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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
L- Aminosäuren durch
Fermentation. L-Aminosäuren
werden als Arzneistoffe, Lebensmittelprodukte und Futtermittelzusätze verwendet.
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Als
direkte Fermentationsverfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren direkt
aus Zuckern sind Verfahren bekannt, bei denen Mutanten eingesetzt
werden, die von Wildtypstämmen
von Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium,
Escherichia, Serratia oder Arthrobacter abgeleitet wurden. Zum Beispiel
sind die nachfolgenden als L-Aminosäuren produzierende Mutanten
bekannt: auxotrophe Mutanten, die Aminosäuren etc. benötigen (Japanische
Veröffentlichte
Geprüfte
Patentanmeldung Nr. 10037/81), Mutanten, die Resistenz gegenüber Aminosäureanaloga,
Vitaminen etc. aufweisen (Japanische Veröffentlichte Ungeprüfte Patentanmeldung
Nr. 134993/81, Japanische Veröffentlichte
Ungeprüfte
Patentanmeldung Nr. 44193/87), Mutanten, die sowohl eine auxothrophe
Mutation für
als auch eine Resistenzmutation gegenüber Aminosäureanaloga aufweisen (Japanische
Veröffentlichte
Ungeprüfte
Patentanmeldung Nr. 31093/75, Japanische Veröffentlichte Ungeprüfte Patentanmeldung
Nr. 134993/81), Mutanten, die eine erniedrigte Abbaubarkeit aufweisen
(Japanische Veröffentlichte
Ungeprüfte
Patentanmeldung Nr. 273487/88, Japanische Veröffentlichte Geprüfte Patentanmeldung
Nr. 48195/77) und Mutanten, deren Aminoacyl-t-RNA synthetisierenden
Enzyme eine verringerte Substrataffinität aufweisen (Japanische Veröffentlichte
Ungeprüfte
Patentanmeldung Nr. 330275/92). Auch bekannt sind Transformanten,
die erhalten wurden durch Transformation mit rekombinanten DNAs,
die Gene enthalten, welche die Biosynthese von Aminosäuren betreffen
(Japanische Veröffentlichte
Ungeprüfte
Patentanmeldung Nr. 893/83, Japanische Veröffentlichte Ungeprüfte Patentanmeldung
Nr. 12995/85, Japanische Veröffentlichte
Ungeprüfte
Patentanmeldung Nr. 30693/85, Japanische Veröffentlichte Ungeprüfte Patentanmeldung
Nr. 195695/86, Japanische Veröffentlichte
Ungeprüfte
Patentanmeldung Nr. 458/90, Japanische Veröffentlichte Ungeprüfte Patentanmeldung
Nr. 42988/90).
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Aufgrund
einer wachsenden Nachfrage nach L-Aminosäuren zur Verwendung als Arzneistoffe,
Lebensmittelprodukte und Futtermittelzusätze in den letzten Jahren besteht
eine zunehmende Notwendigkeit der Verbesserung von Verfahren zur
Herstellung von L-Aminosäuren.
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Daher
war die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Aufgabe,
ein industriell effizientes Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, die
als Arzneistoffe, Lebensmittelprodukte und Futtermittelzusätze verwendbar
sind, bereitzustellen.
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Die
Lösung
der technischen Aufgabe wird bereitgestellt durch die in den Patentansprüchen charakterisierten
Ausführungsformen.
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Entsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, der in
der Lage ist, eine L-Aminosäure
herzustellen und der nicht in einem synthetischen Medium wachsen
kann, welches die L-Aminosäure
als einzige Stickstoffquelle in einer Konzentration von 5 mg/ml
oder geringer enthält.
Außerdem
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
einer L-Aminosäure,
umfassend das Züchten
des Mikroorganismus in einem Nährmedium,
das Ermöglichen
der L-Aminosäure sich
in der Kultur anzureichern und das Gewinnen der L-Aminosäure aus
der Kultur.
