DE69820908T2

DE69820908T2 - N-benzyl-3-indenylaceamidderivative zur behandlung von neoplasia

Info

Publication number: DE69820908T2
Application number: DE69820908T
Authority: DE
Inventors: Gerhard Sperl; Paul Gross; Klaus Brendel; Gary Piazza; Rifat Pamukcu
Original assignee: OSI Pharmaceuticals LLC; University of Arizona
Current assignee: OSI Pharmaceuticals LLC; University of Arizona
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2018-12-12
Also published as: ES2212383T3; US6610854B2; CZ298826B6; CA2314339C; PL196936B1; EP1044187B1; CN1281436A; NO20002972L; HUP0100170A1; CN100436418C; TR200001687T2; US6426349B1; CA2314339A1; NZ504958A; BR9813540A; AU1498199A; AU752072B2; JP4307719B2; EP1044187A1; DE69820908D1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft Verbindungen und Verfahren, um Apoptose zu induzieren oder zu fördern, und um eine unkontrollierte Proliferation neoplastischer Zellen zum Stillstand zu bringen, Verfahren, welche insbesondere nützlich sind, um Neoplasien zum Stillstand zu bringen und zu behandeln, einschließlich präkanzeröser und kanzeröser Läsionen.
Hintergrund der Erfindung
Pharmaka, welche gegen Neoplasien im frühen Stadium wirksam sind, beziehen ein wachsendes und expandierendes Forschungsgebiet und eine mögliche kommerzielle Entwicklung ein. Solche Pharmaka können die Entwicklung von präkanzerösen Läsionen zu Krebs verzögern oder zum Stillstand bringen. Alleine in den Vereinigten Staaten entwickeln jedes Jahr unzählige Menschen präkanzeröse Läsionen, welche eine starke statistisch signifikante Tendenz dazu aufweisen, sich zu malignen Tumoren oder Krebs weiterzuentwickeln. Solche Läsionen umfassen Läsionen der Brust (welche sich zu Brustkrebs entwickeln können), Läsionen der Haut (welche sich zu einem malignen Melanom oder Basalzellkarzinom entwickeln können), adenomatöse Polypen des Kolons (welche sich zu Kolonkrebs entwickeln können), zervikale Dysplasie (Zervikalkrebs) und andere derartige Neoplasmen.
Verbindungen, welche präkanzeröse oder kanzeröse Läsionen oder Karzinome verhindern oder die Remission von bestehenden präkanzerösen oder kanzerösen Läsionen oder Karzinomen induzieren, verzögern des Ausbruch von Krebs und verringern zumindest bei einigen Formen dieser Erkrankungen Krankheit und Tod in wesentlichem Ausmaß.
Solche Verbindungen und Verfahren sind besonders nützlich bei Subpopulationen von Patienten, welche wiederholt präkanzeröse Läsionen entwickeln und deswegen eine statistisch höhere Wahrscheinlichkeit aufweisen, Krebs zu bekommen. Viele Krebsarten (z. B. Brust, Kolon, Prostata usw.) besitzen solche Subpopulationen von Patienten. Ein Beispiel für eine derartige Subpopulation, welche unweigerlich Krebs entwickeln wird (wenn sie nicht behandelt wird) umfasst diejenigen Patienten, welche unter der familiären Form der Polyposis des Kolons leiden. Patienten mit familiärer Polyposis entwickeln normalerweise bereits im Teenageralter viele (z. B. Hunderte oder Tausende) Kolonpolypen. Da jeder Kolonpolyp (ob familiär oder nicht familiär) Berichten zufolge ein Lebenszeitrisiko von ungefähr 5% besitzt, sich zu Krebs zu entwickeln, war – bis vor kurzem – die Behandlung der Wahl für Patienten mit familiärer Polypose die chirurgische Entfernung des Kolons im Alter von Anfang Zwanzig.
Viele andere Krebsarten weisen Subpopulationen auf, welche auch viel höhere Risiken besitzen, im frühen Alter Krebs zu bekommen und dafür, dass der Krebs wieder auftritt, als die Patienten als Ganzes, welche solche eine Krebsart bekommen. Beispielsweise sind solche Subpopulationen unter Brustkrebspatienten und Kolonkrebspatienten identifiziert worden. In der letzteren Subpopulation ist die Entfernung der einzelnen Polypen bei deren Bildung, gegenwärtig die Behandlung der Wahl. Die Entfernung von Polypen bei nicht familiären Patienten ist entweder mit chirurgischen Mitteln oder einer faseroptischen endoskopischen Polytektomie durchgeführt worden – Verfahren, welche unangenehm, teuer (die Kosten einer einzelnen Polytektomie liegen im Bereich von $ 1000 bis $ 1500 für die endoskopische Behandlung und mehr für eine Operation) sind, und ein kleines aber signifikantes Risiko einer Kolonperforation aufweisen.
Die Suche nach Arzneimitteln, welche bei der Behandlung und Vorbeugung von Neoplasien in ihren frühesten Stadien nützlich sind, ist intensiv, da Chemotherapie und Chirurgie bei Krebs selbst oft nicht wirksam sind, und die momentane Chemotherapie schwere Nebeneffekte aufweist. Folglich ist die Suche nach Verbindungen, welche gegen präkanzeröse Läsionen ohne die Nebenwirkungen der konventionellen Chemotherapie wirksam sind, besonders intensiv. Solche Verbindungen werden auch in Betracht gezogen bei genesenen Krebspatienten, welche ein Risiko behalten, dass der Krebs und sogar bei Krebspatienten, welche von Verbindungen profitieren würden, die selektiv in neoplastischen Zellen Apoptose induzieren, dies aber im Wesentlichen nicht in normalen Zellen tun.
Standardarzneimittel für die Chemotherapie bei Krebs stellen keine geeigneten Arzneimittel für die Chemoprävention gegen Krebs dar, da die schweren Nebenwirkungen dieser Arzneimittel nicht ihre Krebs-präventiven Fähigkeiten (im Gegensatz zu Krebs bekämpfenden) wettmachen, ungeachtet welche präventiven Fähigkeiten diese besitzen. Es wird nun angenommen, dass die meisten Standardchemotherapeutika Krebszellen durch Induktion von Apoptose (was manchmal auch als "programmierter Zelltod" bezeichnet wird) zu töten. Apoptose tritt normalerweise in praktisch allen Geweben des Körpers auf. Apoptose spielt eine entscheidende Rolle bei der Gewebehomöostase, das bedeutet, sie stellt sicher, dass die Zahl der neuen erzeugten Zellen entsprechend ausgeglichen wird durch eine gleiche Anzahl von Zellen, welche sterben. Die Apoptose ist besonders ausgeprägt in selbsterneuernden Geweben wie etwa Knochenmark, Immunzellen, Eingeweide und Haut. Die Zellen der Intestinalauskleidung teilen sich beispielsweise so schnell, dass der Körper die Zellen nach nur drei Tagen beseitigen muss, um vor einem übermäßigen Wachstum der Intestinalauskleidung zu schützen und diese zu verhindern.
Standardchemotherapeutika fördern Apoptose nicht nur in Krebszellen, sondern auch in normalen humanen Geweben und besitzen deswegen besonders schwere Wirkungen auf Zellen, welche sich im Körper normalerweise schnell teilen (z. B. Haare, Eingeweide und Haut). Die Ergebnisse dieser Wirkungen auf normale Zellen umfassen Haarausfall, Gewichtsverlust, Übelkeit und Knochenmarkimmunsuppression. Dies ist ein Grund dafür, dass Standardchemotherapeutika für eine Krebsprävention nicht geeignet sind.
Wenn keine einmalige Behandlung (z. B. eine Gentherapie) vorliegt, ist ein anderer Grund der, dass die Krebspräventivtherapie eine chronische Verabreichung eines Arzneimittels erfordert, um die Neoplasiebildung zu unterdrücken, was bei Standardchemotherapeutika aufgrund der oben beschriebenen Arten der Nebenwirkungen offensichtlich eine Kontraindikation darstellt.
Anomalien bei der Apoptose können zur Bildung von präkanzerösen Läsionen und Karzinomen führen. Neuere Forschung zeigt auch, dass Defekte bei der Apoptose bei anderen Erkrankungen außer Krebs eine wichtige Rolle spielen. Entsprechend können Verbindungen, welche die Apoptose modulieren, bei der Prävention oder Bekämpfung von Krebs und auch anderen Erkrankungen verwendet werden.
Mehrere nicht-steroide entzündungshemmende Arzneimittel ("NSAID", "non-steroidal anti-inflammatory drugs"), welche ursprünglich zur Behandlung von Arthritis entwickelt wurden, haben sich bei der Hemmung und Beseitigung von Kolonpolypen als wirksam erwiesen. Polypen verschwinden fast vollständig, wenn die Patienten das Arzneimittel einnehmen, insbesondere, wenn das NSAID Sulindac verabreicht wird. Aber die anhaltende prophylaktische Verwendung von gegenwärtig verfügbaren NSAIDs ist sogar bei Polyposesyndrom-Patienten noch immer durch schwere Nebenreaktionen gekennzeichnet, welche gastrointestiale Irritationen, Perforationen, Ulcerationen und Nierentoxizität umfassen, welche wahrscheinlich durch die Inhibition der Prostaglandinsynthetaseaktivität ("PGE-2") erzeugt werden. Solch eine Inhibition ist ein Erfordernis für die entzündungshemmende Wirkung der NSAIDs, da erhöhte Spiegel von PGE-2 mit einer Entzündung verbunden sind. PGE-2 besitzt eine Schutzfunktion im Gastrointestinaltrakt, dies ist der Grund, warum solche gastrischen Nebenwirkungen bei einer chronischen NSAID-Therapie auftreten, welche bei Arthritis-Patienten selten angezeigt wird, für diese ist eine akute Therapie die Norm. Aber eine chronische Verabreichung von Sulindac ist wichtig für Polypose-Patienten, um zukünftige Polypen zu beseitigen und zu verhindern, welche bei vielen dieser Patienten gastrische Nebenwirkungen verursachen. Wenn eine NSAID-Behandlung aufgrund solcher Komplikationen beendet wird, kommen die Polypen wieder, insbesondere bei Polyposesyndrom-Patienten.
Verbindungen wie die im US-Patent Nr. 5,643,959 offenbarten Verbindungen haben Vorteile bei der Behandlung von neoplastischen Läsionen gezeigt, da gezeigt wurde, dass solche Verbindungen in neoplastischen Zellen, nicht aber in normalen Zellen beim Menschen Apoptose induzieren. Folglich werden die schweren Nebenwirkungen aufgrund der Induktion von Apoptose in normalen Zellen bei konventionellen Chemotherapeutika durch diese neuen Therapeutika vermieden (siehe "Phase I Trial of Sulindac Sulfone in Patients With Familial Polyposis (FAP) With Rectal Polyps: Optimal Dose and Safety," Digestive Disease Week, Abstract Nr. 2457, 10–16. Mai 1997, American Gastroenterological Association et al.). Außerdem zeigen solche Verbindungen nicht die gastrischen Nebenwirkungen, welche mit NSAIDs verbunden sind, da solche Verbindungen PGE-2 nicht wesentlich inhibieren. Es sind wirksamere Verbindungen mit einer solchen Spezifität für Neoplasie, aber ohne wesentliche PGE-2-Aktivität wünschenswert.
WO 97/47303, welche nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, beschreibt substituierte Benzylidenindenylformamide, Acetamide und Propionamide, welche bei der Behandlung von präkanzerösen Läsionen und Neoplasmen verwendbar sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt wirksame Verbindungen bereit, welche in neoplastischen Zellen (aber nicht wesentlich in normalen Zellen) Apoptose induzieren, zur Behandlung von Patienten mit neoplastischen Läsionen, ohne PGE-2 wesentlich zu inhibieren. Diese Erfindung betrifft auch Verfahren zum Induzieren einer solchen spezifischen Apoptose in neoplastischen Zellen durch Exposition solcher Zellen gegenüber einer pharmakologisch wirksamen Menge dieser unten beschriebenen Verbindungen an einem Patienten, welcher solch einer Behandlung bedarf. Solche Zusammensetzungen sind wirksam bei der Modulation von Apoptose und bei der Modulation des Wachstums von präkanzerösen Läsionen und Neoplasmen, leiden aber nicht an den Nebenwirkungen von konventionellen Chemotherapeutika und NSAIDs.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung wird in Anspruch 1 definiert.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung wird in Anspruch 17 definiert.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie oben beschrieben, umfasst die vorliegende Erfindung Verbindungen mit der Formel I unten (ebenso wie ihre pharmazeutische akzeptablen Salze) zur Behandlung eines Patienten mit neoplastischen, insbesondere präkanzerösen Läsionen:
worin R₁ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Niederalkyl, Niederalkoxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Niederalkylmercapto, Niederalkysulfonyl, Cyan, Carboxamid, Carbonsäure, Mercapto, Sulfonsäure und Hydroxy;
R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Niederalkyl,
R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Amino, Hydroxy, Niederalkylamino, und Di-Niederalkylamino;
R₄ Wasserstoff ist, oder R₃ und R₄ zusammen Sauerstoff sind;
R₅ und R₆ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Niederalkyl, Hydroxy-substituiertem Niederalkyl, Aminoniederalkyl, Niederalkylamino-Niederalkyl, Niederalkylamino-Di-Niederalkyl, Niederalkylnitril, -CO₂H, -C(O)NH₂ und einer C₂-C₆-Aminosäure;
R₇ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Aminoniederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkyl, Hydroxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Halogen, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂ und -SO₂(Niederalkyl);
m und n ganze Zahlen von 0 bis 3 sind, unabhängig voneinander ausgewählt,
Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chinolinyl, Isochinolinyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Imidazolyl, Indolyl, Benzimidazolyl, Triazinyl, Tetrazolyl, Thiophenyl, Furanyl, Thiazolyl, Pyrazolyl oder Pyrrolyl oder substituierten Varianten davon, worin die Substituenten einer oder zwei sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkyl, Niederalkoxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Hydroxy -SO₂(Niederalkyl) und -SO₂NH₂.
Bevorzugte Verbindungen dieser Erfindung zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren umfassen diejenigen der Formel 1, worin:
R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkoxy, Amino, Hydroxy, Niederalkylamino und Di-Niederalkylamino, bevorzugt Halogen, Niederalkoxy, Amino und Hydroxy;
R₂ Niederalkyl ist;
R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Amino, Niederalkylamino und Di-Niederalkylamino, bevorzugt Wasserstoff, Hydroxy und Niederalkylamino;
R₅ und R₆ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy-substituiertem Niederalkyl, Aminoniederalkyl, Niederalkylamino-Niederalkyl, Niederalkylamino-Di-Niederalkyl, -CO₂H, -C(O)NH₂; bevorzugt Wasserstoff, Hydroxy-substituiertem Niederalkyl, Niederalkylamino-Di-Niederalkyl, -CO₂H und -C(O)NH₂;
R₇ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Niederalkoxy, Hydroxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Halogen, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂ und -SO₂(Niederalkyl), bevorzugt Wasserstoff, Niederalkoxy, Hydroxy, Amino, Aminoniederalkyl, Halogen, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂ und -SO₂(Niederalkyl);
bevorzugt ist mindestens einer der R₇-Substituenten in para- oder ortho-Stellung, am meisten bevorzugt in ortho-Stellung;
Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chinolinyl, Isochinolinyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl und Pyrazinyl oder den substituierten Varianten davon.
