DE69826452T2

DE69826452T2 - Stellenspezifische proteinmodifizierung

Info

Publication number: DE69826452T2
Application number: DE69826452T
Authority: DE
Inventors: K. Dean PETTIT
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1998-03-05
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2018-03-06
Also published as: EP0973806A1; AU6542598A; JP3708134B2; DK0973806T3; ATE277084T1; EP0973806B1; WO1998040409A1; DE69826452D1; ES2229485T3; JP2001506670A; US6548644B1; PT973806E

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Modifizieren des p75-TNF-Rezeptors und des TNFR:Fc-Fusionsproteins. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Koppeln von Polyethylenglykol mit dem p75-TNF-Rezeptor oder dem TNFR:Fc-Fusionsprotein in einer Weise, welche Vorteile in Zusammenhang mit Polyethylenglykolkonjugierten Proteinen ergibt, während die Bioaktivität des p75-TNF-Rezeptors oder des TNFR:Fc-Fusionsproteins aufrechterhalten wird.
Beschreibung der verwandten Technik
Verfahren und Reagenzien für das chemische Modifizieren von Proteinen kommen seit Jahrzehnten in großem Umfang zum Einsatz. Traditionellerweise wurden chemische Modifikationen durchgeführt, um deren funktionelle Eigenschaften und strukturelle Charakteristika zu untersuchen. Mit dem Auftauchen von rekombinanten DNA-Techniken und Protein-Therapeutika haben Forscher Proteine chemisch modifiziert, um deren therapeutische Eigenschaften zu ändern. Im Speziellen erlangten Verfahren zum Konjugieren von Proteinen mit Polyethylenglykol weit reichende Verbreitung innerhalb der pharmazeutischen und der biochemischen Gemeinschaft infolge zahlreicher verbesserter pharmakologischer und biologischer Eigenschaften in Zusammenhang mit Polyethylenglykol-konjugierten Proteinen. Zum Beispiel ist bekannt, dass eine Polyethylenglykol-Modifikation die Plasma-Halbwertszeit von Proteinen, die in klinischen Anwendungen verwendet werden, deutlich verlängert, wodurch die klinische Nutzbarkeit des Proteins wesentlich verbessert wird. Es ist auch bekannt, dass die Polyethylenglykol-Konjugation die Antigenität und Immunogenität von Proteinen verringert, wodurch lebensbedrohende Anaphylaxie reduziert wird.
Ein weiterer Vorteil in Zusammenhang mit Polyethylenglykol-modifizierten Proteinen besteht darin, dass die Wasserlöslichkeit infolge der hohen Wasserlöslichkeit von Polyethylenglykol erhöht wird. Die erhöhte Wasserlöslichkeit kann die Formulierungseigenschaften des Proteins bei physiologischen pH-Werten verbessern und Komplikationen in Zusammenhang mit der Aggregation von Proteinen mit geringer Löslichkeit verringern.
Zusätzlich haben Polyethylenglykol-konjugierte Proteine in bioindustriellen Anwendungen Verwendung gefunden, beispielsweise in Enzym-basierenden Reaktionen, bei denen die Reaktionsumgebung für die Aktivität des Enzyms nicht optimal ist. Zum Beispiel weisen einige Polyethylenglykol-konjugierte Enzyme eine breitere optimale pH-Aktivität und reduzierte Temperatur optimaler Aktivität auf. Darüber hinaus wurden Enzyme, welche in vielen organischen Lösungsmitteln eine reduzierte Aktivität aufweisen, erfolgreich mit Polyethylenglykol in einem Ausmaß konjugiert, welches diese für katalysierende Reaktionen in organischen Lösemitteln nützlich macht. Zum Beispiel wurde Polyethylenglykol mit Meerrettichperoxidase konjugiert, welches dann in Chloroform und Toluol löslich und aktiv wird (Urrotigoity et al., Biocatalysis, 2: 145–149, 1989).
Polyethylenglykol-konjugierte Proteine unterscheiden sich in dem Ausmaß, in dem die Plasmazirkulations-Halbwertszeit erhöht, die Immunogenität reduziert, die Wasserlöslichkeit verstärkt und die enzymatische Aktivität verbessert wird. Es gibt zahlreiche Faktoren, die für diese Schwankungen verantwortlich sind, wobei zu diesen Faktoren das Ausmaß, in dem das Protein durch Polyethylenglykol ersetzt wird, die Chemiearten, die verwendet werden, um das Polyethylenglykol an das Protein zu heften, und die Orte der Polyethylenglykolstellen auf dem Protein zählen.
Die häufigsten Verfahren für das Anheften von Polyethylenglykol an Proteine beinhalten das Aktivieren von mindestens einer der Hydroxylgruppen auf dem Polyethylenglykol mit einer Funktionalität, die für einen nukleophilen Angriff durch den Stickstoff von Aminogruppen auf dem Protein empfänglich ist. Diese Verfahren führen im Allgemeinen zu einem Verlust an biologischer Aktivität aufgrund des nichtspezifischen Anheftens von Polyethylenglykol.
Alternative Ansätze für das Konjugieren von Proteinen mit Polyethylenglykol schließen das Kontrollieren der Konjugationsreaktanten und -bedingungen ein, so dass die Konjugationsstelle auf den N-Terminus (Kinstler et al., Pharm. Res. 13: 996, 1996) begrenzt ist, welcher das Polyethylenglykol an die Protein-Kohlenhydratfunktionalitäten (Urrutigoity, et al., Biocatalysis 2: 145, 1989) und Polyethylenglykol an die Proteincysteinreste heftet (Goodson et al., Biotechnology 8: 343, 1990). Während diese Ansätze ein bestimmtes Ausmaß an Kontrolle über die Reaktionsstelle bieten, besteht weiterhin ein Bedarf an verbesserten Verfahren zum Bereitstellen von Polyethylenglykol-konjugierten Proteinen. Insbesondere wäre es wünschenswert, Verfahren zum Konjugieren von Proteinen mit Polyethylenglykol bereitzustellen, die zu modifizierten Proteinen führen, welche eine verstärkte Bioaktivität oder geringen Verlust an Bioaktivität aufweisen, während die Vorteile der Polyethylenglykolkonjugation beibehalten werden, einschließlich deutlich verringerter Immunogenität, erhöhter Löslichkeit und verlängerter Zirkulations-Halbwertszeiten, die für modifizierte Proteine charakteristisch sind.
WO 94/13322 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats zwischen einem Polymer und einer ersten Substanz mit einer biologischen Aktivität, die durch eine Domäne davon mediziniert wird, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren der ersten Substanz mit einer zweiten Substanz, welche spezifisch an die Domäne der ersten Substanz bindet, (b) Konjugieren eines Polymers mit der ersten Substanz, welche die zweite Substanz davon gebunden hat, und (c) Freisetzen der zweiten Substanz von der ersten Substanz, welche das Polymer davon konjugiert hat. Konjugate zwischen einem Polymer und einem Antikörper gegen TNF-α.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Proteinmodifikation bereit, welche zu einem modifizierten p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein führen, die geringe oder keine Abnahme einer Aktivität aufweisen, die mit dem p75-TNF-Rezeptor oder dem TNFR:Fc-Fusionsprotein in Zusammenhang gebracht wird. Insbesondere schließt die hierin beschriebene Erfindung Verfahren zum Modifizieren des p75-TNF-Rezeptors oder TNFR:Fc-Fusionsproteins ein, bei denen zuerst eine Stelle auf dem Protein geschützt und danach das geschützte Protein mit Polyethylenglykol unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, welche geeignet sind, das Polyethylenglykol mit dem Protein zu verbinden. Nach dem Entschützen des Proteins weist das resultierende Polyethylenglykol-modifizierte Protein verbesserte Eigenschaften im Vergleich eines p75-TNF-Rezeptors oder eines TNFR:Fc-Fusionsproteins auf, die gemäß Verfahren nach dem bekannten Stand der Technik modifiziert wurden. Eine vorteilhafte Beibehaltung von Aktivität wird auf die Verfügbarkeit von einer oder mehreren Protein-Bindungsstellen zurückgeführt, welche im Konjugationsverfahren unverändert ist und somit sterisch frei bleibt, um nach dem Konjugationsverfahren mit einem Bindungspartner zu interagieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine p75-TNFR:Fc-Peptid-Karte, die durch Umkehrphasen-HPLC-Trennung von TNFR:Fc-Trypsinaufschließungsfragmenten erhalten wurde.
2 ist eine konjugierte p75-TNFR:Fc-Peptid-Karte, die durch Umkehrphasen-HPLC-Trennung von Polyethylenglykol-konjugierten ungeschützten TNFR:Fc-Trypsinaufschließungsfragmenten erhalten wurde.
3 ist eine konjugierte p75-TNFR:Fc-Peptid-Karte, die durch die Umkehrphasen-HPLC-Trennung von Polyethylenglykol-konjugierten geschützten TNFR:Fc-Trypsinaufschließungsfragmenten erhalten wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Konjugieren eines p75-TNF-Rezeptors oder eines TNFR:Fc-Fusionsproteins mit Polyethylenglykol in einer Weise bereit, welche zu Polyethylenglykol-konjugierten Proteinen führt, welche geringe oder keine Verringerung einer gewünschten Aktivität aufweisen. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere Verfahren zum Konjugieren von Polyethylenglykol mit einem p75-TNF-Rezeptor oder einem TNFR:Fc-Fusionsprotein unter Bedingungen bereit, welche eine Polyethylenglykolkonjugation an Stellen auf dem Protein ausschließen. Vorteilhafterweise, weil die Stellen keiner Konjugation mit Polyethylenglykol unterzogen werden, halten der p75-TNF-Rezeptor oder das TNFR:Fc-Fusionsprotein, die gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert wurden, eine gewünschte Aktivität aufrecht, während sie Vorteile in Zusammenhang mit der Polyethylenglykolkonjugation aufweisen. Die Verfahren beruhen auf der Entdeckung, dass durch Schützen von einer oder mehreren kognaten Stellen, Substrat-Bindungsstellen oder anderen Bindungsstellen auf einem p75-TNF-Rezeptor oder einem TNFR:Fc-Fusionsprotein, das Konjugieren des geschützten Proteins mit Polyethylenglykol und anschließendes Entschützen des Proteins, der daraus resultierende Polyethylen-modifizierte p75-TNF-Rezeptor oder das daraus resultierende TNFR:Fc-Fusionsprotein keine Verringerung einer erwünschten Aktivität aufweist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Schützen einer Stelle auf dem p75-TNF-Rezeptor oder dem TNFR:Fc-Fusionsprotein mit einer Reihe von geeigneten Schutzwirkstoffen und Verfahren zum Ausbilden von Komplexen des Schutzwirkstoffes und Proteins erfolgen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung schließen Schutzwirkstoffe jedes beliebige Molekül ein, welches die Fähigkeit zur reversiblen Bindung oder Assoziierung mit einer Stelle auf einem Protein aufweist, welches eine oder mehrere Aminosäuren sein kann. Wenn die Stelle mehr als eine Aminosäure einschließt, können die Aminosäuren benachbart sein, oder die Konformation des Proteins kann die Aminosäuren in unmittelbare räumliche Nähe bringen. Die Stellen schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – kognate Stellen oder Substrat-Bindungsstellen ein, welche mit einer p75-TNF-Rezeptor- oder einer TNFR:Fc-Fusionsprotein-Aktivität assoziiert sind. Zum Beispiel kann ein Schutzwirkstoff in der Form eines Antikörpers, der gegen ein Protein immunreaktiv ist, das für Polyethylenglykol-Konjugation ausgewählt wird, an eine ausgewählte aktive Stelle auf dem Protein unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Bindungsmethodologien gebunden werden. Vorzugsweise wird ein ausgewählter Antikörper-Bindungswirkstoff gegen eine Stelle des ausgewählten Proteins, das die betreffende Aktivität überträgt, oder gegen jene Stelle erhöht, welche die Aktivität aufweist, die es zu erhalten gilt. Im Gegenzug dazu kann ein Antigen ein Schutzwirkstoff für einen Antikörper sein, der zur Modifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählt wurde, indem es so wirkt, dass es ausgewählte Stellen auf dem Antikörper schützt und dann den Antikörper mit Polyethylenglykol konjugiert. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern und Verfahren zum Bereitstellen von Protein-Antikörper-Komplexen sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind Teil des Wissens von Fachleuten.
