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Technische
Gebiete
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Lumineszenzverfahren für ein Luciferin/Luciferase-System,
das eine Lumineszenzreaktion stabilisiert, und ein Luciferase-Nachweisreagens.
Das Lumineszenzverfahren für das
Luciferin/Luciferase-System und das Luciferase-Nachweisreagens,
die durch die vorliegende Erfindung an die Hand gegeben werden,
können
bei allen Nachweissystemen angewendet werden, die ein Luciferase-Enzym
als Reporter und Signal verwenden.
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Hintergrund
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Bei
einer Lumineszenzreaktion mit Luciferin/Luciferase in vitro wird
herkömmlicherweise
dessen Lumineszenzmuster in einem Flash-Zustand beobachtet. Daher
ist es unmöglich,
die Lumineszenzreaktion präzis
ohne Verwendung einer Vorrichtung mit einem spezifischen Mechanismus
für des
Injizieren eines Reagens zu messen. K.V. Wood et al. haben aber
ein Lumineszenzsystem mit einer relativ langen Halbwertszeit von
5 Minuten geschaffen. (Wood, K.V. Recent advantage and prospects
for beetle luciferase as genetic reporters. In: Bioluminescence
and Chemiluminescence current status. Proceeding of the VIth International
Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Cambridge, September
1990. S. 543. Herausgegeben von P. Stanley und L.J. Kricka.). Infolgedessen
ist es möglich
geworden, eine Lumineszenz-Einheit in einem Luciferin/Luciferase-System
mit einem Luminometer oder einem Flüssigszintillationszähler, der
keine automatische Reagens injizierende Vorrichtung hat, präzis zu messen.
Daher wird ein Reporternachweisverfahren, bei dem als Reporter in
einer Kulturzelle erzeugtes Luciferase bei hoher Empfindlichkeit
gemessen wird, verbreitet verwendet. Wenn aber das Reporternachweisverfahren
bei einem so genannten High Throughput Screening für das Entwickeln
einer Medikation verwendet wird, ist die Lumineszenz-Halbwertszeit
von 5 Minuten nicht ausreichend. Für das Messen vieler Proben
durch Verwenden von 96 Mikrotiterplatten-Vertiefungen müssen zum Beispiel
Lumineszenzreagenzien mehrmals zugegeben werden und die Messung
muss jedes Mal ausgeführt werden.
Dadurch bestehen Einschränkungen
hinsichtlich Betrieb und Messung.
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Weiterhin
oxidiert als Lumineszenzsubstrat in einem Lumineszenzreagens enthaltenes
Luciferin leicht während
der Lagerung in einer Lösung,
so dass es ein Oxyluciferin bildet. Es ist bekannt, dass Oxyluciferin
die Enzymreaktion einer Luciferase hemmt. Herkömmliche Luciferin als Lumineszenzsubstrat
enthaltende Lumineszenzreagenzien weisen ein großes Problem auf, da eine Lumineszenzaktivität aufgrund
der Oxidation des Luciferin schlechter wird. Dieses Problem verhindert
die weitere Ausweitung der Einsatzmöglichkeiten der Luciferase
als Reporter verwendenden Analyse. Daher wird die Entwicklung eines
neuen Stabilisierungsverfahrens erwartet.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein Lumineszenzverfahren
für ein
Luciferin/Luciferase-System, das die Halbwertszeit einer Lumineszenzreaktion
verlängert,
sowie ein Luciferase-Nachweisreagens an die Hand zu geben.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft ein Lumineszenzverfahren
für ein
Luciferin-/Luciferase-System, das die Verschlechterung einer Lumineszenzaktivität verhindert
und eine stabile Lumineszenzreaktion gibt, sowie ein Luciferase-Nachweisreagens.
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Offenlegung
der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird ein
Lumineszenzverfahren für
ein Luciferin/Luciferase-System an die Hand gegeben, das das in
Reaktion bringen einer Luciferase-Lösung, die eine erhöhte Menge
aufgelösten
Kohlendioxids enthält,
mit Luciferase umfasst.
