JPH0732711B2

JPH0732711B2 - Ｌ−イソロイシンの製造法

Info

Publication number: JPH0732711B2
Application number: JP58138775A
Authority: JP
Inventors: 瞭一勝亦; 雅子原; 徹夫岡
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1983-07-29
Filing date: 1983-07-29
Publication date: 1995-04-12
Anticipated expiration: 2010-04-12
Also published as: IT8467751A0; CA1228039A; IL72508A0; ES534701A0; IT8467751A1; MX7641E; IT1179025B; IL72508A; JPS6030693A; ES8506094A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明はエッシェリヒア属に属する微生物のアスパルト
キナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキ
ナーゼおよびスレオニンシンターゼをコードする遺伝子
を含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNAを保有
し、かつＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を
培地中に培養し、培養物中にＬ−イソロイシンを生成蓄
積せしめ、該培養物からＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法に関する。

コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などのい
わゆるグルタミン酸生産菌により直接発酵法でＬ−イソ
ロイシンを生産する方法については野生株から誘導され
たＬ−イソロイシン生産性の突然変異株を用いる方法が
知られている。Ｌ−イソロイシン生産性変異株として
は、たとえば特公昭47−38995,特公昭51−6237,特公昭6
54−32070などに記載されているようにアミノ酸の栄養
要求性変異やアミノ酸のアナログに対する耐性変異ある
いはそれらの変異を共有した菌株が知られている。

本発明者らはコリネバクテリウム属あるいはブレビバク
テリウム属の細菌を用いるＬ−イソロイシン生産法にお
いて、従来のＬ−イソロイシン生産性変異の付与による
育種とは全く異なる組換えDNA技法によるＬ−イソロイ
シンの生産方法について研究を重ねた結果Ｌ−イソロイ
シンの前駆体であるスレオニンの生合成に係わる遺伝子
とこれら菌種のベクタープラスミドとの組換え体を保有
せしめた菌株が組換え体非保有株に優るＬ−イソロイシ
ン生産能を有することを見出し本発明を完成するに至っ
た。

コリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属に
属するＬ−イソロイシン非生産性菌株にスレオニン生合
成に係わる遺伝子を含む組換え体DNAを導入したとき、
該菌がＬ−イソロイシン生産菌株となり、また既にＬ−
イソロイシン生産性を有する菌株に導入したときにもＬ
−イソロイシン生産性が向上することについては、本発
明者らが初めて見出した知見である。特回昭58−893に
は、イソロイシンアンタゴニスト耐性に関与する染色体
遺伝子領域が組み込まれたコリネバクテリウム属，ブレ
ビバクテリウム属菌によるＬ−イソロイシンの製造法に
ついて記載があるが、本発明に係る遺伝子とは異なるも
のである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明によればエッシェリヒア属に属する微生物のアス
パルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセ
リンキナーゼおよびスレオニンシンターゼをコードする
遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNAを
保有し、かつＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生
物を培地中に培養し、培養物中にＬ−イソロイシンを生
成蓄積せしめ、該培養物からＬ−イソロイシンを採取す
ることによりＬ−イソロイシンを製造できる。

宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全て用いる
ことができるが、好適には下記の菌株が用いられる。

コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 コリネハグテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 ブレビバクテリウム・ディバリカツム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラブム TCC14067 ブレビバクテリウム・イマリオフィリウム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 宿主としては、イソロイシン生産能を有しない野生株を
用いることもできるが、既にイソロイシン生産性を有す
る菌株を用いることもできる。イソロイシン生産性を有
する菌株としては、アミノ酸要求性変異株，アミノ酸ア
ナログ耐性変異株など公知の菌株が適用できる。

アスパラギン酸からスレオニン酸に到るスレオニン生合
成に係る酵素としては、アスパルトキナーゼ，アスパラ
ギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ，ホモセリンデ
ヒドロゲナーゼ，ホモセリンキナーゼおよびスレオニン
シンターゼがある。〔Agr.Biol.Chem.,38,993（197
4）〕。

本発明においては、エッシェリヒア属に属する微生物の
アスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホ
モセリンキナーゼおよびスレオニンシンターゼをコード
するスレオニン生合成に係る遺伝子が望ましく、とくに
該微生物から誘導されたスレオニンまたはイソロイシン
生産変異株由来の遺伝子が好適である。具体的に好適な
一例としては、大腸菌Ｋ−12のスレオニン・オペロンが
あげられる。

該DNAを組込む為のベクターとしては、本願発明者らの
開発に係る、pCG1,pCG2,pCG4,pCG11,pCE54およびpCB101
などが好適に用いられ、これらベクターの製造法は特開
昭57−134500,特開昭57−183799,特開昭58−35197およ
び特開昭58−105999に記載がある。