Alternative Ansätze zum Schutz der kognaten Stelle, Substratstelle oder Bindungsstelle schließen die Verwendung eines Rezeptors oder eines Liganden als Schutzwirkstoff auf dem kognaten Protein ein, das für die Modifizierung ausgewählt ist. Solche Rezeptor- oder Liganden-Schutzwirkstoffe müssen nicht das natürliche Kognat oder Substrat für dieses Protein sein, sondern müssen lediglich zu ausreichender Bindungsaffinität für die ausgewählte(n) aktive(n) Stelle oder Stellen auf dem betreffenden Protein fähig sein, um die aktive(n) Stelle oder Stellen vor einer Teilnahme an einer Polyethylenglykol-Konjugationsreaktion zu schützen. Weiters sind Enzyme, die Bindungsstellen für ein Substrat aufweisen, das für die Polyethylenglykolmodifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählt ist, geeignete Schutzwirkstoffe für das Substrat.
Bei der Auswahl des Schutzwirkstoffes für einen p75-TNF-Rezeptor oder ein TNFR:Fc-Fusionsprotein ist es wünschenswert, bestimmte Kriterien zu berücksichtigen. Ein Aspekt ist die relative Molekulargröße des Schutzwirkstoffes und des für die Konjugation ausgewählten Proteins. Die Schutzschrittausbeuten können durch das Verhältnis der Größe des Schutzwirkstoffes zu jener des für die Konjugation ausgewählten Proteins begrenzt werden. Typischerweise wird die Schutzreaktion zu den höchsten Ausbeuten führen, wenn das Verhältnis nahe bei eins liegt. Im Allgemeinen ist die Molekularmasse des Schutzwirkstoffes und des Proteins ein Maßstab für deren Molekulargröße. Somit weisen zum Beispiel zweiwertige Antikörper eine Masse von ungefähr 125 bis 150 kDa auf, wobei unter optimierten Reaktionsbedingungen 10 mg Antikörper ungefähr 20 mg von ausgewähltem Protein mit einem Molekulargewicht von 150 kDa schützen werden. Andererseits kann der Antikörper eine so geringe Menge wie 2 mg eines Proteins mit einem Molekulargewicht von 15 kDa schützen. Wenn der Schutzwirkstoff und das ausgewählte Protein eine ähnliche Masse aufweisen, können somit die Ausbeuten beim Schutzschritt am höchsten sein.
Ein weiterer Faktor, der bei der Auswahl eines Schutzwirkstoffes für einen p75-TNF-Rezeptor oder ein TNFR:Fc-Fusionsprotein berücksichtigt werden kann, ist die Stabilität des Schutzwirkstoffes und die Stabilität des Polyethylenglykol-konjugierten Proteins in Lösungen eines Entschützungswirkstoffes, der während des Entschützungsschrittes der Erfindung verwendet wird. Wie unten im Detail besprochen, kann der Schritt des Entschützens des konjugierten Proteins vom Schutzwirkstoff beinhalten, dass der Schutzwirkstoff und das konjugierte entschützte Protein extremen pH-Werten, Lösungen mit erhöhter Ionenstärke oder chaotropen Wirkstoffen ausgesetzt werden. In Fällen, in denen der Schutzwirkstoff in zusätzlichen Schutzreaktionen wiederverwendet werden soll, wird bevorzugt, dass der Schutzwirkstoff so ausgewählt wird, dass das Entschützen des konjugierten Proteins keine extremen Reaktionsbedingungen erfordert, welche zu einem irreversiblen Verlust an Aktivität des Schutzwirkstoffes führen könnten.
Ein weiterer Aspekt, der bei der Auswahl von Schutzwirkstoffen zu berücksichtigen ist, kann die etwaige potentielle Toxizität in Zusammenhang mit dem Wirkstoff oder seiner Verwendung einschließen. Der p75-TNF-Rezeptor oder das TNFR:Fc-Fusionsprotein, die gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert werden und für klinische Anwendungen bestimmt sind, sollten im Wesentlichen frei von jeglichen Substanzen toxischer Natur sein. Obwohl bekannte Proteinreinigungsverfahren hochreines Material bereitstellen, wird bevorzugt, zu vermeiden, dass Schutzwirkstoffe bekannte Toxizitäten aufweisen.
Ein weiterer Aspekt, der bei der Auswahl eines Schutzwirkstoffes zu berücksichtigen ist, ist der Ort von potentiellen Polyethylenglykolkonjugationsstellen auf dem p75-TNF-Rezeptor oder dem TNFR:Fc-Fusionsprotein und deren jeweilige Nähe zu für den Schutz ausgewählten Bindungsstellen. Für einen p75-TNF-Rezeptor oder ein TNFR:Fc-Fusionsprotein mit potentiellen Konjugationsstellen in unmittelbarer Nähe zu einer für den Schutz ausgewählten Stelle, kann es wünschenswert sein, einen Schutzwirkstoff zu verwenden, der ausreichend groß ist, um einen Bereich auf dem Protein zu schützen, der sich in unmittelbarer Nähe zu der Stelle befindet, an die er bindet. Wenn der Schutzwirkstoff in der Lage ist, einen ausreichend großen räumlichen Bereich zu „schützen", der sich außerhalb der ausgewählten Bindungsstelle erstreckt, wird die Polyethylenglykolkonjugation wahrscheinlich ausgeschlossen oder wesentlich reduziert, wodurch eine gewünschte Aktivität des Glykol-konjugierten Proteins beibehalten wird. Der bevorzugte räumlich geschützte Bereich auf dem Protein wird von der räumlichen Ausrichtung der Konjugationsstellen innerhalb des Proteins und von der Größe des Polyethylenglykols abhängen, was unten besprochen wird.
Die gewünschte Aktivität des p75-TNF-Rezeptors oder des TNFR:Fc-Fusionsproteins, die gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert werden, können durch die Auswahl von Schutzwirkstoffen beeinflusst werden. Zum Beispiel können Proteine, die an mehrfache Rezeptor-Untereinheiten binden, mit Polyethylenglykol so konjugiert werden, dass eine erste Rezeptoruntereinheit-Bindungsstelle vor der Konjugationsreaktion geschützt wird und eine zweite Rezeptoruntereinheit-Bindungsstelle nicht geschützt ist. In dieser Ausführungsform wird Polyethylenglykolkonjugation an der geschützten Stelle verhindert oder gehemmt, wodurch die Stelle für Liganden- oder Rezeptorbindung bewahrt wird; und Polyethylenglykolkonjugation wird an den ungeschützten Stellen ermöglicht, wodurch die Stelle weniger zugänglich für Liganden- oder Rezeptorbindung wird. Diese Ausführungsform hat einen Wert bei therapeutischen oder anderen klinischen Anwendungen, weil Bindungsstellen für eine Rezeptoruntereinheit bewahrt werden können, während das Binden an eine andere Rezeptoruntereinheit verhindert wird. Diese Wirkung kann zur Produktion von spezifischen Antagonisten oder Polyethylenglykol-konjugiertem p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein mit anderen einzigartigen modifizierten Funktionen führen.
Ebenso stellt die vorliegende Erfindung Methodologien für das Verhindern von multimerer Assoziation von p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein bereit. Zum Beispiel kann Polyethylenglykol selektiv auf Stellen in oder um die multimere Assoziationsschnittstelle konjugiert werden, während die Bindung des Proteins für ihr natürliches Kognat durch „stellengeschützte" Polyethylenglykolkonjugation, so wie hierin gelehrt, bewahrt wird, wodurch eine Rezeptormultimerisation verhindert wird.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der Schritt des Schützen des p75-TNF-Rezeptors oder TNFR-Fc-Fusionsproteins dadurch erzielt, dass zuerst einer oder mehrere Schutzwirkstoffe auf einen festen Träger immobilisiert werden und dann das Protein mit dem immobilisierten Schutzwirkstoff auf eine Weise in Kontakt gebracht wird, die zur Proteinbindung an den immobilisierten Schutzwirkstoff führt. Vorteilhafterweise können Verfahren der vorliegenden Erfindung, die das Immobilisieren des Schutzwirkstoffes auf einen festen Träger einschließen, unter der Verwendung desselben festen Trägers für nachfolgende Schutzreaktionen wiederholt werden und weisen somit den Vorteil auf, dass der Schutzwirkstoff wiederverwendet wird, ohne dass es notwendig wäre, den Schutzwirkstoff von einem Reaktionsgemisch zu trennen. Ein weiterer Vorteil in Zusammenhang mit dieser Ausführungsform besteht darin, dass unreagiertes Polyethylenglykol und Konjugationsreaktions-Nebenprodukte und sonstige Nebenprodukte leicht von dem Polyethylenglykol-modifizierten Protein entfernt werden, indem die Säule vor dem Entschützen des geschützten modifizierten Proteins gut gewaschen und das konjugierte Protein aus der Säule gewonnen wird. Vorzugsweise sind die chemischen und physikalischen Eigenschaften des festen Trägers von solcher Art, dass eine große Oberfläche zur Verfügung steht, um den Schutzwirkstoff und den p75-TNF-Rezeptor oder das TNFR:Fc-Fusionsprotein zum Reagieren zu bringen, und von solcher Art, dass er unter einer Reihe von Reaktionsbedingungen stabil ist, einschließlich einer Reihe von pH-Werten, Temperaturwerten und einer Reihe von wässerigen und nicht-wässerigen Lösemitteln. Zusätzlich sollte der feste Träger so ausgewählt werden, dass er den Schutzwirkstoff auf eine Weise immobilisiert, die ausreichende Mengen an Schutzwirkstoff bereitstellt, welcher eine Stelle aufweist, die für das Schützen des Proteins zur Verfügung steht.
