jüngsten Berichten unterstützt, dass eine Interferenz mit Signalwegen, die von Molekülen vermittelt wurden, die nicht den bekannten kostimulatorischen Proteinen entsprechen, die T- Zellantwort modulieren kann. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Antikörper-Targeting des gemeinen Leukozyten-Antigens CD45RB zu einer Verhinderung der Transplantatsabstoßung bei Mäusen führte (Lazarovits et al., 1996). Angesichts der funktionellen Ähnlichkeiten zwischen TIRC7 und den bekannten T-Zell-akzessorischen Molekülen ist zu erwarten, dass die strukturelle Neuheit von TIRC7 zum Verständnis verschiedener Mechanismen in der T-Zellantwort beitragen wird. Des Weiteren liefert die erstaunliche Fähigkeit von anti-TIRC7-Antikörpern, die Überlebenszeit von Allotransplantaten in vivo erheblich zu verlängern, eine neue Vorgehensweise für eine selektive Inhibition von unerwünschter T-Zellaktivierung bei der Organtransplantation und bei Autoimmunkrankheiten beim Menschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst besagtes von oben beschriebenem Polynucleotid codiertes Peptid oder Polypeptid die in einem der SEQ ID NOs von 3 bis 9 dargestellte Aminosäuresequenz. Wie in den Beispielen im Anhang beschrieben, entsprechen Peptide, die die oben erwähnten Aminosäuresequenzen enthalten, Teilen der extrazellulären Domäne des TIRC7-Proteins und können vorteilhafter Weise für die Herstellung von Antikörpern verwendet werden, welche die T-Zellunempfindlichkeit induzieren können.
Dementsprechend umfasst in einer besonders bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine lösliche Form besagten Peptids oder Polypeptids. In einer Ausführungsform ist eine lösliche Form von TIRC7 oder ein TIRC7-Ligand eine verkürzte Form des Moleküls, das eine extrazelluläre Domäne des TIRC7 oder einen funktionellen Anteil davon enthält. Es kann ein Teil der extrazellulären Domäne von TIRC7 verwendet werden, der die Fähigkeit behält, einen TIRC7-Liganden zu binden. Ebenso kann ein Teil der extrazellulären Domäne eines TIRC7-Liganden verwendet werden, der die Fähigkeit behält, TIRC7 zu binden. Eine weitere lösliche Form von TIRC7 oder eines TIRC7-Liganden für die erfindungsgemäße Verwendung ist ein Fusionsprotein. Der Begriff "Fusionsprotein" wie hierin verwendet betrifft ein Protein bestehend aus einem ersten Polypeptid eines ersten Proteins in aufeinanderfolgender Aminosäuresequenz mit einem zweiten Polypeptid eines zweiten Proteins. Fusionsproteine können durch standardisierte rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden, worin eine Nucleotidsequenz, die das erste Polypeptid codiert, mit einer Nucleotidsequenz, die das zweite Polypeptid codiert, in-frame ligiert wird und diese Nucleotidsequenzen zur Produktion eines Fusionsproteins exprimiert werden (z. B. unter Verwendung eines rekombinanten in eine Wirtszelle eingeführten Expressionsvektors). Ein bevorzugtes Fusionsprotein ist ein Immunoglobulin-Fusionsprotein, das eine extrazelluläre Domäne oder einen funktionellen Teil von TIRC7 oder eines TIRC7-Liganden einschließt, der an die konstante Region einer schweren Immunglobulinkette gebunden ist, (z. B. die Hinge-CH2 und CH3-Regionen eines humanen Immunoglobulin wie IgG1). Immunoglobulin-Fusionsproteine können beispielsweise hergestellt werden nach Capon, Nature 337 (1989), 525–531.
Der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Antikörper hat vorzugsweise eine Spezifität, die zumindest im Wesentlichen identisch ist mit der Bindungsspezifität des natürlichen Liganden des erfindungsgemäßen TIRC7-Proteins, insbesondere wenn eine T-Zellstimulierung gewünscht ist. Solch ein Antikörper kann eine Bindungsaffinität von mindestens 10⁵ M^–1 haben, vorzugsweise nicht höher als 10⁷M^–1, wenn eine T-Zellstimulation beabsichtigt ist, und vorteilhafter Weise bis zu 10¹⁰ M^–1, falls T-Zellsuppression vermittelt werden soll.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat

(a) ein T-Zell-suppressiver Antikörper eine Affinität von wenigstens ca. 10^–7 M, vorzugsweise wenigstens ca. 10^–9 M und meist bevorzugt wenigstens ca. 10^–11 M, und
(b) ein T-Zell-stimulierender Antikörper eine Affinität von weniger als ca. 10^–7 M, vorzugsweise weniger als ca. 10^–6 M und meist bevorzugt in der Größenordnung von 10^–5 M.