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Erfindungsgemäß wird weiterhin
ein Lumineszenzverfahren für
ein Luciferin/Luciferase-System an die Hand gegeben, bei dem der
pH-Wert der Luciferin-Lösung
in dem Bereich von 5,0 bis 8,5 eingestellt wird.
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Erfindungsgemäß wird weiterhin
ein Lumineszenzverfahren für
ein Luciferin/Luciferase-System an die Hand gegeben, bei dem die
Menge des aufgelösten
Kohlendioxids in der Luciferin-Lösung
durch Zugabe von Trockeneis erhöht
wird.
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Erfindungsgemäß wird weiterhin
ein Lumineszenzverfahren für
ein Luciferin/Luciferase-System an die Hand gegeben, bei dem die
Menge des aufgelösten
Kohlendioxids in der Luciferin-Lösung
durch Einleiten eines Kohlendioxidgases erhöht wird.
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Erfindungsgemäß wird weiterhin
ein Luciferase-Nachweisreagens an die Hand gegeben, welches eine Luciferin-Lösung umfasst,
die eine erhöhte
Menge an aufgelöstem
Kohlendioxid enthält.
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Erfindungsgemäß wird weiterhin
ein Luciferase-Nachweisreagens an die Hand gegeben, welches eine ein
getrocknetes Luciferin enthaltende erste Komponente und eine zweite
Komponente aus einer Lösung,
die eine erhöhte
Menge an aufgelöstem
Kohlendioxid enthält,
umfasst.
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Bevorzugte
Ausführung
der Erfindung
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In
der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Luciferase" alle Luciferasen,
die eine Biolumineszenz betreffen, beispielsweise eine Glühwürmchen-Luciferase,
eine Renilla-Luciferase und eine Cypridina-Hilgendorfii-Luciferase.
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In
der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Luciferin" Lumineszenzsubstrate,
die den Luciferasen entsprechen, die eine Biolumineszenz betreffen,
beispielsweise eine Glühwürmchen-Luciferase,
eine Renilla-Luciferase und eine Cypridina-Hilgendorfii-Luciferase.
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Als
Verfahren zur Steigerung der Menge aufgelösten Kohlendioxids in einer
Luciferase-Lösung
als Lumineszenzreagens für
eine Luciferase wird in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren
der Zugabe eines Kohlendioxidgases oder von Trockeneis bevorzugt.
Beispiele für
das Verfahren umfassen sogar ein Verfahren, bei dem eine anorganische
Verbindung wie Natriumbicarbonat, das durch dessen Zugabe in Wasser
ein Gas erzeugt, zugegeben wird. Es ist aber bevorzugt, ein Kohlendioxidgas
oder ein Trockeneis zu verwenden, das Lebewesen wie Mikroorganismen
kaum beeinträchtigt
und das keine chemische Reaktion oder dergleichen erzeugt.
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Dank
der Verwendung eines Kohlendioxidgases wird die Lumineszenzreaktion
von Luciferase lange Zeit fortgesetzt. Gleichzeitig kann ein Lumineszenzsubstrat,
Luciferin, in der Lösung
vor einer Oxidationsverschlechterung aufgrund aufgelösten Sauerstoffs
geschützt
werden.
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Für das Steuern
des pH-Werts einer Lumineszenzlösung
wird in der vorliegenden Erfindung eine anorganische Säure wie
Chlorwasserstoffsäure,
Schwefelsäure,
Phosphorsäure
und Borsäure,
eine organische Säure
wie Essigsäure,
Weinsäure, Äpfelsäure, Propionsäure, Mucinsäure, Benzoesäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure oder
Fumarsäure,
eine anorganische alkalische Verbindung wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, wässrige Ammoniaklösung, Natriumcarbonat
und Kaliumcarbonat oder eine organische Base wie Anilin, Pyridin,
Imidazol, Monomethylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Monoethylamin,
Diethylamin, Triethylamin, Ethanolamin, Diethanolamin oder Triethanolamin
zugegeben. Durch Steuern eines pH-Werts bei einem bevorzugten pH-Wert
von pH 5 bis 8,5 wird während
einer Lumineszenzreaktion die Verschiebung zu einer alkalischen
Seite verhindert, was zur Aufrechterhaltung der Enzymaktivität von Luciferase
dienen kann.