Bevorzugt sind die Substituenten von Y einer oder zwei, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niederalkoxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Hydroxy -SO₂(Niederalkyl) und -SO₂NH₂; am meisten bevorzugt Niederalkoxy, Di-Niederalkylamino, Hydroxy -SO₂(Niederalkyl) und -SO₂NH₂.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, welche eine Verbindung mit der Formel I umfasst, worin R₁ mit R₇ und Y wie oben für die Verwendung bei der Behandlung solcher Läsionen definiert sind. Bevorzugt wird diese Zusammensetzung ohne therapeutische Mengen eines NSAID verabreicht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer enterisch beschichteten pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, welche erfindungsgemäße Verbindungen umfasst, zur Verwendung bei der Behandlung neoplastischer Läsionen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch beim Inhibieren des Wachstums von neoplastischen Zellen verwendet werden durch Exposition der Zellen gegenüber einer wirksamen Menge der Verbindungen mit der Formel I, worin R₁ mit R₇ und Y wie oben definiert sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in einem Verfahren zur Induktion von Apoptose in humanen Zellen verwendet werden durch Exposition dieser Zellen gegenüber einer wirksamen Menge der Verbindungen mit der Formel I, worin R₁ mit R₇ und Y wie oben definiert sind, wobei solche Zellen gegenüber diesen Verbindungen sensitiv sind.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden bei der Behandlung einer Erkrankung, welche durch die Regulierung der Apoptose profitiert, durch Verwendung einer wirksamen Menge der Verbindungen mit der Formel I, worin R₁ mit R₇ wie oben definiert sind. Die Regulation der Apoptose spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei Erkrankungen, welche mit Anomalien von zellulären Wachstumsmustern verbunden sind, wie etwa einer benignen Prostatahyperplasie, neurodegenerative Erkrankungen wie etwa die Parkinson-Erkrankung, Autoimmunerkrankungen einschließlich Multipler Sklerose und rheumatoider Arthritis, infektiöse Erkrankungen wie etwa AIDS und auch andere Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können verwendet werden als Inhibitoren der cGMP-spezifischen Phosphodiesteraseaktivität, welche in neoplastischen Zellen gefunden wird. Solche Phosphodiesterasen umfassen PDE-5 ebenso wie das neue PDE, welches in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/173,375, eingereicht am 15. Oktober 1998 von Pamukcu et al. offenbart wird. Aus praktischen Gründen kann die PDE-inhibitorische Aktivität solcher Verbindungen untersucht werden, wie es in der parallel anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/046,739, eingereicht am 24. März 1998 von Pamukcu et al. offenbart wird, welche hierin als Referenz enthalten ist. Folglich sind die erfindungsgemäßen Verbindungen nützliche Inhibitoren der PDE-5 und können bei medizinischen Indikationen nützlich sein, bei denen die Hemmung dieser Enzymaktivität erwünscht ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "präkanzeröse Läsion" auf Syndrome, welche durch anomale neoplastische, einschließlich dysplastische Veränderungen des Gewebes dargestellt werden. Beispiele umfassen dysplastisches Wachstum in Kolon-, Brust-, Blasen- oder Lungengeweben, oder Erkrankungen wie etwa das Syndrom des dysplastischen Nävus, einem Vorläufer eines malignen Melanoms der Haut. Neben den Syndromen des dysplastischen Nävus umfassen Beispiele auch Polyposesyndrome, Kolonpolypen, präkanzeröse Läsionen des Zervix (d. h. Zervixdysplasie), des Ösophagus, Prostatadysplasie, Bronchialdysplasie, mit der Brust, der Blase und/oder der Haut verbundene Erkrankungen (z. B. aktinische Keratose), egal ob die Läsionen klinisch identifizierbar sind oder nicht.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Karzinome" auf Läsionen, welche kanzerös sind. Beispiele umfassen maligne Melanome, Brustkrebs, Prostatakrebs und Kolonkrebs.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Neoplasma" sowohl auf präkanzeröse als auch kanzeröse Läsionen und Hyperplasie.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Halo" oder "Halogen" auf Chlor, Brom, Fluor und Iodgruppen, und der Begriff "Alkyl" bezieht sich auf gerade und verzweigte Gruppen. Der Begriff "Niederalkyl" bezieht sich auf C₁-C₈-Alkylgruppen.
Der Begriff "Hydroxy-substituiertes Niederalkyl" bezieht sich auf Niederalkylgruppen, welche mit mindestens einer Hydroxygruppe, bevorzugt nicht mehr als drei Hydroxygruppen substituiert sind.
Der Begriff "-SO₂(Niederalkyl)" bezieht sich auf eine Sulfonylgruppe, welche mit einer Niederalkylgruppe substituiert ist.
Der Begriff "Niederalkoxy" bezieht sich auf Alkoxygruppen mit 1–8 Kohlenstoffatomen, einschließlich gerader, verzweigter oder zyklischer Anordnungen.
Der Begriff "Niederalkylmercapto" bezieht sich auf eine Sulfidgruppe, welche mit einer Niederalkylgruppe substituiert ist; und der Begriff "Niederalkylsulfonyl" bezieht sich auf eine Sulfongruppe, welche mit einer Niederalkylgruppe substituiert ist.
Der Begriff "pharmazeutisch akzeptables Salz" bezieht sich auf nicht toxische Säureadditionssalze und alkalische Erdalkalimetallsalze der Ver bindungen mit der Formel I. Die Salze können in situ während der abschließenden Isolierung und Reinigung solcher Verbindungen hergestellt werden, oder durch Umsetzen der freien Base- oder Säurefunktionen beispielsweise mit einer geeigneten organischen Säure oder Base separat hergestellt werden. Beispielhafte Säuredditionssalze umfassen das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Bisulfat, Acetat, Valerat, Oleat, Palmatat, Stearat, Laurat, Borat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Mesylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Glukoheptonat, Lactobionat, Laurylsulfatsalze und dergleichen. Beispielhafte Alkali- und Erdalkalimetallsalze umfassen die Natrium-, Kalzium-, Kalium- und Magnesiumsalze.
Es wird verstanden werden, dass bestimmte Verbindungen mit der Formel I ein asymmetrisches Kohlenstoffatom besitzen können und somit als Enantiomere existieren können. Solange es nicht anders angegeben ist, umfasst diese Erfindung solche Enantiomere, einschließlich aller Racemate. Die separaten Enantiomere können aus chiralem Ausgangsmaterial synthetisiert werden, oder die Racemate können durch konventionelle Verfahren getrennt werden, welche im Fachgebiet der Chemie bekannt sind, wie etwa eine chirale Chromatographie, eine fraktionierte Kristallisation der diastereomeren Salze und dergleichen.
Die Verbindungen mit der Formel I können auch als geometrische Isomere (Z und E) existieren, wobei das Z-Isomer bevorzugt ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern formuliert werden für eine orale Verabreichung in einer festen oder flüssigen Form, oder für eine rektale oder topische Verabreichung, obwohl Träger für eine orale Verabreichung am meisten bevorzugt sind.
Pharmazeutisch akzeptable Träger für die orale Verabreichung umfassen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver, Pastillen und Körnchen. In solchen festen Dosierungsformen kann der Träger mindestens ein inertes Verdünnungsmittel wie etwa Saccharose, Lactose oder Stärke umfassen. Solche Träger können neben Verdünnungsmitteln auch zusätzliche Substanzen umfassen, z. B. Schmiermittel wie etwa Magnesiumstearat, wie es normalerweise praktiziert wird. Im Fall von Kapseln, Tabletten, Pastillen und Pillen können die Träger auch puffernde Mittel umfassen. Träger wie etwa Tabletten, Pillen und Körnchen können mit enterischen Beschichtungen auf den Oberflächen der Tabletten, Pillen oder Körnchen hergestellt werden. Alternativ kann die enterisch beschichtete Verbindung in eine Tablette, Pille oder ein Körnchen gepresst werden, und die Tablette, die Pille oder die Körnchen zur Verabreichung an den Patienten verwendet werden. Bevorzugte enterische Beschichtungen umfassen diejenigen, welche sich beim pH des Kolons lösen oder sich zersetzen wie etwa Schellack oder Eudraget S.
Pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung, z. B. pharmazeutisch akzeptable Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirup und Elixiere, welche normalerweise im Fachgebiet verwendete inerte Verdünnungsmittel wie etwa Wasser enthalten. Neben solchen inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen auch Adjuvanzien wie etwa Benetzungsmittel, Emulgiermittel und Suspensionsmittel, und Süßungsmittel, Geschmacksstoffe und Geruchsmittel enthalten.
Pharmazeutisch akzeptable Träger für die topische Verabreichung umfassen DMSO, Alkohol oder Propylenglykol und dergleichen, welche mit Pflastern oder anderem flüssigkeitshaltigem Material verwendet werden können, um das Medikament auf der Haut am Platz zu halten, so dass das Medikament nicht austrocknet.
Pharmazeutisch akzeptable Träger für eine rektale Verabreichung sind bevorzugt Zäpfchen, welche neben den erfindungsgemäßen Verbindungen Arzneimittelträger wie etwa Kakaobutter oder ein Zäpfchenwachs oder ein Gel enthalten können.
Der pharmazeutisch akzeptable Träger und die erfindungsgemäßen Verbindungen werden in Einheitsdosisformen zur Verabreichung an einem Patienten formuliert. Die Dosierungsspiegel des Wirkstoffs (d. h. der erfindungsgemäßen Verbindungen) in der Einheitsdosierung kann so variiert werden, dass eine Menge an Wirkstoff erhalten wird, welche in Übereinstimmung mit dem gewünschten Verabreichungsverfahren (d. h. oral oder rektal) eine die Läsion beseitigende Aktivität erreichen kann. Das ausgewählte Dosierungsniveau hängt deswegen von der Art des verabreichten Wirkstoffs, des Wegs der Verabreichung, der gewünschten Behandlungsdauer und anderen Faktoren ab. Falls erforderlich, kann die Einheitsdosierung so sein, dass die tägliche Anforderung an Wirkstoff in einer Dosis vorliegt, oder zwischen mehreren Dosierungen der Verabreichung aufgeteilt wird, z. B. zwei- bis viermal pro Tag.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind bevorzugt in einen Behälter verpackt (z. B. einer Box oder Flasche oder beides) mit einem geeigneten bedruckten Material (z. B. einer Packungsbeilage), welches die Indikationen, Gebrauchsanleitung usw. enthält.
Es gibt mehrere allgemeine Schemata zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen. Ein allgemeines Schema (welches mehrere Variationen besitzt) betrifft den Fall, worin sowohl R₃ als auch R₄ jeweils Wasserstoff sind. Dieses erste Schema wird unmittelbar anschließend im Schema 1 gezeigt. Das andere allgemeine Schema (welches auch mehrere Variationen besitzt) betrifft den Fall, bei dem mindestens eines von R₃ und R₄ ein von Wasserstoff verschiedener Anteil ist, aber innerhalb der obigen Formel I liegt. Dieses zweite Schema wird unten als "Schema II" beschrieben.
Das allgemeine Schema zur Herstellung von Verbindungen, worin sowohl R₃ als auch R₄ jeweils Wasserstoff ist, ist in Schema I veranschaulicht, welches teilweise im US-Patent mit der Nr. 3,312,731 beschrieben ist, welches hierin als Referenz enthalten ist. In Schema I ist R₁ wie in der Formel I oben definiert. Aber in Schema I kann der Substituent auch ein reaktiver Teil (z. B. eine Nitrogruppe) sein, welche später umgesetzt werden kann, um eine größere Zahl von anderen substituierten Indenen aus den Nitro-substituierten Indenen herzustellen.
Schema I
In Schema I können mehrere Variationen verwendet werden. In einer Variation kann ein substituiertes Benzaldehyd (a) mit einem substituierten Essigester in einer Knövenagel-Reaktion (siehe Reaktion 2) oder mit einem α-Halogenpropionsäureester in einer Reformatsky-Reaktion (siehe Reaktionen 1 und 3) kondensiert werden. Der resultierende ungesättigte Ester (c) wird hydriert und hydrolysiert, um eine substituierte Benzylpropionsäure (e) zu ergeben (siehe Reaktionen 4 und 5). Alternativ ergibt ein substituierter Malonsäureester in einer typischen Malonsäureestersynthese (siehe Reaktionen 6 und 7) und Hydrolysedecarboxylierung des resultierenden substituierten Esters (g) direkt die Benzylpropionsäure (e). Dieses letztere Verfahren ist besonders bevorzugt für Nitro- und Alkylthiosubstituenten am Benzolring.
Der nächste Schritt ist der Ringschluss der β-Arylpropionsäure (e), um ein Indanon (h) zu bilden, was durch eine Friedel-Crafts-Reaktion unter Verwendung eines Lewissäurekatalysators (vgl. Organic Reactions, Vol. 2, S. 130) oder durch Erhitzen mit Phosphorsäure (siehe Reaktion 8 bzw. 9) durchgeführt werden kann. Das Indanon (h) kann mit einem α-Halogenester in der Reformatsky-Reaktion kondensiert werden, um die aliphatische Säurenseitenkette durch Ersetzen der Carboxylgruppe einzubringen (siehe Reaktion 10). Alternativ kann dieses Einbringen durchgeführt werden durch Verwendung einer Wittig-Reaktion, in welcher das Reagenz ein α-Triphenylphospinylester ist, ein Reagenz, welches das Carbonyl mit einer Doppelbindung an das Carbon ersetzt (siehe Reaktion 12). Dieses Produkt (I) lagert sich dann unmittelbar in das Inden (j) um (siehe Reaktion 13). Wenn der Weg der Reformatsky-Reaktion verwendet wird, muss das intermediäre 3-Hydroxy-3-aliphatische Säurederivat i zum Inden (j) dehydriert werden (siehe Reaktion 11).
Die Indenylessigsäure (k) in THF wird dann mit Oxalyl oder Thionylchlorid oder einem ähnlichen Reagenz umgesetzt, um das Säurechlorid (m) zu erzeugen (siehe Reaktion 15), wobei das Lösungsmittel vedampft wird. Es gibt zwei Verfahren, um die Reaktion 16 durchzuführen, welche die Addition der Benzylaminseitenkette (n) ist.
Verfahren (I)
In dem ersten Verfahren wird das Benzylamin (n) langsam bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 5-Fluor-2-methyl-3-indenylacetylchlorid in CH₂Cl₂ zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht unter Rückfluss erhitzt und mit wässrigem HCl (10%), Wasser und wässrigem NaHCO₃ (5%) extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet (Na₂SO₄) und wird verdampft, um die Amidverbindung (o) zu ergeben.
Verfahren (II)
Im zweiten Verfahren wird die Indenylessigsäure (k) in DMA mit einem Carbodiimid (z. B. N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid) und Benzylamin bei Raumtemperatur für 2 Tage umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird tropfenweise in gerührtes Eiswasser gegeben. Es wird ein gelbes Präzipität abgefiltert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Rekristallisation ergibt die Amidverbindung (o).
Verbindungen des Typs a (Schema III), o (Schema I), t (Schema II), y (Schema IIB) können alle in der Schema III gezeigten Kondensationsreaktion verwendet werden.
Substituenten