Ein Faktor, der die Auswahl des festen Trägers oder des Säulenmaterials beeinflusst, ist die endgültige räumliche Ausrichtung des immobilisierten Schutzwirkstoffes. Vorzugsweise ist der immobilisierte Schutzwirkstoff räumlich auf dem festen Träger so ausgerichtet, dass er in der Lage ist, den p75-TNF-Rezeptor oder das TNFR:Fc-Fusionsprotein in einer optimierten Weise zu schützen. Um dies zu erreichen, kann die Verwendung zusätzlicher aktiver Verbindungen nützlich sein, welche den Schutzwirkstoff in einer gewünschten Konfiguration ausrichten. Zum Beispiel wird eine Säule mit festem Träger, welche das immobilisierte Protein A oder Protein G enthält, die Säule für das Immobilisieren von Antikörpern über das Binden durch die Fc-Domäne des Antikörpers vorbereiten. Auf diese Weise immobilisierte Antikörper weisen eine räumliche Ausrichtung auf, welche für deren maximale Bindung mit dem für die Konjugation ausgewählten Protein sorgt. Ein weiterer Ansatz, bei dem zusätzliche Verbindungen verwendet werden, schließt die Verwendung von Abstandhaltern oder Verbindungsstücken zwischen dem Säulenmaterial und dem Schutzwirkstoff ein, um den Schutzwirkstoff auszurichten und für eine maximale Kontaktfläche zwischen dem Blockwirkstoff und dem für die Konjugation ausgewählten Protein zu sorgen. Verbindungsstücke oder Abstandhalter für Proteine und Biomoleküle im Allgemeinen sind im Handel weit verbreitet und können zum Beispiel von Pierce Chemical und Sigma Chemical bezogen werden. Optimale Reaktionsbedingungen und bevorzugte Anwendungen für die Abstandhalter oder Verbindungsstücke sind auf dem Fachgebiet hinlänglich bekannt. Zum Beispiel beschreibt Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, 1993, die Verwendung von Reagenzien für das Koppeln von Proteinen und anderen Molekülen an eine Reihe von funktionellen Gruppen durch heterobifunktionelle Reagenzien und homobifunktionelle Reagenzien.
Feste Träger mit guter struktureller und chemischer Stabilität unter einer Reihe von Reaktionsbedingungen sind im Handel erhältlich. Diese Träger weisen typischerweise die Form von Perlen oder Partikeln auf, sind aus einem quervernetzten Polymer hergestellt und mit einer Reihe von Immobilisierungsmechanismen verfügbar. Zum Beispiel können feste Träger, welche die Fähigkeit aufweisen, kationisch oder anionisch mit Verbindungen zu interagieren, welche gegensätzlich geladene ionische funktionelle Gruppen aufweisen, verwendet werden, um Schutzwirkstoffe über eine ionische Hälfte zu binden. Feste Träger für ionischen Austausch sind weit verbreitet und schließen Funktionalitäten wie geladene Aminogruppen, Karbonate, Säure- und Basegruppen mit unterschiedlicher Ionenstärke und pH-Werten ein. Ebenso schließen geeignete feste Träger solche Träger ein, welche eine spezifische Bindungsfunktionalität aufweisen, die imstande ist, an einen Abschnitt eines betreffenden Proteins zu binden. Zum Beispiel können feste Träger, welche einen Liganden für den Fc-Abschnitt von IgG aufweisen, verwendet werden, um Antikörper oder TNFR:Fc-Fusionsproteine zu immobilisieren. Geeignete, im Handel erhältliche Säulen schließen solche ein, welche feste Träger mit gebundenem Protein A und Protein G aufweisen, von denen beide ausgewählte Abschnitte von IgG binden werden. Wiederum andere geeignete feste Träger sind solche, welche aktive reaktive Stellen für kovalentes Anheften eines gewünschten Schutzwirkstoffes aufweisen. Feste Träger mit dieser Eigenschaft schließen jene ein, welche Funktionalitäten aufweisen, welche mit Nukleophilen reagieren, wie Aminogruppen, Hydroxylgruppen und Sulfhydrylgruppen. Beispiel 1 unten beschreibt die Verwendung eines solchen im Handel erhältlichen festen Trägers, EMPHAZE^TM, welcher eine Azlacton-Funktionalität aufweist, die mit Nukleophilen reaktiv ist. Wiederum andere geeignete feste Träger sind solche, die aus polymeren Materialien hergestellt werden und kovalent, eng assoziierte oder inkorporierte Stellen aufweisen, welche spezifische Aminosäuresequenzen binden. Die allgemeinen Prinzipien der Affinitätschromatographie sowie feste Träger für das Praktizieren der Affinitätschromatographie, bei der einer oder mehrere spezifische Bindungspartner auf einem chromatographischen Bett bereitgestellt werden, so dass Bindungsliganden immobilisiert werden können, um den Liganden zu reinigen, werden in Affinity Chromatography, Principles and Methods, Pharmacia Publication 18-1022-29 besprochen.
In bevorzugten Ausführungsformen, bei denen Schutzwirkstoffe auf festen Trägern immobilisiert werden, kann der Schritt des Schützens von Stellen auf dem p75-TNF-Rezeptor oder dem TNFR:Fc-Fusionsprotein dadurch erzielt werden, dass eine Lösung, welche das Protein für die Polyethylenglykol-Konjugation enthält, mit dem festen Träger, welcher den immobilisierten Schutzwirkstoff aufweist, in Kontakt gebracht wird, um ein geschütztes Protein in der Form eines Schutzwirkstoffes und Proteinkomplexes bereitzustellen. Fachleute werden schätzen, dass optimale Reaktionsbedingungen von dem p75-TNF-Rezeptor oder dem TNFR:Fc-Fusionsprotein, dem festen Träger und dem Schutzwirkstoff abhängen. Infolgedessen können der Reaktions-pH-Wert, die Reaktionstemperatur, die Reaktionszeit und das Reaktionsmedium gemäß bekannten Prinzipien zur Herstellung des ausgewählten Schutzwirkstoffes und Proteinkomplexes variiert werden. Der feste Träger, der einen immobilisierten Schutzwirkstoff aufweist, kann in einer Säule enthalten sein, wobei in einem solchen Fall das In-Kontakt-Bringen des Proteins einschließen kann, dass die Lösung, welche das Protein enthält, durch die Säule mit einer Rate und unter einer Temperatur und pH-Bedingungen durchgeführt wird, welche die Schutzreaktion fördern.
Im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung sind Verfahren eingeschlossen, bei denen der Schutzschritt in Lösung durchgeführt wird und der Schutzwirkstoff nicht immobilisiert ist. Solche lösungsbasierenden Verfahren schließen das Bereitstellen einer Lösung von Schutzwirkstoff und p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein in geeigneten relativen Mengen und unter Reaktionsbedingungen ein, welche ausreichen, um dafür zu sorgen, dass der Schutzwirkstoff und das Protein einen Komplex bilden. Wie oben erwähnt, können der Reaktions-pH-Wert, die Reaktionstemperatur, die Reaktionszeit und das Reaktionsmedium gemäß bekannten Prinzipien für das Binden des Schutzwirkstoffes und des Proteins variiert werden. Vorzugsweise wird, nach der Schutzreaktion, der Komplex aus Schutzwirkstoff und p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein durch herkömmliche Trenntechniken von dem Reaktionsgemisch getrennt. Geeignete Trenntechniken schließen chromatographische Verfahren wie Umkehrphasenchromatographie, Normalphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, präparative elektrophoretische Verfahren und selektive Präzipitationstechniken ein. Alternativ dazu wird der Komplex aus Schutzwirkstoff und Protein aus der Schutzreaktionslösung nicht vor dem Bilden des Polyethylenglykol-konjugierten Proteins gewonnen. In dieser Ausführungsform werden Reaktionen für das Bilden von Polyethylenglykol-konjugiertem Protein in der Lösung ausgeführt, die für das Schützen des Proteins verwendet wird. Nach den, wie unten beschriebenen, Konjugationsreaktionen können der Polyethylenglykol-konjugierte p75-TNF-Rezeptor oder das TNFR:Fc-Fusionsprotein so wie unten beschrieben entschützt werden, so dass die aktive Stelle oder die aktiven Stellen frei ist/sind und dann aus der Lösung gewonnen wird/werden. Alternativ dazu kann der Polyethylenglykol-konjugierte p75-TNF-Rezeptor oder das TNFR:Fc-Fusionsprotein, das mit dem Schutzwirkstoff zu einem Komplex verbunden ist, gewonnen werden, gefolgt von einem Entschützen des Polyethylenglykol-konjugierten Proteins in der Konjugationsreaktionslösung und von einem Gewinnen des konjugierten Proteins unter Verwendung eines beliebigen Proteinreinigungsplans, einschließlich – ohne darauf beschränkt zu sein – der oben beschriebenen.