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Wenn
der pH-Wert jenseits des Bereichs von 5,0 bis 8,5 liegt, wird die
Lumineszenzreaktion extrem verhindert. Wenn der pH-Wert hoch in
dem obigen Bereich liegt, kann eine starke Lumineszenz-Einheit erhalten
werden. Die Halbwertszeit wird aber verkürzt. Wenn der pH-Wert dagegen
niedrig ist, ist die Lumineszenz-Einheit klein. Es kann aber eine
lange Halbwertszeit erreicht werden. D.h. die Kombinationsveränderung von
pH und einer Pufferkomponente davon kann die Lumineszenz-Einheit
und die Halbwertszeit der Lumineszenz in gewissem Maße einstellen,
wenn eine Lumineszenzlösung
der gleichen Zusammensetzung verwendet wird. Die Pufferlösungskomponente
zur Steuerung eines pH-Werts kann beliebig sein, solange sie nicht
eine Luciferase-Aktivität
verhindert. Die Pufferlösung
umfasst allgemeine Pufferlösungen
wie Trisulfat, Citronensäure
und Bernsteinsäure,
Good-Pufferlösungen
wie HEPES und MES sowie breite Pufferlösungen wie GTA. Die Konzentration
der Pufferkomponente kann eine beliebige Konzentration sein, sofern
sie nicht einen pH-Wert in dem vorbestimmten Bereich vom Start der
Lumineszenz bis zu einem Zeitpunkt, da die Lumineszenz um die Hälfte gesunken
ist, ausreichend halten kann.
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Das
erfindungsgemäße Luciferase-Nachweisreagens
wird so erzeugt, dass bei seinem Mischen mit einer Luciferase enthaltenden
Probe eine Reaktion gestartet wird und eine Konzentration einer
Komponente hinsichtlich einer Lumineszenzreaktion, beispielsweise
einem Lumineszenzsubstrat, erhalten wird, wobei die Konzentration
ausreicht, um eine zu messende Luciferase abzugeben. Das Lumineszenzreagens
umfasst ein Kit eines gefrorenen Erzeugnisses und ein Kit eines
gefriergetrockneten Erzeugnisses.
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Das
gefrorene Erzeugnis wird durch Gefrieren einer Komponente erhalten,
die Luciferin, ATP, CoA, eine Pufferlösungskomponente, Magnesiumione,
etc. enthält.
Kohlendioxid wird vor dem Gefrieren in einer Lösung zwangsaufgelöst. Das
gefrorene Erzeugnis wird bei etwa –70°C gelagert. Nachdem das gefrorene
Erzeugnis aufgetaut und vollständig
Raumtemperatur erreicht hat, wird es verwendet.
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Der
Kit des gefriergetrockneten Erzeugnisses umfasst eine erste Komponente,
die durch Gefriertrocknen einer Lösung, die Luciferin, ATP und
CoA enthält,
erhalten wird, und eine zweite Komponente einer Lösung, die
eine Pufferlösungskomponente
und Magnesiumione enthält.
Die erste Komponente und die zweite Komponente werden direkt vor
der Verwendung gemischt. In diesem Fall wird Kohlendioxid in der Lösung der zweiten
Komponente zwangsaufgelöst
und abgedichtet gelagert. Das gefriergetrocknete Erzeugnis und die Lösungskomponente
werden gefroren gelagert. Nachdem das gefriergetrocknete Erzeugnis
und die Lösungskomponente
aufgetaut sind und Raumtemperatur erreicht haben, werden diese Komponenten
vor der Verwendung gemischt.