X = Halogen, normalerweise Cl oder Br.
E = Methyl, Ethyl oder Benzyl, oder Niederalkyl.
R₁, R₂, R₆, R₅ und R₇ = wie in Formel I definiert.
Y, n und m = wie in Formel I definiert.

Reagenzien und allgemeine Bedingungen für Schema I (Zahlen beziehen sich auf die nummerierten Reaktionen)

(1) Zn-Staub in einem wasserfreien inerten Lösungsmittel wie Benzol und Ether.
(2) KHSO₄ oder p-Toluolsulfonsäure.
(3) NaOC₂H₅ in wasserfreiem Ethanol bei Raumtemperatur.
(4) H₂-Palladium auf Kohle, 40 psi Raumtemperatur.
(5) NaOH in wässrigem Alkohol bei 20–100°C.
(6) NaOC₂H₅ oder eine andere starke Base wie etwa NaH oder K-t-Butoxid.
(7) Säure.
(8) Friedel-Crafts-Reaktion unter Verwendung eines Lewissäurekatalysators. Vgl. Organic Reactions, Vol. II, S. 130.
(9) Hitze mit Polyphosphorsäure.
(10) Reformatsky-Reaktion: Zn in inertem Lösungsmittel, Hitze.
(11) p-Toluolsulfonsäure und CaCl₂ oder I₂ bei 200°C
(12) Wittig-Reaktion unter Verwendung (C₆H₅)₃ P=C-COOE 20–80°C in Ether oder Benzol
(13) (a) NBS/CCl₄/Benzoylperoxid
(b) PtO₂/H₂ (1 atm.)/Essigsäure
(14) (a) NaOH
(b) HCl
(15) Oxalyl oder Thionylchlorid in CH₂Cl₂ oder THF
(16) Verfahren I: 2 Äquvialente NH₂-C(R₅R₆)-Ph-(R₇)_m Verfahren II: Carbodiimid in THF
(17) 1 N NaOCH₃ in MeOH unter Rückflussbedingungen