Im Falle bispezifischer Antikörper, bei denen eine Spezifität auf eine zu zerstörende Targetzelle, beispielsweise eine Tumorzelle, gerichtet ist, ist es von Vorteil, wenn die Bindungsstelle, die das Tumor-Antigen erkennt, eine hohe Affinität aufweist, um die zu zerstörenden Targetzellen mit hoher Effizienz einzufangen. Andererseits sollte die Bindungsaffinität der das erfindungsgemäße TIRC7-Protein erkennenden Bindungsstelle im Bereich der Affinität des natürlichen TIRC7-Liganden oder der Affinität liegen, die üblicherweise für die Interaktion der T-Zell-kostimulatorischen Moleküle mit deren Rezeptor gefunden wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist besagter Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein Einzelketten-Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein Fragment davon, das besagtes Peptid oder Polypeptid spezifisch bindet, auch einschließend einen bispezifischen Antikörper, ein synthetische Antikörper, Antikörper-Fragmente, so wie Fab, Fv oder scFv-Fragmente etc. oder ein chemisch modifiziertes Derivat von einem dieser. Monoklonale Antikörper können beispielsweise durch Techniken hergestellt werden, wie sie ursprünglich in Köhler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, and Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, beschrieben wurden, und die die Fusion von Maus-Myelom-Zellen mit von immunisierten Säugern abgeleiteten Milzzellen mit von Fachleuten entwickelten Modifikationen umfassen. Des Weiteren können Antikörper oder Fragmente davon gegen die vorher genannten Peptide durch Verfahren erhalten werden, die beispielsweise in Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, beschrieben sind. Werden Derivate besagter Antikörper durch die Phagen-Display-Technik erhalten, kann surface plasmon resonance, wie sie im BIAcore-System angewendet wird, zur Steigerung der Effektivität von Phagen-Antikörpern, die an ein Epitop des erfindungsgemäßen Peptids oder Polypeptids binden, verwendet werden (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97–105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7–13). Die Herstellung chimerer Antikörper ist beispielsweise in WO89/09622 beschrieben. Verfahren zur Produktion von humanisierten Antikörpern sind beispielsweise in EP-A1 0 239 400 und WO90/07861 beschrieben. Eine weitere Quelle für Antikörper, derer man sich erfindungsgemäß bedienen kann, sind die so genannten xenogenen Antikörper. Das generelle Prinzip zur Herstellung xenogener Antikörper, so wie humane Antikörper in Mäusen, ist beispielsweise in WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 und WO 96/33735 beschrieben.
Gemäß der Erfindung anzuwendende Antikörper oder deren korrespondierende Immunglobulinkette(n) können durch dem Fachmann bekannte konventionelle Techniken weiter modifiziert werden, beispielsweise durch Anwendung von Aminosäuredeletion(en), -insertion(en), -substitution(en) und/oder -rekombination(en) und/oder (jede) andere dem Fachmann bekannte Modifikationen) entweder alleine oder in Kombination. Verfahren zur Einführung solcher Modifikationen in die der Aminosäuresequenz einer Immunglobulinkette zu Grunde liegenden DNA-Sequenz sind dem Fachmann hinreichend bekannt; siehe beispielsweise Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y.
Die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthaltenen Peptide, Polypeptide und Antikörper können eine weitere Domäne enthalten, die durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen verknüpft ist. Die Verknüpfung kann auf genetischer Fusion gemäß den in Fachkreisen bekannten und oben beschriebenen Methoden basieren oder kann durchgeführt werden durch beispielsweise chemisches Cross-linking, wie z. B. in WO 94/04686 beschrieben. Die im Fusionsprotein zusätzlich anwesende Domäne enthaltend das erfindungsgemäß verwendete Peptid, Polypeptid oder den Antikörper kann vorzugsweise durch einen flexiblen Linker verknüpft sein, vorteilhafter Weise einen Polypeptid-Linker, wobei besagter Polypeptid-Linker mehrfache, hydrophile, Peptid-gebundene Aminosäuren von einer Länge enthält, die ausreicht um die Entfernung zwischen dem C-terminalen Ende besagter weiterer Domäne und dem N-terminalen Ende des Peptids, Polypeptids oder Antikörpers, oder umgekehrt, zu überbrücken. Das oben beschriebene Fusionsprotein kann des weiteren einen spaltbaren Linker oder eine Spaltstelle für Proteinasen enthalten.
Des Weiteren kann besagte weitere Domäne eine vordefinierte Spezifität oder Funktion aufweisen. In der Literatur finden sich beispielsweise ganze Mengen von Verweisen auf das Konzept des Targeting von bioaktiven Substanzen wie Medikamente, Toxine und Enzyme zu spezifischen Stellen im Körper zur Zerstörung oder Ortung von malignen Zellen oder um einen lokalen Medikamenten- oder einen enzymatischen Effekt zu induzieren. Es wurde vorgeschlagen, diesen Effekt durch Konjugation der bioaktiven Substanzen an monoklonale Antikörper zu erreichen (siehe beispielsweise N. Y. Oxford University Press; und Ghose, (1978) J. Natl. Cancer Inst. 61: 657–676).
In diesem Zusammenhang ist es zu verstehen, dass die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung anwesenden Polypeptide durch konventionelle dem Fachmann bekannte Verfahren weiter modifiziert werden können. Dies ermöglicht die Konstruktion von Fusionsproteinen enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, Polypeptid oder den erfindungsgemäßen Antikörper und andere funktionelle Aminosäuresequenzen, z. B. nukleäre Lokalisierungssignale, transaktivierende Domänen, DNA-bindende Domänen, Hormon-bindende Domänen, Protein-Tags (GST, GFP, h-myc-Peptid, FLAG, HA-Peptide), die von heterologen Proteinen abgeleitet sein können. Daher können bei der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung nicht-markierte genauso wie markierte (Poly-)Peptide oder Antikörper verwendet werden.
Beispielsweise können die Peptide, Polypeptide und Antikörper markiert mit einem therapeutischen Wirkstoff verabreicht werden. Diese Wirkstoffe können direkt oder indirekt an die erfindungsgemäßen Antikörper oder (Poly-)Peptide gebunden sein, siehe supra, und sie können so ausgewählt werden, dass sie eine Medikamentenfreisetzung vom Antigen an der Targetstelle ermöglichen. Beispiele für therapeutische Wirkstoffe, die zur Immuntherapie an die (Poly-)Peptide und Antikörper gebunden werden können, sind Medikamente, Radioisotope, Lektine und Toxine. Die Medikamente, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide gekoppelt werden können, schließen Verbindungen ein, die man im klassischen Sinn als Medikamente bezeichnet, wie Mitomycin C, Daunorubicin und Vinblastin.
Bei der Verwendung von radioisotopisch gebundenen erfindungsgemäßen (Poly-)Peptiden oder Antikörpern wie für Immuntherapie sind bestimmte Isotope bevorzugter als andere, in Abhängigkeit von Faktoren wie der Leukozytenverteilung genauso wie der Stabilität und der Emission. Je nach der Autoimmunantwort können manche Emitter anderen vorgezogen werden. Im Allgemeinen sind α- und β-Partikel emittierende Radioisotope bei der Immuntherapie bevorzugt. Bevorzugt sind α-Emitter mit hoher Energie und geringer Reichweite, so wie ²¹²Bi. Beispiele für Radioisotope, die zu therapeutischen Zwecken an die erfindungsgemäßen (Poly-)Peptide und Antikörper gebunden werden können sind ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹²At, ²¹¹Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd und ¹⁸⁸Re.
Lektine sind Proteine, die üblicherweise aus pflanzlichem Material isoliert werden und mit spezifischen Zuckerresten binden. Viele Lektine können auch Zellen agglutinieren und Lymphozyten stimulieren. Rizin jedoch ist ein toxisches Lektin, das in der Immuntherapie verwendet wurde. Dies wird erreicht durch Bindung der Rizin-α-Peptidkette, die für die Toxizität verantwortlich ist, an das Polypeptid, um damit eine ortsspezifische Erzielung des toxischen Effekts zu ermöglichen.
Toxine sind von Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen produzierte giftige Substanzen, die, in ausreichender Dosierung, oft tödlich sind. Diphtherietoxin ist eine Substanz, die vom Corynebacterium diphtheria produziert wird und die therapeutisch verwendet werden kann. Dieses Toxin besteht aus einer α- und einer β-Untereinheit, die unter geeigneten Bedingungen getrennt werden können. Die toxische A-Komponente kann an einen erfindungsgemäßen Antikörper gebunden werden und zum ortsspezifischen Transport zu den interagierenden T-Zellen verwendet werden.
Andere therapeutische Wirkstoffe wie oben beschrieben, die an das erfindungsgemäße Polypeptid gekoppelt werden können, ebenso wie entsprechende ex vivo und in vivo therapeutische Protokolle sind dem Fachmann bekannt bzw. können vom ihm leicht erfasst werden. Wann immer es angemessen ist, kann der Fachmann ein erfindungsgemäßes Polynucleotid verwenden, das im Folgenden beschrieben wird und das eines/n der oben beschriebenen (Poly-)Peptide bzw. Antikörper codiert oder die entsprechenden Vektoren an Stelle des proteinartigen Materials selbst.
Daher wird der Fachmann bereitwillig anerkennen, dass das/der erfindungsgemäße (Poly)Peptid und Antikörper zur Herstellung von Fusionsproteinen mit gewünschter Spezifität und biologischer Funktion verwendet werden kann. Es wird erwartet, dass die (Poly-)Peptide und Antikörper, die dann gegebenenfalls in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden, ebenso wie Fusionsprotein davon, eine wichtige therapeutische und wissenschaftliche Rolle insbesondere im medizinischen Bereich spielen, z. B. bei der Entwicklung neuer Behandlungsansätze für T-Zellabhängige Störungen, so wie bestimmte Arten von Krebs und Autoimmunkrankheiten, oder als interessante Hilfsmittel für Analyse und Modulation der entsprechenden zellulären Transduktions-Signalwege.
Vorzugsweise enthält besagte weitere Domäne ein Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Effektor-Molekülen mit einer Konformation, die geeignet für biologische Aktivität ist, Aminosäuresequenzen, die in der Lage sind, ein Ion zu sequestrieren und Aminosäuresequenzen, die sich selektiv an einen festen Träger oder ein vorher ausgewähltes Antigen binden können. Diese Domäne kann ein Enzym, ein Toxin, einen Rezeptor, eine Bindungsstelle, eine biosynthetische Antikörper-Bindungsstelle, einen Wachstumsfaktor, einen Zelldifferenzierungsfaktor, Lymphokin, Cytokin, ein Hormon, einen bereits aus Entfernung identifizierbaren Rest, einen Anti-Metaboliten, ein radioaktives Atom oder ein Antigen enthalten. Dieses Antigen kann beispielsweise ein Tumorantigen, ein virales Antigen, ein mikrobisches Antigen, ein Allergen, ein Auto-Antigen, ein Virus, ein Mikroorganismus, ein Polypeptid, ein Peptid oder eine Mehrzahl von Tumorzellen sein. Des Weiteren schließt besagte Sequenz, die ein Ion sequestrieren kann, ein Calmodulin, Methallothionein, ein Fragment davon oder eine Aminosäuresequenz angereichert mit wenigstens einer der folgenden Substanzen ein: Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin oder Arginin. Zusätzlich kann besagte Polypeptidsequenz, die selektiv an einen festen Träger binden kann, eine positiv oder negativ geladene Aminosäuresequenz sein, eine Cystein enthaltende Aminosäuresequenz, Avidin, Streptavidin, ein Fragment des Staphylococcus Protein A, GST, ein His-Tag, ein FLAG-Tag, Lex A oder c-myc wie in den Beispielen im Anhang verwendet. Einige der oben beschriebenen Effektor-Moleküle und Aminosäuresequenzen können in einer Vorform anwesend sein, die wiederum entweder aktiv sein kann oder auch nicht und die entfernt werden kann, wenn sie z. B. in eine bestimmte zelluläre Umgebung eintritt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann weiter einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen phosphatgepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Befeuchtungsmitteln, sterile Lösungen etc. Solche Träger umfassende Zusammensetzungen können durch wohlbekannte konventionelle Verfahren formuliert werden. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Subjekt in einer geeigneten Dosierung verabreicht werden. Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen kann auf verschiedene Arten erfolgen, z. B. durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung. Der Dosierungsplan wird vom verantwortlichen Arzt und von klinischen Faktoren bestimmt werden. Wie im medizinischen Bereich bestens bekannt ist, hängt die Dosierung für einen jeden Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich Körpergröße, Körperoberfläche, Alter, die spezielle zu verabreichende Verbindung, Geschlecht, Zeitpunkt und Weg der Verabreichung, allgemeiner Gesundheitszustand und andere Medikamente, die gleichzeitig verabreicht werden. Eine typische Dosierung kann z. B. im Bereich von 0.0001 bis 1000 μg (oder von Nucleinsäure zur Expression oder zur Inhibition der Expression in diesem Bereich); Dosierungen unter oder über diesem exemplarischen Bereich werden in Betracht gezogen, besonders unter Erwägung der zuvor erwähnten Faktoren. Im Allgemeinen sollte der Dosierungsplan, sofern es um die regelmäßige Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung geht, in einem Bereich von 1 μg- bis 10 mg-Einheiten pro Tag liegen. Sieht der Dosierungsplan eine kontinuierliche Infusion vor, so sollte er ebenfalls in einem Bereich von jeweils 1 μg bis 10 mg-Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute liegen. Fortschritte können durch periodische Beurteilungen überwacht werden. Verschiedene Dosierungen sind möglich, eine bevorzugte Dosierung für intravenöse Verabreichung von DNA liegt jedoch bei circa 10⁶ bis 10¹² Kopien des DNA-Moleküls. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können lokal oder systemisch verabreicht werden. Im Allgemeinen wird die Verabreichung parenteral, z. B. intravenös erfolgen; DNA kann auch direkt an der Targetstelle verabreicht werden, z. B. durch biolistischen Beschuss einer internen oder externen Targetstelle oder mit einem Katheter zu einer Stelle in einer Arterie. Zubereitungen für parenterale Verabreichung schließen ein wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Wässrige Träger schließen ein Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen einschließlich salinische und gepufferte Medien. Parenterale Trägersubstanzen schließen ein Natriumchloridlösung, Ringersche Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, milchsaure Ringersche Lösung oder fixierte Öle. Intravenöse Trägersubstanzen schließen ein flüssige und nährende Regenerate, elektrolytische Regenerate (wie die auf der Ringerschen Dextrose basierenden) und ähnliche. Konservierungsstoffe und andere Zusätze können auch anwesend sein wie z. B. Mikrobizide, Antioxidanzien, Chelatbildner, inerte Gase und dergleichen. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung weitere Wirkstoffe enthalten wie T-Zell-kostimulatorische Moleküle oder dem Stand der Technik bekannte Cytokine oder deren Inhibitoren oder Aktivatoren, abhängig von der beabsichtigten Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung.
