JPH119295A - 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 医薬品、食品および飼料添加物などとして有
用なＬ−アミノ酸の工業的製造法を提供する。 【構成】 Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、該Ｌ−
アミノ酸を唯一の窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含有す
る合成培地では生育のできない微生物を栄養培地に培養
し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物
よりＬ−アミノ酸を採取することによりＬ−アミノ酸を
製造する。
用なＬ−アミノ酸の工業的製造法を提供する。 【構成】 Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、該Ｌ−
アミノ酸を唯一の窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含有す
る合成培地では生育のできない微生物を栄養培地に培養
し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物
よりＬ−アミノ酸を採取することによりＬ−アミノ酸を
製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は発酵法によるＬ−ア
ミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、医薬品、食
品および飼料添加物などに用いられている。
ミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、医薬品、食
品および飼料添加物などに用いられている。
【０００２】
【従来の技術】糖から直接Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させ
る直接発酵法としては、コリネバクテリウム属、ブレビ
バクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属、アース
ロバクター属などの微生物の野生株から誘導した突然変
異株を用いる方法が知られている。例えばＬ−アミノ酸
生産性変異株としては、アミノ酸等の栄養要求性を有し
た菌株（特公昭５６-１００３７）、アミノ酸のアナロ
グやビタミン等の耐性変異を有した菌株（特開昭５６-
１３４９９３、特開昭６２-４４１９３）、栄養要求性
変異とアミノ酸のアナログ耐性変異を共有した菌株（特
開昭５０-３１０９３、特開昭５６-１３４９９３）、分
解能の低下した菌株（特開昭６３-２７３４８７、特公
昭５２-４８１９５）、あるいはアミノアシルｔ−ＲＮ
Ａ合成酵素に基質親和性が減少した変異を有する菌株
（特開平４-３３０２７５）等が知られている。さらに
アミノ酸の生合成に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
で形質転換された菌株（特開昭５８-８９３、特開昭６
０-１２９９５、特開昭６０-３０６９３、特開昭６１-
１９５６９５、特開平２-４５８、特開平２-４２９８
８）も知られている。
る直接発酵法としては、コリネバクテリウム属、ブレビ
バクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属、アース
ロバクター属などの微生物の野生株から誘導した突然変
異株を用いる方法が知られている。例えばＬ−アミノ酸
生産性変異株としては、アミノ酸等の栄養要求性を有し
た菌株（特公昭５６-１００３７）、アミノ酸のアナロ
グやビタミン等の耐性変異を有した菌株（特開昭５６-
１３４９９３、特開昭６２-４４１９３）、栄養要求性
変異とアミノ酸のアナログ耐性変異を共有した菌株（特
開昭５０-３１０９３、特開昭５６-１３４９９３）、分
解能の低下した菌株（特開昭６３-２７３４８７、特公
昭５２-４８１９５）、あるいはアミノアシルｔ−ＲＮ
Ａ合成酵素に基質親和性が減少した変異を有する菌株
（特開平４-３３０２７５）等が知られている。さらに
アミノ酸の生合成に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
で形質転換された菌株（特開昭５８-８９３、特開昭６
０-１２９９５、特開昭６０-３０６９３、特開昭６１-
１９５６９５、特開平２-４５８、特開平２-４２９８
８）も知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】近年、Ｌ−アミノ酸の
医薬、食品、飼料等への需要の増大によって、益々その
製造法の改善が望まれている。従って、本発明の目的
は、医薬品、食品および飼料添加物等として有用なＬ−
アミノ酸の工業的に効率のよい製造方法を提供すること
にある。
医薬、食品、飼料等への需要の増大によって、益々その
製造法の改善が望まれている。従って、本発明の目的
は、医薬品、食品および飼料添加物等として有用なＬ−
アミノ酸の工業的に効率のよい製造方法を提供すること
にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、Ｌ−ア
ミノ酸を生産する能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の
窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生
育のできない微生物、および該微生物を栄養培地に培養
し、培養物中に該Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養
物よりＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−ア
ミノ酸の製造法を提供することができる。
ミノ酸を生産する能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の
窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生
育のできない微生物、および該微生物を栄養培地に培養
し、培養物中に該Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養
物よりＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−ア
ミノ酸の製造法を提供することができる。
【０００５】一般に微生物は、Ｌ−アミノ酸からアンモ
ニアを遊離させる酵素としてＬ−アミノ酸デヒドロゲナ
ーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒド
ラターゼ等を、またＬ−アミノ酸からアンモニアを転移
させる酵素としてＬ−アミノ酸トランスアミナーゼ等を
有しているため、Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として含
む合成培地で生育可能であり、５ｍｇ／ｍｌ以下の低濃
度の窒素源でも生育することができる。
ニアを遊離させる酵素としてＬ−アミノ酸デヒドロゲナ
ーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒド
ラターゼ等を、またＬ−アミノ酸からアンモニアを転移
させる酵素としてＬ−アミノ酸トランスアミナーゼ等を
有しているため、Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として含
む合成培地で生育可能であり、５ｍｇ／ｍｌ以下の低濃
度の窒素源でも生育することができる。
【０００６】本発明の微生物として、Ｌ−アミノ酸を生
産する能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源とし
て５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできな
い微生物であればいずれも用いることができ、例えば、
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェ
リヒア属、セラチア属およびアースロバクター属から選
ばれる属に属する微生物であり、Ｌ−アミノ酸を生産す
る能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５
ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできない微
生物をあげることができる。具体的には、エシェリヒア
・コリH-9244 THN-1株をあげることができる。
産する能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源とし
て５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできな
い微生物であればいずれも用いることができ、例えば、
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェ
リヒア属、セラチア属およびアースロバクター属から選
ばれる属に属する微生物であり、Ｌ−アミノ酸を生産す
る能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５
ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできない微
生物をあげることができる。具体的には、エシェリヒア
・コリH-9244 THN-1株をあげることができる。
【０００７】本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸を生産す
る能力を有する微生物に通常の変異処理、あるいは細胞
融合法、形質導入法、その他の遺伝子組換え技法を施
し、５ｍｇ／ｍｌ以下の少量のＬ−アミノ酸を唯一の窒
素源とする合成培地では生育できない微生物を選択する
ことにより取得することができる。本発明の微生物は、
さらに、Ｌ−アミノ酸生産性を向上させる他の性質（例
えば、栄養要求性変異、薬剤耐性、薬剤感受性等）を合
わせ持っていても良い。
る能力を有する微生物に通常の変異処理、あるいは細胞
融合法、形質導入法、その他の遺伝子組換え技法を施
し、５ｍｇ／ｍｌ以下の少量のＬ−アミノ酸を唯一の窒
素源とする合成培地では生育できない微生物を選択する
ことにより取得することができる。本発明の微生物は、
さらに、Ｌ−アミノ酸生産性を向上させる他の性質（例
えば、栄養要求性変異、薬剤耐性、薬剤感受性等）を合
わせ持っていても良い。
【０００８】合成培地として、本発明の微生物が栄養要
求性を持たない場合には最少培地を、栄養要求性を持つ
場合には該最少培地に栄養要求物質を添加した培地を合
成培地として用いることができる。本発明の微生物を用
いたＬ−アミノ酸の生産は、通常の細菌培養法にて実施
することができる。
求性を持たない場合には最少培地を、栄養要求性を持つ
場合には該最少培地に栄養要求物質を添加した培地を合
成培地として用いることができる。本発明の微生物を用
いたＬ−アミノ酸の生産は、通常の細菌培養法にて実施
することができる。
【０００９】Ｌ−アミノ酸の生産に用いる培地として
は、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要と
する微量の栄養素を程よく含有するものならば、合成培
地または天然培地いずれも使用可能である。炭素源とし
ては、グルコース、フラクトース、ラクトース、糖蜜、
セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱粉加水分解
物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、リン
ゴ酸、乳酸などの有機酸、グリセリン、エタノールなど
のアルコールなどが用いられる。
は、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要と
する微量の栄養素を程よく含有するものならば、合成培
地または天然培地いずれも使用可能である。炭素源とし
ては、グルコース、フラクトース、ラクトース、糖蜜、
セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱粉加水分解
物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、リン
ゴ酸、乳酸などの有機酸、グリセリン、エタノールなど
のアルコールなどが用いられる。
【００１０】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウムなどの各種無機塩類、有機酸のアンモニウ
ム塩、アミン類、ペプトン、肉エキス、コーンスチープ
リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種
発酵菌体およびその消化物などが用いられる。無機物と
しては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リ
ン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどが用いられ
る。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウムなどの各種無機塩類、有機酸のアンモニウ
