JPH088863B2 - ルシフェラーゼ - Google Patents

ルシフェラーゼ

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JPH088863B2
JPH088863B2 JP62300022A JP30002287A JPH088863B2 JP H088863 B2 JPH088863 B2 JP H088863B2 JP 62300022 A JP62300022 A JP 62300022A JP 30002287 A JP30002287 A JP 30002287A JP H088863 B2 JPH088863 B2 JP H088863B2
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luciferase
luciferin
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hydroxy
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直樹 梶山
力 増田
宏樹 辰巳
衛一 中野
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酸素分子によるルシフェリンの酸化を触媒
する、純化されたルシフェラーゼに関する。
〔従来の技術〕
従来、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシ
フェラーゼは、不安定であるために精製に成功していな
いのが実情である〔蛋白質 核酸 酸素、第32巻、第10
号、第44〜59頁、特に第47頁（第1234〜1249頁、特に第
1237頁）（1987）〕。
ルシフェラーゼは、ATPの定量等に極めて有効に用い
ることができる。
〔発明が解決しようとする問題点〕
本発明は、ゲンジボタル由来のルシフェラーゼを提供
することを目的とする。
〔問題点を解決するための手段〕
そこで、本発明者等は、このような実情に鑑み鋭意検
討した結果、ゲンジボタル尾部からルシフェラーゼを単
離し、純化することに成功し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ゲンジボタル（Luciola cruciat
a）から純化されたルシフェラーゼであって、下記の理
化学的性質： 作用： 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるル
シフェリンの酸化を触媒する酵素である。
ルシフェリン＋ATP＋O2→ オキシルシフェリン＋AMP＋ピロリン酸＋CO2＋光 基質特異性： ADP、CTP、UTP及びGTPには作用しない。
至適pH及び安定pH範囲： 至適pHは、ルシフェリンを基質とした場合、pH8.0〜
9.5である（第１図参照）。
安定pH範囲は、pH6.5〜9.0である（第２図参照）。
作用適温の範囲： ０〜50℃である。
pH、温度等による失活の条件： pH5.0以下及びpH11.0以上で４時間後完全に失活す
る。
pH7.8において、温度50℃、15分間の熱処理により完
全に失活する。
を有し、かつ以下の精製工程： a.ゲンジボタルルシフェラーゼの粗酵素溶液から30〜60
％の硫酸アンモニウム飽和で形成した沈殿を、1mMエチ
レンジアミン４酢酸２ナトリウム及び硫酸アンモニウム
を10％飽和となるように25mMトリス（ヒドロキシ）アミ
ノメタン−塩酸緩衝液,pH＝7.8に添加することによって
調製した溶液中に溶解すること； b.該溶解した沈殿溶液をゲル濾過クロマトグラフィーに
供し、活性区分を回収すること； c.該活性区分を0.1M塩化ナトリウムおよび10％（V/V）
エチレングリコールを、10mMリン酸１水素ナトリウム−
リン酸２水素ナトリウム溶液に添加することによって調
製した緩衝液に対して透析すること； d.10mMリン酸緩衝液で平衡化したヒドロキシ−アパタイ
トカラム上に該透析物質を吸着すること； e.該ヒドロキシ−アパタイトカラムから10mM〜100mMの
リン酸緩衝液,pH7.5によるリニアグラジエントによって
溶出されたルシフェラーゼ活性を有する区分を採取する
こと； を行うことにより得られる。
以下、本発明の詳細に説明する。
先ず、本酵素の理化学的性質を以下に記載する。
作用： 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるル
シフェリンの酸化を触媒する酵素である。
基質特異性： ADP、CTP、UTP及びGTPには作用しない。
至適pH及び安定pH範囲： 至適pHは、ルシフェリンを基質とし、25mMグリシルグ
リシンのpHをpH6.5〜11.5迄変化させ、温度30℃で反応
させ、20秒間発光量（フォトン数）を測定した場合、第