Reagenzien und Verfahren zum Ausbilden von Polyethylenglykol-Konjugaten mit Proteinen sind an sich auf dem Fachgebiet bekannt und sind im Allgemeinen auf die Praxis der vorliegenden Erfindung anwendbar. Typischerweise schließen diese Verfahren ein, dass zuerst ein aktiviertes Polyethylenglykol bereitgestellt wird, bei dem eine oder beide Hydroxylgruppen auf einem Polyethylenglykol aktiviert werden, und dass das aktivierte Polyethylenglykol mit aktiven Stellen auf einem für die Polyethylenglykol-Konjugation ausgewählten Protein zum Reagieren gebracht wird. Die am weitesten verbreiteten Verfahren für das Konjugieren eines Proteins mit Polyethylenglykol basieren auf einer nukleophilen Reaktion zwischen Proteinaminostellen (ε-Aminostickstoff von Lysin oder das aminoterminale Amin) und einem aktivierten Hydroxyl von Polyethylenglykol. Da Sulfhydryle auch Nukleophile sind, sind Cysteinsulfhydryle, die nicht Teil einer Disulfidbrücke sind, auch potentielle Reaktionsstellen auf dem Protein. Die allgemeinen Prinzipien von Polyethylenglykol-Konjugation mit Proteinen und allgemeine aktivierende Reagenzien werden von Delgado et al. in The Uses and Properties of PEG-Linked Proteins, aus Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3,4): 249–304(1992), beschrieben. Aktivierte Formen von Polyethylenglykol und Monomethoxypolyethylenglykol sind im Handel erhältlich und können in Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Insbesondere Shearwater Polymers, Inc. of Huntsville, AL, stellt eine Reihe von Polyethylenglykolpolymeren und Polyethylenglykol-Derivaten bereit. Der Shearwater Polymers, Inc. Catalog (Shearwater Polymers, Inc. Catalog, Functionalized Biocompatible Polymers for Research, 1994) schließt eine große Bandbreite an aktivierten Polyethylenglykolen ein, die für das Koppeln mit Proteinen unter einer großen Bandbreite an Reaktionsbedingungen geeignet sind. Dieser Katalog stellt zudem bevorzugte Reaktionsbedingungen für ihre abgeleiteten Polyethylenglykol-Reagenzien bereit. Nachdem Fachleute auf die zahlreichen Reagenzien aufmerksam gemacht wurden, die für das Konjugieren von Proteinen mit Polyethylenglykol geeignet sind, werden sie die Vielfalt an Auswahlmöglichkeiten für Reagenzien angesichts der Natur des ausgewählten Proteins, der Natur der reaktiven Aminogruppen oder Sulfhydrylgruppen auf dem Protein und der Endverwendung des konjugierten Proteins schätzen. Zum Beispiel kann – um konjugierte Proteine bereitzustellen, welche eine verbesserte Löslichkeit, verbesserte Aktivitätseigenschaften und Abgabeeigenschaften aufweisen, aber nicht unbedingt eine erhöhte klinische Clearance-Zeit – ein Succinimidylsuccinat-aktiviertes Polyethylenglykol (SS-PEG) in der Konjugationsreaktion verwendet werden. Die Ester-Verbindung mit dem Protein ist weniger stabil und wird in vivo hydrolysieren, wobei das Polyethylenglykol aus dem Protein freigesetzt wird. Es sind aktivierte Polyethylenglykole erhältlich, die im Vergleich zu Sulfhydrylgruppen bevorzugter mit Aminogruppen reagieren und umgekehrt. Häufig ausgewählte aktivierte Polyethylenglykole schließen Succinimidylkarbonat-aktivierte Polyethylenglykole und Succimidylpropionsäurepolyethylenglykole ein.
Als Alternative zur Auswahl im Handel erhältlicher aktivierter Polyethylenglykole kann ein gewünschtes Polyethylenglykol unter Verwendung von Reagenzien aktiviert werden, welche mit Hydroxylfunktionalitäten reagieren, um eine Stelle zu bilden, die mit einer Stelle auf einem gewünschten Protein reaktiv ist. Typischerweise ist die Protein-reaktive Stelle eine Aminogruppe, kann aber auch ein Sulfhydryl oder Hydroxyl sein, und das aktivierte Polyethylenglykol ist typischerweise ein aktiver Ester oder Imidizol (siehe Seiten 274–285 ibid). Vorzugsweise wird nur eine Hydroxylfunktionalität des Polyethylenglykols aktiviert, was dadurch erreicht werden kann, dass ein Monomethoxypolyethylenglykol in einer aktivierenden Reaktion verwendet wird. Verfahren, bei denen zwei Hydroxyle aktiviert werden, liegen jedoch auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung. Je nach Natur der aktivierenden Gruppe und des nukleophilen Angriffs kann die aktivierende Hälfte in das Protein nach der nukleophilen Reaktion aufgenommen werden oder nicht.
Das Polyethylenglykol kann ein beliebiges Molekulargewicht aufweisen, liegt aber vorzugsweise im Bereich von ungefähr 500 bis ungefähr 100.000 und bevorzugter im Bereich von 2.000 bis 20.000. Die Kriterien für die Auswahl eines spezifischen Polyethylenglykol-Molekulargewichts schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – das Molekulargewicht des für die Modifizierung ausgewählten Proteins, die Ladung auf dem Protein, den Typ des Proteins und die Anzahl und den Ort von potentiellen Stellen für die Konjugation ein. Immunologische und Plasma-Halbwertszeit-Eigenschaften von Proteinen, die mit unterschiedlichem Molekular-Polyethylenglykol-Molekulargewicht konjugiert werden, werden in Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9: 249, 1992, besprochen. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, ist die Plasma-Halbwertszeit umso länger und die Proteinlöslichkeit umso größer, je größer die Menge an Polyethylenglykol ist, das mit dem Protein konjugiert wird. Da die Molekulargewichtstrenngrenze für glomeruläre Filtrierung bei ungefähr 70 kDA liegt, erfahren Proteine mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 70 kDA verlängerte Plasma-Halbwertszeiten. Für Proteine mit mehr als 70 kDA werden die Auswirkungen des Polyethylenglykols und seines Molekulargewichts mit seinem Clearance-Mechanismus variieren.
Im Allgemeinen führt die Verwendung eines Polyethylenglykols mit einem hohen Molekulargewicht in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu konjugierten Proteinen mit mehr Polyethylenglykol pro Molekül Protein als die Verwendung von Polyethylenglykol mit einem geringeren Molekulargewicht. Wenn eine große Menge an Polyethylenglykol pro p75-TNF-Rezeptor- oder TNFR:Fc-Fusionsprotein-Molekül wünschenswert ist, liegt das Molekulargewicht des Polyethylenglykols somit vorzugsweise bei bis zu 20.000. Polyethylenglykole mit geringerem Molekulargewicht können, aufgrund ihrer größeren Lösungsmobilität, mit mehr Stellen auf dem Protein konjugieren als ein Protein mit höherem Molekulargewicht. Wenn ein Protein eine Anzahl an erwünschten Konjugationsstellen aufweist, kann es daher bevorzugt sein, ein Polyethylenglykol mit einem geringeren Molekulargewicht zu verwenden, um sicherzustellen, dass eine optimale Anzahl an Stellen konjugiert wird. Dies mag ein besonders wünschenswerter Ansatz sein, wenn die potentiellen Konjugationsstellen oder Reaktionsstellen auf dem Protein in unmittelbarer Nähe zueinander sind. Ein weiterer Aspekt, der bei der Auswahl eines Molekulargewichts von Polyethylenglykol berücksichtigt wird, ist jener, dass – obwohl Proteine, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden, geschützte Stellen aufweisen – Polyethylenglykole mit größerem Molekulargewicht so groß sein können, dass, sobald sie konjugiert sind, ihre Molekulargröße dazu führt, dass sie ihren räumlichen oder sterischen Einfluss ausdehnen, so dass Bindungs- oder Rezeptorstellen eine reduzierte Zugänglichkeit aufweisen. Es liegt im Wissen der Fachleute, ein optimales Polyethylenglykol-Molekulargewicht für p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein und die Vorteile zu bestimmen, die aus der Polyethylenglykolkonjugation gewünscht werden.
Nach dem Konjugieren des geschützten p75-TNF-Rezeptors oder TNFR-Fc-Fusionsproteins mit Polyethylenglykol schließt die vorliegende Erfindung ferner das Entschützen des Proteins mit einem Entschützungswirkstoff ein. So wie hierin verwendet, ist ein Entschützungswirkstoff ein beliebiges Molekül, eine beliebige Lösung oder ein beliebiges Gas mit einem vorbestimmten pH-Wert, wobei die Lösung eine vorbestimmte Ionenstärke aufweist, welche das reversibel gebundene Protein aus dem Komplex von Protein und Schutzwirkstoff freisetzt oder spaltet. In bevorzugten Ausführungsformen, bei denen der Schutzwirkstoff an einen festen Träger immobilisiert wird, kann das Entschützen des konjugierten Proteins erfolgen, indem der feste Träger, welcher den immobilisierten Schutzwirkstoff und das konjugierte Protein aufweist, mit einem geeigneten Entschützungswirkstoff in Kontakt gebracht wird. Vorteilhafterweise kann diese Technik dazu führen, dass der Schutzwirkstoff am festen Träger immobilisiert und für eine Wiederverwendung in nachfolgenden Polyethylenglykol-Konjugationsreaktionen unter Verwenden desselben festen Trägers und immobilisierten Schutzwirkstoffes verfügbar bleibt. Der ausgewählte Entschützungswirkstoff und seine Verwendung können je nach Natur des Komplexes aus Schutzwirkstoff und konjugiertem Protein variieren. Insbesondere kann bei der Auswahl eines Entschützungswirkstoffes und des Verfahrens, bei dem dieser verwendet wird, die Stärke des Komplexes oder der Dissoziationskonstante (Kd) für den Komplex aus Schutzwirkstoff und konjugiertem p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein ein zu berücksichtigender Aspekt sein. In vielen Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein geeigneter Entschützungswirkstoff zum Beispiel eine Pufferlösung mit einem pH-Wert sein, welcher dazu führt, dass der Schutzwirkstoff das konjugierte Protein aus dem Schutzwirkstoff freisetzt. Wenn der Komplex aus Schutzwirkstoff und konjugiertem Protein stark assoziiert ist und harte pH-Bedingungen erforderlich sind, um den Komplex zu dissoziieren, ist es typischerweise ratsam, das entschützte konjugierte Protein in ein Puffersystem mit einem angepassten pH-Wert zu eluieren, welcher den endgültigen pH-Wert der Lösung des entschützten konjugierten Proteins nahe bei neutral lässt.
Alternativ dazu können Entschützungswirkstoffe Lösungen mit einer Ionenstärke sein, welche ausreicht, um den Komplex aus Schutzwirkstoff und konjugiertem p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein zu zerstören und das konjugierte Protein aus dem Schutzwirkstoff freizusetzen. Konjugierte Proteine können aus Komplexen von Proteinen und Schutzwirkstoff unter Verwendung eines stärker bindenden kompetitiven Schutzwirkstoffes freigesetzt werden. Zusätzliche Entschützungswirkstoffe schließen Denaturierungsmittel wie Harnstoff, Chelatbildner wie EGTA und EDTA oder andere Reagenzien ein, einschließlich Kaliumisothiocyanat und chaotrope Salze. Die Eigenschaften vieler Liganden:Bindungspartner-Komplexe und geeigneter Reagenzien für das Entschützen des Komplexes werden in Pharmacia Affinity Chromatography Principles and Methods, 18-1022-29, Seiten 117–119 (1993), besprochen. Auf jeden Fall wird der Entschützungswirkstoff so ausgewählt, dass er dazu führt, dass der p75-TNF-Rezeptor oder das TNFR:Fc-Fusionsprotein eine größere Affinität für die Lösung aufweisen, welche den Entschützungswirkstoff enthält, als das Protein für den Schutzwirkstoff hat. Wenn das für die Modifizierung ausgewählte Protein TNFR und der Schutzwirkstoff ein TNFR-neutralisierender Antikörper ist, ist ein geeigneter Entschützungswirkstoff eine Pufferlösung mit niedrigem pH-Wert, weil TNFR aus seinem neutralisierenden Antikörper bei geringen pH-Werten dissoziiert.