ム塩、アミン類、ペプトン、肉エキス、コーンスチープ
リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種
発酵菌体およびその消化物などが用いられる。無機物と
しては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リ
ン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどが用いられ
る。
【００１１】培養は、振盪培養または通気撹拌培養など
の好気的条件下にて行われ、培養温度は２０〜４０℃
で、好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培地のｐＨ
はｐＨ５〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保持す
る。培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、無機あるいは有
機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などに
よって行う。通常１〜７日間の培養により、培養液中に
Ｌ−アミノ酸が生成蓄積する。
の好気的条件下にて行われ、培養温度は２０〜４０℃
で、好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培地のｐＨ
はｐＨ５〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保持す
る。培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、無機あるいは有
機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などに
よって行う。通常１〜７日間の培養により、培養液中に
Ｌ−アミノ酸が生成蓄積する。
【００１２】培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物
を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併
用することにより、培養液からＬ−アミノ酸を回収する
ことができる。
を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併
用することにより、培養液からＬ−アミノ酸を回収する
ことができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に本発明の実施例を示す。
【００１４】実施例１ Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源と
して５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のでき
ない微生物の取得 ジアミノピメリン酸に対する栄養要求性を有するエシェ
リヒア・コリＨ−４５８１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４１
１）より誘導したジアミノピメリン酸非要求株Ｈ−７７
００に、常法に従って、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジンによる変異処理（０．２ｍｇ／ｍ
ｌ、３０℃、３０分間）を施した後、合成寒天平板培地
〔グルコース ０．５％、リン酸一カリウム ０．３％、
リン酸二ナトリウム ０．６％、硫酸マグネシウム ０．
０１％、塩化アンモニウム ０．２％、塩化カルシウム
２０ｍｇ／ｌ、栄養要求物質（ＤＬ−メチオニン）２０
ｍｇ／ｌ、寒天 ２％、ｐＨ７．２〕に塗布した。
して５ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のでき
ない微生物の取得 ジアミノピメリン酸に対する栄養要求性を有するエシェ
リヒア・コリＨ−４５８１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４１
１）より誘導したジアミノピメリン酸非要求株Ｈ−７７
００に、常法に従って、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジンによる変異処理（０．２ｍｇ／ｍ
ｌ、３０℃、３０分間）を施した後、合成寒天平板培地
〔グルコース ０．５％、リン酸一カリウム ０．３％、
リン酸二ナトリウム ０．６％、硫酸マグネシウム ０．
０１％、塩化アンモニウム ０．２％、塩化カルシウム
２０ｍｇ／ｌ、栄養要求物質（ＤＬ−メチオニン）２０
ｍｇ／ｌ、寒天 ２％、ｐＨ７．２〕に塗布した。
【００１５】３０℃で２〜６日間培養し、生育してきた
コロニー約１０4個を釣菌分離し、上記合成培地中の塩
化アンモニウムの代わりにＬ−スレオニンを唯一の窒素
源として１ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で添
加した合成寒天培地上にそれぞれレプリカした。３０℃
で２日培養し、前者の培地上では生育できないが後者の
培地上では生育する株を約３０株取得した。
コロニー約１０4個を釣菌分離し、上記合成培地中の塩
化アンモニウムの代わりにＬ−スレオニンを唯一の窒素
源として１ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で添
加した合成寒天培地上にそれぞれレプリカした。３０℃
で２日培養し、前者の培地上では生育できないが後者の
培地上では生育する株を約３０株取得した。
【００１６】これら菌株について、実施例３と同様な方
法によりＬ−スレオニンの生産試験を行った。特にＬ−
スレオニンの生産性の向上した株をエシェリヒア・コリ
H-9244 THN-1と命名した。該H-9244 THN-1株はブダペス
ト条約に基づいて平成９年６月１９日付けで、ＦＥＲＭ
ＢＰ−５９８５として工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されている。
法によりＬ−スレオニンの生産試験を行った。特にＬ−
スレオニンの生産性の向上した株をエシェリヒア・コリ
H-9244 THN-1と命名した。該H-9244 THN-1株はブダペス
ト条約に基づいて平成９年６月１９日付けで、ＦＥＲＭ
ＢＰ−５９８５として工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されている。
【００１７】実施例２ Ｌ−スレオニンを唯一の窒素源
とする合成寒天平板培地での生育比較試験 実施例１で取得した変異株H-9244 THN-1について、Ｌ−