１図に示す如くpH8.0〜9.5であり、また安定pH範囲は、
ルシフェリンを含有する緩衝液（pH4.6〜8.0:25mMリン
酸緩衝液、pH8.0〜11.5:25mMグリシン・塩化ナトリウム
−水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用。なお、それ
ぞれの緩衝液には10％飽和となる如く硫酸アンモニウム
を添加したものである。）に酵素を添加し、温度０℃で
４時間作用させた場合、第２図に示す如く、6.5〜9.0で
ある。なお、第２図において、 それぞれ25mMリン酸緩衝液、及び25mMグリシン・塩化ナ
トリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合の活
性を示す。
力価の測定法 25mMグリシルグリシン（pH7.8）8ml、硫酸マグネシウ
ム溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）に硫酸マグネ
シウムを0.1Mとなる如く添加した溶液〕0.5ml及びルシ
フェリン溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）にルシ
フェリンを1mMとなる如く添加した溶液〕0.8mlを混合し
てルシフェリン混合液を調製する。
このようにして得たルシフェリン混合液400μ及び
測定するルシフェラーゼ10μを混合したものに、ATP
溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）にATPを10mMとな
る如く添加したもの。〕80μを注入すると同時に、ル
ミノメーター（アロカ社製、ルミネッセンスリーダ BL
R−201）により発生するフォトン数を20秒間積算して求
める。
作用適温の範囲 pH7.8のもとに、各温度で反応させ20秒間発光量（フ
ォトン数）を測定した場合、０〜50℃の範囲内にある。
pH、温度などによる失活の条件 （イ）pHによる失活の条件 pH5.0以下及びpH11.0以上で４時間後完全に失活す
る。
（ロ）温度による失活の条件 pH7.8において、温度50℃、15分間の熱処理により完
全に失活する。
次に、本酵素を製造するための具体的手段を以下に述
べる。
本酵素を製造する方法としては、如何なる方法でも良
く、例えば、以下の方法が挙げられる。
本発明に用いられるゲンジホタルとしては、自然界よ
り採集したもの、あるいは人工的に養殖したもの等如何
なるものでもよく、そして、ゲンジボタル尾部には、ル
シフェラーゼが多量に存在するためにゲンジボタル尾部
はルシフェラーゼ分離源として好適である。
そして、緩衝液に、ゲンジボタルを添加して粉砕し、
粉砕物を得る。
緩衝液としては、ルシフェラーゼを失活させるもので
なければ、如何なるものでもよく、例えば、トリス（ヒ
ドロキシ）アミノメタン−塩酸緩衝液、グリシン・塩化
ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等
にそれぞれ10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加
したもの等が挙げられる。
粉砕手段としては、乳鉢及び乳棒を用いる方法、ホモ
ゲナイザー、ワーリングブレンダー、フレンチプレス等
を用いる方法等が挙げられる。
次いで、粉砕物より通常の遠心分離あるいは濾過処理
等により残渣を除去して、粗酵素液を得るか、これに必
要により凍結乾燥法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱
法などを適宜選択して実施することにより粗酵素粉末を
得る。
上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末よりさらに精製酵素
標品を得るには、例えばセファデックス、ウルトロゲル
もしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換
体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用
いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶
出法、庶糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティク
ロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分
画法等を適宜選択し、組合わせて実施することにより、
精製された酵素標品を得ることが出来る。
〔実施例〕
次に、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。
実施例 25mMトリス（ヒドロキシ）アミノメタン−塩酸緩衝液