Des Weiteren ist durch die vorliegende Erfindung geplant, dass die verschiedenen Polynucleotide und Vektoren, die die oben beschriebenen Peptide oder Polypeptide codieren, entweder alleine oder in Kombination verabreicht werden unter der Verwendung von standardisierten Vektoren und/oder Gentransportsystemen, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Polynucleotid alleine oder als Teil eines Vektors verwendet werden, um das erfindungsgemäße (Poly-)Peptid in Zellen zu exprimieren, z. B. zur Gentherapie oder Diagnostizierung von durch T-Zellstörungen verursachten Krankheiten. Die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Vektoren werden in die Zellen eingeführt, die wiederum das (Poly-)Peptid produzieren. Nach der Verabreichung können besagte Polynucleotide stabil in das Genom des Subjekts integriert werden. Andererseits können virale Vektoren verwendet werden, die spezifisch für bestimmte Zellen oder Gewebe sind und in besagten Zellen persistieren. Geeignete pharmazeutische Träger sind dem Stand der Technik hinreichend bekannt. Die erfindungsgemäß bereiteten pharmazeutischen Zusammensetzungen können für die Verhütung, die Behandlung oder das Aufschieben verschiedener Arten von Krankheiten, die mit T-Zell-verbundenen Immunschwächen und bösartigen Zellveränderungen zusammenhängen, verwendet werden.
Darüber hinaus ist es möglich, eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, die erfindungsgemäßes Polynucleotid oder erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, in der Gentherapie zu verwenden. Die Gentherapie, die auf der Einführung therapeutischer Gene in Zellen mittels Ex-vivo- oder In-vivo-Techniken basiert, ist eine der bedeutendsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren und Verfahren für die In-vitro- oder In-vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und dem Fachmann hinreichend bekannt; siehe beispielsweise Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534–539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911–919; Anderson, Science 256 (1992), 808–813; Isner, Lancet 348 (1996), 370–374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077–1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714–716; WO94/29469; WO 97/00957 oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635–640, und darin zitierte Referenzen. Die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Vektoren können für die direkte Einführung oder für die Einführung mittels Liposomen oder viraler Vektoren (z. B. adenoviral, retroviral) in die Zelle bestimmt werden. Vorzugsweise ist besagter Vektor ein Expressionsvektor und/oder ein Gentransfer- oder Targetingvektor. Von Viren wie Retroviren, Vakziniaviren, Adeno-assoziierte Viren, Herpesviren oder Rinder-Papillomaviren abgeleitete Expressionsvektoren können für das Einbringen der erfindungsgemäßen Polynucleotide oder des erfindungsgemäßen Vektors in Target-Zellpopulationen verwendet werden. Bevorzugt ist besagte Zelle eine Keimlinienzelle, eine embryonale Zelle oder eine davon abgeleitete Eizelle, insbesondere bevorzugt ist diese Zelle eine Stammzelle. Wie zuvor erwähnt, können geeignete Gen-Einschleusungssysteme u. a. Liposomen, rezeptorvermittelte Transportsysteme, nackte DNA und virale Vektoren wie Herpesviren, Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren sein. Die Verbringung von Nucleinsäuren zu einer spezifischen Stelle im Körper zur Gentherapie kann auch mittels eines biolistischen Beschusssystems erreicht werden, so wie das von Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726–2729) beschriebene. Es ist zu verstehen, dass die eingeführten Polynucleotide und Vektoren das Genprodukt nach Einführung in besagte Zelle exprimieren und vorzugsweise in diesem Zustand bleiben, so lange die Zelle lebt. Beispielsweise können Zelllinien, die das Polynucleotid unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen stabil exprimieren, gemäß dem Fachmann hinreichend bekannten Verfahren konstruiert werden. Noch besser als die Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsquellen enthalten, ist die Transformierung von Wirtszellen mit dem erfindungsgemäßen Polynucleotid und einem selektierbaren Marker auf entweder dem gleichen oder auf gesonderten Plasmiden. Nach der Einführung von fremder DNA kann den veränderten Zellen ein 1–2tägiges Wachstum in einem angereicherten Medium gestattet werden, woraufhin sie in ein selektives Medium umgebettet werden. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht der Selektion Resistenz und erlaubt die Selektion der Zellen, die das Plasmid stabil in ihre Chromosomen integriert haben und Wachsen, um Foci zu bilden, die dann wiederum kloniert und zu Zelllinien expandiert werden können. Solche hergestellten Zelllinien sind auch besonders nützlich bei Screeningverfahren zum Nachweis von Verbindungen die z. B. an der T-Zellaktivierung oder -stimulation beteiligt sind.
Es können eine Reihe von Selektionssystemen verwendet werden, einschließend, aber nicht begrenzt auf, die Herpes-simplex-Virus-Thymidin-Kinase (Wigler, Cell 11(1977), 223), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026), und Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy, Cell 22 (1980), 817) in tk^–, hgprt^– bzw. aprt^– Zellen. Des Weiteren kann Antimetaboliten-Resistenz verwendet werden als Basis für die Selektion von dhfr, das gegen Methotrexat resistent macht (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527), für gpt, das gegen Mycophenolsäure resistent macht (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); für neo, das gegen Aminoglycosid G-418 resistent macht (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1); für hygro, das gegen Hygromycin resistent macht (Santerre, Gene 30 (1984) 147) oder Puromycin (pat, puromycin N-acetyl transferase). Zusätzliche selektierbare Gene wurden beschrieben, z. B. trpB, das Zellen die Verwendung von Indol an Stelle von Tryptophan erlaubt; hisD, das Zellen die Verwendung von Histinol an Stelle von Histidin erlaubt (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); und ODC (Ornithindecarboxylase), das gegen den Ornithindecarboxylase-Inhibitor 2-(Difluoromethyl)-DL-Ornithin resistent macht, DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung enthaltend irgendeines/n der oben beschriebenen Proteine, Antikörper, (Poly)Peptide, Polynucleotide, Vektoren oder Zellen und gegebenenfalls geeignete Mittel zum Nachweis. Die oben beschriebenen (Poly-)Peptide und Antikörper sind beispielsweise geeignet zur Verwendung in Immunassays, wo sie in flüssigem Zustand oder an einen im festen Zustand befindlichen Träger gebunden verwendet werden können. Beispiele für Immunassays, die besagtes (Poly-)Peptid verwenden können, sind kompetitive und nicht-kompetitive Immunassays in entweder direktem oder indirektem Format. Beispiele für solche Immunassays sind der Radioimmunassay (RIA), der Sandwich-(immunometrischer Assay) oder der Western-Blot-Assay. Die (Poly-)Peptide und Antikörper können an viele verschiedene Träger gebunden sein und zur Isolation von Zellen, die spezifisch an besagte Polypeptide gebunden sind, verwendet werden. Beispiele für hinreichend bekannte Träger schließen ein Glas, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Dextran, Nylon, Amylosen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Für die Verwendungen der Erfindung kann der Träger löslich oder nicht-löslich sein.
Dem Fachmann sind viele verschiedene Markierungen und Verfahren zur Markierung bekannt. Beispiele für Arten von in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Markierungen schließen ein Enzyme, Radioisotope, kolloidale Metalle, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen und biolumineszente Verbindungen; siehe auch die vorstehend diskutierten Ausführungsformen.
Besagte diagnostische Zusammensetzungen können auch für Verfahren zum Expressionsnachweis eines erfindungsgemäßen Polynucleotids durch Nachweis des Vorhandenseins von mRNA, die ein TIRC7-Membranprotein codiert, verwendet werden, was den Erhalt von mRNA aus einer Zelle und Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit einer ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül von mindestens 15 Nucleotiden, das unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen spezifisch mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotid hybridisieren kann (siehe auch supra), enthaltenden Sonde, den Nachweis des Vorhandenseins von an die Sonde hybridisierter mRNA und damit den Nachweis der TIRC7-Expression durch die Zelle beinhaltet.
Des Weiteren umfasst die Erfindung Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines TIRC7-Membranproteins in einer Probe, z. B. einer Zellprobe, was den Erhalt der Zellprobe von einem Subjekt, das Inkontaktbringen besagter Probe mit einem der vorstehend genannten Antikörper unter die Bindung des Antikörpers an das TIRC7-Protein erlaubenden Bedingungen und den Nachweis der so gebundenen Antikörper durch beispielsweise Immunassay-Techniken wie Radioimmunassay oder Enzymimmunassay beinhaltet. Des Weiteren kann der Fachmann Polypeptide, die funktionelle TIRC7-Proteine sind, spezifisch nachweisen und von mutierten Formen, die ihre T-Zell-stimulatorische Aktivität verloren oder geändert haben, unterscheiden durch Verwendung eines Antikörpers, der entweder ein (Poly-)Peptid mit TIRC7-Aktivität spezifisch erkennt, nicht jedoch eine inaktive Form davon, oder der eine inaktive Form spezifisch erkennt, nicht jedoch das entsprechende Polypeptid mit TIRC7-Aktivität. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch in der Affinitätschromatographie verwendet werden, um das TIRC7-Membranprotein oder oben beschriebene (Poly-)Peptide zu reinigen und diese von verschiedenen Quellen zu isolieren.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Diagnose einer Prädisposition in einem Subjekt zu einer mit der Expression eines TIRC7-Allels assoziierten Störung, umfassend die Isolierung der DNA von Betroffenen, die an einer mit Unter- oder Überexpression eines TIRC7-Proteins assoziierten Störung leiden; Verdauung der isolierten DNA mit wenigstens einem Restriktionsenzym; elektrophoretische Trennung der resultierenden DNA-Fragmente auf einem Sizing-Gel; Inkontaktbringen des resultierenden Gels mit einer wie oben beschriebenen Nucleinsäuresonde, die spezifisch an ein TIRC7-Protein codierende DNA hybridisieren kann und mit einem nachweisbaren Marker markiert ist; Nachweis markierter Bänder auf dem Gel, welche an die markierte Sonde hybridisiert haben um ein für die DNA von Personen, die von der mit der Expression eines TIRC7-Proteins assoziierten Störung betroffen sind, spezifisches Bandenmuster zu bilden; Präparieren der DNA des Subjekts gemäß den oben beschriebenen Schritten, um nachweisbare markierte Bänder auf einem Gel zu produzieren; und Vergleich des für die DNA von Betroffenen, die an einer mit der Expression eines TIRC7-Proteins assoziierten Störung leiden, spezifischen Bandenmusters, um zu bestimmen, ob die Muster gleich oder unterschiedlich sind und um dadurch die Prädisposition zu dieser Störung zu diagnostizieren, falls die Muster gleich sind. Die nachweisbaren Marker der vorliegenden Erfindung können mit allgemein angewandten radioaktiven Markierungen markiert werden, wie z. B. ³²P und ³⁵S, es können jedoch auch andere Markierungen, wie Biotin oder Quecksilber, genauso wie die oben beschriebenen verwendet werden. Verschiedene dem Fachmann hinreichend bekannte Verfahren können zur Markierung von nachweisbaren Markern verwendet werden. Zum Beispiel können DNA-Sequenzen und RNA-Sequenzen mit ³²P oder ³⁵S markiert werden unter Anwendung des Random-Primer-Verfahrens. Nachdem ein geeigneter nachweisbarer Marker erhalten wurde, können verschiedene dem Fachmann hinreichend bekannte Verfahren verwendet werden, um den nachweisbaren Marker mit der relevanten Probe in Kontakt zu bringen. Es können beispielsweise DNA-DNA, RNA-RNA und DNA-RNA-Hybridisierungen gemäß standardisierten Verfahren durchgeführt werden. Verschiedene Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren sind dem Fachmann hinreichend bekannt, z. B. Southern- und Northern-Blotting, PCR, Primer-Extension und dergleichen. Des Weiteren kann die vom Subjekt erhaltene mRNA, die cRNA, die cDNA oder die genomische DNA sequenziert werden, um Mutationen zu identifizieren, die charakteristische Fingerabdrücke von TIRC7-Mutationen bei mit der Expression von TIRC7 oder mutierten Versionen davon assoziierten Störungen sein können. Des Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren, in denen solch ein Fingerabdruck mit aus dem Subjekt erhaltenen RFLPs von DNA oder RNA generiert werden kann, gegebenenfalls kann die DNA oder RNA vor der Analyse amplifiziert werden, Verfahren dazu sind dem Fachmann hinreichend bekannt. RNA-Fingerabdrücke können durchgeführt werden durch z. B. Verdauen einer aus dem Subjekt erhaltenen RNA-Probe mit einem geeigneten RNA-Enzym, wie beispielsweise RNase T₁, RNase T₂ oder dergleichen oder einem Ribozym, und z. B. durch elektrophoretische Trennung und Nachweis des RNA-Fragments auf PAGE, wie oben oder in den angehängten Beispielen beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wenigstens ein zweites Agens, vorzugsweise ein Agens, das abhängig von der beabsichtigten Verwendung T-Zellstimulation inhibiert oder aktiviert. Solche Agenzien schließen beispielsweise ein Moleküle, die die Rezeptor-Ligand-Interaktion oder dergleichen blocken oder nachahmen können, was je nachdem T-Zellsuppression oder -aktivierung nach sich zieht.