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Sowohl
das gefrorene Erzeugnis als auch das gefriergetrocknete Erzeugnis
können
in einem Lösungszustand
24 Stunden lang bei Raumtemperatur oder einen Monat lang bei niedrigen
Temperaturen (4°C)
bei praktisch keinem Verlust der Lumineszenzeigenschaften gelagert
werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezug auf Beispiele eingehend erläutert.
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Beispiel 1
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Auf
10 ml eines Luciferase-Nachweisreagens des „Pica Gene Luminescence Kit" (Produktnr. „PGL100", bezogen von TOYO
INK MFG. Co., LTD), wurde eine GTA-Pufferlösung, deren pH-Wert auf 6,7
eingestellt war, zugegeben, um eine Endkonzentration von 100 mM
zu erhalten. Dann wurde ein Trockeneis in einer Menge von 1 g pro
10 ml des Lumineszenzreagens zugegeben und das Trockeneis wurde
vollständig verdampft.
Als Stabilisator für
Luciferase wurde Glycerol zugegeben, so dass eine Endkonzentration
von 1% erhalten wurde, und das Gemisch wurde gut gemischt, um eine
Lumineszenzlösung
zu erzeugen.
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10 μl einer Enzymlösung, die
100 ng/ml Luciferase enthielt, wurde auf eine Messküvette für ein Luminometer
(„LB9506", bezogen von Berthold)
gegeben. Dann wurden 100 μl
der oben erzeugten Lumineszenzlösung
zugegeben und die Küvette
wurde sofort auf das Luminometer gesetzt. Direkt nach Zugabe des
Reagens (0 Minuten) bis zu Verstreichen von 7 Sunden (420 Minuten)
wurden Lumineszenz-Einheiten
im zeitlichen Verlauf gemessen. Bei der Lumineszenzreaktion mittels
des obigen Lumineszenzreagens wurde die Lumineszenz-Einheit (RLU/s)
bei einem in etwa konstanten Wert 5 Minuten nach Start stabilisiert,
wenngleich die Lumineszenz-Einheit
in zunehmender Richtung war. 30 Minuten ab Start erreichte die Lumineszenz-Einheit
ihren Spitzenwert und wurde dann allmählich gedämpft. Danach kam die Lumineszenz-Einheit
zwei Stunden nach Start auf 50% der maximalen Lumineszenz-Einheit,
so dass sie eine Halbwertszeit erreichte.
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Bei
Verdünnen
der Luciferase-Enzymlösung
und Zugabe der verdünnten
Lösung
in dem Bereich von 10 ng (10–9g) auf 1 fg (10–15g)
wurden ferner 10 fg Luciferase-Enzym
in der obigen Lumineszenzlösung
nachgewiesen.
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Weiterhin
wurde die erzeugte Lumineszenzlösung
dreimal gefroren und aufgetaut. Es wurde nahezu keine Abnahme einer
Lumineszenz-Aktivität
beobachtet. Die erzeugte Lumineszenzlösung wies nach einmonatiger
Lagerung bei 4°C
keine Abnahme der Aktivität
auf.
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Beispiel 2
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Auf
10 ml eines Luciferase-Nachweisreagens des „Pica Gene Luminescence Kit" (Produktnr. „PGL100", bezogen von TOYO
INK MFG. Co., LTD), wurde eine Citronensäure-Pufferlösung, deren pH-Wert auf 6,3
eingestellt war, zugegeben, um eine Endkonzentration von 100 mM
zu erhalten. Dann wurde ein Trockeneis in einer Menge von 1 g pro
10 ml des Lumineszenzreagens zugegeben und das Trockeneis wurde vollständig verdampft.
Als Stabilisator für
Luciferase wurde Glycerol zugegeben, so dass eine Endkonzentration
von 1% erhalten wurde, und das Gemisch wurde gut gemischt, um eine
Lumineszenzlösung
zu erzeugen.