に、1mMエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム及び2mMフ
ェニルメチルスルフォニルフルオリドを添加し、更に硫
酸アンモニウムを10％飽和となる如く添加して得た混液
（pH7.8）15mlに、ゲンジボタル〔（株）西武百貨店よ
り購入〕の尾部150匹分を添加し、ヒスコトロン
〔（株）日音医理科器械製作所製〕を用いて破壊したも
のを、12,000r.p.m.で20分間遠心分離処理し、上清（粗
酵素溶液）14.5mlを得た。
このようにして得た粗酵素溶液を常法により硫化アン
モニウムを用いて塩析し、30％〜60％飽和で生成した沈
澱を30,000r.p.m.で10分間遠心分離処理し、その沈澱を
25mM混合液〔少量の25mMトリス（ヒドロキシ）アミノメ
タン−塩酸緩衝液に、1mMエチレンジアミン４酢酸２ナ
トリウム及び10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添
加して得た溶液（pH7.8）〕に溶解させて溶液を得た。
次いで、この溶液を、上記25mM混合液で平衡化された
ウルトロゲル（Ultrogel）AcA34（LKB社製）カラム中を
通過させてゲル濾過クロマトグラフィーを行い活性区分
を得た。
このようにして得た区分を、リン酸緩衝液〔10mMリン
酸１水素ナトリウム−リン酸２水素ナトリウム溶液に、
0.1M塩化ナトリウム及びエチレングリコール10％（V/
V）を添加した緩衝液〕を用いて透析を行い、得られた
溶液を、10mMリン酸緩衝液で平衡化されたヒドロキシ−
アパタイトHPLC（東洋曹達工業社製、TSKgel HA−100
0）カラムに吸着させ、10〜100mM迄のリン酸緩衝液（pH
7.5）によるリニアグラジエント（Liner Gradient）溶
出を行うことにより純化されたゲンジボタル由来のルシ
フェラーゼ活性区分200μ〔酵素活性:3.5×102キロカ
ウント（Kcount）〕を得た。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明酵素の至適pH域を示す図であり、また
第２図は、本発明酵素の安定pH範囲を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中野 衛一 埼玉県岩槻市木曽良２―86 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，74（７），1977，Ｐ．2799− 2802

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ゲンジボタル（Luciola cruciata）から純
    化されたルシフェラーゼであって、下記の理化学的性
    質： 作用； 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
    フェリンの酸化を触媒する酵素である。 ルシフェリン＋ATP＋O2→ オキシルシフェリン＋AMP＋ピロリン酸＋CO2＋光 基質特異性； ADP、CTP、UTP及びGTPには作用しない。 至適pH及び安定pH範囲； 至適pHは、ルシフェリンを基質とした場合、pH8.0〜9.5
    である。 安定pH範囲は、pH6.5〜9.0である。 作用適温の範囲； ０〜50℃である。 pH、温度等による失活の条件； pH5.0以下及び11.0以上で４時間後完全に失活する。 pH7.8において、温度50℃、15分間の熱処理により完全
    に失活する。 を有し、かつ以下の精製工程： a.ゲンジボタルルシフェラーゼの粗酵素溶液から30〜60
    ％の硫酸アンモニウム飽和で形成した沈殿を、1mMエチ
    レンジアミン４酢酸２ナトリウム及び硫酸アンモニウム
    を10％飽和となるように25mMトリス（ヒドロキシ）アミ
    ノメタン−塩酸緩衝液,pH＝7.8に添加することによって
    調製した溶液中に溶解すること； b.該溶解した沈殿溶液をゲル濾過クロマトグラフィーに
    供し、活性区分を回収すること； c.該活性区分を0.1M塩化ナトリウムおよび10％（V/V）
    エチレングリコールを、10mMリン酸１水素ナトリウム−
    リン酸２水素ナトリウム溶液に添加することによって調
    製した緩衝液に対して透析すること； d.10mMリン酸緩衝液で平衡化したヒドロキシ−アパタイ
    トカラム上に該透析物質を吸着すること； e.該ヒドロキシ−アパタイトカラムから10mM〜100mMの
    リン酸緩衝液,pH7.5によるリニアグラジエントによって
    溶出されたルシフェラーゼ活性を有する区分を採取する
    こと； を行うことにより得られる該純化されたルシフェラー
    ゼ。
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