Solche Wirkstoffe umfassen die, die die Aktivität von beispielsweise kostimulatorischen Molekülen, Integrinen, lg-Superfamily-Molekülen, Selektinen blockieren ebenso wie Medikamente, die Chemokine und deren jeweilige Rezeptor-Interaktionen blockieren, Medikamente, die die IL2/IL2-Rezeptor-Interaktion blockieren und andere handelsübliche immunosuppressive Medikamente so wie IL-2R mAbs, IL-Toxine und IL-Muteine. Beispiele für kostimulatorische Moleküle und deren Liganden sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. in Schwartz, Cell 71 (1992), 1065–1068. Die Unterbrechung der Rezeptor-Ligand-Interaktionen durch die Verwendung von mAbs oder löslichem CTLA41g für die Interaktion zwischen CD28 zu B7-2 und CTLA4 zu B7-1 und B7-2 ist beschrieben in Blazar, J. Immunol. 157 (1996), 3250–3259; Bluestone, Immunity 2 (1995), 555–559; Linsley, Science 257 (1992), 792–95. Beispiele für die Blockierung der Rezeptor-Ligand-Interaktion durch die Verwendung von mAbs an CD40 oder CD40L wurden beschrieben von Burden, Nature 381 (1996), 434–435; Kirk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 8789–8794 CD2-Antigen und sein Ligand LFA-3 sind beschrieben in Bagogui Li et al., review in Adhesion Molecules, Fusion proteins, Novel Peptides, and Monoclonal Antibodies, Recent Developments in Transplantation Medicine, Vol. II, 1995, Physicians & Scientists Publishing Co., Inc. und die Blockierung ihrer Interaktion durch Verwendung von mAbs (anti-Leu-5b, OKT11, T11) ist beschrieben in Brumberg, Transplantation 51 (1991) 219–225 or CD2.1gG1 fusion protein. Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen CD4-Moleküle ist beschrieben in Cosimi, Surgery 108 (1990), 406–414. CD47-Blockade wird beschrieben von Rheinhold, J. Exp. Med. 185 (1997), 1–11. Integrine und lg-Superfamily-Moleküle schließen ein LFA-1 mit seinem Liganden ICAM-1, -2, -3, Mac-1 mit seinem Liganden ICAM-1, -3; ICAM-1 mit seinem Liganden LFA-1, Mac-1, CD43; ICAM-2 mit seinem Liganden LFA-1; ICAM-3 mit seinem Liganden LFA-1, Mac-1; VLA4 und VCAM-1, siehe z. B. David, Adams, Übersichtsartikel in Adhesion Molecules, Fusion proteins, Novel Peptides, and Monoclonal Antibodies, Recent Developments in Transplantation Medicine, Vol. II, 1995, Physicians & Scientists Publishing Co., Inc.; Isobe, Science, 255 (1992), 1125–1127; Cosimi, J. Immunology 144 (1990), 4604–4612; Hynes, Cell 69 (1992), 11–25. Des Weiteren können verwendet werden selektiv interferierende Agenzien mit VLA-4 mAbs an der alpha4-Integrinkette (CD49d), betal-Integrinkette (CD29) oder ein aktivierungsinduziertes Neoepitop von VLA-4 ebenso wie lösliche VLA-4-Liganden, so wie lösliches Fibronektin oder sein relevantes Peptid (GPEILDVPST), oder lösliches VCAM-1 oder sein relevantes Peptid. Weitere selektiv blockierende Agenzien sind Antisense-Oligonucleotide, die dazu bestimmt sind, mit zytoplasmischer alpha4-, betal- oder VCAM-1-mRNA zu hybridisieren; Fedoseyeva, J. Immunol. 57 (1994), 606–612.
Ein weiteres Beispiel ist das Medikament Pentoxifyllin (PTX), das die Expression von VCAM-1 blockieren kann; Besler, J. Leukoc. Biol. 40 (1986), 747–754. Des Weiteren könnten VCAM-1 mAb, M/K-2, anti-murine beispielsweise die Überlebensdauer von Allotransplantaten verlängern, Orosz, Transplantation, 56 (1993), 453–460.
Blockieren der Mitglieder der Integrinfamilie und deren Liganden durch die Verwendung von mAbs ist beschrieben in Kupiec-Weglinski, Übersichtsartikel in Adhesion Molecules, Fusion proteins, Novel Peptides, and Monoclonal Antibodies, Recent Developments in Transplantation Medicine, Vol. II, 1995, Physicians & Scientists Publishing Co., Inc.
Selektine, z. B., L-Selektin (CD62L), E-Selektin (CD62E), P-Selektin (CD62P) wurden beschrieben in Forrest and Paulson, Selectin family of adhesion molecules. In: Granger und Schmid-Schonbein, eds. Physiology and Pathophysiology of Leukocyte Adhesion. New York, Oxford Press, 1995, pp 68–146.
Die Kombination von konventionellen immunosuppressiven Medikamenten, z. B. ATG, ALG, OKT3, Azathioprin, Mycophenylat, Mofetyl, Cyclosporin A, FK506, Corticosteroide kann verwendet werden wie beschrieben in Cosimi, Transplantation 32 (1981), 535–539; Shield, Transplantation 38 (1984), 695–701.
Die Interruption von Chemokinen und Interaktionen mit deren jeweiligem Rezeptor durch die Verwendung von mAbs ist besprochen in Luster, Chemokines-chemotactic cytokines that mediate inflammation, New Engl. J. Med. Feb. (1998), 436–445.
Daher kann jeder wie oben beschriebene und in den Beispielen erwähnte Wirkstoff in Übereinstimmung mit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung oder den im Folgenden beschriebenen Verfahren und Anwendungen verwendet werden. Andererseits ist es dem Fachmann offensichtlich, dass die erfindungsgemäßen Polynucleotide, Vektoren, Proteine, Peptide, Polypeptide, Antikörper, Zellen und pharmazeutischen Zusammensetzungen in für die oben erwähnten T-Zell-kostimulatorischen Moleküle, Inhibitoren und Medikamente beschriebenen Verfahren und Anwendungen verwendet werden können.
Vorteilhafter Weise ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung bestimmt zur Verwendung bei der Organtransplantation, zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, allergischen oder infektiösen Krankheiten oder zur Behandlung von Tumoren. Ein Beispiel für die Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verbesserung der Allotransplantats- oder Xenotransplantatstoleranz ist im Hinblick auf die Verabreichung eines LFA-3- bzw. CD2-bindenden Proteins in WO93/06852 beschrieben.
Des Weiteren betrifft diese Erfindung Verfahren zur Modulation von (antigenspezifischer) T-Zellunempfindlichkeit. Der Begriff „T-Zellunempfindlichkeit" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Reduktion von oder einen Mangel an T-Zellproliferation, lymphokiner Sekretion oder Induktion von Effektorfunktionen durch eine T-Zelle, wenn sie dem Antigen (oder einem Antigenanteil) ausgesetzt wird. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung liefern eine Möglichkeit, die Unempfindlichkeit einer T-Zelle gegenüber einem Antigen in vitro oder in vivo zu induzieren, aufrecht zu erhalten oder umzukehren. Dementsprechend sind die Verbindungen dieser Erfindung besonders nützlich zur Modulation von (antigenspezifischer) T-Zellunempfindlichkeit. Der Begriff „Modulation" ist beabsichtigt sowohl die Induktion und Aufrechterhaltung eines unempfindlichen Zustands als auch die Umkehrung eines unempfindlichen Zustands, d. h. die Wiederherstellung der T-Zellempfindlichkeit, zu beinhalten.
Wie in Beispiel 3 beschrieben, verbleiben T-Zellen nach einer anti-TIRC7-Antikörper-Behandlung in einem unempfindlichen aber funktionellen Zustand, da exogen rekombinantes IL-2 den antiproliferativen Effekt der Antikörper umgekehrt hat. Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer anderen Ausführungsform ein In-vitro-Verfahren zur Induktion oder Aufrechterhaltung der Unempfindlichkeit einer T-Zelle gegenüber einem Antigen, umfassend das Inkontaktbringen der T-Zelle mit einem Agens, das die Stimulation der T-Zelle durch ein TIRC7-Membranprotein inhibiert. Anleitungen zur Ausführung von Verfahren zur Modulation von T-Zellunempfindlichkeit sind dem Fachmann allgemein bekannt und sind z. B. beschrieben in WO95/24217 und den darin zitierten Referenzen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Agens, das die T-Zellstimulation durch ein TIRC7-Membranprotein inhibiert, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion oder Aufrechterhaltung der T-Zellunempfindlichkeit gegenüber einem Antigen in einem Subjekt. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Anwendungen können mit geprimten oder ungeprimten T-Zellen verwendet werden, je nachdem was der Fachmann damit beabsichtigt.
Vorzugsweise blockiert im erfindungsgemäßen Verfahren oder der erfindungsgemäßen Anwendung das Agens eine Interaktion des TIRC7-Membranproteins mit seinem Liganden. Wie oben beschrieben, legen die Resultate der erfindungsgemäß durchgeführten Experimente die Existenz eines Liganden nahe, der mit TIRC7 interagiert und dadurch die T-Zellproliferation stimuliert. Die Blockierung besagter Interaktion, z. B. durch Antikörper oder lösliche vom TIRC7-Membranprotein abgeleitete (Poly-)Peptide, sollte zu einer T-Zellunempfindlichkeit führen. Daher ist in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der erfindungsgemäßen Anwendung das Agens ein Polynucleotid, ein Vektor, eine Zelle, Peptid oder Polypeptid oder ein Antikörper, wie vorstehend beschrieben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das oben beschriebene Verfahren oder die oben beschriebene Anwendung die Verwendung eines zweiten Agens wie oben definiert.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein erstes Agens, das eine T-Zelle durch ein TIRC7-Membranprotein stimuliert und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Wie dem Fachmann unmittelbar klar sein wird, öffnet die Bereitstellung des neuen erfindungsgemäßen TIRC7-Proteins den Weg für alternative Vorgehensweisen für die T-Zellstimulation und die Behandlung von entsprechenden Krankheiten. Es ist zu erwarten, dass das die T-Zelle durch den TIRC7-Membranprotein stimulierenden Wirkstoff die Proliferation von (aktivierten) T-Zellen beträchtlich steigern wird und somit die Immunantwort verstärken kann. Beispiele für diese Art von „Vakzine" sind z. B. beschrieben in WO91/11194 und beispielsweise in der Literatur, auf die oben Bezug genommen wurde. Solche Agenzien umfassen auch Promotoren, die vor der codierenden Region des das TIRC7-Protein codierenden Gens eingefügt werden können, z. B. durch Gentransfer und homologe Rekombination in der 5'-untranslatierten Region des Gens, siehe auch supra. Ein solcher Promotor kann reguliert werden und damit die kontrollierte Expression des TIRC7-Proteins in bestimmten Zellen erlauben.
Vorzugsweise ist besagter Wirkstoff ein Ligand des TIRC7-Membranproteins oder ist wenigstens einer der oben beschriebenen anti-TIRC7-Membranprotein-Antikörper.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung des Weiteren ein zweites Agens, das die T-Zellproliferation stimuliert, z. B. IL-2, IL-4 oder ein Agens, das eine T-Zelle durch einen CD2-, CD28-, CD40- oder CTLA4-Oberflächenrezeptor stimuliert.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein In-vitro-Verfahren für die Wiederherstellung der Empfindlichkeit gegen ein Antigen durch eine T-Zelle, die dem Antigen gegenüber unempfindlich ist, umfassend das Inkontaktbringen der T-Zelle in der Anwesenheit des Antigens mit einem ersten Wirkstoff, der die T-Zelle durch ein TIRC7-Membranprotein stimuliert. Neben der Anwendung des Liganden selbst, kann besagter TIRC7-Ligand auch vorzugsweise auf der Zelloberfläche exprimiert werden, indem man ein den TIRC7-Liganden in einer für die Expression des TIRC7-Liganden auf der Zelloberfläche geeigneten Form codierendes Nucleinsäuremolekül in die Zelle einführt. Vorzugsweise ist die Zelle eine Tumorzelle. Vektoren und Verfahren für die Einführung eines solchen Nucleinsäuremoleküls sind dem Fachmann hinreichend bekannt und sind auch z. B. oben beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann des Weiteren das Inkontaktbringen der T-Zelle mit einem zweiten Wirkstoff umfassen, wie es für die pharmazeutischen Zusammensetzungen oben definiert wurde. Vorzugsweise wird die T-Zelle mit dem zweiten Agens vor Kontakt mit dem ersten Agens in Kontakt gebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das zweite Agens, vorzugsweise CD2-, CD28-, CTLA4-Ligand oder CD40, auf der Zelloberfläche exprimiert, indem man ein den CD2-, CD28-, CTLA4-Liganden oder CD40 codierendes Nucleinsäuremolekül in einer zur Expression besagtes Liganden auf der Zelloberfläche geeigneten Form in die Zelle einführt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines ersten Wirkstoffs wie oben definiert, welcher in der Lage ist, eine T-Zelle durch ein TIRC7-Membranprotein zu stimulieren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Stimulation einer T-Zellantwort gegen eine Tumorzelle in einem Subjekt mit einem Tumor. Solche Wirkstoffe umfassen beispielsweise auch bispezifische Antikörper wie oben beschrieben. Vorzugsweise wird die Tumorzelle modifiziert, so dass sie einen TIRC7-Liganden und/oder einen CD2-, CD28-, CTLA4-Liganden oder CD40 vorzugsweise auf der Tumorzelloberfläche exprimiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anwendung wird die Tumorzelle vom Subjekt erhalten, ex vivo modifiziert um eine modifizierte Tumorzelle zu bilden und besagte Tumorzelle wird für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet, die zur Verabreichung an das Subjekt bestimmt ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anwendung werden die T-Zellen von einem Subjekt erhalten, mit IL-2 oder IL-4 ex vivo in Kontakt gebracht und besagte modifizierte T-Zellen werden zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet, die zur Verabreichung an das Subjekt bestimmt ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Anwendungen, Verfahren und pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verabreichung an ein Subjekt gedacht, das Empfänger einer Knochenmarks- oder einer peripheren Stammzellentransplantation ist. Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung zum Inkontaktbringen mit Knochenmark oder peripheren Stammzellen vor der Transplantation in den Empfänger bestimmt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahren und Anwendungen der vorliegenden Erfindung in der Organtransplantation, der peripheren Stammzellentransplantation oder für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten oder Allergien eingesetzt.
Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von T-Zellaktivierenden oder -kostimulatorischen Verbindungen oder zur Identifizierung von Inhibitoren der T-Zellaktivierung oder -stimulation umfassend