In Ausführungsformen, bei denen der feste Träger in einer Säule konfiguriert ist, wird das Entschützen des konjugierten p75-TNF-Rezeptors oder des TNFR:Fc-Fusionsproteins praktischerweise ausgeführt, indem eine Lösung des Entschützungswirkstoffes durch die Säule unter Bedingungen durchgeführt wird, welche es dem Entschützungswirkstoff ermöglichen, das Protein zu entschützen. Der Polyethylenglykol-konjugierte p75-TNF-Rezeptor oder das TNFR:Fc-Fusionsprotein können direkt aus der Lösung des Entschützungswirkstoffes gesammelt und gewonnen werden. Wenn der feste Träger in einem Behälter enthalten ist, kann der feste Träger, der den immobilisierten Schutzwirkstoff aufweist, von der Lösung, welche das entschützte Polyethylenglykol-konjugierte Protein enthält, durch Filtern, Zentrifugieren oder sonstige auf dem Fachgebiet bekannte Trennungstechniken getrennt werden.
Wenn der Komplex aus Schutzwirkstoff und Polyethylenglykol-konjugiertem p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein in Lösung oder nicht an einem festen Träger immobilisiert ist, kann das konjugierte Protein entschützt werden, indem Entschützungswirkstoff zur konjugierten Proteinlösung hinzugefügt wird. Die Kriterien für die Auswahl der Entschützungswirkstoffe sind dieselben wie oben beschrieben und können Pufferlösungen mit einem ausgewählten pH-Wert, Lösungen mit einer ausgewählten Ionenstärke oder andere Lösungen oder möglicherweise Gase mit Eigenschaften sein, die für das Entschützen von Proteinen aus einem Bindungspartner geeignet sind. Die Bedingungen für den Entschützungsschritt sollten so sein, dass ausreichend Zeit und Temperatur aufrechterhalten werden, um es dem Entschützungswirkstoff zu ermöglichen, dafür zu sorgen, dass der konjugierte p75-TNF-Rezeptor oder das TNFR:Fc-Fusionsprotein von dem Schutzwirkstoff dissoziiert. Das entschützte Polyethylenglykol-konjugierte Protein kann aus der Lösung des Schutzwirkstoffes unter Verwendung von standardmäßigen Proteingewinn- und Reinigungstechniken gewonnen werden, einschließlich präparativer Flüssigchromatographie, Ionenaustauschchromatographie und präparativen elektrophoretischen Techniken.
Während die oben beschriebenen Polyethylenglykol-Konjugationsverfahren jene sind, bei denen das Ergebnis Polyethylenglykol ist, das an einen p75-TNF-Rezeptor oder ein TNFR:Fc-Fusionsprotein über eine kovalente Bindung konjugiert ist, liegt es im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, Verfahren einzuschließen, bei denen die Konjugation über eine andere Assoziation erfolgt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung können ein p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein modifiziert werden, indem sie mit Polyethylenglykol unter Verwendung einer Reihe von unterschiedlichen Kopplungs- oder Konjugationsmechanismen konjugiert werden. Zum Beispiel können ein p75-TNF-Rezeptor oder ein TNFR:Fc-Fusionsprotein bei einer Aminogruppe oder einer anderen in geeigneter Weise reaktiven Funktionalität mit einem polyA-Oligonukleotid derivatisiert und dann mit einem Polyethylenglykol konjugiert werden, das mit einem polyT-Oligonukleotid derivatisiert ist. Ein weiterer Ansatz schließt das Derivatisieren des Proteins mit einer Funktionalität, welche einen bekannten spezifischen Bindungspartner aufweist, und anschließendes Konjugieren des Proteins mit Polyethylenglykol ein, welches mit dem Bindungspartner für die Funktionalität derivatisiert worden ist. Zum Beispiel können ein p75-TNF-Rezeptor oder ein TNFR:Fc-Fusionsprotein mit Biotin und dem Polyethylenglykol derivatisiert werden, das mit Strepavidin oder Avidin (oder umgekehrt) derivatisiert ist. Dies führt zum spezifischen Binden von Polyethylenglykol an die Proteinstellen, welche das Biotin aufweisen. Eine Reihe von Reagenzien für das Modifizieren von Proteinen zum Zweck der Einführung bestimmter Funktionalitäten sind im Handel erhältlich. Zum Beispiel identifiziert der Pierce ImmunoTechnology-Katalog eine Reihe von Reagenzien in Zusammenhang mit Proteinmodifizierung und stellt Zugang zu diesen bereit. Unter diesen befinden sich Trauts Reagenzien und SATA (Pierce ImmunoTechnology-Katalog, Band I, Seit E-14), welche aktive Gruppen an N-terminalen Aminen und Lysinamino-Funktionalitäten einführen können. Diese aktiven Gruppen schaffen Stellen für weiteres Einführen von Funktionalitäten zum spezifischeren Reagieren mit Polyethylenglykol. Fachleute werden auch erkennen, dass ionische Wechselwirkungen zwischen Polyethylenglykol und dem p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein ebenfalls möglich sind. Zum Beispiel kann eine Assoziation zwischen einer ionischen Hälfte auf dem Protein und seinem Gegenion auf Polyethylenglykol verwendet werden, wenn die Assoziation ausreichend stark ist, um unter physiologischen Bedingungen assoziiert zu bleiben.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, welche zuvor modifizierte p75-TNF-Rezeptoren oder TNFR:Fc-Fusionsproteine verwenden können, schließen jene Verfahren ein, bei denen das für die Konjugation ausgewählte Protein zu wenig potentielle Polyethylenglykolkonjugationsstellen oder keine potentiellen Polyethylenglykolkonjugationsstellen außerhalb des geschützten Aminosäurebereichs aufweist. Durch das Modifizieren des geschützten Proteins, um Amino- und Sulfliydryl-Stellen auf dem Protein einzuführen, kann ausreichendes Polyethylenglykol mit dem ausgewählten Protein konjugiert werden, um die gewünschten Vorteile zu ergeben. Das Modifizieren des ausgewählten Proteins kann erreicht werden, indem Verfahren zum genetischen Engineering oder chemischen Modifizieren verwendet werden. Wie oben erwähnt, sind Verfahren und Reagenzien zum Modifizieren von Proteinen, um eine große Bandbreite an erwünschten Ergebnissen zu erzielen, auf dem Fachgebiet hinlänglich bekannt. Insbesondere in Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, 1993, werden Informationen in Bezug auf Konjugationsreagenzien und Verfahrensbedingungen bereitgestellt.
Während Polyethylenglykol ein bevorzugter Proteinkonjugationsreaktant ist, wurden eine Reihe von zusätzlichen Polymer-Modifikatoren verwendet, um Proteine zu modifizieren. Diese schließen modifizierte Polyethylenglykole, verzweigte Polyethylenglykole, quervernetzte Polyethylenglykole, Dextrane, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylakohol, Polyaminosäuren, Albumin und Gelatine ein. Fachleute werden – sobald sie die vorliegende Erfindung verstanden haben – schätzen, dass die Prinzipien und Verfahren, die hierin beschrieben werden, auf Verfahren zum Modifizieren von Proteinen mit einem beliebigen dieser zusätzlichen Reagenzien angewendet werden können.
Ein p75-TNF-Rezeptor oder TNFR:Fc-Fusionsprotein, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren modifiziert wurden, weisen Vorteile in Zusammenhang mit der Polyethylenglykolkonjugation auf, ohne den erwarteten deutlichen Verlust an Aktivität. Durch bloßes Anwenden bekannter Testverfahren, um Post-Konjugationsaktivität herzustellen, können die Vorteile für Proteine dargestellt werden, die gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert werden. Zusätzlich zur Evaluierung von Polyethylenglykol-konjugierten Proteinen in Bezug auf ihre Aktivität, können diese in Bezug auf den Grad der Polyethylenglykol-Substitution, in Bezug auf das Molekulargewicht und in Bezug auf Konjugationsstellen analysiert werden. Techniken zur Durchführung dieser analytischen Verfahren sind hinlänglich bekannt, wobei einige in Bezug auf Polyethylenglykol-konjugierte Proteine in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3 : 4): 285–291, 1992, beschrieben werden. Beispiel 3 unten beschreibt Verfahren zum Bestimmen des Molekulargewichts oder der hydrodynamischen Volumina, des Grads an Polyethylenglykol-Substitution und der Bioaktivität von p75-TNFR:Fc-Fusionsprotein, das gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert wurde. Eine Charakterisierung konjugierter Proteine in Bezug auf ihr Molekulargewicht und ihren Substitutionsgrad ist für die Praxis der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich, verschafft aber Einblick in die Spezifika des Konjugationsproduktes.
Die folgenden Beispiele werden präsentiert, um eine detailliertere Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu liefern und verstehen sich in Bezug auf den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise als einschränkend.
BEISPIEL 1
Stellengeschützte TNFR:Fc-Konjugation
Im Folgenden wird ein Verfahren für die Polyethylenglykolkonjugation eines dimeren TNF-Rezeptors gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben. Das ausgewählte Protein war eine kovalent dimerisiertes Fusionskonstruktion aus zwei extrazellulären, Liganden-bindenden Abschnitten des humanen p75-TNF-Rezeptors, die durch einen IgGlFc-Anteil (TNFR:Fc) miteinander fusioniert wurden (Mohler et al., J. Immunol. 151: 1548–1561, 1993). TNFR:Fc ist ein 120 kDA-Protein, das an TNFα und LTα mit hoher Affinität bindet.
Rekombinantes TNFR:Fc wurde erhalten, indem das Protein in CHO-Zellen unter Verwendung des Dihydrofolatreduktase-selektierbaren verstärkbaren Markers exprimiert wurde. Suspensionszellen wurden zentrifugiert und in serumfreies Medium in einem kontrollierten Bioreaktor resuspendiert. Das Produkt wurde nach 7 Tagen gesammelt, und das TNFR:Fc- Molekül wurde unter Verwendung von Protein-A-Affinitätschromatographie, gefolgt von einem Ionenaustausch-Chromatographieschritt, gereinigt.