Indanone innerhalb des Umfangs der Verbindung (h) in Schema I sind in der Literatur bekannt und sind deswegen als Zwischenprodukte für den Rest der Synthese leicht verfügbar, so dass die Reaktionen 1 bis 7 günstigerweise vermieden werden können. Unter solchen Indanonen sind:
5-Methoxyindanon
6-Methoxyindanon
5-Methylindanon
5-Methyl-6-methoxyindanon
5-Methyl-7-chlorindanon
4-Methoxy-7-chlorindanon
4-Isopropyl-2,7-dimethylindanon
5,6,7-Trichlorindanon
2-n-Butylindanon
5-Methylthioindanon
Schema II besitzt zwei sich gegenseitig ausschließende Schemata: Schema IIA und Schema IIB. Schema IIA wird verwendet, wenn R₃ Hydroxy ist und R₄ Wasserstoff ist oder wenn die zwei Substituenten eine Oxogruppe bilden. Wenn R₃ ein Niederalkylamino ist, wird Schema IIB verwendet.
Schema IIA
Ähnlich wie in Schema I wird in Schema IIA die Indenylessigsäure (k) in THF mit Oxalylchlorid unter Rückflussbedingungen umgesetzt, um das Säurechlorid (p) zu erzeugen (siehe Reaktion 18), woraufhin das Lösungsmittel verdampft wird. In Reaktion 19 wird ein Gemisch mit 0°C von Benzylhydroxylaminhydrochlorid (q) und Et₃N mit einer kalten Lösung des Säurechlorids in CH₂Cl₂ über einen Zeitraum von 45–60 min behandelt. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur erwärmt und für 1 h gerührt, und wird mit Wasser behandelt. Die resultierende organische Schicht wird mit 1 N HCl und Lauge gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und wird verdampft. Das rohe Produkt, ein N-Hydroxy-N-benzylacetamid (r) wird durch Kristallisierung oder Flash-Chromatographie gereinigt. Dieses allgemeine Verfahren wird von Hoffman et al., JOC 1992, 57, 5700–5707 gelehrt.
Der nächste Schritt ist die Herstellung des N-Mesyloxyamids (s) in Reaktion 20, welche ebenso von Hoffman et al., JOC 1992, 57, 5700–5707 gelehrt wird. Im besonderen wird zu einer Lösung der Hydroxamsäure (r) in CH₂Cl₂ bei 0°C Triethylamin zugegeben. Das Gemisch wird für 10–12 min gerührt und es wird tropfenweise Methansulfonylchlorid zugegeben. Das Gemisch wird bei 0°C für 2 h gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 2 h gerührt. Die organische Schicht wird mit Wasser, 1 N HCl und Lauge gewaschen und wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach einer Rotationsverdampfung wird das Produkt (die Produkte) normalerweise durch Kristallisierung oder Flash-Chromatographie gereinigt.
Die Herstellung des N-Benzyl-α-(hydroxy)amids (t) in Reaktion 21 wird auch von Hoffman et al., JOC 1992, 57, 5700–5707 und von Hoffman et al., JOC 1995, 60, 4121–4125 gelehrt. Im besonderen wird zu einer Lösung des N-(Mesyloxy)amids (der N-(Mesyloxy)amide) in CH₃CN/H₂O Trimethylamin in CH₃CN über einen Zeitraum von 6–12 h zugegeben. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst. Die Lösung wird mit Wasser, 1 N HCl und Lauge gewaschen und wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach einer Rotationsverdampfung wird das Produkt/die Produkte normalerweise durch Rekristallisation gereinigt.
Die Reaktion 22 in Schema IIA betrifft eine Kondensation mit bestimmten Aldehyden, welche in Schema III unten beschrieben wird, ein Schema, welches den Produkten gemeinsam ist, welche gemäß den Schemata I, IIA und IIB hergestellt werden.
Die abschließende Reaktion 23 in Schema IIA ist die Herstellung des N-Benzyl-α-ketoamids (v), welches die Oxidation eines sekundären Alkohols (u) zu einem Keton betrifft, z. B. durch eine Pfitzner-Moffatt-Oxidation, welche den Alkohol selektiv oxidiert, ohne die Y-Gruppe zu oxidieren. Die Verbindungen (u) und (v) können derivatisiert werden, um Verbindungen zu erhalten mit R₃- und R₄-Gruppen, wie in Formel I dargestellt.
Schema IIB
Wie oben erklärt, wird das Schema IIB angewendet, wenn R₃ ein Niederalkylamino ist. Ähnlich wie in Schema I wird in Schema IIB die Indenylessigsäure (k) in THF mit Oxalylchlorid unter Rückflussbedingungen umgesetzt, um das Säurechlorid (p) zu erzeugen (siehe Reaktion 18), woraufhin das Lösungsmittel verdampft wird. In Reaktion 24 wird ein Gemisch eines Alkylhydroxylaminhydrochlorids (d. h. HO-NHR, worin R ein Niederalkyl, bevorzugt Isopropyl ist) und Et₃N bei 0°C mit einer kalten Lösung des Säurechlorids in CH₂Cl₂ über einen Zeitraum von 45–60 min behandelt. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur erwärmt und wird für 1 h gerührt, und wird mit Wasser verdünnt. Die resultierende organische Schicht wird mit 1 N HCl und Lauge gewaschen, wird über Magnesiumsulfat getrocknet und wird verdampft. Das rohe Produkt, ein N-Hydroxy-N-alkylacetamid (w) wird durch Kristallisierung oder Flash-Chromatographie gereinigt. Dieses allgemeine Verfahren ist auch in Hoffman et al., JOC 1992, 57, 5700–5707 gelehrt.
Die Herstellung des N-Mesyloxyamids (x) in Reaktion 25 wird ebenso in Hoffman et al., JOC 1992, 57, 5700–5707 gelehrt. Im besonderen wird eine Lösung der Hydroxamsäure (w) in CH₂Cl₂ bei 0°C mit Triethylamin behandelt, wird für 10–12 min gerührt und wird tropfenweise mit Methansulfonylchlorid behandelt. Das Gemisch wird bei 0°C für 2 h gerührt und auf Raumtemperatur aufgewärmt und wird für weitere 2 h gerührt. Die resultierende organische Schicht wird mit Wasser, 1 N HCl und Lauge gewaschen und wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach einer Rotationsverdampfung wird das Produkt (x) normalerweise durch Kristallisation oder Flash-Chromatographie gereinigt.
Die Herstellung der N-Benzylindenyl-α-Niederalkylamino-Acetamid-Verbindung (y) in Schema IIB wie in Hoffman et al., JOC 1995, 60, 4121–25 und J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 5031–34 gelehrt, betrifft die Reaktion des N-Mesyloxyamids (x), wobei ein Benzylamin in CH₂Cl₂ bei 0°C über einen Zeitraum von 30 min zugegeben wird. Die resultierende Lösung wird bei 0°C für 1 h und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird mit 1 N NaOH behandelt. Das Extrakt mit CH₂Cl₂ wird mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach einer Rotationsverdampfung wird das Produkt (y) durch Flash-Chromatographie oder Kristallisation gereinigt.
Schema III
Das Schema III betrifft die Kondensation der Heterocycloaldehyde (d. h. Y-CHO) mit den Indenylamiden, um die Endverbindungen mit der Formel I zu erzeugen. Diese Kondensation wird beispielsweise in Reaktion 17 in Schema I oben und in Reaktion 22 in Schema IIA angewandt. Sie wird auch verwendet, um die Verbindung (y) in Schema IIB zu den Endverbindungen mit der Formel I umzuwandeln.
In Schema III wird das Amid (a') aus den obigen Schemata, ein N-Heterocycloaldehyd (z) und Natriummethoxid (1 M in Methanol) bei 60°C unter Stickstoff für 24 h gerührt. Nach dem Kühlen wird das Reaktionsgemisch in Eiswasser geschüttet. Ein Feststoff wird abgefiltert, wird mit Wasser gewaschen und in Vakuum getrocknet. Die Rekristallisation stellt eine Verbindung mit der Formel I in den Schemata I und IIB und das Zwischenprodukt (u) in Schema IIA bereit.
Wie oben angemerkt wird, ist es bei der Herstellung vieler Arten der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt, einen Nitrosubstituenten am Benzolring des Indanonkerns zu verwenden, und ihn später in einen gewünschten Substituenten umzuwandeln, da durch diesen Weg eine große Vielzahl von Substituenten erreicht werden kann. Dies wird erreicht durch Reduktion der Nitrogruppe zur Aminogruppe, gefolgt von der Verwendung der Sandmeyer-Reaktion, um Chlor, Brom, Cyan oder Xanthat anstelle von Amino einzubringen. Aus den Cyanderivaten ergibt die Hydrolyse das Carboxamid und die Carbonsäure; andere Derivate der Carboxygruppe, so wie die Ester, können dann hergestellt werden. Die Xanthane ergeben durch Hydrolyse die Mercaptogruppe, welche leicht zur Sulfonsäure oxidiert werden kann oder zu einer Alkylthiogruppe alkyliert werden kann, welche dann zu Alkylsulfonylgruppen oxidiert werden kann. Diese Reaktionen können entweder vor oder nach dem Einbringen des 1-Substituenten durchgeführt werden.
Das Vorhergehende kann anhand der folgenden Beispiele besser verstanden werden, welche zum Zweck der Veranschaulichung gezeigt werden. Wie in den folgenden Beispielen verwendet, beziehen sich die Referenzen auf Substituenten wie etwa R₁, R₂ usw. auf die entsprechenden Verbindungen und Substituenten in der obigen Formel I.
Beispiel 1
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
(A) p-Fluoro-α-methylzimtsäure
p-Fluorbenzaldehyd (200 g, 1,61 Mol), Propionsäureanhydrid (3,5 g, 2,42 Mol) und Natriumpropionat (155 g, 1,61 Mol) werden in einem 1 l Dreihalskolben, welcher mit Stickstoff gespült wurde, gemischt. Der Kolben wird stufenweise in einem Ölbad auf 140°C erhitzt. Nach 20 h wird der Kolben auf 100°C abgekühlt und in 8 l Wasser gegossen. Das Präzipitat wird durch Zugabe von Kaliumhydroxid (302 g) in 2 l Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird mit Ether extrahiert und die Etherextrakte werden mit einer Kaliumhydroxidlösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen werden filtriert, werden mit konzentrierter HCl angesäuert und werden filtriert. Der gesammelte Feststoff p-Fluor-α-methylzimtsäure wird mit Wasser gewaschen und wird getrocknet und wie erhalten verwendet.
(B) p-Fluor-α-methylhydrozimtsäure
Zu p-Fluor-α-methylzimtsäure (117,9 g, 0,987 Mol) in 3,6 l Ethanol werden 11,0 g 5% Pd/C zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur unter einem Wasserstoffdruck von 275,8 kPa (40 psi) reduziert. Wenn die Wasserstoffaufnahme nachlässt, wird der Katalysator abgefiltert und das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft, um das Produkt p-Fluor-α-methylhydrozimtsäure zu erhalten, welches direkt im nächsten Schritt verwendet wurde.
(C) 6-Fluor-2-methylindanon
Zu 932 g Polyphosphorsäure bei 70°C (Dampfbad) wird p-Fluor-α-methylhydrozimtsäure (93,2 g, 0,5 Mol) langsam unter Rühren zugegeben. Die Temperatur wird schrittweise auf 95°C angehoben und das Gemisch wird bei dieser Temperatur für 1 h gehalten. Das Gemisch wird abgekühlt und wird zu 2 l Wasser zugegeben. Die wässrige Suspension wird mit Ether extrahiert. Der Extrakt wird zweimal mit einer gesättigten Natriumchloridlösung, 5% Na₂CO₃-Lösung und Wasser gewaschen und wird getrocknet und wird auf 200 g Silicagel aufkonzentriert; die Aufschlämmung wird auf eine 5-Pfund-Silicagelsäule zugegeben, welche mit 5% Ether-Petrolether gepackt wurde. Die Säule wird mit 5–10% Ether-Petrolether eluiert und ergibt 6-Fluor-2-methylindanon. Nach der Elution folgt eine TLC.
(D) 5-Fluor-2-methylindenyl-3-essigsäure
Ein Gemisch aus 6-Fluor-2-methylindandon (18,4 g, 0,112 Mol), Cyanessigsäure (10,5 g, 0,123 Mol), Essigsäure (6,6 g) und Ammoniumacetat (1,7 g) in trockenem Toluol (15,5 ml) wird unter Rühren für 21 h unter Rückfluss erhitzt, wobei das freigesetzte Wasser in einer Dean-Stark-Falle gesammelt wird. Das Toluol wird verdampft und der Rückstand wird in 60 ml heißem Ethanol und 14 ml einer 2,2 N wässrigen Kaliumhydroxidlösung gelöst. Es werden 22 g 85% KOH in 150 ml Wasser zugegeben, und das Gemisch wird für 13 h unter Rückfluss erhitzt. Der Ethanol wird unter Vakuum entfernt und es werden 500 ml Wasser zugegeben. Die wässrige Lösung wird ausgiebig mit Ether extrahiert und wird dann mit Kohle gekocht. Das wässrige Filtrat wird mit 50% kalter Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Das Präzipität wird getrocknet und es wird 5-Fluor-2-methylindenyl-3-essigsäure (Schmelzpunkt 164–166°C) erhalten.
(E) 5-Fluor-2-methylindenyl-3-acetylchlorid
5-Fluor-2-methylindenyl-3-essigsäure (70 mmol) in THF (70 ml) wird mit Oxalylchlorid (2 M in CH₂Cl₂; 35 ml; 70 mmol) unter Rückflussbedingungen (24 h) umgesetzt. Das Lösungsmittel wird verdampft und ergibt die Titelverbindung, welche als solche im nächsten Schritt verwendet wird.
(F) 5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
Benzylamin (5 mmol) wird langsam bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 5-Fluor-2-methylindenyl-3-acetylchlorid (2,5 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht unter Rückfluss erhitzt und wird mit wässriger HCl (10%), Wasser und wässriger NaHCO₃ (5%) extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet (Na₂SO₄) und wird verdampft und ergibt die Titelverbindung, welche aus CH₂Cl₂ rekristallisiert wird, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (Schmelzpunkt 144°C) zu ergeben.
(G) (Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid (3,38 mmol), 4-Pyridincarboxaldehyd (4 mmol), Natriumethoxid (1 M NaOCH₃ in Methanol (30 ml)) werden unter Stickstoff unter Rühren für 24 h bei 60°C erhitzt. Nach dem Kühlen wird das Reaktionsgemisch in Eiswasser (200 ml) geschüttet. Es wird ein Feststoff abgefiltert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Rekristallisation aus CH₃CN ergibt die Titelverbindung (Schmelzpunkt 202°C) als einen gelben Feststoff (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyridinyl).
(H) (E)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
Die aus der CH₃CN-Rekristallisation von 1G erhaltene Ausgangslösung ist reich am geometrischen Isomer von 1G. Das E-Isomer kann in reiner Form erhalten werden durch wiederholte Rekristallisationen aus CH₃CN.
Beispiel 2
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(3-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
Diese Verbindung wird erhalten aus 5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid (Beispiel 1F) unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1, Teil G und Ersetzen des 4-Pyridincarboxyaldehyds durch 3-Pyridincarboxaldehyd. Die Rekristallisation aus CH₃CN ergibt die Titelverbindung (Schmelzpunkt 175°C) (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Pyridinyl).
Beispiel 3
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(2-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
Diese Verbindung wird erhalten aus 5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid (Beispiel 1F) unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 1, Teil G und Ersetzen von 4-Pyridincarboxaldehyd durch 2-Pyridincarboxaldehyd. Die Rekristallisation aus Ethylacetat ergibt die Titelverbindung (Schmelzpunkt 218°C) (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 2-Pyridinyl).
Beispiel 4
(Z)-Fluor-2-methyl-(4-chinolinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
Diese Verbindung wird erhalten aus 5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid (Beispiel 1F) unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 1, Teil G und Ersetzen von 4-Pyridincarboxaldehyd durch 4-Chinolincarboxaldehyd. Die Rekristallisation aus Ethylacetat ergibt die Titelverbindung (Schmelzpunkt 239°C) (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Chinolinyl).
Beispiel 5
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4,6-dimethyl-2-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylcetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit 4,6-Dimethyl-2-pyridincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4,6-Dimethyl-2-pyridinyl).
Beispiel 6
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(3-chinolinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit 3-Chinolincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Chinolinyl).
Beispiel 7
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(2-chinolinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit 2-Chinolincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 2-Chinolinyl).
Beispiel 8
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(pyrazinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit Pyrazinaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = Pyrazinyl).
Beispiel 9
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(3-pyrazinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit Pyridazin-3-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Pyridazinyl).
Beispiel 10
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyrimidinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit Pyrimidin-4-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyrimidinyl).
Beispiel 11
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(2-methyl-4-pyrimidinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit 2-Methylpyrimidin-4-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisierung ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 2-Methyl-4-pyrimidinyl).
Beispiel 12
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridazinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit Pyridazin-4-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyridazinyl).
Beispiel 13
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(1-methyl-3-indolyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit 1-Methylindol-3-carboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = N, n = 1, m = 1, Y = 1-Methyl-3-indolyl).
Beispiel 14
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(1-acetyl-3-indolyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 1, Teil F wird mit 1-Acetyl-3-indolcarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelerbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 1-Acetyl-3-indolyl).
Beispiel 15
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
(A) 5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
Diese Verbindung wird erhalten aus 5-Fluor-2-methylindenyl-3-acetylchlorid (Beispiel 1E) unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1, Teil F und Ersetzen von Benzylamin durch 2-Flurobenzylamin.