(a) Kultivierung von T-Zellen in der Anwesenheit des wie oben beschriebenen TIRC7-Proteins, (Poly-)Peptids, Antikörpers oder der wie oben beschriebenen Zelle und, gegebenenfalls in der Anwesenheit einer Verbindung, die ein erkennbares Signal als Antwort auf die T-Zellaktivierung liefern kann, mit einer zum Screenen bestimmten Verbindung unter Bedingungen, die eine Interaktion der Verbindung mit dem TIRC7-Protein, (Poly-)Peptid, Antikörper oder der/den Zelle(n) erlauben; und
(b) Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines durch die Interaktion der Verbindung mit der Zelle generierten Signals.

Der Begriff „Verbindung" im erfindungsgemäßen Verfahren schließt eine einzelne Substanz oder eine Mehrzahl von Substanzen ein, die identisch sein können oder auch nicht.
Besagte Verbindungen) kann/können, z. B. Proben, z. B. Zellextrakte aus beispielsweise Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen umfassen. Des Weiteren können besagte Verbindungen zwar dem Stand der Technik bekannt sein, es kann jedoch bisher nicht bekannt sein, dass sie die T-Zellaktivierung inhibieren können bzw. dass sie als T-Zell-kostimulatorischer Faktor nützlich sind. Die Mehrzahl von Verbindungen können z. B. zum Kulturmedium hinzugefügt oder in die Zelle injiziert werden.
Wenn eine Probe, die (eine) Verbindungen) enthält, im erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wird, ist es entweder möglich, die Verbindung von der ursprünglichen Probe, die als die fragliche Verbindung enthaltend identifiziert wurde, zu isolieren oder man kann die ursprüngliche Probe weiter unterteilen, wenn sie beispielsweise aus einer Mehrzahl verschiedener Verbindungen besteht, um so die Anzahl unterschiedlicher Substanzen pro Probe zu reduzieren und das Verfahren mit den Untereinheiten der ursprünglichen Probe zu wiederholen. Es kann dann durch dem Stand der Technik bekannte Verfahren, wie hierin und in den angehängten Beispielen beschrieben, bestimmt werden, ob besagte Probe oder Verbindung die gewünschten Eigenschaften aufweist. Je nach Komplexität der Proben können die oben beschriebenen Schritte mehrmals durchgeführt werden, vorzugsweise bis die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Probe nur noch eine begrenzte Anzahl von Substanzen oder nur noch eine Substanz enthält. Vorzugsweise umfasst besagte Probe Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften, im besonders bevorzugten Fall sind besagte Substanzen identisch. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können vom Fachmann leicht durchgeführt und gestaltet werden, z. B. in Übereinstimmung mit anderen auf Zellen basierenden Assays, die im Stand der Technik beschrieben sind (siehe z. B. EP-A-0 403 506) oder durch Verwendung und Modifikation der Verfahren wie in den angehängten Beispielen beschrieben. Des Weiteren wird der Fachmann umgehend erkennen, welche weiteren Verbindungen oder Zellen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden können, z. B. B-Zellen, Interleukine oder Enzyme, die nötigenfalls beispielsweise eine bestimmte Vorstufe in die Verbindung konvertieren, was wiederum die T-Zellaktivierung stimuliert oder unterdrückt, oder die (ko-)stimulatorische Signale liefern. Eine solche Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt durchaus im Bereich der Fähigkeiten eines Fachmanns und kann ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt werden.
Verbindungen, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können umfassen Peptide, Proteine, Nucleinsäuren einschließlich cDNA-Expressionsbibliotheken, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Liganden, peptidomimetische Substanzen, PNAs und dergleichen. Besagte Verbindungen können ebenso funktionelle Derivate oder Analoge bekannter T-Zellaktivatoren oder -inhibitoren sein. Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten und Analogen sind dem Fachmann hinreichend bekannt und werden beschrieben in z. B. Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U.S.A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Des Weiteren können besagte Derivate und Analoge gemäß dem Stand der Technik bekannten oder wie z. B. in den angehängten Beispielen beschrieben Verfahren auf ihre Effekte getestet werden. Des Weiteren können peptidomimetische Substanzen und/oder computergestütztes Design von geeigneten Aktivatoren oder Inhibitoren der T-Zellaktivierung verwendet werden, z. B. gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren. Geeignete Computerprogramme können zur Identifikation von interaktiven Stellen eines potentiellen Inhibitors und des TIRC7-Proteins durch computergestützte Recherchen nach komplementären Strukturmotiven verwendet werden (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114–120). Weitere geeignete Computersyteme für das computergestützte Design von Protein und Peptiden sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. in Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033–1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1–13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987–5991. Die bei der oben beschriebenen Computeranalyse erhaltenen Resultate können in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um z. B. bekannte T-Zellaktivatoren oder -inhibitoren zur optimieren. Geeignete peptidomimetische Substanzen können ebenso durch die Synthese von peptidomimetischen kombinatorischen Bibliotheken durch sukzessive chemische Modifikation wie hierin und in den angehängten Beispielen beschrieben. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von peptidomimetischen kombinatorischen Bibliotheken sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. in Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220–234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709–715. Des Weiteren kann die dreidimensionale und/oder kristallographische Struktur von Inhibitoren oder Aktivatoren der T-Zellstimulation verwendet werden zur Konstruktion von peptidomimetischen Inhibitoren oder Aktivatoren der T-Zellstimulation, die im erfindungsgemäßen Verfahren zu testen sind (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933–12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545–1558).
Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifikation von Verbindungen bereit, die T-Zell-vermittelte Immunantworten modulieren können. Dementsprechend sind Verbindungen, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung dahingehend identifiziert wurden, ob sie Inhibitoren bzw. Aktivatoren der T-Zellstimulation sind, auch im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Verbindungen, denen nachgewiesen wurde, dass sie T-Zell-vermittelte Antworten aktivieren, können bei der Behandlung von Krebs oder damit verbundenen Krankheiten verwendet werden. Zusätzlich kann es auch möglich sein, virale Krankheiten spezifisch zu inhibieren und dabei eine virale Infektion oder die Verbreitung der Viren zu verhindern. Als Suppressoren der T-Zellaktivierung oder -stimulation identifizierte Verbindungen können verwendet werden für z. B. die Behandlung von Hautbeschwerden (siehe z. B. WO93/06866) oder bei der allogenen oder xenogenen Organtransplantation, um eine Abstoßung des Transplantats zu verhindern; siehe auch supra.
Es wird daher erwartet, dass die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Verbindungen sehr nützlich bei diagnostischen und besonders bei therapeutischen Anwendungen sind.
Daher betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend die Formulierung und gegebenenfalls Synthetisierung der in Schritt (b) des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Verbindung in pharmazeutisch akzeptabler Form. Daher betrifft die vorliegende Erfindung allgemein ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen Agens umfassend die erfindungsgemäße Synthetisierung der Proteine, (Poly-)Peptide, Polynucleotide, Vektoren, Antikörper oder Verbindungen in einer Menge, die ausreichend ist, um besagtes Agens in einer therapeutisch wirksamen Menge an den Patienten zu geben.
Verfahren zur Synthetisierung dieser Agenzien sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und z. B. oben beschrieben.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten therapeutisch nützlichen Verbindungen können einem Patienten durch jedwede für die individuelle Verbindung geeignete Methode verabreicht werden, z. B. oral, intravenös, parenteral, transdermal, transmucosal oder durch Operation oder Implantation (z. B. mit der Verbindung in Form einer festen oder halbfesten biologisch abbaubaren und resorbierbaren Matrix), an oder in der Nähe der Stelle, an der die Wirkung der Verbindung gewünscht wird. Therapeutische Dosierungen werden durch einen Fachmann als geeignet bestimmt, siehe auch supra.
Solche nützlichen Verbindungen können beispielsweise transagierende Faktoren sein, die an das erfindungsgemäße TIRC7-Protein binden. Identifikation der transagierenden Faktoren kann durch Standardverfahren aus dem Stand der Technik erfolgen (siehe z. B. Sambrook, supra und Ausubel, supra). Zur Feststellung, ob ein Protein and das erfindungsgemäße TIRC7-Protein bindet, können standardisierte native Gel-Shift-Analysen durchgeführt werden. Um einen transagierenden Faktor, der an das erfindungsgemäße TIRC7-Protein bindet, zu identifizieren, können die erfindungsgemäßen Polypeptide und Peptide als Affinitätsreagenzien in standardisierten Verfahren zur Proteinpurifikation oder als Sonde zum Screening einer Expressionsbibliothek verwendet werden. Ist der transagierende Faktor erst einmal identifiziert, kann die Modulation seiner Bindung an das erfindungsgemäße TIRC7-Protein weiter verfolgt werden, beginnend mit z. B. Screening nach dem Inhibitor der Bindung des transagierenden Faktors an das erfindungsgemäße TIRC7-Protein. Aktivierung oder Repression von TIRC7-spezifischen Genen könnten dann in Subjekten erreicht werden durch Verabreichung des transagierenden Faktors (oder seines Inhibitors) oder des ihn codierenden Gens, z. B. in einem in den hierin vorstehenden Ausführungsformen beschriebenen Vektor. Zusätzlich können, wenn die aktive Form des transagierenden Faktors ein Dimer ist, dominant-negative Mutanten des transagierenden Faktors hergestellt werden, um seine Aktivität zu inhibieren. Des Weiteren können nach Identifikation des transagierenden Faktors weitere Verbindungen in dem Weg identifiziert werden, der zur Aktivierung (d. h. Signaltransduktion) oder Repression eines Gens führt, das das erfindungsgemäße TIRC7-Protein codiert. Modulation der Aktivitäten dieser Komponenten können dann weiter verfolgt werden, um zusätzliche Medikamente oder Verfahren zur Modulation der Expression oder Aktivität des erfindungsgemäßen TIRC7-Proteins zu entwickeln.
Neben den oben beschriebenen Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Polynucleotide für die Gentherapie und zur Identifikation homologer Moleküle können die beschriebenen Polynucleotide auch für diverse andere Anwendungen verwendet werden, z. B. zur Identifikation von Nucleinsäuremolekülen, die mit dem oben beschriebenen TIRC7-Protein interagierende Proteine codieren. Dies kann durch dem Stand der Technik hinreichend bekannte Assays erreicht werden, wie beispielsweise beschrieben in Scofield (Science 274 (1996), 2063–2065) durch die Verwendung des so genannten Hefe-„Zwei-Hybriden-Systems". In diesem System wird das von den erfindungsgemäßen Polynucleotiden codierte (Poly)Peptid oder ein kleinerer Teil davon an die DNA-bindende Domäne des GAL4-Transkriptionsfaktors gebunden. Ein Hefestamm, der dieses Fusionsprotein exprimiert und ein lacZ-Reportergen enthält, das von einem geeigneten Promotor angetrieben wird, der vom GAL4-Transkriptionsfaktor erkannt wird, wird mit einer cDNA-Bibliothek transformiert, die Tierproteine, vorzugsweise Säugerproteine oder Peptide davon exprimiert, die an eine Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Falls ein von einer der cDNAs codiertes Peptid in der Lage ist, mit dem ein erfindungsgemäßes (Poly-)Peptid enthaltenden Fusionsprotein zu interagieren, ist der Komplex in der Lage, die Expression des Reportergens zu steuern. So können das erfindungsgemäße Polynucleotid und das codierte Peptid zur Identifikation von mit TIRC7-Proteinen interagierenden Peptiden und Proteinen verwendet werden. Andere Verfahren zur Identifizierung von mit dem erfindungsgemäßen TIRC7-Protein interagierenden Verbindungen oder solche Moleküle codierenden Nucleinsäuremolekülen sind, z. B. das In-vitro-Screening mit Phagen-Display-System ebenso wie Filter-bindende Assays oder „Echtzeit"-Messung der Interaktion unter Verwendung von z. B. dem BIAcore-Apparat (Pharmacia); siehe die oben aufgeführten Referenzen.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Polynucleotids, der erfindungsgemäßen Vektoren, Peptide, Polypeptide, Antikörper und Zellen ebenso wie gemäß eines erfindungsgemäßen wie oben beschriebenen Verfahrens identifizierte Verbindungen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, die mit T-Zellaktivierung verbunden und mit Th1- und Th2-Immunantwort assoziiert sind, zur Behandlung von akuter und chronischer Abstoßung von Allo- und Xenoorgantransplantaten und Knochenmarkstransplantation, zur Behandlung von rheumatoider Arthritis, Lupus erythematodes, multipler Sklerose, Enzephalitis, Vaskulitis, Diabetes mellitus, Pankreatitis, Gastritis, Thyroiditis, zur Behandlung von bösartigen Störungen von T-, B- oder NK-Zellen, zur Behandlung von Asthma, Lepra lepromatosa tuberosa, mit dem Helicobacter pylori assoziierter Gastritis oder für die Behandlung von Hauttumoren, Nebennierentumoren oder Lungentumoren.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide, Vektoren, Zellen, Proteine, (Poly-)Peptide, Antikörper, Inhibitoren, Aktivatoren, pharmazeutischen Zusammensetzungen, Anwendungen und Verfahren können zur Behandlung aller Arten von Krankheiten verwendet werden, von denen bisher nicht bekannt ist, dass sie mit der Modulation von T-Zellen zusammenhängen oder davon abhängen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, Verfahren und Anwendungen der vorliegenden Erfindung können wünschenswerter Weise beim Menschen angewendet werden, wenngleich die Behandlung von Tieren ebenfalls von den hierin beschriebenen Verfahren und Anwendungen umfasst wird.
Diese und andere Ausführungsformen sind offenbart und umfasst durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung. Weiterführende Literatur zu einem/r in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung anzuwendendem/r Antikörper, Verfahren, Anwendungen und Verbindungen kann aus öffentlichen Bibliotheken und Datenbanken bezogen werden unter der Verwendung von z. B. elektronischen Vorrichtungen. Beispielsweise kann die öffentliche Datenbank "Medline" genutzt werden, die im Internet z. B. unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html zugänglich ist. Weitere Datenbanken und Adressen, wie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ sind dem Fachmann hinreichend bekannt und können auch erhalten werden über beispielsweise http://www.lycos.com. Eine Übersicht über biotechnologische Patentinformationen und eine Übersicht über relevante Patentinformationsquellen die für retrospektive Recherchen oder die Beobachtung aktueller Entwicklungen nützlich sind, ist in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352–364 zu finden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Diese Offenbarung kann am besten im Zusammenhang mit den hierin durch Bezugnahme enthaltenen begleitenden Figuren zu verstehen sein, die das Folgende darstellen:
1: Identifizierung von TIRC7 aus alloaktivierten Zellen.