Ein antihuman TNFR:Fc-neutralisierender monoklonaler Antikörper (hu TNFR M1) wurde wie in Ware et al., Immunol. 147: 4229 beschrieben, erzeugt. Neunzehn Milligramm (19 mg) des hu TNFR M1 wurden in 1 L Kopplungspuffer von 0,5 M Natriumcitrat und 0,1 M Natriumbikarbonat, mit 1 M NaOH auf einen pH-Wert 8,6 eingestellt, dialysiert. Nach einer Dialyse über Nacht wurde der Dialysierungspuffer durch ein zweites 1 L-Volumen ersetzt und die Dialyse einen Tag lang fortgesetzt. Eine Affinitätssäule wurde durch Laden von 0,37 g 3 M EMPHAZE^TM Biosupport-Medium (gekauft bei 3 M in Minneapolis, MN) in eine 3 mL-Amicon-Säule hergestellt. Das 3 M EMPHAZE^TM Biosupport-Medium wird aus hydrophilen hoch-quervernetzten Bis-acrylamid/azlacton-Copolymerperlen hergestellt, welche Azlacton-Funktionalitäten aufweisen, die kovalent Biomoleküle durch ihre nukleophilen Funktionalitäten anheften.
Humaner TNFR M1 wurde an den EMPHAZE^TM festen Träger immobilisiert, indem 5 mL dialysierte hu TNFR M1 Lösung, mit einem gesamten hu TNFR M1-Gehalt von 17 mg, zu den Perlen hinzugefügt wurden, und zwar gemäß den Anweisungen des Herstellers, um Proteine mit den Azlacton-Funktionalitäten zum Reagieren zu bringen. Nach der Reaktion wurden die Perlen und die Lösung zentrifugiert, bis sich ein Perlenpellet in dem Zentrifugenrohr bildete. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert, und die Perlen wurden mit 10 Volumina von 3,0 M Ethanolamin bei einem pH-Wert 9 gelöscht, um unreagierte Azlacton-Stellen auf den Perlen zu blockieren. Nach einem 2,5 Stunden langen Löschen gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden die Perlen zu einem Pellet zentrifugiert und die Ethanolamin-Überstandsflüssigkeit aus dem Pellet dekantiert. Danach wurden 25 mL proteinfreies PBS zu den Perlen hinzugefügt, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang gewirbelt. Nach dem Wirbelmischen wurde das PBS entfernt und zusätzliche 25 mL PBS wurden dem Gemisch hinzugefügt.
Nach dem Immobilisieren des Antikörpers auf den festen Träger wurden die Perlen, welche den immobilisierten Antikörper aufweisen, zu einer Amicon-Säule transferiert. Danach wurden aktive Stellen auf TNFR:Fc mit dem M1-Antikörper-Schutzwirkstoff geschützt, indem eine Lösung, die 0,5 mg TNFR:Fc enthielt, über die Perlen mit einer Durchflussrate von 0,1 mL/Minute durchgeführt wurde. Nach Abschluss der Schutzreaktion wurde das TNFR:Fc mit einem 5.000 MW Polyethylenglykol konjugiert, indem eine Lösung aus 10 mg SC-PEG-5000 (5.000 MW Succinimidylkarbonat-aktiviertes Monomethoxypolyethylenglykol, gekauft bei Shearwater Polymers, Birmingham, AL) in 5 mL von 50 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8,5, durch die EMPHAZE^TM-Säule mit 1 mL/Minute über Nacht bei 25°C durchgeführt wurde.
Nach der Konjugationsreaktion wurde das Polyethylenglykol-konjugierte TNFR:Fc entschützt, indem eine 50 mM-Lösung aus Natriumcitrat, eingestellt auf einen pH-Wert von 3,0, durch die Säule mit einer Durchflussrate von 1 mL/Minute 60 Minuten lang durchgeführt wurde. Danach wurde die Lösung von gewonnenem Polyethylenglykol-konjugiertem TNFR:Fc auf einen pH-Wert von 7,4 mit 0,1 N NaOH neutralisiert.
BEISPIEL 2
Kontroll-TNFR:Fc-Konjugation
Im Folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung eines Kontroll-Polyethylenglykolkonjugierten TNFR:Fc in einem Verfahren beschrieben, welches keinen Schritt zum Schützen des TNFR:Fc einschließt. Einhundert Mikrogramm (100 μg) von rekombinantem humanem (rhu) TNFR:Fc, das in Beispiel 1 in 400 μL von 50 mM Na₂HPO₄ bei einem pH-Wert von 8,5 verwendet wurde, wurde mit SC-PEG 5000 in verschiedenen Molverhältnissen von Polyethylenglykol zu Protein (berechnet als Anzahl von Lysinresten in TNFR:Fc) über Nacht bei 4°C zum Reagieren gebracht. Die molaren Verhältnisse von Protein zu Lysinresten betrugen 1,25 : 1, 0,625 : 2, 0,313 : 1, 0,156 : 1 und 0,078 : 1. Das Polyethylenglykol-konjugierte TNFR:Fc wurde durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer Bio-Sil-400-Säule, erhältlich bei BioRad, Hercules, CA, gemäß den Anweisungen des Herstellers für Proteinreinigung gereinigt.
BEISPIEL 3
Charakterisierung von konjugiertem TNFR:Fc
Im Folgenden wird die Charakterisierung von konjugiertem geschützten TNFR:Fc, hergestellt in Beispiel 1, und dem Kontroll-TNFR:Fc, hergestellt in Beispiel 2, beschrieben. Die Charakterisierung schloss das Analysieren der konjugierten Proteine in Bezug auf die Anzahl von Polyethylenglykol-Ketten pro TNFR:Fc-Molekül (Konjugationsgrad), Proteinmolekulargewicht und Bioaktivität des konjugierten Proteins ein. Zusätzlich wurden nichtkonjugierte TNFR:Fc-Kontrollproben unter Anwendung derselben analytischen Verfahren analysiert.
Grad der Polyethylenglykolkonjugation
Die Konzentration der Proteine in den Lösungen, die in Beispiel 1 und Beispiel 2 erhalten wurden, wurde unter Verwendung eines Beckman-Aminosäure-Analysators gemäß den Herstelleranweisungen bestimmt. Danach wurde die Anzahl an Polyethylenglykoleinheiten pro Molekül von TNFR:Fc in Lösung unter Verwendung des Fluorescamin-Verfahrens bestimmt, das allgemein in Sartore et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, 31: 213, 1991, beschrieben wird. Das erwähnte Fluorescamin-Verfahren schließt die Verwendung des Fluorescamin-Reagenzen, eines nicht-fluoreszierenden Reagenzen, ein, der mit primären Aminen reagiert, um ein hoch fluoreszierendes, quantitativ erfassbares Produkt zu erzeugen. Im Speziellen wurde das Volumen jeder der Proteinlösungen so angepasst, dass die Konzentration des Proteins bei ungefähr 200 μg/mL lag. Danach wurde jede Proteinlösung einer Reihe von 5 Röhren hinzugefügt, so dass die Röhren folgende Volumina aufwiesen: 0,5 mL, 0,4 mL, 0,3 mL, 0,2 mL und 0,1 mL. Jede Röhre wurde auf ein Gesamtvolumen von 2,0 mL mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8,0 verdünnt.
Sequentiell wurde 1,0 mL einer Lösung von 0,3 mg/Ml Fluorescamin (gekauft bei Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) in Aceton jeder der Proberöhren und einer Kontrollröhre, die 2 mL Pufferlösung enthielt, hinzugefügt. Nach heftigem Mischen über einen Zeitraum von 5 Minuten wurde jede Probe in einem Fluoreszenzspektrometer bei einer Erregungswellenlänge von 390 nm und einer Emissionswellenlänge von 475 nm analysiert. Um die relative Menge an Lysinmodifizierung zu bestimmen, wurde ein Plot an Fluoreszenzeinheiten versus Proteinkonzentration erstellt. Der Prozentsatz von Polyethylenglykolkonjugation wurde als 1-(Slope modifiziertes Protein/Slope nicht-modifiziertes Protein) × 100 bestimmt.
Molekulargrößen-Analyse
Die relative Molekulargröße der ungeschützten konjugierten TNFR:Fc-Proben, die geschützte konjugierte TNFR:Fc-Probe und die Kontroll-TNFR:Fc-Probe wurden unter Anwendung von standardmäßigen Größenausschlussverfahren und einer Bio-Sil-SEC-400-Säule bestimmt. Die Molekulargröße wurde unter Anwendung von Standards für Proteine mit hohem Molekulargewicht bestimmt und spiegelt im Vergleich zu einem genauen Molekulargewicht ein hydrodynamisches Volumen oder eine relative Größe der konjugierten Proteine genauer wider. Dies deshalb, weil die Standards Proteine sind, welche bekannte Molekulargewichte aufweisen und nicht Polyethylenglykol-modifizierte Proteine. Polyethylenglykolketten werden in Lösung ausgedehnt und weisen größere Radien auf als Proteine. Somit erhöht das Konjugieren von Polyethylenglykol an Proteine deren scheinbares Molekulargewicht, weil die konjugierten Proteine höhere hydrodynamische Volumina pro tatsächlichem Molekulargewichtsanstieg aufweisen, der dem Polyethylenglykol zugerechnet wird. Die Folge ist eine größere relative Molekulargröße im Vergleich zu Proteinstandards.
Bioaktivität von konjugiertem TNFR:Fc und unkonjugiertem TNFR:Fc
Die Bioaktivitäten des Polyethylenglykol-konjugierten TNFR:Fc, das in Beispiel 1 und in Beispiel 2 hergestellt wird, und eines unkonjugierten TNFR:Fc wurden unter Anwendung einer Bio-Analyse, die allgemein in Onozaki et al., J. Immunology 135: 3962 (1985) und Nakai et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 154: 1189 (1988), beschrieben wird, bestimmt. Die Bioanalyse basiert auf der hemmenden Reaktion der A375 humanen malignen Melanoma-adhärenten Zelllinie auf TNFα. Lösliches TNFR:Fc kann die hemmende Aktivität von TNFα in einer dosisabhängigen Weise spezifisch neutralisieren. Um die Bioanalyse durchzuführen, wurde eine 375-Zelllinie (ATCC CRL 1872) unter Verwendung einer Trypsin-EDTA-Lösung geerntet, um die Zellmonoschicht von den Kolben zu entfernen. Die geernteten Zellen wurden mit einem Analyse-Medium von Dulbeccos' Modified Eagles Medium mit hinzugefügtem fötalem Rinderserum, nicht-essentiellen Aminosäuren und Natriumpyruvat (alle bei GIBCO gekauft) gewaschen.
Sechsundneunzig Vertiefungen-Platten wurden mit seriellen Verdünnungen von Arbeitslösungen von unmodifiziertem TNFR:Fc, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, blockiertem TNFR:Fc, konjugiert mit Polyethylenglykol wie in Beispiel 1 beschrieben, und ungeschütztem TNFR:Fc, konjugiert mit Polyethylenglykol, erstellt wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Danach wurden gleiche Mengen an TNFα (R & D Systems, Katalognr.: #210-CA TF) im oben beschriebenen Analyse-Medium zu Vertiefungen in 96 Vertiefungs-Platten hinzugefügt, gefolgt von einer Beimengung eines gleichen Volumens von ungefähr 4 × 10⁵ geernteter Zellsuspension zu jeder Vertiefung.