(B) (Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid wird umgesetzt mit 4-Pyridincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyridinyl).
Beispiel 16
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(3-pyridinyliden)-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 15, Teil A wird mit 3-Pyridincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = N, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Pyridinyl).
Beispiel 17
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(2-pyridinyliden)-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 15, Teil A wird mit 2-Pyridincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 2-Pyridinyl).
Beispiel 18
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-chinolinyliden)-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 15, Teil A wird mit 4-Chinolincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Chinolinyl).
Beispiel 19
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(3-pyrazinyliden)-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 15, Teil A wird mit Pyrazinaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Pyrazinyl).
Beispiel 20
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(3-pyridazinyliden)-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 15, Teil A wird mit 3-Pyrazin-3-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Pyridazinyl).
Beispiel 21
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(3-pyrimidinyliden)-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 15, Teil A wird mit Pyrimidin-4-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Pyrimidinyl).
Beispiel 22
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridazinyliden)-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-fluorbenzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 15, Teil A wird mit Pyridazin-4-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyridazinyl).
Beispiel 23
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-(S-α-hydroxymethyl)benzyl)-indenylacetamid
(A) 5-Fluor-2-methyl-3-(N-(S-α-hydroxylmethyl)benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methylindenyl-3-essigsäure (aus Beispiel 1D) (2,6 mmol) in DMA (2 ml) wird mit n-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (4 mmol) und S-2-Amino-2-phenylethanol (3,5 mmol) bei Raumtemperatur für 2 Tage umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird tropfenweise zu gerührtem Eiswasser (50 ml) zugegeben. Ein weißes Präzipität wird abgefiltert, mit Wasser gewaschen (5 ml) und im Vakuum getrocknet. Die Rekristallisation aus Ethylacetat ergibt die gewünschte Verbindung.
(B) (Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-(S-α-hydroxymethyl)benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-(S-α-hydroxylmethyl)benzyl)-indenylacetamid aus Teil A wird mit 4-Pyridincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyridinyl).
Beispiel 24
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(3-pyridinyliden)-3-(N-(S-α-hydroxymethyl)benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-(S-α-hydroxylmethyl)benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 23 Teil A wird mit 3-Pyridincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Pyridinyl).
Beispiel 25
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(2-pyridinyliden)-3-(N-(S-α-hydroxymethyl)benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-(S-α-hydroxylmethyl)benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 23 Teil A wird mit 2-Pyridincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 2-Pyridinyl).
Beispiel 26
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-chinolinyliden)-3-(N-(S-α-hydroxymethyl)benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-(S-α-hydroxylmethyl)benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 23 Teil A wird mit 4-Chinolincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Chinolinyl).
Beispiel 27
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(pyrazinyliden)-3-(N-(S-α-hydroxymethyl)benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-(S-α-hydroxylmethyl)benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 23 Teil A wird mit Pryazidincarboxaldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = Pyrazidinyl).
Beispiel 28
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(3-pyridazinyliden)-3-(N-(S-α-hydroxymethyl)benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-(S-α-hydroxylmethyl)benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 23 Teil A wird mit Pryidazidin-3-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 3-Pyridazinyl).
Beispiel 29
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyrimidinyliden)-3-(N-(S-α-hydroxymethyl)benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-(S-α-hydroxylmethyl)benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 23 Teil A wird mit Pyrimidin-4-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyrimidinyl).
Beispiel 30
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridazinyliden)-3-(N-(S-α-hydroxymethyl)benzyl)-indenylacetamid
5-Fluor-2-methyl-3-(N-(S-α-hydroxylmethyl)benzyl)-indenylacetamid aus Beispiel 23 Teil A wird mit Pyridazin-4-aldehyd gemäß dem Verfahren von Beispiel 1, Teil G umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten. Die Rekristallisation ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyridazinyl).
Beispiel 31
rac-(Z)-5-fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)indenyl-α-hydroxyacetamid
(A) 5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl-N-hydroxy)-indenylacetamid
Zu einem Gemisch aus N-Benzylhydroxylaminhydrochlorid (12 mmol) und Et₃N (22 mmol) in CH₂Cl₂ (100 ml) bei 0°C wird eine kalte Lösung von 5-Fluor-2-methylindenyl-3-acetylchlorid (Beispiel 1, Schritt E) (10 mmol) in CH₂Cl₂ (57 ml) über einen Zeitraum von 45–60 min zugegeben. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur erwärmt und wird für 1 h gerührt. Das Gemisch wird mit Wasser (100 ml) verdünnt und die organische Schicht wird mit HCl (2 × 25 ml) und Lauge (2 × 100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und verdampft. Das rohe Produkt wird mit Flash-Chromatographie gereinigt, um die Titelverbindung zu erhalten.
(B) 5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl-N-mesyloxy)-indenylacetamid
Zu einer Lösung aus 5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl-N-hydroxy)-indenylacetamid (5 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) bei 0°C wird Triethylamin (5 mmol) zugegeben. Das Gemisch wird für 10 min gerührt und Methansulfonylchlorid (5,5 mmol) wird tropfenweise zugegeben. Die Lösung wird bei 0°C für 2 h gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 2 h gerührt. Die organische Schicht wird mit Wasser (2 × 20 ml) in HCl (15 ml) und Lauge (20 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach einer Rotationsverdampfung wird das Produkt mit Flash-Chromatographie gereinigt, um Titelverbindung zu erhalten.
(C) rac-5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-α-hydroxyindenylacetamid
Zu einer Lösung aus 5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl-N-mesyloxy)-indenylacetamid (2 mmol) in CH₃CN/H₂O (jeweils 12 ml) wird Triethylamin (2,1 mmol) in CH₃CN (24 ml) über einen Zeitraum von 6 h zugegeben. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird mit Ethylacetat (60 ml) verdünnt, mit Wasser (4 × 20 ml) in HCl (15 ml) und Lauge (20 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach einer Rotationsverdampfung wird das Produkt durch Rekristallisation gereinigt, um die Titelverbindung zu erhalten.
(D) rac-(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenyl-α-hydroxyacetamid
Wird aus rac-5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-α-hydroxyindenylacetamid unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 1, Teil G erhalten (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = OH, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyridinyl).
Beispiel 32
2-[(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benyzl)-indenyl]-oxyacetamid
Für eine Pfitzner-Moffatt-Oxidation wird eine Lösung aus rac-(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenyl-α-hydroxyacetamid (1 mmol) in DMSO (5 ml) mit Dicyclohexylcarbodiimid (3 mol) behandelt. Das Gemisch wird über Nacht gerührt und das Lösungsmittel wird verdampft. Das rohe Produkt wird durch Flash-Chromatographie gereinigt und ergibt die Titelverbindung (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ und R₄ zusammen bilden C = O, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, und Y = 4-Pyridinyl).
Beispiel 33
rac-(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenyl-α-(2-propylamino)-acetamid
(A) 5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-propyl-N-hydroxy)-indenylacetamid
Wird erhalten aus 5-Fluor-2-methylindenyl-3-acetylchlorid (Beispiel 1, Schritt E) unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 31, Teil A und Ersetzen von N-Benzylhydroxylaminhydrochlorid mit N-2-Propylhydroxylaminhydrochlorid.
(B) 5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-propyl-N-mesyloxy)-indenylacetamid
Wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 31, Teil B erhalten.
(C) rac-5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-α-(2-propylamino)-acetamid
Zu 5-Fluor-2-methyl-3-(N-2-propyl-N-mesyloxy)-indenylacetamid (2 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) bei 0°C wird Benzylamin (4,4 mmol) in CH₂Cl₂ (15 ml) über einen Zeitraum von 30 min zugegeben. Die resultierende Lösung wird bei 0°C für 1 h und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird mit 1 N NaOH behandelt und wird mit CH₂Cl₂ (100 ml) extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser (2 × 10 ml) gewaschen und wird über MgSO₄ getrocknet. Nach einer Rotationsverdampfung wird das Produkt durch Flash-Chromatographie gereinigt.
(D) rac-(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenyl-α-(2-propylamino)-acetamid
Wird aus rac-5-Fluor-2-methyl-3-(N-benzyl)-α-(3-propylamino)-acetamid unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1, Teil G erhalten (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = Isopropylamino, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyridinyl).
Beispiel 34
(Z)-6-Methoxy-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
(A) Ethyl-2-hydroxy-2-(p-methoxyphenyl)-1-methylpropionat
In einen 500 ml-Dreihalskolben werden 36,2 g (0,55 Mol) Zinkstaub platziert, ein 250 ml-Zugabetrichter wird mit einer Lösung von 80 ml wasserfreiem Benzol, 20 ml wasserfreiem Ether, 80 g (0,58 Mol) p-Anisaldehyd und 98 g (0,55 Mol) Ethyl-2-brompropionat beladen. Etwa 10 ml der Lösung werden zu dem Zinkstaub unter heftigem Rühren zugegeben, und das Gemisch wird sanft erwärmt, bis eine exotherme Reaktion beginnt. Der Rest wird tropfenweise mit einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, dass das Reaktionsgemisch ruhig weiterhin refluxiert (ca. 30–35 min). Nachdem die Zugabe vollständig ist, wird das Gemisch in einem warmen Wasserbad platziert und für 30 min unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlung auf 0°C werden 250 ml 10% Schwefelsäure unter heftigem Rühren zugegeben. Die Benzolschicht wird zweimal mit 50 ml-Portionen 5% Schwefelsäure extrahiert und zweimal mit 50 ml-Portionen Wasser gewaschen. Die vereinigten wässrigen sauren Schichten werden mit 2 × 50 ml Ether extrahiert. Die vereinigten Ether- und Benzolextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet. Die Verdampfung des Lösungsmittels und Fraktionierung des Rückstands durch eine 6''-Vigreux-Kolonne ergibt 89 g (60%) des Produkts Ethyl-2-hydroxy-2-(p-methoxyphenyl)-1-methylpropionat, Siedepunkt 165–160°C (1,5 mm).
(B) 6-Methoxy-2-methylindanon
Durch das Verfahren, welches von Vander Zanden, Rec. Trav. Chem. 68, 413 (1949) beschrieben wird, wird die Verbindung aus Teil A in 6-Methoxy-2-methylindanon umgewandelt.
Alternativ kann die gleiche Verbindung erhalten werden durch Zugabe von α-Methyl-β-(p-methoxyphenyl)propionsäure (15 g) zu 170 g Polyphosphorsäure bei 50°C und Erhitzen des Gemischs für 2 h bei 83–90°. Der Sirup wird in Eiswasser gegossen. Das Gemisch wird für ½ h gerührt und wird mit Ether (3 ×) extrahiert. Die Etherlösung wird mit Wasser (2 ×) und 5% NaHCO₃ (5 ×) gewaschen, bis das gesamte saure Material entfernt worden ist, und wird über Natriumsulfat getrocknet. Die Verdampfung der Lösung ergibt 9,1 g des Indanons als ein blassgelbes Öl.
(C) (Z)-6-Methoxy-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
Gemäß den in Beispiel 1, Teile D–G beschriebenen Verfahren wird diese Verbindung erhalten durch Substituieren von 6-Methoxy-2-methylindanon für 6-Fluor-2-methylindanon in Teil D des Beispiels 1.
Beispiel 35
(Z)-5-Methoxy-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3(N-benzyl)-indenylacetamid
(A) Ethyl-5-methoxy-2-methyl-3-indenylacetat
Eine Lösung von 13,4 g 6-Methoxy-2-methyl-indanon und 21 g Ethylbromacetat in 45 ml Benzol wird über einen Zeitraum von 5 min zu 21 g Zinkamalgam (hergestellt nach Org. Syn. Coll. Vol. 3) in 110 ml Benzol und 40 ml trockenem Ether. Es werden einige wenige Iodkristalle zugegeben, um die Reaktion zu starten, und das Reaktionsgemisch wird bei einer Rückflusstemperatur (65°C) mit externem Erhitzen gehalten. In Intervallen von 3 h werden zwei Chargen von 10 g Zinkamalgam und 10 g Bromester zugegeben und das Gemisch wird dann für 8 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Zugabe von 30 ml Ethanol und 150 ml Essigsäure wird das Gemisch in 700 ml 50% wässrige Essigsäure geschüttet. Die organische Schicht wird abgetrennt und die wässrige Schicht wird zweimal mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten werden gründlich mit Wasser, Ammoniumhydroxid und Wasser gewaschen. Das Trocknen über Natriumsulfat, die Verdampfung des Lösungsmittels im Vakuum gefolgt von Pumpen bei 80° (Badtemperatur) (1–2 ml) ergibt das rohe Ethyl-(1-hydroxy-2-methyl-6-methoxy-indenyl)acetat (ca. 18 g).
Ein Gemisch des obigen rohen Hydroxyesters, 20 g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat und 20 g wasserfreies Calciumchlorid in 250 ml Toluol werden über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wird filtriert und der feste Rückstand wird mit Toluol gewaschen. Die vereinigte Toluollösung wird mit Wasser, Natriumbicarbonat, Wasser gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Verdampfen wird das rohe Ethyl 5-methoxy-3-methyl-3-indenylacetat auf mit Säure gewaschenem Aluminiumoxid chromatographiert und das Produkt wird mit Petrolether-ether (v/v 50–100%) als ein gelbes Öl eluiert (11,8 g, 70%).
(B) (Z)-5-Methoxy-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylacetamid
Gemäß den in Beispiel 1, Teile E–G beschriebenen Verfahren wird diese Verbindung erhalten durch Substituieren von Ethyl-5-methoxy-2-methyl-3-indenylacetat durch 5-Fluor-2-methindenyl-3-essigsäure in Beispiel 1, Teil E.
Beispiel 36
(Z)-α-5-Methoxy-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)-indenylpropionamid
(A) α-(5-Methoxy-2-methyl-3-indenyl)propionsäure
Das Verfahren von Beispiel 35, Teil (A) wird befolgt unter Verwendung von Ethyl-α-brompropionat in äquivalenten Mengen anstelle von Ethylbromacetat, welches darin verwendet wird. Es wird Ethyl-α-(1-Hydroxy-6-methoxy-2-methyl-1-indenyl)propionat erhalten, welches auf die gleiche Art und Weise zu Ethyl-α-(5-Methoxy-2-methyl-4-indenyl)propionat dehydratisiert wird.
Der obige Ester wird verseift, um α-(5-Methoxy-2-methyl-3-indenyl)propionsäure zu erhalten.
(B) (Z)-α-5-Methoxy-2-methyl-(4-pyridinyl)-3-(N-benzyl)-α-methylindenylpropionamid
Gemäß den in Beispiel 1, Teile E–G beschriebenen Verfahren wird diese Verbindung erhalten durch Ersetzen von α-5-Methoxy-2-methyl-3-indenyl)propionsäure für 5-Fluor-2-methylindenyl-3-essigsäure in Beispiel 1, Teil E.
Beispiel 37
(Z)-α-Fluor-5-methoxy-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)indenylacetamid
(A) Methyl-5-methoxy-2-methyl-3-indenyl-α-fluoracetat
Ein Gemisch aus Kaliumfluorid (0,1 Mol) und Methyl-5-methoxy-2-methyl-3-indenyl-α-tosyloxyacetat (0,05 Mol) in 200 ml Dimethylformamid wird unter Stickstoff bei der Rückflusstemperatur für 2–4 h erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt, in Eiswasser geschüttet und dann mit Ether extrahiert. Die Etherlösung wird mit Wasser, Natriumbicarbonat gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Verdampfung des Lösungsmittels und Chromatographie des Rückstands auf einer mit Säure gewaschenen Aluminiumoxidsäule (300 g) unter Verwendung von Ether-petrolether (v/v 20–50%) als Elutionsmittel ergibt das Produkt Methyl-5-methoxy-2-methyl-3-indenyl-α-fluoracetat.
(B) (Z) α-Fluor-5-methoxy-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)indenylacetamid
Gemäß den in Beispiel 1, Teile E–G beschriebenen Verfahren wird diese Verbindung erhalten durch Substituieren von Methyl-5-methoxy-2-methyl-3-indenyl-α-fluoracetat für 5-Fluor-2-methylindenyl-3-essigsäure in Beispiel 1, Teil E.
Für das Einbringen des Teils = CH-Y in Schema III kann ein beliebiger der geeigneten heterozyklischen Aldehyde verwendet werden, entweder im Fall einer basenkatalysierten Kondensation direkt oder in einer Wittig-Reaktion in einer alternativen Route. Die Aldehyde, welche verwendet werden können, sind in Tabelle 1 unten aufgeführt:
Tabelle 1