(A): Differential-Display-Identifizierung eines 24 h nach der Alloaktivierung humaner T-Lymphozyten hochregulierten 350 bp-Transkripts. Jede Spur zeigt ein mRNA-Expressionsmuster einer Einbahn-MLR entweder 0 oder 24 h nach der Aktivierung. Zwei unterschiedliche MLRs (a und b) zeigten ähnliche Genexpressionsmuster.
(B): Nucleotidsequenz der TIRC7-cDNA. Gezeigt sind die cDNA und 614 abgeleitete Aminosäuresequenzen des TIRC7-Transkripts. Vorausgesagte transmembrane Regionen sind unterstrichen und fett dargestellt.

2: Vorausgesagte Sekundärstruktur von TIRC7.
Die vorausgesagte Sekundärstruktur des TIRC7-Proteins enthält 7 Transmembran-überspannende Domänen (TM). Die gemäß Sequenzen im mutmaßlichen intrazellulären Aminoterminus (NH₃), extrazellulären Carboxyterminus (COOH) und der größten intrazellulären (IC) und extrazellulären (EC) Schleife synthetisierten Peptide (P1–P7) wurden für die Erzeugung von Kaninchen-anti-TIRC7 polyklonalen Antikörpern verwendet. Anti-TIRC7-Antikörper mit einem modulatorischen Effekt auf die T-Zellantwort sind im Kasten angegeben.
3: TIRC7 wird bei der T-Zellaktivierung hochreguliert und auf der Zellmembran lokalisiert.

(A): Die TIRC7-mRNA-Expression ist hochreguliert und allostimuliert in humanen T-Zellen. MLR-0 und MLR-24 zeigen die Zeitpunkte 0 h bzw. 24 h nach der Koinkubation von allogenem Responder und Stimulator-Lymphozyten an.
(B): Die TIRC7-mRNA-Hochregulierung in MLR (24 h) wird von Cyclosporin A (Cyc A) verhindert.

4: Lokalisierung des TIRC7-Proteins.

(A): Ein einzelnes 75 kDa-Protein wird von anti-TIRC7-Antikörpern (AK79 ist gezeigt) vorwiegend in Membranproteinextrakten humaner Lymphozyten erkannt. Die Bindung von AK79 an TIRC7 wird in der Anwesenheit des entsprechenden Peptids P2 (Ab + P2) unterbunden.
(B): Das gleiche 75 kDa-Protein wird auch von einem anti-c-myc-Antikörper erkannt in Membranpräparationen von COS-7-Zellen, die mit einem c-myc-markierten TIRC7-Expressionsvektor (COS-t) transient transfiziert wurden, jedoch nicht erkannt in nicht-transfizierten COS-7-Zellen (COS7-nt).

5: Anti-TIRC7-Antikörper inhibieren die 7-Zellproliferation und die IL-2-Produktion.

(A): Gegen die extrazellulär befindlichen TIRC7-Peptide gerichtete Anti-TIRC7-Antikörper (AK73, AK76, AK79) inhibieren die Proliferation in alloantigen-stimulierten T-Zellen, wie durch die [³H]-Thymidin-Integration bestimmt. Die Inhibierung wurde verringert, als Antikörper mit ihren entsprechenden Peptiden vorinkubiert wurden. Proliferation in einer MLR nach 24 h ist als positive Kontrolle dargestellt. Die Proliferation wurde durch ein Vorimmunserum (Kontroll-Ab) nicht beeinflusst. Jeder Balken repräsentiert Mittelwert und Standardabweichung aus 7 unabhängigen Experimenten.
(B): Inhibition der Proliferation durch exogenes TIRC7-Protein In einer Einbahn-MLR inhibierte in vitro translatiertes TIRC7-Protein die Proliferation abhängig von der Dosierung. Proteinverdünnungen sind angezeigt. Es wurde keine Inhibierung der Proliferation beobachtet, wenn Vektor alleine (Vektor) oder ein unverwandte cDNA (unrel) bei der In-vitro-Translations-Präparation verwendet wurde.
(C): Anti-TIRC7-Antikörper inhibieren die Th1-spezifische Cytokinexpression. PHA-stimulierte humane Lymphozyten wurden mit AK73, AK76 bzw. AK79 koinkubiert. Überstände der Mitogen-stimulierten Kulturen wurden nach 24 h und nach 48 h entnommen. Die Cytokinexpression in diesen Kulturen wurden durch ELISA bestimmt. Jeder Balken repräsentiert Mittelwert und Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.
(D): Die anti-TIRC7-Antikörper-vermittelte Inhibierung der Proliferation von PHA-aktivierten T-Zellen wird durch exogenes IL-2 wieder hergestellt. Jeder Balken repräsentiert Mittelwert und Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.

6: Anti-TIRC7-Antikörper-Targeting in vivo verlängert die Überlebenszeit von Allotransplantaten signifikant.

(A): Lewis-Ratten-Empfänger von Wistar-Furth-Rattennieren-Allotransplantaten erhielten entweder anti-TIRC7-AK73 (n = 7), Kontrollantikörper aus Vorimmunserum (n = 7) oder keine Behandlung (n = 7). Die Behandlung wurde 2 Stunden vor und unmittelbar nach der Transplantation begonnen und wurde an den Tagen 1, 2, 4 und 6 nach der Transplantation wiederholt. Mit Kontrollantikörper behandelte Tiere wiesen eine durchschnittliche Überlebensdauer von 8 ± 1 Tagen auf, wohingegen die durchschnittliche Überlebenszeit der die unbehandelte Kontrollgruppe repräsentierenden Tiere TIRC7 ± 2 Tage betrug. 6 von 7 Tieren der experimentellen Gruppe bewahrten funktionelle Transplantate über 45 Tage. Eine Ratte in der mit anti-TIRC7-Antikörper behandelten experimentellen Gruppe hatte eine Überlebenszeit von 21 Tagen. Wie an Tag 45 nach der Transplantation bewertet, war die durchschnittliche Überlebenszeit in dieser Gruppe 41,5 Tage (p < 0,001 gegenüber der Kontrollgruppe).

7: Histologische Analyse von Nierenallotransplantaten an Tag 7 nach der Transplantation.

(A): Nierenallotransplantate von Kontrollantikörper erhaltenden Ratten wiesen schwere Gewebezerstörung und eine diffuse mononukleare Infiltration auf, was den histologischen Ergebnissen in den Nierenallotransplantaten der unbehandelten Tiere ähnlich war.
(B): Nierenallotransplantate von zwei zusätzlichen mit anti-TIRC7-Antikörpern behandelten Tieren, die an Tag 7 geopfert wurden, zeigten sehr geringen interstitielle Infiltration mononuklearer Zellen. In den Allotransplantaten dieser Tiere wurden keine Gewebeverletzungen festgestellt.