Die Platten wurden in eine Feuchtigkeitskammer bei 37°C und 10% CO₂ angeordnet, und die Zellen wurden 72 Stunden inkubiert. Danach wurden die Platten aus der Kammer entfernt und die Zellen mit PBS-Lösung gewaschen, geblottet und mit Ethylalkohol fixiert. Lebensfähige Zellen wurden durch Färben der fixierten Zellen mit 0,1% wässeriger Kristallviolettlösung sichtbar gemacht. Nach dem Waschen der Platten mit Wasser und dem Blotten der Zellen wurden 2% Natriumdeoxycholatlösung zu jeder Vertiefung hinzugefügt, und die Vertiefungen jeder Platte wurden im Hinblick auf optische Dichte bei 570 nm auf einem Plattenleser unter Verwendung von Delta-Soft-Mikroplatten-Analysesoftware gelesen. Standardmäßige Bioaktivitätseinheiten wurden jeder Probe zugewiesen und angepasst, um die Konzentration von TNFR:Fc in den Vertiefungen zu berücksichtigen. Vertiefungen, welche Blanks enthielten, wurden einer Bioaktivität von Null zugewiesen, und solche, die unmodifiziertes oder unkonjugiertes TNFR:Fc enthielten, erhielten eine Bioaktivität von 100 zugewiesen.
Tabelle II zeigt die Ergebnisse des Grads der Polyethylenglykolkonjugationsanalysen, der Molekulargrößenanalysen und der Bioaktivitäts-Tests für jede der TNFR:Fc-Protein-Studien.
Tabelle II Ergebnisse der Charakterisierung von konjugiertem TNFR:Fc
Wie durch die Ergebnisse der Charakterisierungsanalysen in Tabelle II dargestellt, zeigen Proteine, welche vor ihrer Konjugation geschützt wurden, keine Verringerung ihrer Aktivität. In der Tat ist, im Fall von TNFR:Fc, die Bioaktivität des Proteins verstärkt. Wenn ein TNFR:Fc vor seiner Konjugation mit Polyethylenglykol nicht geschützt ist, zeigt es einen Anstieg in der Anzahl von Polyethylenglykoleinheiten oder -ketten pro TNFR:Fc-Molekül bis zu ungefähr 4,5 Einheiten Polyethylenglykol pro TNFR:Fc-Molekül. Ebenso, und wie erwartet, steigt das relative Molekulargewicht des konjugierten Proteins mit zunehmender Menge an Polyethylenglykol im Reaktionsgemisch. Ferner, wie erwartet, nimmt die Aktivität von TNFR:Fc, konjugiert ohne den Vorteil einer blockierten Stelle, mit steigenden Verhältnissen von Polyethylenglykol : Lysinresten in der Konjugationsreaktion ab. Überraschenderweise ergibt, wenn ein Protein vor der Konjugationsreaktion geschützt ist, die Messung der Aktivität des konjugierten Proteins eine sogar noch höhere Aktivität als die eines unkonjugierten Kontrollproteins. Die Aktivität des Proteins, das unter geschützten Bedingungen konjugiert wurde, wird verstärkt, ungeachtet der relativ hohen Anzahl an Polyethylenglykoleinheiten, die mit dem Protein konjugiert sind. Das heißt, dass unter den Reaktionsbedingungen zwischen ungefähr 5 bis 6 Polyethylenglykoleinheiten pro TNFR:Fc mit dem geschützten Protein konjugieren, was zu einer Bioaktivität führt, die bei 110% bis 130% des Kontrollproteins gemessen wird. Im Gegensatz dazu fällt, wenn ein Durchschnitt von ungefähr 4,5 Polyethylenglykoleinheiten mit einem ungeschützten TNFR:Fc konjugiert, die Aktivität auf weniger als 40% von jener eines unkonjugierten Kontrollproteins. Es ist klar, dass Verfahren der vorliegenden Erfindung Polyethylenglykol-konjugierte Proteine bereitstellen, welche verstärkte Vorteile gegenüber dem Stand der Technik aufweisen.
Beispiel 4
Erzeugen von TNFR:Fc-Peptid-Karten
Um die Stellen der Polyethylenglykolkonjugation und die mit der Konjugationsstelle in Verbindung stehende Aktivität zu untersuchen, wurden Peptid-Karten für Konjugationsprodukte von ungeschütztem TNFR:Fc, die gemäß der vorliegenden Erfindung konjugierten Produkte und unkonjugiertes Kontroll-TNFR:Fc erzeugt. Die Peptid-Karten wurden erzeugt, indem das TNFR:Fc mit Trypsin aufgeschlossen wurde, einem Enzym, das auf Lysyl- und Arginylverbindungen von Peptidketten wirkt. Es wird erwartet, dass natives nicht-glykosyliertes TNFR:Fc, das mit Trypsin behandelt ist, 39 Fragmente bildet, da es 38 Stellen gibt, die einen Lysin- oder Argininrest aufweisen. Von Polyethylenglykol ist bekannt, dass es durch verfügbare Aminofunktionalitäten auf Lysin konjugiert, und die Reaktivität von Trypsin gegenüber einer konjugierten Lysinstelle wird geändert. Infolgedessen wird erwartet, dass die Trypsinaufschließungskarte eines konjugierten Proteins im Vergleich zu einem nichtkonjugierten Protein Informationen in Bezug auf Konjugationsstellen und den Grad der Konjugation bereitstellen wird.
Die Trypsinaufschließung wurde erzielt, indem 200 μL von ungefähr 10 mg/mL Proteinlösung mit 500 μL von 7 M Guanidin : HCl und 0,1 M TRIS-HCl, bei einem pH-Wert von 8,3, verdünnt wurden. Danach wurden 7 μL von 1 M Dithiothreitol zur Proteinlösung hinzugefügt, und die Lösung wurde 15 Minuten lang bei 65°C inkubiert, um das Protein zu reduzieren. Nach dem Abkühlen der Lösung des reduzierten Proteins wurden 15,4 μL von 1 M wässerigem Iodoacetamid hinzugefügt, und die Lösung des reduzierten Proteins wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Beimengen von weiteren 15,4 μL von 1 M Dithiothreitol zur Lösung, wurde die Lösung 10 Minuten lang inkubiert und auf ein endgültiges Volumen von 7 mL durch Hinzufügen von 6,276 mL von 0,1 M TRIS bei einem pH-Wert von 7,5 verdünnt. Eine N-Glycanase-Lösung wurde der Proteinlösung auf ein endgültiges Verhältnis von 2 U N-Glycanase/100 μg TNFR:Fc hinzugefügt. Diese Lösung wurde eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Danach wurde ausreichende Trypsinlösung, die 1 μg/μL enthielt, der Proteinlösung hinzugefügt, um ein endgültiges Verhältnis von Trypsin : WT-Protein von 1 : 10 zu erhalten. Der Probe wurde die Möglichkeit zum Aufschließen gegeben, indem sie 5 Stunden lang bei 37°C inkubiert wurde. Nach dem Inkubieren wurde die Aufschließung gelöscht, indem die Aufschließung drei Minuten lang gekocht und unter Verwendung von 10% Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt wurde.
Das oben erwähnte Verfahren wurde unter Verwendung von Proben von unkonjugiertem TNFR:Fc, von TNFR:Fc, das nach dem Schützen seiner Bindungsstelle konjugiert wurde, und von TNFR:Fc durchgeführt, das ohne Blockieren seiner Bindungsstelle konjugiert wurde. Alle Proben wurden danach mit Hilfe eines Waters HPLC-Systems, ausgestattet mit einem Kromasil C18, 5 μ, 100 A Porengröße, 3,2 × 250 mm mit einer Guard-Säule chromatographiert. Eine gradiente mobile Phase wurde mit Lösemittel A, welches wässerige 0,15% TFA enthielt, und mit Lösemittel B verwendet, welches 0,12% TFA in 80% CH₃CN enthielt. Die Durchflussrate lag bei 0,5 mL/Min mit einer Laufzeit von 215 Minuten. Ein UV-Detektor überwachte die Absorbanzen bei 220 nm und bei 280 nm.
Die Chromatogramme für die tryptische Peptid-Karte, die für das unkonjugierte Kontroll-TNFR:Fc, das TNFR:Fc, das ohne den Schutzschritt konjugiert wurde, und das TNFR:Fc erhalten wurden, das nach einem Schutzschritt konjugiert wurde, sind in 1, 2 bzw. 3 dargestellt. Im Allgemeinen zeigen die Karten, dass das Konjugieren von geschütztem TNFR:Fc und ungeschütztem TNFR:Fc zum Verschwinden von Spitzen aus der Karte oder einer Reduktion der Spitzenhöhe führt. Insbesondere sind die Spitzen zu beachten, die als T7, T1 und T9 bezeichnet werden. Es wird bestätigt, dass die T7-Spitze ein Trypsinaufschließungsfragment ist, das an beiden Enden von Arginin flankiert ist. Da keine der aktiven Stellen für dieses Aufschließungsfragment ein Lysin enthält, wird nicht erwartet, dass dieses Fragment durch eine Polyethylenglykol-Konjugationsreaktion beeinträchtigt wird. Infolgedessen wird davon ausgegangen, dass die Spitze für eine TNFR:Fc-Aufschließungsprobe dieselbe ist, ungeachtet dessen, ob das TNFR:Fc einer Polyethylenglykol-Konjugationsreaktion unterzogen wurde oder nicht. Aus diesem Grund wurde die T7-Spitze dazu verwendet, alle anderen Spitzen der drei Chromatogramme zu normalisieren und wird mit gleichen Spitzenhöhen in den drei Karten dargestellt.
Das T1-Fragment wurde als der N-Terminus von TNFR:Fc identifiziert und ist in der Trypsinaufschließungskarte des unkonjugierten Kontroll-Proteins (1) sehr deutlich, während es in den Karten des Proteinkonjugats ohne vorherigen Schutz (2) und in der Karte des Proteins, das nach einem Schutzschritt konjugiert wird, abwesend ist. Dies entspricht den Erwartungen, da der N-Terminus eine sehr reaktive Aminofunktionalität enthält, welche schnell mit einer aktivierten Polyethylenglykolfunktionalität konjugiert. Das aufgeschlossene Polyethylenglykol-konjugierte Fragment wird nicht beim selben Elutionsvolumen während der HPLC-Trennung eluieren.