Pyrrol-2-aldehyd
Pyrimidin-2-aldehyd
6-Methylpyridin-2-aldehyd
1-Methylbenzimidazol-2-aldehyd
Isochinolin-4-aldehyd
4-Pyridincarboxaldehyd
3-Pyridincarboxaldehyd
2-Pyridincarboxaldehyd
4,6-Dimethyl-2-pyridincarboxaldehyd
4-Methyl-2-pyridincarboxaldehyd
4-Chinolincarboxaldehyd
3-Chinolincarboxaldehyd
2-Chinolincarboxaldehyd
2-Chlor-3-chinolincarboxaldehyd
Pyrazinaldehyd (hergestellt wie von Rutner et al., JOC 1963, 28, 1898–99 beschrieben)
Pyridazin-3-aldehyd (hergestellt wie von Heinisch et al., Monatshefte für Chemie 108, 213–224, 1977 beschrieben)
Pyrimidin-4-aldehyd (hergestellt wie von Bredereck et al., Chem. Ber. 1964, 97, 3407–17 beschrieben)
2-Methyl-pyrimidin-4-aldehyd (hergestellt wie von Bredereck et al., Chem. Ber. 1964, 97, 3407–17 beschrieben)
Pyridazin-4-aldehyd (hergestellt wie von Heinisch et al., Monatshefte für Chemie 104, 1372–1382 (1973) beschrieben)
1-Methylindol-3-carboxaldehyd
1-Acetyl-3-indolcarboxaldehyd