Die im Folgenden in illustrierender Weise dargelegten Beispiele werden zu einem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer vielen Vorteile beitragen.
Beispiele
Beispiel 1: Klonierung eines neuen Membranprotein (TIRC7) codierenden Gens, das in alloaktivierten humanen T-Zellen differentiell exprimiert wird
Zur Identifizierung neuer während der frühen Stadien der T-Zellaktivierung als Reaktion auf Alloantigene induzierter Gene wurde eine Differential-Display-RT-PCR-Analyse der mRNA-Expression durchgeführt 0 h und 24 h nach Ansetzen einer gemischten Lymphozytenkultur (MLR). In Übereinstimmung mit institutionellen Regeln bezüglich der Durchführung von Experimenten am Menschen wurden aus gesunden freiwilligen Probanden periphere Blutlymphozyten (PBLs) unter Verwendung von standardisierten Ficoll-Zentrifugierungs-Methoden isoliert und in RPMI mit 10% fetalem Kälberserum verdünnt. Responder-PBLs wurden mit gleichen Anzahlen an bestrahlten (3000 rad, 13 Min.) Stimulator-PBLs stimuliert. Die Zellen wurden für 24 h in Gewebeflaschen bei einer anfänglichen Konzentration von 10⁶ Zellen/ml zur RNA-Isolierung co-kultiviert. Gesamt-RNA wurde aus MLR nach 0 h und 24 h unter Verwendung des RNAzol-B-Verfahrens (TelTest, Inc.) isoliert und Differential-Display wurde wie vormals beschrieben durchgeführt (Kojima et al., 1996). Kurz, 2 μg Gesamt-RNA wurden unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und 200 U MMLV reverser Transkriptase (GibcoBRL) revers transkribiert. Eine 40-Zyklen-PCR-Amplifikation mit einem Gesamtvolumen von 10 μl wurde unter Verwendung von 1 μg of cDNA, 1.25 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 2.5 nM-Primer, 5 μCi ³⁵S-dATP und 0.3 U Taq-Polymerase durchgeführt. Die Primer für die PCR-Amplifikation waren: 5'-GACGGAACAGCTTC -3' (SEQ ID NO: 10) und 5'- TGCGTCTGGTTCT-3' (SEQ ID NO: 11). Die PCR-Produkte wurden bei 4°C gelagert und mittels Elektrophorese in 6%-Polyacrylamid-Harnstoff-Gelen getrennt, auf Filterpapier transferiert, getrocknet und autoradiographiert. Das differentiell exprimierte cDNA-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten, eluiert, reamplifiziert, in pBluescriptSK⁺-Plasmid kloniert und sequenziert an der Howard Hughes Biopolymers Research Facility oder dem Dana Farber Cancer Institute Biopolymer Facility an der Harvard Medical School. Homologierecherchen wurden unter Verwendung von BLAST bei NCBI durchgeführt. Alignments wurden unter Verwendung von Geneworks 2.1.1 durchgeführt. Wie in 1A gezeigt, wurde ein 350 bp-cDNA-Fragment identifiziert, das 24 h nach der Stimulation induziert wurde und zur Identifizierung von mehreren Klonen aus λ-gt-10-cDNA-Bibliotheken aus humanen T-Zellen verwendet wurde. Eine λ gt-10-cDNA-Bibliothek (Clontech), die aus humanen T-Zellen hergestellt wurde, die für 48 h mit PHA aktiviert wurden, wurden mit dem 350-bp-TIRC7-cDNA-Fragment gescreent. Kurz, Plaque-Abzüge von 1,200,000 unabhängigen cDNA-Klonen wurden mit einer ³²P-markierten cDNA für 24 h bei 42°C in 40% Formamid hybridisiert, 10% Dextransulfat, 4 × SSC (1 × SSC besteht aus 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7.0), 0.8 × Denhardtscher Lösung (1 × Denhardt enthält 0.02% Polyvinylpyrrolidon, 0.02% Ficoll, 0.02% Rinderserumalbumin), 0.5% Natriumdodecylsulfat (SDS), und 20 mg Lachssperma-DNA. Die Filter wurden zweimal für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 × SSC, 10% SDS gewaschen und für 30 Minuten bei 65°C mit 0.2 × SSC, 10% SDS, gefolgt von Autoradiographie. Drei positive Klone wurden ausgewählt und Plaque-gereinigt. cDNA wurde in beide Richtungen sequenziert unter Verwendung einer Primer-Walking-Strategie. Eine PAC genomische Bibliothek wurde unter Verwendung einer 2kb-cDNA-Sonde, die die ORF cDNA von TIRC7 enthielt, gescreent und die gesamte genomische cDNA von TIRC7 und OC116 wurde bidirektional sequenziert. Die Sequenzanalyse ergab eine 2488 bp-cDNA (SEQ ID NO: 1), die TIRC7 benannt wurde (T cell immune response cDNA7 (T-Zellen-Immunantwort cDNA7); Gen Bank Zugangsnummer: AF025374), und die einen offenen Leserahmen von 1842 nt enthielt und eine Proteinlänge von 614 Aminosäuren voraussagte (SEQ ID NO: 2) (1B). Des Weiteren wurde eine zweite cDNA von TIRC7 kloniert (SEQ ID NO: 12), die eine Aminosäuresequenz codiert, die mit der des von der anderen TIRC7-cDNA codierten Proteins identisch ist, bis auf eine Aminosäure-Substitution bei Aminosäureposition 121 (Arg → Gln). Es wurde daher darauf geschlossen, dass beide cDNAs Allele des TIRC7-codierenden Gens repräsentierten. Eine Hydrophobizitäts-Analyse der Proteinsequenz zeigte 7 hydrophobe Domänen, kompatibel mit Transmembran-überspannenden Domänen.
Der N-Terminus von TIRC7 hat keine übereinstimmende Signalpeptidsequenz und ist gefolgt von sieben hydrophoben Domänen, die die Topologie eines intrazellulären N-Terminus und einer extrazellulär orientierten C-Domäne voraussagen (2). TIRC7 enthält viele mutmaßliche Stellen für post-translationale Modifikation einschließlich Phosphorylierungsstellen für PKC (an Aminosäurepositionen 58, 98 und 148) und PKA (an Aminosäureposition 21), ebenso wie N-verknüpfte-Glykosylationsstellen (an Aminosäurepositionen 267 und 287). Es wurde keine Aminosäurehomologie mit irgendwelchen Proteinen gefunden, von denen man weiß, dass sie in die T-Zellaktivierung involviert sind. TIRC7 teilt wohl eine Aminosäurehomologie (12–83%) mit einigen Proteinen, die mutmaßliche Untereinheiten der vacuolären Protonenpumpe H⁺-ATPase (VPP) in einer Vielzahl von Spezies sein sollen (Bowman et al., 1988; Lee et al., 1990; Peng et al., 1994; Perin et al., 1991, Manolson et al., 1992, Manolson et al., 1994; Solioz and Davies., 1994; Li et al., 1996). Die Analyse der gesamten genomischen DNA-Organisation von TIRC7 zeigte, dass TIRC7 und eine kürzlich beschriebene humane Osteoclasten-spezifische cDNA namens OC116 (Li et al., 1996) alternativ gespleißte Transkripte desselben Gens sind. Die Funktion von OC116 ist bisher unbekannt und es wurde gezeigt, dass die 2640 nt-mRNA, die ein 814-Reste-Protein codiert, ausschließlich in humanen Osteoclastenzellen exprimiert wird. Die Regionen mit der stärksten Homologie von TIRC7 und diesen mutmaßlichen VPPs sind vorwiegend in ihren vorausgesagten transmembranen Domänen und den C-Termini. Daher gehört TIRC7 zu einer größeren Familie von strukturell verwandten Membranproteinen, dessen Funktionen bisher noch nicht eindeutig erläutert wurden.
Um die Expressionskinetik von TIRC7 zu bestimmen, wurde eine Northern-Blot-Analyse von Gesamt-RNA aus Alloantigen-aktivierten Lymphozyten durchgeführt. Die Northern-Blots wurden mit 7–10 μg Gesamt-RNA präpariert, wie vormals beschrieben (Kojima et al., 1996). RNA aus verschiedenen humanen Geweben enthaltende Poly(A)⁺Northern-Blots wurden von Clontech erworben. Die Northern-Blots wurden mit der TIRC7-cDNA in voller Länge oder einem TIRC7-spezifischen cDNA-Fragment (nt 52–391) geprobt. Hybridisierungen über Nacht wurden mit ³²P-markierten cDNA-Sonden (10⁶ cpm/μl) bei 42°C in 40% Formamid, 10% Dextransulfat, 4 X SSC, 7 mM Tris (pH 7.6), 0.8 × Denhardtsche Lösung, 0.02 mg/ml Lachsspermien-DNA und 10% SDS durchgeführt. Die Blots wurden zweimal in 2 × SSC und 0.1% SDS für 20 Minuten bei Raumtemperatur, und einmal bei 65°C in 0.2 X SSC, 0.1% SDS gewaschen und bei –80°C autoradiographiert. Eine TIRC7-spezifische cDNA-Sonde wies das erwartete 2.5 kb-Transkript ebenso nach wie eine zusätzliche 4kb-mRNA unbekannten Ursprungs (3A–B). Die Alloaktivierung der T-Zellen resultierte in einer 20-fachen Hochregulierung der TIRC7-Expression nach 24 h (3A). Die TIRC7-Expression war vorübergehend, mit noch keinem Anstieg nach 1 h, der höchsten Expression nach 24 h und einer Rückkehr zum Basiswert nach 72 h. Um zu zeigen, dass die Hochregulierung von TIRC7 in der Responder-T-Zellpopulation stattfand, wurde eine zusätzliche MLR unter Verwendung von Stimulatoren durchgeführt, denen alle T-Zellen entfernt worden waren. Für Induktions- oder Inhibitionsstudien der TIRC7-Expression wurden PBLs Concanavalin A (10 ng/ml), Phytohemagglutinin (PHA) (20 mg/ml), Staphylococcus aureus-Enterotoxin B (10 μg/ml), OKT3-mAK (10 mg/ml), Cyclosporin A (1 mg/ml) oder rIL-2 (10 U/ml) ausgesetzt. Die Stimulierung mit OKT3-mAK wurde durchgeführt, indem der Antikörper auf Kunststoffkulturplatten über Nacht bei 4°C immobilisiert wurde, bevor die Zellsuspension zugegeben wurde. Zur RNA-Isolation aus CD4⁺ und CD8⁺ humanen T-Zellen wurden PBLs mit immunmagnetischen Kügelchen inkubiert, welche mit Anti-CD4 oder Anti-CD8-lgG beschichtet waren, und dann der magnetischen Separation unterzogen. Es wurde gezeigt, dass die TIRC7-mRNA-Expression in Responderzellen 24 h nach Co-Kultur erhöht war.
Cyclosporin A (Cyc A), ein Inhibitor der Calcineurin-abhängigen T-Zellaktivierungswege, blockierte die TIRC7-Induktion in einer MLR (3B). Des Weiteren war exogenes IL-2 ein wirksamer Induzierer der TIRC7-Expression, wohingegen mit Staphylococcus aureus-Enterotoxin B (SEB) oder OKT3-mAK-Stimulation nach 24 h ein mäßiger Anstieg der TIRC7-Expression beobachtet wurde, wenngleich OKT3-mAK die TIRC7-Expression nach 48 h auf ein ähnliches Niveau steigerte wie durch Antiallogen induziert. Im Gegensatz dazu steigerten weder Concanavalin A (Con A) noch Pythohemagglutinin (PHA) die TIRC7-Expression nach 24 oder 48 h.
Northern-Analyse zeigte, dass TIRC7 fast ausschließlich in Immungeweben exprimiert wird und der mRNA-Expressionslevel hoch war in Milz, Lymphknoten, peripherem Blut und Appendix, wohingegen niedrigere Expressionslevel beobachtet wurden in Knochenmark und fetaler Leber bzw. fetalem Thymus. TIRC7 wurde auch in CD4⁺- und CD8⁺-Lymphozyten nachgewiesen, nicht jedoch in EBV-transformierten primären B-Zellen, Burkitt Lymphomzellen, EBV-infizierten Burkitt Lymphomzellen und ruhenden oder aktivierten Jurkat-Zellen.
In der Western-Blot-Analyse wurde ein einzelnes Protein von ungefähr 75 kDa Molekularmasse vor allem in Membranextrakten humaner Lymphozyten nachgewiesen (4A). PBLs wurden lysiert in 50 mM Tris (pH 7.59), 150 mM NaCl, 1% Triton, Aprotinin (0.15 U/ml), 20 mM Leupeptin, and 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid. Lysate wurden durch SDS-PAGE separiert und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Membranen wurden jeweils mit primärem (siehe Beispiel 2, infra) und sekundärem Antikörper für 1 h inkubiert und es wurde gebundener primärer Antikörper von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem sekundären Antikörper nachgewiesen, gefolgt von einer verstärkten Chemolumineszenz. Polyklonaler AK79 (siehe Beispiel 2, infra) wurde in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 5000 verwendet. Der mit Peroxidase konjugierte sekundäre Antikörper (Anti-Kaninchen-lgG) wurde in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 2000 verwendet. Um das TIRC7/c-myc-Fusionsprotein nachzuweisen, wurde der Anti-c-myc-Antikörper in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 1000 verwendet und der sekundäre Antikörper (Anti-Maus-lgG) in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 2000. Dasselbe Protein wurde in Membranaufbereitung aus CHO-Zellen und COS-7-Zellen gefunden (4B), die einmal dauerhaft und einmal vorübergehend mit einem c-myc-markierten TIRC7-Expressionsvektor transfiziert wurden. Der TIRC7-ORF voller Länge wurde stromaufwärts einer c-myc-Epitop-Sequenz kloniert um ein Fusionsproteinskonstrukt in einem Säuger-Expressionsvektor herzustellen (Progmega). Die transiente Transfektion von COS7-Zellen und die stabile Transfektion von CHO-Zellen wurde mit dem Lipofectamin-Transfektionsverfahren wie beschrieben (Schülein et al., 1996) durchgeführt. Ein Anti-c-myc-Antikörper (InVitrogen) wurde zum Nachweis des Proteins verwendet. TIRC7-Lokalisation an der Zellmembran wurde mit konfokaler Mikroskopie und flusszytometrischer Analyse sowohl in humanen Lymphozyten als auch in stabil transfizierten CHO-Zellen bestätigt.
Beispiel 2: TIRC7 vermittelt ein essentielles Signal während früher Ereignisse bei der T-Zellaktivierung
Die funktionelle Signifikanz einiger bei der T-Zellaktivierung benötigter Proteine wurde durch Modulation ihrer Signale durch Targeting mit spezifischen Antikörpern bestimmt. Um festzustellen, ob gegen TIRC7 gerichtete Antikörper die T-Zell-proliferative Antwort verändern könnten, wurden 7 synthetische verschiedene Domänen des TIRC7-Proteins (P1–P7, 12mers; SEQ ID NO: 3 bis 9) repräsentierende Peptide verwendet, um polyklonale Kaninchen-Antipeptid-Antikörper zu produzieren (2A). Antigene nicht-transmembrane Regionen von TIRC7 wurden unter Verwendung von PSORT und PC-GENE identifiziert und zur Konstruktion von kurzen Peptidsequenzen verwendet. Gereinigte synthetische Peptide (P1–P7)(Henklein Laboratorien, Berlin, Deutschland) wurden zur Immunisierung von Kaninchen verwendet (Seramun, Berlin, Deutschland). Tiere wurden nach drei und nach sechs Wochen geboostet. Insgesamt wurden 14 polyklonale Antikörper gegen 7 verschiedene Peptide (P1–P7) präpariert. Die gepoolten Antisera wurden nach der Bindung von Peptid an BSA durch Affinitätschromatographie gereinigt. Alle Antikörper mit ihren entsprechenden Peptiden wurden mit ELISA getestet. Wie in 5A gezeigt, wurde gefunden, dass drei der Antikörper AK73, AK76 und AK79, die jeweils gegen die extrazellulär gelegenen Domänen P4, P6 und P2 (SEQ ID NO: 6, 8 und 2) gerichtet waren, die Proliferation von alloaktivierten T-Zellen zu 87–93% inhibieren. Für Proliferationsassays wurden Responder-PBLs in der Anwesenheit einer gleichen Anzahl von bestrahlten Stimulatorzellen (gesamt 2 × 10⁶ Zellen/ml) mit entweder dem Medium alleine, mit Antikörpern oder mit Kontrollserum in jeden Well einer Rundboden-96-Well-Mikrotiterplatte in einem endgültigen Kulturvolumen von 200 μl eingebracht. Anti-TIRC7-Antiseren wurden der MLR in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 500 hinzugefügt. Die Platten wurden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert und mit 1 μCi [³H]-Thymidin (ICN Biochemicals) pro Well für die verbleibenden 18 h der Kultivierung gepulst. Alle Platten wurden geerntet und gezählt auf einem Betaplate-Flüssigkeits-Szintillationszähler. Die Zählungen wurden dargestellt als die durchschnittlichen cpm von vierfachen Wells, die 72 h nach dem 18-stündigen Pulsen geerntet wurden. Um vollständige Lysis der Zellen zu verhindern, wurden Antikörper vor der Verwendung für 20 Minuten bei 52°C inkubiert. Experimente zur Peptidblockierung wurden durch Co-Inkubation des Antikörpers mit dem entsprechenden Peptid für 30 Minuten bei 4°C vor Initiierung der MLR_G durchgeführt. Für Studien, in denen TIRC7-Protein verwendet wurde, wurden serielle Verdünnungen (1 : 200, 1 : 300, 1 : 600) des dialysierten in vitro translatierten TIRC7-Proteins zu MLRs hinzugefügt und die Inhibition wurde durch Integration von ³H-Thymidin gemessen. Die Cytokinexpression für IL-2, IL-4 und Interferon-γ wurden durch ELISA in Kulturüberständen nachgewiesen. Handelsübliche Kits wurden verwendet für IL-2 (Laboserv), IL-4 (Laboserv) und IFN-γ (Medgenix). Die Anti-TIRC7-Antikörper inhibierten die T-Zellproliferation abhängig von der Dosierung. Die Inhibierung wurde verringert, wenn die entsprechenden Peptide zu der Reaktion hinzugefügt wurden, um den Antikörper spezifisch zu neutralisieren. Die Antikörper hatten keine Wirkung, wenn sie 24 h bis 72 h nach der Initiierung der MLR hinzugefügt wurden, was anzeigt, dass das TIRC7-vermittelte Signal spezifisch für ein frühes Ereignis in der T-Zellantwort war. Diese drei Anti-TIRC7-Antikörper bewirkten auch effiziente Inhibition der durch ConA, PHA bzw. OKT3-mAK induzierten T-Zellaktivierung.
Mit der T-Zellaktivierung assoziierte Membranproteine sind oftmals in Ligand-Rezeptor-Interaktionen involviert, die durch exogenes lösliches Protein blockiert werden können, wie durch die Blockierung der Interaktion von CD28/B7 mit dem löslichen Protein CTLA4Ig (Linsley et al., 1992) gezeigt wurde. In-vitro-translatiertes TIRC7-Protein wurde daraufhin auf seine Fähigkeit getestet, die MLR durch seine Hinzufügung zu MLR-Kulturen zum Zeitpunkt 0 in Verdünnungsverhältnissen von 1 : 200, 1 : 300, 1 : 600 zu inhibieren. 2 μg TIRC7-cDNA wurden in einem In-vitro-Translations-TNT-Lysat-System (Promega), welches ³⁵S Methionin (ICN) enthielt, translatiert. Das Produkt wurde mit SDS-PAGE (11%) und Autoradiographie visualisiert. Für MLR-Inhibitionsexperimente wurde TIRC7-Protein in vitro in der Anwesenheit von mikrosomalen Membranen synthetisiert. Die In-vitro-Translationsmixtur wurde dann in 500 μl PBS suspendiert und gegen PBS für 24 h dialysiert. Wie in 5B gezeigt, unterdrückte exogenes TIRC7-Protein in Abhängigkeit von der Dosierung signifikant die Proliferation alloreaktiver T-Zellen. In Kontrollexperimenten wurde bei der Verwendung von entweder Vektor alleine (5B) oder einer anderen unverwandten cDNA in der In-vitro-Translations-Reaktionsmixtur keine Inhibition festgestellt.
Beispiel 3: Targeting des TIRC7-vermittelten Signals inhibiert Th1-spezifische Cytokinexpression, die durch exogenes rIL-2 umgekehrt wird
Um weiter zu unterscheiden, ob von TIRC7 vermittelte Signale T-Zell-Untergruppen differentiell beeinflussen, wurden humane T-Zellen mit entweder OKT3-mAK, ConA oder PHA gereizt und die für Th1- und Th2-Lymphozyten-Untergruppen spezifischen Cytokinprofile wurden in der Anwesenheit und Abwesenheit von Anti-TIRC7-Antikörpern analysiert. Wie in 5C gezeigt, wurde nach 48 h ein signifikanter Abfall der Th1-spezifischen Cytokine IL-2 und IFN-γ in allen Kulturen der PHA-stimulierten Lymphozyten beobachtet. Von den drei getesteten Mitogenen fand die IL-2 und IFN-γ Niederregulierung in ConA- und PHA-aktivierten Kulturen nach 24 h statt, wohingegen die OKT3-mAKstimulierten T-Zellen einen signifikanten Abfall von IL-2 bereits nach 24 h, jedoch von IFN-γ erst nach 48 h zeigten. In keiner der Mitogen-aktivierten T-Zellen wurde eine Niederregulierung der IL-4-Produktion, die spezifisch für Th2-Lymphozyten ist, nach 24 h und nach 48 h beobachtet. Bemerkenswerter Weise stellte die exogene Hinzufügung von rekombinantem IL-2 in Mitogen-aktivierte mit Anti-TIRC7-Antikörpern inkubierte Kulturen die verminderte T-Zellproliferation wieder her (5D).
Beispiel 4: TIRC7-Antikörper-Targeting verlängert die Überlebenszeit von Nierenallotransplantaten in vivo signifikant