Interessanterweise ist bekannt, dass die Spitze, die als T9 bezeichnet wird, einem Fragment entspricht, welches einen Aminosäurerest lys108 einschließt, von dem angenommen wird, dass er am Binden von TNFα beteiligt ist. Bedeutenderweise ist die T9-Spitze in der Karte, die mit dem Aufschließen des TNFR:Fc assoziiert ist, das ohne vorherigen Schutz (2) konjugiert wurde, wesentlich reduziert, wodurch gezeigt wird, dass dieser Lysinrest keine aktive Stelle für die Trypsinaufschließung war, wahrscheinlich als Folge der ungeschützten Polyethylenglykol-Konjugationsreaktion. Im Gegensatz dazu ist die T9-Spitze, die mit der Aufschließungkarte von TNFR:Fc assoziiert wird, welches nach dem Schutz (3) konjugiert wird, nicht größenmäßig verringert, was zeigt, dass der Lysinrest durch die Konjugationsreaktion nicht beeinträchtigt wurde und während der Trypsinaufschließung aktiv bleibt. Diese Daten legen die Vermutung sehr nahe, dass ein TNFR:Fc vor der Konjugationsreaktion ausreichend geschützt wurde und erklärt die beibehaltene Aktivität in Zusammenhang mit dem TNFR:Fc, das gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert wurde.
REFERENZBEISPIEL 5
Konjugieren von IL-4R
Im Folgenden wird das Konjugieren eines IL-4-Rezeptors (IL-4R) unter Anwendung eines stellengeschützten Verfahrens beschrieben. Rekombinanter IL-4R, der in CHO-Zellen hergestellt wurde, war das ausgewählte Protein, wobei der verwendete Schutzwirkstoff ein IL-4R monoklonaler Antikörper war, welcher die Aktivität von IL-4R neutralisiert. Verfahren zum Exprimieren von IL-4R in CHO-Zellen und Herstellen eines neutralisierenden Antikörpers werden in der PCT-Veröffentlichung WO 90/05183 beschrieben. Der IL-4R neutralisierende Antikörper wurde an 3 M EMPHAZE^TM Biosupport-Medium auf im Wesentlichen dieselbe Weise immobilisiert wie in Beispiel 1 beschrieben, und zwar unter Verwendung von 15 mg neutralisierendem Antikörper und 0,25 g 3 M EMPHAZE^TM.
Die Perlen mit immobilisiertem Antikörper wurden auf eine 2 mL Amicon-Säule (VL 11 × 25) aus rostfreiem Stahl transferiert und durch zwei Minuten langes Fließen von PBS durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 mL/Minute gefüllt. Die Säule wurde durch zwanzig Minuten langes Fließen von 50 mM Na₂HPO₄ (pH-Wert von 8,5) mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mL/Minute ausgeglichen. Danach wurden 400 μl der IL-4R-Lösung (5,0 mg/mL IL-4R in 20 mM Tris, pH-Wert 7,4) auf die Säule in 50 mM Na₂HPO₄ (pH-Wert 8,5) geladen. Die resultierende Lösung wurde kontinuierlich eine Stunde lang mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mL/Minute durch die Säule geführt.
Nach der Schutzreaktion wurde der IL-4R mit Polyethylenglykol konjugiert, indem 50 mg Succinimidylpropionsäure (SPA)-aktiviertes PEG5000 (ein 10-facher Molüberschuss von Polyethylenglykol zu Lysinresten auf dem IL-4R) in 6 mL von 50 mM Na₂HPO₄ (pH-Wert 8,5) durch Pumpen der Lösung in das Harz in der Säule hinzugefügt wurden. Der Polyethylenglykol-Konjugationsreaktion wurde die Möglichkeit gegeben, über Nacht fortzufahren. Ungebundenes Polyethylenglykol und Konjugationsreaktions-Nebenprodukte wurden aus der Säule gespült, indem 50 mM Na₂HPO₄ (pH-Wert 8,5) 60 Minuten lang bei 0,5 mL/Minute gepumpt wurden.
Der konjugierte IL-4R wurde entschützt und aus der Säule eluiert, indem 0,2 M Natriumcitrat (pH-Wert 2,5) bei 0,5 mL pro Minute eine Stunde lang durch die Säule gepumpt wurden. Fraktionen von eluiertem Material wurden gesammelt und durch UV-Absorbanz bei 280 nm analysiert. Proben, welche Protein enthielten, wurden durch Zugabe von 0,1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert.
Der konjugierte IL-4R wurde durch SDS-PAGE und Größenausschlusschromatographieanalyse charakterisiert. Jede dieser Techniken bestätigte, dass geschützter IL-4R mit Polyethylenglykol konjugierte.
REFERENZBEISPIEL 6
Konjugieren von huGM-CSF
Rekombinanter huGM-CSF wurde in Hefe hergestellt, so wie in Gillis, D. L. et al., Behring Inst. Mitt., 83: 1–7 (1988) beschrieben. Neunundachtzig Milligramm von GM-CSF monoklonalem Antikörper, Immunex-Bezeichnung M8, spezifisch für den N-Terminus von huGM-CSF, wurden an 25 mL Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose gemäß den Herstelleranweisungen konjugiert.
Nachdem der Antikörper an das Harz immobilisiert worden ist, wurde er in eine 50 mL Amicon-Säule geschüttet und durch Fließen von PBS durch die Säule gefüllt. GM-CSF (1,5 mL bei 6,8 mg/mL NaH₂PO₄ (pH-Wert 7,0) wurde auf die Säule in 50 mM NaH₂PO₄ (pH-Wert 7,0) geladen, und die Lösung wurde zwei Stunden lang mit 0,5 mL/Minute kontinuierlich durch die Säule geführt. Danach wurde die Säule ausgeglichen, indem 50 mM NaH₂PO₄ (pH-Wert 8,5) eine Stunde lang durch die Säule geführt wurden.
Der GM-CSF wurde mit Polyethylenglykol konjugiert, indem 500 mg Succinimidylkarbonat(SC)-aktiviertes Polyethylenglykol 5000 (ein 50-facher Molüberschuss von Polyethylenglykol zu restlichen Lysinaminogruppen auf GM-CSF) in 10 mL von 50 mM NaH₂PO₄ (pH-Wert 8,5) hinzugefügt wurden und indem die Lösung über Nacht durch die Säule mit 0,1 mL/Minute gepumpt wurde.
Konjugierter GM-CSF wurde aus der Säule durch einstündiges Pumpen von 50 mM NaH₂PO₄ (pH-Wert 11,0) mit 1 mL/Minute eluiert. Fraktionen von eluiertem Material wurden gesammelt und durch UV-Absorbanz bei 280 nm analysiert. Protein-enthaltende Proben wurden auf einen pH-Wert von 7,1 durch die Beimengung von 1 M HCl neutralisiert. Der konjugierte GM-CSF wurde durch SDS-PAGE und MALDI-TOF-Massenspektrometrie charakterisiert. Jede dieser Techniken bestätigte, dass GM-CSF mit PEG konjugiert worden war. Die Masseänderung lag bei ungefähr 14 kDa, dem Molekulargewicht von unmodifiziertem GM-CSF, bis 29 kDa. Die erfasste Molekulargewichtsänderung zeigt, dass drei Moleküle von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 5.000 an jedes GM-CSF-Molekül konjugierten.

Claims

Verfahren zum Konjugieren von p75-TNF-Rezeptor mit Polyethylenglykol, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: – Binden des p75-TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörpers an den TNF-Rezeptor, um einen stellengeschützten p75-TNF-Rezeptor bereitzustellen; und – In-Kontakt-Bringen des stellengeschützten p75-TNF-Rezeptors mit Polyethylenglykol unter Bedingungen, die ausreichen, um das Polyethylenglykol an den stellengeschützten TNF-Rezeptor zu konjugieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Bindens des p75-TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörpers an den p75-TNF-Rezeptor folgende Schritte aufweist: – Immobilisieren des TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörpers an einen festen Träger; und – In-Kontakt-Bringen des p75-TNF-Rezeptors mit dem immobilisierten TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörper unter Bedingungen, welche den TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörper dazu bringen, reversibel den p75-TNF-Rezeptor zu binden, wobei ein geschützter p75-TNF-Rezeptor bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der feste Träger funktionelle Gruppen aufweist, die kovalent an den TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörper binden können.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Schritt des In-Kontakt-Bringens des geschützten p75-TNF-Rezeptors mit Polyethylenglykol enthält, dass ein aktiviertes Polyethylenglykol mit Nukleophilen auf dem p75-TNF-Rezeptor zum Reagieren gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches ferner den Schritt aufweist, durch den der geschützte p75-TNF-Rezeptor entschützt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Schritt des Entschützens des geschützten p75-TNF-Rezeptors das Behandeln des geschützten p75-TNF-Rezeptors mit einem Entschützungswirkstoff aufweist, wobei der Entschützungswirkstoff in der Lage ist, den p75-TNF-Rezeptor von dem Schutzwirkstoff zu dissoziieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, welches ferner den Schritt der Gewinnung des Polyethylenglykol-konjugierten p75-TNF-Rezeptors aufweist.
Polyethylenglykol-konjugierter p75-TNF-Rezeptor, der gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt ist.
Verfahren zum Modifizieren eines TNFR:Fc-Fusionsproteins, wobei das Verfahren folgende Schritte enthält: – Immobilisieren eines TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörpers an einen festen Träger; und – In-Kontakt-Bringen des TNFR:Fc-Fusionsproteins mit dem immobilisierten TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörper unter Bedingungen, die dazu führen, dass der TNF-Rezeptor neutralisierende Antikörper an das TNFR:Fc-Fusionsprotein bindet; und – In-Kontakt-Bringen des geschützten TNFR:Fc-Fusionsproteins mit Polyethylenglykol unter Bedingungen, die ausreichen, um das Polyethylenglykol an das TNFR:Fc-Fusionsprotein zu konjugieren.
Verfahren nach Anspruch 9, welches ferner den Schritt des Entschützens des geschützten und konjugierten TNFR:Fc-Fusionsproteins aufweist.
Polyethylenglykol-konjugiertes TNFR:Fc-Fusionsprotein, das gemäß dem Verfahren nach Anspruch 9 oder 10 hergestellt ist.
Verfahren zum Konjugieren eines TNFR:Fc-Fusionsproteins mit Polyethylenglykol, wobei das Verfahren folgende Schritte enthält: – Immobilisieren eines TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörpers an einen festen Träger; – In-Kontakt-Bringen des TNFR:Fc-Fusionsproteins mit dem immobilisierten TNF-Rezeptor neutralisierenden Antikörper unter Bedingungen, welche dazu führen, dass der TNF-Rezeptor neutralisierende Antikörper an das TNFR:Fc-Fusionsprotein bindet; und – In-Kontakt-Bringen des geschützten TNFR:Fc-Fusionsproteins mit Polyethylenglykol unter Bedingungen, die dazu führen, dass das Polyethylenglykol mit dem TNFR:Fc-Fusionsprotein konjugiert.
Verfahren nach Anspruch 12, das ferner den Schritt des Entschützens des konjugierten TNFR:FC-Fusionsproteins aufweist.