Die obigen Aldehyde können in den obigen Reaktionsschemata in Kombination mit verschiedenen geeigneten Aminen verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Verbindungen herzustellen. Beispiele für geeignete Amine sind in Tabelle 2 unten aufgezählt:
Tabelle 2

Benzylamin
2,4-Dimethoxybenzylamin
2-Methoxybenzylamin
2-Fluorbenzylamin
4-Dimethylaminobenzylamin
4-Sulfonaminobenzylamin
1-Phenylethylamin (R-Enantiomer)
2-Amino-2-phenylethanol (S-Enantiomer)
2-Phenylgylcinonitril (S-Enantiomer)

Beispiel 38
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)indenylacetamidhydrochlorid
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridinyliden)-3-(N-benzyl)indenylacetamid (1396 g; MW 384,45; 3,63 Mol) aus Beispiel 1 wird bei 45°C in Ethanol (28 l) gelöst. Schrittweise wird wässrige HCl (12 Mol; 363 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter Rückfluss für 1 h erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, dann bei –10°C für 3 h gelagert. Der resultierende Feststoff wird abgefiltert, mit Ether gewaschen (2 × 1,5 l) und wird über Nacht luftgetrocknet. Das Trocknen unter Vakuum bei 70°C für 3 Tage ergibt (Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridyliden)-3-(N-benzyl)indenylacetamidhydrochlorid mit einem Schmelzpunkt von 207–209°C (R₁ = F, R₂ = CH₃, R₃ = H, R₄ = H, R₅ = H, R₆ = H, R₇ = H, n = 1, m = 1, Y = 4-Pyridinyl·Hydrochlorid). Ausbeute: 1481 g (97%; 3,51 Mol); MW: 420,91 g/Mol.
¹H-NMR (DMSO-d₆): 2,18 (s, 3 =C-CH₃); 3,54 (s, 2, =CH₂CO); 4,28 (d, 2, NCH₂); 6,71 (m, l, ar); 7,17 (m, 8, ar); 8,11 (d, 2, ar; AB-System); 8,85 (m, 1, NH); 8,95 (d, 2, ar., AB-System); IR (KRb): 3432 NH; 1635 C=O; 1598 C=C.
Biologische Wirkungen
(A) Wachstumshemmung
Die Verbindung von Beispiel 1 wurde untersucht im Hinblick auf ihre Wirksamkeit der Wachstumshemmung auf die humane Kolonkarzinomzelllinie SW-480, erhalten von der ATCC (Rockville, MD), um den Grad der Wachstumshemmung zu ermitteln. Die Wachstumshemmung dieser Zelllinie ist hinweisend auf einen Nutzen bei präkanzerösen Läsionen und Neoplasien. Die Zelllinie und der für solche Experimente verwendete Wachstumsassay sind gut charakterisiert und werden verwendet, um die antineoplastischen Eigenschaften von NSAIDs zu bewerten. Der Assay wird vom National Cancer Institute der Vereinigten Staaten in dessen Screening-Programm für neue Antikrebsmittel verwendet.
Stammlösungen der Arzneimittel wurden in 100% DMSO hergestellt und wurden dann mit RPMI-Medium für die Untersuchungen der Zellkultur verdünnt. Alle Arzneimittellösungen wurden frisch am Tag der Untersuchung hergestellt. Die kultivierten Zellen wurden mit Passage #99 erhalten und im RPMI-Medium, welches mit 5% fötalem Kälberserum und 2 mmol Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin ergänzt war, angezogen. Die Kulturen wurden in einer angefeuchteten Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO₂ bei 37°C gehalten. Die Kulturen wurden passagiert, wenn die Dichte noch nicht konfluent war, unter Verwendung einer Lösung von 0,05% Trypsin und 0,35 mmol EDTA. Die Zellen wurden mit 1000 Zellen/Well in 96 Well-Flachbodenmikrotiterplatten ausplattiert.
Die Wachstumshemmung der Tumorzellen wurde bewertet unter Verwendung des Sulforhodamin B (SRB)-Proteinbindungsassays. In diesem Assay werden Tumorzellen in 96-Well-Platten ausplattiert und mit einem Arzneimittelhaltigen Medium für 6 Tage behandelt (ständige Exposition). Für jede Platte werden 6 Wells als Kontrollen ohne Behandlung bestimmt, 6 Wells als Kontrollen für das Vehikel (0,1% DMSO) und die restlichen Wells für Arzneimittelverdünnungen, wobei pro Arzneimittelkonzentration 3 Wells verwendet wurden. Am Ende des Expositonszeitraums wurden die Zellen fixiert und mit Sulforhodamin B, einem Proteinbindungsfarbstoff gefärbt. Der Farbstoff wurde dann solubilisiert und die optische Dichte der resultierenden Lösung wurde in einem Lesegerät für 96 Well-Platten bestimmt. Die mittlere Farbstoffintensität der behandelten Wells wurde dann durch die mittlere Farbstoffintensität der Kontroll-Wells (6 Wells jeweils) dividiert, um die Wirkung des Arzneimittels auf die Zellen zu bestimmen. Die Farbstoffintensität ist proportional zur Anzahl der Zellen oder zur Menge an Protein pro Well. Der resultierende Wert "Prozent Inhibition" stellt dann das Ausmaß der Wachstumshemmung dar, welche durch das Arzneimittel verursacht wird.
Für jedes Experiment wurde ein IC₅₀-Wert bestimmt und zu Vergleichszwecken verwendet. Dieser Wert ist äquivalent mit der Konzentration des Arzneimittels, welche benötigt wird, um das Tumorzellwachstum um 50% zu hemmen. Der IC₅₀-Wert wurde graphisch erhalten durch Verbinden der Mittelwerte für jede untersuchte Arzneimittelkonzentration. Jedes Experiment umfasste mindestens 3 Wells pro Arzneimittelkonzentration. Die Konzentration wurde in einem logarithmischen Maßstab auf der X-Achse aufgetragen. Der IC₅₀-Wert, welche für die Verbindung aus Beispiel 1 erhalten wurde, betrug 0,724 für die SW-480-Zelllinie.
(B) Hemmung der Cyclooxigenase (COX)
COX katalysiert die Bildung von Prostaglandinen und Thromboxan durch den oxidativen Metabolismus der Arachidonsäure. Die Verbindung von Beispiel 1 dieser Erfindung und eine Positivkontrolle (Sulindacsulfid) wurden bewertet, um zu bestimmen, ob sie die gereinigte Cyclooxigenase des Typs I (siehe Tabelle 3 unten) inhibierten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden im Hinblick auf hemmende Wirkungen auf die gereinigte COX bewertet. Die COX wurde aus Samenblasen von Widdern gereinigt, wie es von Boopathy, R. und Balasubramanian, J., 239: 371–377, 1988 beschrieben wird. Die COX-Aktivität wurde untersucht, wie es von Evans, A. T., et al., "Actions of Cannabis Constituents on Enzymes Of Arachidonate Metabolism Anti-Inflammatory Potential," Biochem. Pharmacol., 36: 2035–2037, 1987 beschrieben wird. Kurz gesagt, gereinigte COX wurde mit Arachidonsäure (100 μM) für 2,0 min bei 37°C in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindungen inkubiert. Der Assay wurde beendet durch die Zugabe von TCA, und die COX-Aktivität wurde durch die Extinktion bei 530 nm bestimmt.
Tabelle 3
(C) Apoptose
Die Apoptose wurde gemessen unter Verwendung eines Assays für den Zelltod, welcher auf den morphologischen Charakteristika von apoptotischen Zellen basiert (d. h. kondensiertes Chromatin). Die Präparation der Arzneimittel und die Zellkulturbedingungen waren die gleichen wie im Fall des oben beschriebenen SRB-Assays, außer dass humane Kolonkarzinomzellen HT-29 verwendet wurden. Die konfluenten Kulturen wurden in 12,5 cm²-Flaschen durch Ausplattieren von 0,5 × 10⁶ Zellen/Flasche hergestellt. Die Kulturen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie nach einer Markierung mit Acridinorange und Ethidiumbromid im Hinblick auf Apoptose untersucht. Schwimmende und angeheftete Zellen wurden durch Trypsinierung gesammelt und dreimal mit PBS gewaschen. Aliquots von 1 ml wurden zentrifugiert (3 g). Das Pellet wurde in 25 μl Medium und 1 μl eines Farbstoffgemischs, welches 100 μg/mol Acridinorange und 100 μg/ml Ethidiumbromid, hergestellt in PBS enthielt, resuspendiert und sanft gemischt. 10 μl des Gemischs wurden auf einem Mikroskopobjektträger platziert und mit einem Deckgläschen von 22 mm² bedeckt, und wurden mit 40 × Trockenobjektiven unter Auflichtbeleuchtung durch eine Filterkombination untersucht.
Ein Wissenschaftler, welchem die Identität der Proben nicht bekannt war, zählte mindestens 100 Zellen pro Probe. Apoptotische Zellen wurden identifiziert durch die nukleäre Kondensation des Chromatins, gefärbt durch das Acridinorange oder Ethidiumbromid. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten dargestellt.
Tabelle 4 Apoptosewirkungen der Verbindungen
Die Apoptose wurde auch gemessen basierend auf der Menge an fragmentierter DNA, welche in den Zelllysaten enthalten war. Kurz gesagt, SW-480-Kolonadenokarzinomzellen wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten ("MTP") mit einer Dichte von 10 K Zellen/Well in 180 μl ausplattiert und wurden für 24 h inkubiert. Dann wurden die Zellen mit 20 μl Aliquots einer geeignet verdünnten Verbindung behandelt, und für weitere 48 h inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Proben gemäß der folgenden Schritte präpariert. Die MTP wurde zentrifugiert (15 min, 1000 rpm) und der Überstand wurde vorsichtig durch ein schnelles Umdrehen der MTP entfernt. Die Zellpellets in jedem Well wurden in 200 μl Lysepuffer resuspendiert und für 45 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Die Lysate wurden dann zentrifugiert (15 min, 1000 rpm) und 20 μl Aliquots des Überstands (= cytoplasmische Fraktion) wurden zur Analyse in eine mit Streptavidin beschichtete MTP übertragen. Es wurde darauf geachtet, dass die lysierten Pellets in der MTP nicht geschüttelt wurden (= Zellnuklei, enthaltend unfragmentierte DNA mit hohem Molekulargewicht). Die Proben wurden sofort untersucht, da eine Lagerung bei 4°C oder 20°C die ELISA-Signale verringert.
Die Proben wurden dann gemäß einem DNA-Fragmentierungsassayprotokoll bearbeitet, es wurden Dosis-Wirkungskurven erzeugt, basierend auf den Werten der optischen Dichte. Die Quantifikation der DNA wurde durchgeführt durch einen kommerziell erhältlichen photometrischen Enzymimmunoassay, hergestellt von Mannheim-Boehringer unter dem Namen "Cell Death Detection ELISA^plus". Der Assay basiert auf einem quantitativen Sandwich-Enzym-Immunoassyprinzip unter Verwendung von monoklonalen Maus-Antikörpern, welche gegen DNA bzw. Histone gerichtet sind. Dies ermöglicht die spezifische Bestimmung von Mono- und Oligonukleosomen in den cytoplasmischen Fraktionen der Zelllysate. Kurz gesagt, ist das Assayverfahren wie folgt. Die Probe (Zelllysat, Serum, Kulturüberstand usw.) wird in eine mit Streptavidin beschichtete MTP platziert. Danach wird ein Gemisch von Anti-Histon-Biotin und Anti-DNA-POD von einer Inkubation von 2 h gefolgt. Während der Inkubationsdauer bindet der Anti-Histon-Antikörper an die Histonkomponente der Nukleosomen und fixiert gleichzeitig den Immunkomplex an die mit Steptavidin beschichtete MTP über die Biotinylierung. Zusätzlich reagiert der Anti-DNA-POD-Antikörper mit der DNA-Komponente der Nukleosomen. Nach der Entfernung von nicht gebundenen Antikörpern durch einen Waschschritt wird die Menge der Nukleosomen quantifiziert durch die im Immunkomplex zurückgehaltene POD. Die POD wird photometrisch mit ABTS^® (2,2'-Azino-di[3-ethylbenzthiazolin-sulfonat])* als Substrat bestimmt.
Die Stimulationsverstärkung (FS "fold stimulation" = ODmax/ODveh), ein Indikator der Apoptosereaktion, wurde für jede untersuchte Verbindung bestimmt. Die EC₅₀-Werte wurden entweder speziell durch eine Software zur Datenanalyse bestimmt oder bezogen auf den wirksamen Konzentrationsbereich jeder Verbindung bestimmt (ECR = min. wirksame Dosis – min. Dosis zur Peakwirkung). Diese FS- und EC₅₀-Werte für die untesuchten Verbindungen sind oben in Tabelle 4 aufgeführt.