Der Effekt der Modulation des TIRC7-vermittelten Signals wurde in einem Tiermodell untersucht, in dem Nieren von Wistar-Furth-Ratten in Lewis-Ratten transplantiert wurden. Männliche inzüchtige Ratten von 200–250 g (Harlan Winkelmann, Deutschland) wurden während des gesamten Experiments verwendet. Wistar-Furth-Ratten (WF, RT1^u) wurden in Lewis-Ratten, denen beide Nieren entfernt worden waren, transplantiert unter Verwendung von mikrochirurgischen Techniken; die Ischämiezeit betrug 30 ± 5 Minuten. Cryostat-Sektionen wurden in Formalin fixiert. Das fixierte Gewebe wurde in Paraffin eingebettet und Gewebesektionen wurden mit Hämatoxylin und Eosin eingefärbt. In Anfangsexperimenten wurden Anti-humane-TIRC7-Antikörper auf ihre Fähigkeit getestet, die Proliferation von Lewis-Ratten-Lymphozyten, die mit bestrahlten Wistar-Furth-Ratten-Lymphozyten stimuliert wurden, in vitro zu inhibieren. Es wurde gezeigt, dass AK73 die Ratten-T-Zellproliferation wirksam blockierte. In Nierentransplantationsexperimenten verblieben die Tiere entweder unbehandelt (n = 7), erhielten präimmunes Kaninchenserum (n = 7) oder wurden mit Anti-TIRC7-Antikörper AK73 (n = 7) behandelt 2 h vor, direkt nach und an den Tagen 1, 2, 4 und 6 nach der Transplantation. Außer leichter Diarrhöe wurden in der mit Anti-TIRC7-Antikörper behandelten Gruppe keine Nebenwirkungen beobachtet. Anti-TIRC7-Antikörper verlängerte die Überlebenszeit des Transplantats in den behandelten Tieren signifikant (p < 0,001). Sechs von sieben Allotransplantaten der Anti-TIRC7-behandelten Tieren bewahrten ihre Funktionalität über 45 Tage nach der Beendigung der Antikörperverabreichung. Ein mit Anti-TIRC7-Antikörper behandeltes Tier starb an Tag 21. Im Gegensatz dazu starben alle Tiere aus beiden Kontrollgruppen am 7. bis 9. Tag nach der Transplantation an Nierenversagen (6). Die histologische Untersuchung der Nierentransplantate zweier zusätzlicher mit Antikörper behandelter Tiere, die an Tag 7 nach der Transplantation geopfert wurden, zeigte eine sehr leichte lymphozytische Infiltration, jedoch keine Anzeichen von Gewebsnekrose (7B). Im Gegensatz dazu zeigten Nierentransplantate aus Kontrolltieren beachtliche Anzeichen akuter Transplantatsabstoßung einschließlich diffuser mononuklearer Zellinfiltrate ebenso wie ausgedehnte von Nekrose befallene Bereiche (7A).
Zusammenfassung: TIRC7 ist ein neues T-Zell-akzessorisches Protein
TIRC7 stellt ein neues Protein dar, das eine essentielle Rolle bei der T-Zellaktivierung spielt. Bald nach der Stimulation des T-Zellrezeptors wird der TIRC7-mRNA-Level vorübergehend erhöht. Diese Steigerung der Expression scheint auf einem IL-2-abhängigen Signalweg zu beruhen, da die Hochregulierung von TIRC7-mRNA auch nach der Inkubation der T-Zellen mit IL-2 beobachtet wird und die Blockierung der TIRC7-Hochregulierung mit Cyclosporin A erreicht wird. T-Zellstimulation durch Mitogene wie ConA oder PHA kann durchweg nicht die TIRC7-Expression hochregulieren. Das Muster der Gewebsexpression legt nahe, dass TIRC7 ein Produkt reifer lymphoider Zellen ist, da TIRC7 in allen lymphoiden Geweben exprimiert wird, in geringen Mengen nur in Thymus, Knochenmark und fetaler Leber. Das TIRC7-Protein wird vorwiegend auf der Zellmembran exprimiert, übereinstimmend mit einem Target für einen externen Liganden. Die Sieben-Transmembran-Domänen-Struktur sagt drei extrazelluläre Schleifen und einen extrazellulär orientierten Carboxyterminus voraus. Gegen die extrazellulären Domänen gerichtete Anti-TIRC7-Antikörper, nicht jedoch die, die die vorausgesagten intrazellulären Domänen des Proteins erkennen, können die T-Zellproliferation als Reaktion auf Alloaktivierung in einer gemischten Lymphozytenkultur oder als Reaktion auf Mitogene effizient unterdrücken. Der von einer Vielzahl verschiedener stimulatorischer Signalwege induzierte inhibitorische Effekt von Anti-TIRC7-Antikörpern auf T-Zellen legt nahe, dass TIRC7 eine zentrale Rolle bei der T-Zellaktivierung spielt. Darüber hinaus legt die Inhibition der T-Zellproliferation in MLR durch Antikörper-Targeting von TIRC7 die Existenz eines Liganden nahe, der spezifisch mit TIRC7 interagiert. Diese Hypothese wird gestützt durch die dosierungsabhängige Inhibition der T-Zellproliferation in einer MLR in der Anwesenheit von löslichem in vitro translatierten TIRC7-Protein.
TIRC7 hat eine 38%ige Aminosäurehomologie zu J6B7, einem aus einer Mauszelllinie isolierten Protein (Lee et al., 1990). Wie TIRC7 hat auch J6B7 eine beträchtliche Homologie zu der mutmaßlichen Ratten-H⁺-ATPase-Untereinheit VPP116 (Manolson et al., 1992). Es wurde gezeigt, dass in vitro translatiertes J6B7-Protein die Maus-T-Zellproliferation in einer MLR zu 89% inhibiert, was vergleichbar mit den Ergebnissen ist, die mit in vitro translatiertem löslichen TIRC7-Protein in humaner MLR in der vorliegenden Studie erhalten wurden.
Antikörper-Targeting von TIRC7 hat einen selektiven inhibitorischen Effekt auf die Th1-Lymphozyten-Untergruppe, wie durch die Inhibition der IL-2- und IFN-γ-, nicht jedoch der IL-4-Cytokinproduktion bewiesen wird. Mit Anti-TIRC7-Antikörper-Behandlung scheinen die Zellen in einem unempfindlichen aber funktionellen Stadium zu bleiben, da exogenes rekombinantes IL-2 den antiproliferativen Effekt der Anti-TIRC7-Antikörper umkehrte. Die Fähigkeit eines Anti-TIRC7-Antikörpers, die Transplantatsabstoßung im in vivo Modell einer Rattennierentransplantation zu verhindern, spiegelt die in den in vitro durchgeführten Studien erhaltenen Ergebnisse wieder. Darüber hinaus sind die Effekte des Antikörper-Targeting von TIRC7 denen recht ähnlich, die durch Targeting kostimulatorischer Moleküle beobachtet wurden. TIRC7 teilt keine strukturelle Homologie oder Sequenzhomologie mit irgendeinem der bekannten T-Zell-akzessorischen Moleküle. Daher könnte TIRC7 an einem individuellen Signalweg, der früh im Verlauf der T-Zellaktivierung induziert wird, teilhaben.
Angesichts der funktionellen Ähnlichkeiten zwischen TIRC7 und den bekannten T-Zell-akzessorischen Molekülen wird erwartet, dass die strukturelle Neuheit von TIRC7 zum Verständnis individueller Mechanismen in der T-Zellantwort beiträgt. Darüber hinaus bietet die erstaunliche Fähigkeit von Anti-TIRC7-Antikörper, die Überlebenszeit von Allotransplantaten in vivo signifikant zu verlängern, einen neuen Ansatz für eine selektive Inhibition unerwünschter T-Zellaktivierung bei der humanen Organtransplantation und bei Autoimmunkrankheiten.
Der Fachmann wird die vielen Äquivalente der hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung erkennen, oder lediglich mittels routinemäßiger Experimente ermitteln können. Solche Äquivalente sollen von den folgenden Patentansprüchen umfasst werden.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid, das ein TIRC7-Membranprotein von ungefähr 75 kDa oder ein Fragment davon codiert, das in der Lage ist die Proliferation von T-Zellen als Reaktion auf eine Alloaktivierung in einer gemischten Lymphozytenkultur oder als Reaktion auf Mitogene zu inhibieren, und eine DNA-Sequenz enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) DNA-Sequenzen, die eine Nucleotidsequenz enthalten, welche die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 13 dargestellten Aminosäuresequenzen von Aminosäureposition 1 bis 614 oder von Aminosäureposition 1 bis 601 codieren; (ii) DNA-Sequenzen, die eine in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 12 dargestellte Nucleotidsequenz enthalten; (iii) DNA-Sequenzen, die eine Nucleotidsequenz enthalten, welche ein Fragment des Proteins codieren, das durch eine DNA-Sequenz von (i) oder (ii) codiert wird, wobei das Fragment in der Lage ist, die Proliferation von T-Zellen als Reaktion auf Alloaktivierung in einer gemischten Lymphozytenkultur oder als Reaktion auf Mitogene zu inhibieren; und (iv) DNA-Sequenzen, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen mit einem der in (i) bis (iii) definierten Polynucleotide hybridisiert, und die mindestens zu 70% mit einem dieser Polynucleotide identisch sind.
Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls von mindestens 15 Nucleotiden Länge, das spezifisch mit einem Polynucleotid nach Anspruch 1 oder mit einem dazu komplementären Strang hybridisiert zum Nachweis und/oder der Amplifikation eines Polynucleotids nach Anspruch 1 oder zur Repression der Expression eines Gens, das das Polynucleotid nach Anspruch 1 enthält, in vitro.
Vektor enthaltend das Polynucleotid nach Anspruch 1.
Der Vektor nach Anspruch 3, wobei das Polynucleotid funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Transkription und gegebenenfalls Expression des Nukleinsäuremoleküls ermöglichen.
Wirtszelle, die ein Polynucleotid nach Anspruch 1 unter der Kontrolle eines heterologen Promotors oder den Vektor nach Anspruch 3 oder 4 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines TIRC7-Membranproteins oder eines biologisch aktiven Fragments davon, umfassend: (a) Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 5 unter Bedingungen, die die Expression des Proteins ermöglichen; oder (b) In vitro-Translation des Polynucleotids nach Anspruch 1; und Gewinnung des in (a) oder (b) hergestellten Proteins.
TIRC7-Membranprotein oder ein Fragment davon, das in der Lage ist die Proliferation von T-Zellen als Reaktion auf Alloaktivierung in einer gemischten Lymphozytenkultur oder als Reaktion auf Mitogene zu inhibieren, und das durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert oder durch das Verfahren nach Anspruch 6 hergestellt ist.
Antikörper, der spezifisch eine extrazellulare Domäne des TIRC7-Membranproteins nach Anspruch 7 erkennt.
Zelle, die modifiziert wurde um den Antikörper nach Anspruch 8 zu exprimieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid oder Polypeptid, das in der Lage ist, die Stimulation von T-Zellen durch das TIRC7-Membranprotein, wie in Anspruch 7 definiert, zu inhibieren und/oder von einem Antikörper erkannt wird, der in der Lage ist die Stimulation von T-Zellen durch das TIRC7-Membranprotein, das durch ein Fragment des Polynucleotids nach Anspruch 1 codiert wird, zu inhibieren, oder enthaltend einen Antikörper, der spezifisch das Peptid oder Polypeptid erkennt; und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Peptid oder Polypeptid in einer löslichen Form vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Peptid oder Polypeptid die in einer der SEQ ID NOs: 3 bis 9 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, außerdem enthaltend einen zweiten Wirkstoff, der die Stimulation von T-Zellen inhibiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei der zweite Wirkstoff ein Antikörper für einen an der T-Zell Stimulation beteiligten Rezeptor oder Liganden oder eine lösliche Form des Rezeptors ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei der zweite Wirkstoff die Interaktion des CD2-, CD28-, CTLA4- oder CD40-Oberflächenrezeptors mit einem CD2-, CD28-, CTLA4- oder CD40-Liganden blockiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 15 zur Verwendung in Zell- oder Organtransplantation, zur Behandlung von Autoimmun-, allergischen oder infektiösen Krankheiten, oder zur Behandlung von Tumoren.
Diagnostische Zusammensetzung, enthaltend ein Polynucleotid nach Anspruch 1, den Vektor nach Anspruch 3 oder 4, die Zelle nach Anspruch 5 oder 9, das Protein nach Anspruch 7 oder den Antikörper nach Anspruch 8 oder ein (Poly-)Peptid oder einen Antikörper, wie in einem der Ansprüche 10 bis 12 definiert; und gegebenenfalls geeignete Mittel für den Nachweis.
In-vitro-Verfahren zur Induktion oder zum Aufrechterhalten der Unempfindlichkeit einer T-Zelle für ein Antigen, die das Inkontaktbringen einer T-Zelle mit einem Wirkstoff umfasst, der die Stimulation der T-Zelle durch das TIRC7-Membranprotein nach Anspruch 7 inhibiert.
Verwendung eines Wirkstoffs, der die T-Zell-Stimulation durch das TIRC7-Membranprotein nach Anspruch 7 inhibiert zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion oder Aufrechterhaltung der T-Zellunempfindlichkeit für ein Antigen in einem Subjekt.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Wirkstoff eine Interaktion des TIRC7-Membranproteins mit seinem Liganden blockiert.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 20, wobei der Wirkstoff ein Peptid oder Polypeptid ist, das in der Lage ist, die T-Zellstimulation durch das TIRC7-Membranprotein zu inhibieren und/oder von einem Antikörper erkannt wird, der in der Lage ist, die T-Zell-Stimulation durch das TIRC7-Membranprotein, welches durch ein Fragment des Polynucleotids nach Anspruch 1 codiert wird, zu inhibieren, oder ein Antikörper ist, der spezifisch das Peptid oder Polypeptid erkennt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 20 oder 21 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, außerdem umfassend die Verwendung eines zweiten Wirkstoffs, wie in einem der Ansprüche 13 bis 16 definiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen ersten Wirkstoff, der eine T-Zelle über das TIRC7-Membranprotein nach Anspruch 7 stimuliert, und gegebenenfalls ein pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Wirkstoff ein Ligand des TIRC7-Membranproteins oder mindestens ein anti-TIRC7-Membranprotein-Antikörper ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23 bis 24, außerdem umfassend einen zweiten Wirkstoff, der die T-Zell Proliferation stimuliert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der Wirkstoff IL-2, IL-4 oder ein Wirkstoff ist, der eine T-Zelle durch einen CD2-, CD28-, CD40- oder CTLA4-Oberflächenrezeptor stimuliert.
In-vitro-Verfahren zur Wiederherstellung der Empfindlichkeit für ein Antigen durch eine T-Zelle, die unempfindlich für das Antigen ist, umfassend das Inkontaktbringen der T-Zelle in der Anwesenheit des Antigens mit einem ersten Wirkstoff, der die T-Zelle über das TIRC7-Membranprotein nach Anspruch 7 stimuliert.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der TIRC7-Ligand durch Einführen in die Zelle eines Nukleinsäuremoleküls, das den TIRC7-Liganden in einer für die Expression des TIRC7-Liganden an der Zelloberfläche geeigneten Form codiert auf einer Zelloberfläche exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, außerdem umfassend das Inkontaktbringen der T-Zelle mit einem zweiten Wirkstoff, wie in Anspruch 25 oder 26 definiert.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die T-Zelle mit dem zweiten Wirkstoff in Kontakt gebracht wird bevor sie mit dem ersten Wirkstoff in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, wobei ein CD2-, CD28-, CD40- oder CTLA4-Ligand durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls in die Zelle, das den CD2-, CD28-, CD40- oder CTLA4-Liganden in einer für die Expression des Liganden auf der Zelloberfläche geeigneten Form codiert, auf der Zelloberfläche exprimiert wird.
Verwendung eines ersten Wirkstoffs, wie in Anspruch 23 oder 24 definiert, zur Herstellung einer pharmazeutische Zusammensetzung zur Stimulation einer T-Zellantwort auf eine Tumorzelle in einem Subjekt mit einem Tumor.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Tumorzelle so modifiziert ist, dass sie einen TIRC7-Liganden und/oder einen CD2-, CD28-, CD40- oder CTLA4-Liganden exprimiert, vorzugsweise auf der Tumorzelloberfläche.
Verwendung nach Anspruch 33 oder 34, wobei die Tumorzelle eine modifizierte Tumorzelle des Subjekts ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 22 oder 33 bis 35, wobei das Subjekt ein Empfänger von peripheren Stammzellen oder eines Knochenmarkstransplantats ist.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung dafür bestimmt ist, vor der Transplantation in den Empfänger mit peripheren Stammzellen oder Knochenmarkszellen in Kontakt gebracht zu werden.
Verfahren zur Identifizierung von T-Zellaktivierenden oder co-stimulierenden Verbindungen oder zur Identifizierung von Inhibitoren der T-Zellaktivierung und -stimulierung umfassend (a) das Kultivieren von T-Zellen in der Gegenwart des Proteins nach Anspruch 7, des Antikörpers nach Anspruch 8, der Zelle nach Anspruch 5 oder 9 oder eines Peptids oder Polypeptids, das in der Lage ist, die T-Zellstimulation durch das TIRC7-Membranprotein zu inhibieren und/oder das durch einen Antikörper, der in der Lage ist, die T-Zell-Stimulation durch das TIRC7-Membranprotein, das durch ein Fragment des Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert wird, zu inhibieren oder eines Antikörpers, der spezifisch das Peptid oder Polypeptid erkennt, und gegebenenfalls, in Anwesenheit einer Komponente, die in der Lage ist, ein nachweisbares Signal als Reaktion auf die T-Zellaktivierung zu liefern, mit einer zu überprüfenden Verbindung unter Bedingungen, die die Interaktion der Verbindung mit dem (Poly)Peptid, Antikörper oder Zelle(n) erlaubt; und (b) das Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals, das durch die Interaktion der Verbindung mit den Zellen erzeugt wird.
Verwendung eines Peptids oder Polypeptids, das in der Lage ist die T-Zellstimulation durch das TIRC7-Membranprotein zu inhibieren und/oder das durch einen Antikörper erkannt wird, der in der Lage ist, die T-Zellstimulation durch das TIRC7-Membranprotein, das durch ein Fragment des Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert wird, zu inhibieren oder eines Antikörper, der spezifisch das Peptid oder Polypeptid erkennt, des Polynucleotids nach Anspruch 1, des Vektors nach Anspruch 3 oder 4, des Proteins nach Anspruch 7, des Antikörpers nach Anspruch 8, der Zelle nach Anspruch 5 oder 9 oder der Verbindung, die durch ein Verfahren nach Anspruch 38 identifiziert wurde für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung akuter und chronischer Erkrankungen, die mit einer T-Zellaktivierung und Th1- und Th2-Immunantwort verbunden sind, zur Behandlung von akuten und chronischen Abstoßungsreaktionen nach Allo- und Xeno-Organtransplantaten und Knochenmarkstransplantationen, zur Behandlung von rheumatischer Arthritis, Lupus erythematodes, Multipler Sklerose, Encephalitis, Vasculitis, Diabetes Mellitus, Pancreatitis, Gastritis, Thyroiditis, zur Behandlung von bösartigen Erkrankungen von T, B oder NK Zellen, zur Behandlung von Asthma, Lepra lepromatosa tuberosa, Helicobacter-pylori-assoziierter Gastritis oder zur Behandlung von Hauttumoren, Nebennierentumoren oder Lungentumoren.