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Beispiele
der in der vorliegenden Erfindung hergestellten L-Aminosäuren schließen L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Alanin,
L-Arginin, L-Isoleucin, L-Glycin, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, L-Cystein,
L-Serin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Threonin, L-Valin, L-Histidin, L-Phenylalanin,
L-Prolin, L-Methionin, L-Lysin, L-Leucin etc. ein. Ein bevorzugtes
Beispiel ist L-Threonin.
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Im
Allgemeinen besitzen Mikroorganismen Enzyme wie L-Aminosäuredehydrogenase,
L-Aminosäureoxidase
und L-Aminosäuredehydratase,
welche die Aktivität
besitzen, Ammoniak aus L-Aminosäuren
freizusetzen, und Enzyme wie L-Aminosäuretransaminase, welche die
Aktivität
besitzen, Ammoniak von L-Aminosäuren
auf Ketosäuren
zu übertragen,
und können
daher in einem synthetischen Medium wachsen, das eine L-Aminosäure als
einzige Stickstoffquelle in einer derart niedrigen Konzentration
wie 5 mg/ml oder geringer enthält.
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In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung kann die L-Aminosäure-Produktivität durch Verwendung eines Mikroorganismus,
der in der Lage ist, die L-Aminosäure herzustellen
und der nicht in einem synthetischen Medium wachsen kann, das diese
Aminosäure
als einzige Stickstoffquelle in einer Menge von 5 mg/ml oder geringer
enthält,
verbessert werden, wodurch ein industriell effizientes Verfahren
zur Herstellung von L-Aminosäuren
bereitgestellt wird.
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In
der vorliegenden Erfindung kann jeder Mikroorganismus verwendet
werden, solange er in der Lage ist, eine L-Aminosäure herzustellen
und nicht in einem synthetischen Medium wachsen kann, das diese
L-Aminosäure
als einzige Stickstoffquelle in einer Konzentration von 5 mg/ml
oder geringer enthält.
Zum Beispiel können
Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia,
Serratia oder Arthrobacter verwendet werden, die in der Lage sind,
eine L-Aminosäure
herzustellen und nicht in einem synthetischen Medium wachsen können, das
diese L-Aminosäure
als einzige Stickstoffquelle in einer Menge von 5 mg/ml oder geringer
enthält.
Beispiele geeigneter Spezies schließen Corynebacterium glutamicum,
Brevibacterium ammoniagenes, Escherichia coli, Serratia marcescens
und Arthrobacter parraffineus ein. Ein typisches Beispiel für einen
geeigneten Stamm ist Escherichia coli N-9244 THN-1.
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Die
erfindungsgemäßen Mikroorganismen
können
erhalten werden, indem Mikroorganismen, die in der Lage sind, eine
L-Aminosäure
zu produzieren, einer herkömmlichen
Mutationsbehandlung oder Zellfusion, Transduktion oder einem anderen
Verfahren zur Erzeugung rekombinanter DNA unterzogen werden und
dann Mikroorganismen ausgewählt
werden, die nicht in einem synthetischen Medium wachsen können, das
die L-Aminosäure
als einzige Stickstoffquelle in einer Konzentration von 5 mg/ml
oder darunter enthält.
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Die
erfindungsgemäßen Mikroorganismen
können
zusätzlich
Eigenschaften zur Verbesserung der L-Aminosäure-Produktivität besitzen,
zum Beispiel eine auxothrophe Mutation, Arzneistoffresistenz und
Arzneistoffsensitivität.
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Als
synthetisches Medium kann ein Minimalmedium verwendet werden, wenn
der erfindungsgemäße Mikroorganismus
ein prototropher ist. Wenn der erfindungsgemäße Mikroorganismus ein auxotropher
ist, kann eine Medium verwendet werden, das hergestellt wird durch
Zugeben des benötigten
Nährstoffes
zum Minimalmedium.
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Die
Herstellung von L-Aminosäuren
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen kann mit
einem gewöhnlichen
Verfahren zum Züchten
von Bakterien durchgeführt
werden.
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Als
zur Herstellung von L-Aminosäuren
verwendetes Medium kann jedes synthetische und natürliche Medium
verwendet werden, solange es geeigneterweise Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und Spuren von Nährstoffen,
die der verwendete Stamm benötigt,
enthält.