スレオニン生合成に係る酵素の供与体DNAとベクターDNA
の組換え体DNAは、試験管内で両DNAを制限酵素で切断し
た後DNAリガーゼで再連結反応し、この結合反応物を用
いてスレオニン生合成にあずかる酵素をコードする遺伝
子が欠損したコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属の変異株を形質転換し、欠損形質が相補された
形質転換株を選択する組換えDNA技法によって得ること
ができる。この組換えDNA技法は特開昭57−186492およ
び特開昭657−186489に記載の方法に従って行うことが
できる。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体DNAを選択する代わりに、例えば大腸菌
のごとく既に遺伝子組換え技法が確立している宿主−ベ
クター系を用いることもできる。すなわち、スレオニン
生合成に係る酵素の供与体DNAとベクターDNAの試験管内
結合反応物を用い、スレオニン生合成にあずかる酵素を
コードする遺伝子が欠損した大腸菌の変異株を形質転換
し、欠損形質が相補された形質転換株を選択し、この形
質転換株からクローン化したDNAとコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属菌のベクターDNAとを試
験管内で制限酵素で切断した後、DNAリガーゼ再結合反
応させ、この結合反応物を用いて、スレオニン合成にあ
ずかる酵素をコードする遺伝子が欠損したコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属の変異株を形質転
換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択すること
によっても同様に組換え体DNAを取得することができ
る。

本発明で用いるスレオニン生合成に係わる遺伝子を含む
DNAの具体的に好適な例として大腸菌Ｋ−12株のスレオ
ニン・オペロンが挙げられる。大腸菌のスレオニン・オ
ペロンのDNAを含む組換え体プラスミドpEthr1を例にあ
げて本発明をさらに詳細に説明する。

大腸菌のスレオニンオペロンを含むDNA断片は大腸菌の
宿主・ベクター形を用いて予めクローン化することがで
きる。宿主大腸菌で遺伝子をクローン化する方法は例え
ばMethods in Enzymology,68巻,Ray Wu（Ed）Academic
Press New York（1979年）に記載されている。具体的に
は下記のごとく行う。

野生型スレオニンオペロンを有する大腸菌から抽出した
染色体DNAを大腸菌ベクタープラスミドpGA22を制限酵素
Hind IIIで消化した後、T4ファージリガーゼを作用させ
る。この混成液を用いて公知の方法により大腸菌Ｋ−12
株亜株GT−３（３種類のアスパルトキナーゼを欠損した
変異株，ホモセリン・ジアミノピメリン酸要求性）を形
質転換し、ジアミノピメリン酸とpGA22の選択マーカー
であるカナマイシンを含む最小培地上で生育する形質転
換株を選択する。出現した形質転換株の保有するプラス
ミドはその培養菌体から常法により分離でき、ついで各
種制限酵素で処理して生成するDNA断片をアガロースゲ
ル電気泳動で解析することにより、その構造を知ること
ができる。こうして得られたプラスミドの一つが第１図
に示す構造のpGH2である。すでに大腸菌のスレオニオペ
ロンを含むDNA断片にはクローン化されており、制限酵
素切断部位も位置づけられている〔Cossart,P.et al.:M
olec.Gen.Genet,175,39（1979）参照〕。pGH2はそれに
合致するDNA断片を有しており、スレオニンオペロンを
含むことが確かである。GT−３株のアスパルトキナーゼ
欠損はpGH2のスレオニン・オペロン上に存在するアスパ
ルトキナーゼによって相補され、ホモセリンおよびジア
ミノピメリン酸非要求性となる。

pEthr1はpGH2とコリネバクテリウム属およびブレビバク
テリウム属のベクタープラスミドpCG11の組換え体とし
取得できる。pCG11は、本発明者らが先に発明し、特許
出願（特開昭57−134500）されたプラスミドで、コリネ
バクテリウム・グルタミクム225−57株（ATCC31808,FER
M−P5865）から分離されたプラスミドpCG1における制限
酵素Bgl IIのただ一つの切断部位にコリネバクテリウム
・グルタミクム225−250株（ATCC31830,FERM−P5939）
から分離されたプラスミドpCG4のストレプトマイシンお
よび／またはスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む制限
酵素BamH I断片を両者の同一接着末端を利用して結合せ
しめたプラスミドである。pCG11はそれを保有するコリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC39022の培養菌株か
ら本発明者らが、特開昭57−186492に開示した方法で濃
縮単離する。常法によりpGH2をBamH IでpCG11をBgl II
で消化した後、混合してT4リガーゼを作用させる。次に
このDNA混成液を用いてコリネバクテリウム・グルタミ
クムLA201（ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損変
異株）を形質転換する。コリネバクテリウム・グルタミ
クムLA201はコリネバクテリウム・グルタミクムATCC318
33（特開昭57−186492）由来のリゾチーム感受性変異株
Ｌ−22株から通常用いられる変異処理により誘導された
ホモセリン（あるいはスレオニンとメチオニン），ロイ
シン要求性の変異株であり、そのホモセリン要求性はス
レオニン生合成経路上のアスパルトセミアルデヒドから
ホモセリンに代謝するホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝
子の欠損に基づいている。