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10 μl einer Enzymlösung, die
100 ng/ml Luciferase enthielt, wurde auf eine Messküvette für ein Luminometer
(„LB9506", bezogen von Berthold)
gegeben. Dann wurden 100 μl
der oben erzeugten Lumineszenzlösung
zugegeben und die Küvette
wurde sofort auf das Luminometer gesetzt. Direkt nach Zugabe des
Reagens (0 Minuten) bis zu Verstreichen von 7 Stunden (420 Minuten)
wurden Lumineszenz-Einheiten
im zeitlichen Verlauf gemessen. Bei der Lumineszenzreaktion mittels
des obigen Lumineszenzreagens wurde die Lumineszenz-Einheit (RLU/s)
bei einem in etwa konstanten Wert 10 Minuten nach Start stabilisiert.
60 Minuten ab Start erreichte die Lumineszenz-Einheit ihren Spitzenwert
und wurde dann allmählich gedämpft. Selbst nach
7 Stunden wurde die Lumineszenz-Einheit noch bei 67% der maximalen
Lumineszenz-Einheit gehalten.
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Bei
Verdünnen
der Luciferase-Enzymlösung
und Zugabe der verdünnten
Lösung
in dem Bereich von 10 ng auf 1 fg wurden ferner 100 fg Luciferase-Enzym
in der obigen Lumineszenzlösung
nachgewiesen.
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Weiterhin
wurde die erzeugte Lumineszenzlösung
dreimal gefroren und aufgetaut. Es wurde nahezu keine Abnahme einer
Lumineszenz-Aktivität
beobachtet. Die erzeugte Lumineszenzlösung wies nach einmonatiger
Lagerung bei 4°C
keine Abnahme der Aktivität
auf.
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Beispiel 3
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Auf
10 ml eines Luciferase-Nachweisreagens des „Pica Gene Luminescence Kit" (Produktnr. „PGL100", bezogen von TOYO
INK MFG. Co., LTD), wurde eine GTA-Pufferlösung, deren pH-Wert auf 6,7
eingestellt war, zugegeben, um eine Endkonzentration von 100 mM
zu erhalten. Dann wurde ein Kohlendioxidgas mit einem Gaseinleitungsrohr
bei einer Strömungsgeschwindigkeit
von 20 ml/min etwa 3 Minuten lang in die Reagenslösung eingeleitet,
während
es leicht perlte. Als Stabilisator für Luciferase wurde Glycerol
zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 1% erhalten wurde,
und das Gemisch wurde gut gemischt, um eine Lumineszenzlösung zu
erzeugen.
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10 μl einer Enzymlösung, die
100 ng/ml Luciferase enthielt, wurde auf eine Messküvette für ein Luminometer
(„LB9506", bezogen von Berthold)
gegeben. Dann wurden 100 μl
der oben erzeugten Lumineszenzlösung
zugegeben und die Küvette
wurde sofort auf das Luminometer gesetzt. Direkt nach Zugabe des
Reagens (0 Minuten) bis zu Verstreichen von 7 Stunden (420 Minuten)
wurden Lumineszenz-Einheiten
im zeitlichen Verlauf gemessen. Bei der Lumineszenzreaktion mittels
des obigen Lumineszenzreagens wurde die Lumineszenz-Einheit (RLU/s)
bei einem in etwa konstanten Wert 5 Minuten nach Start stabilisiert,
wenngleich die Lumineszenz-Einheit
in zunehmender Richtung war. 30 Minuten ab Start erreichte die Lumineszenz-Einheit
ihren Spitzenwert und wurde dann allmählich gedämpft. Danach kam die Lumineszenz-Einheit
zwei Stunden nach Start auf 50% der maximalen Lumineszenz-Einheit,
so dass sie eine Halbwertszeit erreichte.
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Bei
Verdünnen
der Luciferase-Enzymlösung
und Zugabe der verdünnten
Lösung
in dem Bereich von 10 ng auf 1 fg wurden ferner 10 fg Luciferase-Enzym
in der obigen Lumineszenzlösung
nachgewiesen.