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Beispiele
der Kohlenstoffquellen schließen
Kohlenhydrate wie Glucose, Fructose, Lactose, Melasse, Cellulosehydrolysate,
Rohzuckerhydrolysate und Stärkehydrolysate,
organische Säuren
wie Brenztraubensäure,
Essigsäure,
Fumarsäure, Äpfelsäure und
Milchsäure
und Alkohole wie Glycerin und Ethanol ein.
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Beispiele
der Stickstoffquellen schließen
Ammoniak, verschiedene anorganische Salze (wie Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat), Ammoniumsalze
organischer Säuren,
Amine, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat,
Sojakuchenhydrolysat, verschiedene fermentierte Zellen und deren
verdaute Produkte ein.
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Beispiele
der anorganischen Substanzen schließen Kaliumdihydrogenphosphat,
Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid,
Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumchlorid
und Calciumcarbonat ein.
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Die
Züchtung
wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, zum Beispiel durch Schüttelkultur
oder Spinnerkultur unter Belüftung.
Die Züchtungstemperatur
liegt im Bereich von 20 bis 40°C,
vorzugsweise 28 bis 37°C.
Der pH-Wert des Mediums liegt im Bereich von pH 5 bis 9, vorzugsweise
im Neutralbereich. Die Anpassung des pH-Wertes wird unter Verwendung von Calciumcarbonat,
einer organischen oder anorganischen Säure, einer Alkalilösung, Ammoniak,
einem pH-Puffer etc. durchgeführt.
Normalerweise wird eine L-Aminosäure
in der Kultur durch 1 bis 7 Tage Züchtung gebildet und angereichert.
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Nach
Abschluss der Züchtung
werden Präzipitate
wie Zellen aus der Kultur entfernt und die L-Aminosäure kann
aus der Kultur durch Ionenaustauschchromatographie, Konzentration,
Aussalzen etc. in Kombination gewonnen werden.
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Bestimmte
Ausführungsformen
der Erfindung werden in den folgenden Beispielen veranschaulicht.
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Beispiel 1
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Gewinnung
von Mikroorganismen, die nicht in einem synthetischen Medium wachsen
können,
das eine L-Aminosäure
als einzige Stickstoffquelle in einer Menge von 5 mg/ml oder geringer
enthält.
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Escherichia
coli H-7700, wobei es sich um einen Stamm handelt, der keine Diaminopimelinsäure benötigt und
der aus Escherichia coli H-4581 (FERM BP-1411), der Diaminopimelinsäure benötigt, erhalten
wurde, wurde einer Mutationsbehandlung unter Verwendung von N-Methyl-N'-nitro-N-Nitrosoguanidin
(0,2 mg/ml bei 30°C
für 30
min) gemäß einem
herkömmlichen
Verfahren unterzogen und dann auf einem synthetischen Agar-Plattenmedium
(0,5 % Glucose, 0,3 Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6 % Dinatriumhydrogenphosphat, 0,01
% Magnesiumsulfat, 0,2 % Ammoniumchlorid, 20 mg/l Calciumchlorid,
20 mg/l benötigter
Nährstoff (DL-Methionin)
und 2 % Agar, pH 7,2) ausgestrichen.
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Die
Züchtung
wurde bei 30°C
für 2 bis
6 Tage durchgeführt
und die auf der Platte wachsenden Kolonien (etwa 104)
wurden gepickt und auf synthetischem Agarmedium vermehrt, das anstelle
von Ammoniumchlorid im vorstehenden synthetischen Medium L-Threonin
als einzige Stickstoffquelle in einer Konzentration von 1 mg/ml
bzw. 10 mg/ml enthielt.
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Die
Züchtung
wurde bei 30°C
für 2 Tage
durchgeführt
und es wurden etwa 30 Stämme
erhalten, die nicht auf dem Medium wachsen konnten, das 1 mg/ml
L-Threonin enthielt,
aber auf dem Medium, das 10 mg/ml L-Threonin enthielt.