Außerdem wurde unter Verwendung des obigen DNA-Fragmentierungstests eine Dosiswirkung für die Verbindung von Beispiel 1 erhalten. Diese Daten sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5

Dosis (μM)	Apoptosespiegel (Mittlerer OD-Wert ± SD)
0,5	0,186 ± 0,008
1,0	0,207 ± 0,061
5,0	0,208 ± 0,073
10	0,296 ± 0,050
50	0,500 ± 0,048
100	0,633 ± 0,053
500	0,659 ± 0,012

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern in Einheitsdosisformen auf konventionelle Art und Weise formuliert werden, so dass der Patient, welcher einer Therapie gegen präkanzeröse Läsionen bedarf, periodisch (z. B. einmal oder mehrmals pro Tag) eine erfindungsgemäße Verbindung einnehmen kann. Die exakte Anfangsdosis der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch angemessenes Experimentieren bestimmt werden. Der Fachmann sollte verstehen, dass die anfängliche Dosierung ausreichend sein sollte, um eine Blutplasma konzentration zu erreichen, welche sich dem Prozentsatz des IC₅₀-Werts der Verbindung annähert, wobei der Prozentsatz von der chemopräventiven oder chemotherapeutischen Indikation abhängt. Die Berechnung der anfänglichen Dosierung zieht auch mehrere Faktoren in Betracht, wie etwa die Formulierung und die Art der Verabreichung der bestimmten Verbindung, z. B. oral oder intravenös. Wenn man von einem Patienten mit einem durchschnittlichen Kreislaufsystemvolumen von etwa 4 l ausgeht, würde man, basierend auf den IC₅₀-Werten der erfindungsgemäßen Verbindungen, beispielsweise eine Dosierung von etwa 0,6 mg bis 4,0 g solcher Verbindungen bei einer intravenösen Verabreichung berechnen, um eine systemische Kreislaufkonzentration zu erreichen, welche äquivalent ist mit der IC₅₀-Konzentration.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch cGMP-spezifische PDE-Inhibitoren, wie i EP 0,881,330B (US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/046,739, eingereicht am 24. März 1998) gelehrt wird. Die Verbindungen können im Hinblick auf die inhibitorische Wirkung auf die Phosphodiesteraseaktivität untersucht werden unter Verwendung eines der Enzyme, welche aus einer beliebigen Tumorzelllinie, wie etwa HT-29 oder SW-480 isoliert wurden. Die Phosphodiesteraseaktivität kann bestimmt werden unter Verwendung der im Fachgebiet bekannten Verfahren, wie etwa einem Verfahren unter Verwendung von radioaktivem zyklischem ³H GMP (cGMP) (zyklisches 3',5'-Guanosinmonophosphat) als das Substrat für das PDE5-Enzym. (Thompson, W. J., Teraski, W. L., Epstein, P. M., Strada, S. J., Advances in Cyclic Nucleotide Research, 10: 69–92, 1979, welches hierin als Referenz enthalten ist). Kurz gesagt, eine Lösung mit einer definierten, für das Substrat ³H-cGMP spezifischen Aktivität (0,2 μM; 100 000 cpm; mit 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl₂ und 1 mg/ml BSA) wird mit dem zu untersuchenden Arzneimittel in einem Gesamtvolumen von 400 μl gemischt. Das Gemisch wird bei 30°C für 10 min mit teilweise gereinigter cGMP-spezifischer PDE inkubiert, welche aus HT-29-Zellen isoliert wurde. Die Reaktionen werden beispielsweise durch Kochen des Reaktionsgemischs für 75 sec beendet. Nach dem Abkühlen auf Eis werden 100 μl 0,5 mg/ml Schlangengift (O. Hannah-Gift, erhältlich von Sigma) zugegeben und für 10 min bei 30°C inkubiert. Diese Reaktion wird dann durch die Zugabe eines Alkohols, z. B. 1 ml 100% Methanol beendet. Die Assayproben werden auf eine Anionenchromatographiesäule (1 ml Dowex von Aldrich) aufgetragen und mit 1 ml 100% Methanol gewaschen. Die Menge der Radioaktivität im Durchschlag und in den Waschlösungen auf den Säulen wird dann mit einem Szintillationscounter gemessen. Das Ausmaß der PDE5-Hemmung wird durch Berechnen der Menge der Radioaktivität in den mit Arzneimittel behandelten Reaktionen und Vergleichen mit einer Kontrollprobe (ein Reaktionsgemisch ohne die untersuchte Verbindung) bestimmt.
Unter Verwendung solcher Protokolle besaß der cGMP-spezifische PDE-Inhibitor von Beispiel 1 einen IC₅₀-Wert von 0,68 μM bei Verwendung von HT-29-Zellextrakten.

Claims

Verbindung mit der Formel
worin R₁ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Niederalkyl, Niederalkoxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Niederalkylmercapto, Niederalkylsulfonyl, Cyan, Carboxamid, Carbonsäure, Mercapto, Sulfonsäure und Hydroxy; R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Niederalkyl, R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Amino, Hydroxy, Niederalkylamino und Di-Niederalkylamino; R₄ Wasserstoff ist, oder R₃ und R₄ zusammen Sauerstoff sind; R₅ und R₆ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Niederalkyl, Hydroxy-substituiertem Niederalkyl, Aminoniederalkyl, Niederalkylamino-Niederalkyl, Nideralkylamino-Di-Niederalkyl, Niederalkylnitril, -CO₂H, -C(O)NH₂ und einer C₂-C₆-Aminosäure; R₇ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Aminoniederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkyl, Hydroxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Aminoniederalkyl, Halogen, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂ und -SO₂(Niederalkyl); m und n ganze Zahlen von 0 bis 3 sind, unabhängig voneinander ausgewählt; Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chinolinyl, Isochinolinyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Imidazolyl, Indolyl, Benzimidazolyl, Triazinyl, Tetrazolyl, Thiophenyl, Furanyl, Thiazolyl, Pyrazolyl oder Pyrrolyl oder substituierte Varianten davon, worin die Substituenten einer oder zwei sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkyl, Niederalkoxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Hydroxy, -SO₂(Niederalkyl) und -SO₂NH₂; und pharmazeutisch akzeptable Salze davon, worin sich der Begriff „Nieder" auf eine Gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bezieht.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y ausgewählt ist aus Pyridinyl oder Chinolonyl.
Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkyl, Amino, Hydroxy, Niederalkylamino und Di-Niederalkylamino.
Verbindung nach Anspruch 3, worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkoxy, Amino und Hydroxy.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R₂ Niederalkyl ist.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Amino, Niederalkylamino und Di-Niederalkylamino.
Verbindung nach Anspruch 6, worin R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy und Niederalkylamino.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R₅ und R₆ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy-substituiertem Niederalkyl, Aminoniederalkyl, Niederalkylamino-Niederalkyl, Niederalkylamino-Di-Niederalkyl, -CO₂H, -C(O)NH₂.
Verbindung nach Anspruch 8, worin R₅ und R₆ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy-substituiertem Niederalkyl, Niederalkylamino-Di-Niederalkyl, -CO₂H, -C(O)NH₂.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R₇ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Niederalkoxy, Hydroxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Halogen, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂, Aminoniederalkyl und -SO₂(Niederalkyl).
Verbindung nach Anspruch 10, worin R₇ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Niederalkoxy, Hydroxy, Amino, Halogen, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂, Aminoniederalkyl und -SO₂(Niederalkyl).
Verbindung nach Anspruch 11, worin mindestens einer der R₇-Substituenten in ortho- oder para-Stellung ist.
Verbindung nach Anspruch 12, worin mindestens einer der R₇-Substituenten in ortho-Stellung ist.
Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chinolinyl, Isochinolinyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl und Pyrazinyl oder den substituierten Varianten davon.
Verbindung nach Anspruch 14, worin die Substituenten von Y ein oder zwei sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niederalkoxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Hydroxy, -SO₂(Niederalkyl) und -SO₂NH₂.
Verbindung nach Anspruch 15, worin die Substituenten von Y ein oder zwei sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niederalkoxy, Di-Niederalkylamino, Hydroxy, -SO₂(Niederalkyl) und -SO₂NH₂.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen pharmazeutischen akzeptablen Träger und eine Verbindung nach Anspruch 1.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17, worin Y ausgewählt ist aus Pyridinyl oder Chinolonyl.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkoxy, Amino, Hydroxy, Niederalkylamino und Di-Niederalkylamino.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Niederalkoxy, Amino und Hydroxy.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, worin R₂ Niederalkyl ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, worin R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Amino, Niederalkylamino und Di-Niederalkylamino.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy und Niederalkylamino.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 23, worin R₅ und R₆ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy-substituiertem Niederalkyl, Aminoniederalkyl, Niederalkylamino-Niederalkyl, Niederalkylamino-Di-Niederalkyl, -CO₂H, -C(O)NH₂.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, worin R₅ und R₆ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy-substituiertem Niederalkyl, Niederalkylamino-Di-Niederalkyl, -CO₂H, -C(O)NH₂.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 25, worin R₇ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Niederalkoxy, Hydroxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Halogen, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂, Aminoniederalkyl und -SO₂(Niederalkyl).
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, worin R₇ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Niederalkoxy, Hydroxy, Amino, Halogen, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂, Aminoniederalkyl und -SO₂(Niederalkyl).
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin mindestens einer der R₇-Substituenten in ortho- oder para-Stellung ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28, worin mindestens einer der R₇-Substituenten in ortho-Stellung ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 29, worin Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chinolinyl, Isochinolinyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl und Pyrazinyl oder den substituierten Varianten davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 30, worin die Substituenten von Y ein oder zwei sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niederalkoxy, Amino, Niederalkylamino, Di-Niederalkylamino, Hydroxy, -SO₂(Niederalkyl) und -SO₂NH₂.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 31, worin die Substituenten von Y ein oder zwei sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niederalkoxy, Di-Niederalkylamino, Hydroxy -SO₂(Niederalkyl) und -SO₂NH₂.
(Z)-5-Fluor-2-methyl-(4-pyridyliden)-3-(N-benzyl)indenylacetamidhydrochlorid.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Neoplasie.