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Weiterhin
wurde die erzeugte Luminneszenzlösung
dreimal gefroren und aufgetaut. Es wurde nahezu keine Abnahme einer
Lumineszenz-Aktivität
beobachtet. Die erzeugte Lumineszenzlösung wies nach einmonatiger
Lagerung bei 4°C
keine Abnahme der Aktivität
auf.
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Vergleichsbeispiel 1
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10 μl einer Enzymlösung, die
100 ng/ml Luciferase enthielt, wurde auf eine Messküvette für ein Luminometer
(„LB9506", bezogen von Berthold)
gegeben. „Pica
Gene Luminescence Kit" (Produktnr. „PGL100", bezogen von TOYO
INK MFG. Co., LTD) wurde als herkömmliches Lumineszenzreagens
erzeugt. 100 μl
des erzeugten Reagens wurden auf die Küvette gegeben. Die Küvette wurde
sofort auf das Luminometer gesetzt. Direkt nach Zugabe des Reagens
(0 Minuten) bis zu Verstreichen von 7 Stunden (420 Minuten) wurden
Lumineszenz-Einheiten im zeitlichen Verlauf gemessen. Ab Start der
Lumineszenzreaktion wurden sehr hohe Lumineszenz-Einheiten erhalten.
Die Lumineszenz-Einheit erreichte aber nach etwa 5 Minuten eine
Halbwertszeit. 2 Stunden ab Start der Reaktion war die Lumineszenz-Einheit auf 1,4%
der maximalen Lumineszenz-Einheit (RLU/s) gesunken. Ferner war sie
7 Stunden ab Start auf 0,7% der maximalen Lumineszenz-Einheit (RLU/s)
gesunken. Nach dreimaligen Einfrieren und Auftauen der erzeugten
Lumineszenzlösung
war die Lumineszenz-Aktivität
auf 90% gesunken. Nach einmonatiger Lagerung bei 4°C war die
Aktivität
der Lumineszenzlösung
auf 10% oder weniger gesunken.
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Tabelle
1 zeigt die Messergebnisse der Beispiele und des Vergleichsbeispiels.
Das erfindungsgemäße Verfahren
zeigt gegenüber
dem herkömmlichen
Verfahren ausgezeichnete Ergebnisse bei der Kontinuität und Stabilität der Lumineszenz. Tabelle
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Hinweis: 100 μl
jedes Lumineszenz-Reagens wurden auf 1 ng/10 μl einer Luciferase-Lösung zugegeben, Lumineszenz-Einheiten
wurden direkt nach Reaktionsstart mit einem Luminometer („LB9506", bezogen von Berthold)
gemessen, um eine relative Lumineszenz-Einheit pro Zeiteinheit Sekunde
zu messen.
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Gewerbliche Eignung
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Wenn
die erfindungsgemäß erzeugte
Lumineszenzlösung
verwendet wird, wird die Lumineszenzstabilität verglichen mit einer herkömmlichen
Lumineszenzlösung
mit einer Halbwertszeit der Lumineszenz von 5 Minuten beträchtlich
verbessert. Bei Verwendung der Lumineszenzlösung mit einem hohen pH-Wert
wird die Halbwertszeit um das 20fache oder mehr bei einer Nachweisempfindlichkeit
von 10 fg erhöht.
Bei Verwendung der Lumineszenzlösung
mit einem niedrigen pH-Wert wird die Halbwertszeit um das 90fache
oder mehr bei einer Nachweisempfindlichkeit von 100 fg erhöht.
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Wie
vorstehend beschrieben wird erfindungsgemäß ein Lumineszenzmessverfahren
an die Hand gegeben, das anstelle des herkömmlichen Luciferase-Lumineszenzmessverfahrens
bezüglich
Kontinuität
und Stabilität
ausgezeichnet ist, wobei das Verfahren durch Schnelligkeit und hohe
Empfindlichkeit gekennzeichnet ist.