スレオニンを唯一の窒素源とする合成寒天平板培地での
生育度を親株Ｈ−７７００と比較した。窒素源としてＬ
−スレオニンを１〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、かつ
要求アミノ酸であるＤＬ−メチオニンを２０ｍｇ／ｌ添
加した合成寒天平板培地上に、天然培地で２４時間培養
した各菌体を生理食塩水に懸濁して１〜１０ｃｅｌｌｓ
／ｃｍ2になるように塗布し、３３℃、４日間培養し
た。
とする合成寒天平板培地での生育比較試験 実施例１で取得した変異株H-9244 THN-1について、Ｌ−
スレオニンを唯一の窒素源とする合成寒天平板培地での
生育度を親株Ｈ−７７００と比較した。窒素源としてＬ
−スレオニンを１〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、かつ
要求アミノ酸であるＤＬ−メチオニンを２０ｍｇ／ｌ添
加した合成寒天平板培地上に、天然培地で２４時間培養
した各菌体を生理食塩水に懸濁して１〜１０ｃｅｌｌｓ
／ｃｍ2になるように塗布し、３３℃、４日間培養し
た。
【００１８】該培養により培地上に出現したコロニーの
大きさを第１表に示した。Ｈ−７７００株は窒素源が存
在するいずれの培地上で生育可能であったが、H-9244 T
HN-1株はＬ−スレオニンを唯一の窒素源として５ｍｇ／
ｍｌ以下の濃度を含む合成寒天培地上では全く生育でき
なかった。
大きさを第１表に示した。Ｈ−７７００株は窒素源が存
在するいずれの培地上で生育可能であったが、H-9244 T
HN-1株はＬ−スレオニンを唯一の窒素源として５ｍｇ／
ｍｌ以下の濃度を含む合成寒天培地上では全く生育でき
なかった。
【００１９】
【表１】
【００２０】実施例３ Ｌ−スレオニンの製造 実施例１で取得した変異株H-9244 THN-1または親株Ｈ−
７７００を用いたＬ−スレオニンの製造を以下の方法で
行った。H-9244 THN-1またはＨ−７７００株をそれぞれ
６ｍｌの種培地（グルコース２％、ペプトン １％、酵
母エキス １％、ＮａＣｌ ０．２５％、ＤＬ−メチオニ
ン １３０ｍｇ／ｌ、炭酸カルシウム １％、ｐＨ７．
０）を含む太型試験管に接種して、３０℃で１６時間振
盪培養した。
７７００を用いたＬ−スレオニンの製造を以下の方法で
行った。H-9244 THN-1またはＨ−７７００株をそれぞれ
６ｍｌの種培地（グルコース２％、ペプトン １％、酵
母エキス １％、ＮａＣｌ ０．２５％、ＤＬ−メチオニ
ン １３０ｍｇ／ｌ、炭酸カルシウム １％、ｐＨ７．
０）を含む太型試験管に接種して、３０℃で１６時間振
盪培養した。
【００２１】得られた種培養液０．１ｍｌを、それぞれ
５ｍｌの生産培地（グルコース ６％、コーンスチープ
リカー ０．２％、硫酸アンモニウム １．６％、リン酸
一カリウム ０．１％、ＤＬ−メチオニン １００ｍｇ／
ｌ、リン酸マグネシウム ４％、炭酸カルシウム １％、
ｐＨ７．０）を含む太型試験管に接種して、３０℃で４
８時間振盪培養した。
５ｍｌの生産培地（グルコース ６％、コーンスチープ
リカー ０．２％、硫酸アンモニウム １．６％、リン酸
一カリウム ０．１％、ＤＬ−メチオニン １００ｍｇ／
ｌ、リン酸マグネシウム ４％、炭酸カルシウム １％、
ｐＨ７．０）を含む太型試験管に接種して、３０℃で４
８時間振盪培養した。
【００２２】培養後、培養液中のＬ−スレオニンの蓄積
量を、高速液体クロマトグラフィー法により定量した。
結果を第２表に示した。親株Ｈ−７７００に比べ、H-92
44 THN-1株のＬ−スレオニン生産性は著しく向上してい
た。
量を、高速液体クロマトグラフィー法により定量した。
結果を第２表に示した。親株Ｈ−７７００に比べ、H-92
44 THN-1株のＬ−スレオニン生産性は著しく向上してい
た。
【００２３】
【表２】
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−アミノ酸を生産す
る能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５
ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできない微
生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上
させることができ、これによりＬ−アミノ酸を工業的に
効率よく製造できる。
る能力を有し、該Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５
ｍｇ／ｍｌ以下含有する合成培地では生育のできない微
生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上
させることができ、これによりＬ−アミノ酸を工業的に
効率よく製造できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、該
Ｌ−アミノ酸を唯一の窒素源として５ｍｇ／ｍｌ以下含
有する合成培地では生育のできない微生物。 - 【請求項２】 微生物が、コリネバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属および
アースロバクター属から選ばれる属に属する微生物であ
る、請求項１記載の微生物。 - 【請求項３】 微生物が、エシェリヒア・コリH-9244 T
HN-1株である、請求項１または２記載の微生物。 - 【請求項４】 請求項１、２または３記載の微生物を栄
養培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積さ
せ、該培養物より該Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴
とするＬ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項５】 Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、
請求項４記載の製造法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16571697A JP3966583B2 (ja) | 1997-06-23 | 1997-06-23 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| US09/099,036 US5919670A (en) | 1997-06-23 | 1998-06-18 | Process for producing L-amino acids by fermentation |
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