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Mit
den erhaltenen Stämmen
wurde ein L-Threonin Produktionstest in gleicher Weise wie in Beispiel 3
durchgeführt.
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Ein
Stamm, der eine deutlich verbesserte L-Threonin-Produktivität aufwies,
wurde Escherichia coli H-9244 THN-1 genannt.
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Der
Stamm N-9244 THN-1 wurde am 19. Juni 1997 als FERM BP-5985 unter
dem Budapester Vertrag beim National Institute of Bioscience und
Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt.
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Beispiel 2
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Vergleichender
Test zum Wachstum der Stämme
auf synthetischem Agar-Plattenmedium, das L-Threonin als einzige
Stickstoffquelle enthält.
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Der
Grad des Wachstums der Mutante H-9244 THN-1, die in Beispiel 1 erhalten
wurde, wurde verglichen mit dem des Ausgangsstammes H-7700, wobei
synthetisches Agar-Plattenmedium verwendet wurde, das L-Threonin
als einzige Stickstoffquelle enthielt.
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Jeder
der beiden Stämme,
die für
24 Stunden in einem natürlichen
Medium gezüchtet
worden waren, wurde in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und die resultierende
Suspension wurde auf synthetisches Agar-Plattenmedium, das L-Threonin als einzige
Stickstoffquelle in unterschiedlichen Konzentrationen (1 bis 15
mg/ml) und 20 mg/l DL-Methionin enthielt, welches die benötigte Aminosäure ist,
in einer Zelldichte von 1 bis 10 Zellen/cm2 ausgestrichen.
Die Züchtung
wurde bei 33°C
für 4 Tage
durchgeführt.
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Die
Größen der
Kolonien, die durch die Züchtung
auf dem Medium erschienen, sind in Tabelle 1 gezeigt.
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Der
Stamm H-7700 konnte auf jedem der synthetischen Agarmedien wachsen,
die L-Threonin als einzige Stickstoffquelle enthielten, während der
Stamm H-9244 THN-1 nicht auf allen der synthetischen Agarmedien
wachsen konnte, die L-Threonin als einzige Stickstoffquelle in Konzentrationen
von 5 mg/ml oder geringer enthielten. Tabelle
1
- +:
- Gutes Wachstum (Koloniegröße: 1–3 mm)
- ±:
- Wachstumsfähig (Koloniegröße: ≤ 0,5 mm)
- –:
- Kein Wachstum (Keine
Koloniebildung beobachtet)
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Beispiel 3 Herstellung
von L-Threonin
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Die
Herstellung von L-Threonin unter Verwendung der Mutante H-9244 THN-1,
die in Beispiel 1 erhalten wurde, und deren Ausgangsstamm H-7700
wurde auf folgende Weise durchgeführt.
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Jeder
der Stämme
H-9244 THN-1 und H-7700 wurde in 6 ml eines Saatmediums (2 % Glucose,
1 % Pepton, 1 % Hefeextrakt, 0,25 % NaCl, 130 mg/l DL-Methionin
und 1 % Calciumcarbonat, pH 7,0) in einem großen Teströhrchen inokkuliert, es folgte
eine Schüttelkultur
bei 30°C
für 16
Stunden.
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Dann
wurden 0,1 ml der erhaltenen Saatkultur in 5 ml eines Herstellungsmediums
(6 % Glucose, 0,2 % Maisquellwasser, 1,6 % Ammoniumsulfat, 0,1 %
Kaliumdihydrogenphosphat, 100 mg/l DL-Methionin, 4 % Magnesiumphosphat
und 1 Calciumcarbonat, pH 7,0) in einem großen Teströhrchen inokkuliert, es folgte
eine Schüttelkultur
bei 30°C
für 48
Stunden.
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Nachdem
die Züchtung
abgeschlossen war, wurde die Menge an in der Kultur angereichertem
L-Threonin durch Hochleistungsflüssigchromatographie
bestimmt.
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
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Die
L-Threonin-Produktivität
des Stammes H-9244 THN-1 war verglichen mit der des Ausgangsstammes
H-7700 signifikant verbessert.
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