形質転換は、本発明者らが先に発明し特許出願されたコ
リネバクテリウ属あるいはブレビバクテリウム属菌種の
プロトプラストを使用する形質転換法（特開昭57−1864
92および特開昭57−186489、具体的には実施例に示す）
により実施することができる。本法を用い、コリネバク
テリウム・グルタミクムLA201株のプロトプラストを形
質転換後、一旦、非選択的に再生培地上で正常細胞に復
帰増殖させる。再生菌をかき厚め、滅菌した生理的食塩
水で洗滌後、ロイシンを補充した最少培地に再塗布し、
生育するコロニーを分離する。

こうして得られたホモセリン非要求株の中にはpGH2由来
のカナマイシン耐性形質およびpCG11由来のスペクチノ
マイシン耐性形質を同時に獲得しているものがある。こ
れらの形質転換株の保有するプラスミドDNAは前記pCG11
の単離と同様な方法で培養菌体から単離精製でき、それ
らを各種制限酵素とアガロースゲル電気泳動で解析する
ことにより構造を知ることができる。形質転換株の一株
から得られたプラスミドがpEthr1であり、その制限酵素
切断地図とその作製工程を第１図に示す。pEthr1はpGH2
のスレオニンオペロンを含むBamH I切断片がpCG11に組
み込まれたプラスミドであることが明らかである。

別の形質転換株からはpCG11に対するスレオニンオペロ
ン含有BamH I切断片がpEthr1とは逆向きのプラスミドが
取得される。いずれの組み換え体プラスミドを用いて再
形質転換してもコリネバクテリウム・グルタミクムLA20
1はカナマイシンおよびスペクチノマイシン耐性形質と
連関して、ホモセリン要求性が相補され、それらの形質
転換株は各種制限酵素切断部位で特徴づけられる供与プ
ラスミドを保有することが確かめられる。

ホモセリン要求性の相機能は組換え体プラスミドの有す
る大腸菌スレオニン・オペロン上に位置する大腸菌のホ
モセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子の形質発現に由来す
る。大腸菌スレオニン・オペロンはアスパルトキナー
ゼ，ホモセリンデヒドロゲナーゼ，ホモセリンキナーゼ
およびスレオニンシンターゼの遺伝子をコードし、それ
らは一つの転写単位として転写される〔Theze,J.and I.
Saint−Girons:J.Bacteriol.,118,990（1974）参照〕こ
とが知られており、その全遺伝子の発現機能は第１図の
pGH2における目盛約5.4KbのHind III部位と目盛約11.3K
bのBamH I部位の間の領域に存在することが明らかにさ
れている〔Cossart,P.et al.:Molec.Gen.Genet.,175,39
（1979）参照〕。従ってpEthr1は全遺伝子の発現機能を
保持しており、それを保有するコリネバクテリウム・グ
ルタミクム内では単にホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝
子だけでなく、アスパルトキナーゼ，ホモセリンキナー
ゼおよびスレオニンシンターゼ遺伝子も形質発現するこ
とは確かである。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
しpEthr1を保有するＬ−イソロイシン生産菌は前記と同
様にpEthr1を用いてコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌のプロトプラストを形質転換し、pEth
r1の有するスペクチノマイシンおよび／またはストレプ
トマイシン耐性マーカーで選択した形質転換株として得
られる。形質転換株がpEthr1を保有していることは、そ
れから抽出単離したプラスミドの構造を前記のごとく各
種制限酵素とアガロースゲル電気泳動で解析することに
よって確認できる。具体的に作製したＬ−イソロイシン
生産株としてコリネバクテリウム・グルタミクムK40（F
ERM Ｐ−7160）（FERM BP−455）とブレビバクテリウ
ム・フラブムATCC14067のpEthr1保有株をあげることが
できる（実施例参照）。コリネバクテリウム・グルタミ
クムK40は、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC318
33からＳ−（２−アミノエチル）−システイン耐性変異
株として誘導されたＬ−イソロイシン生産性菌株で、そ
のpEthr1保有株K41（FERM Ｐ−7161）（FERM BP−45
6）およびブレビバクテリウム・フラブムATCC14067のpE
thr1保有株K42（FERM BP−355）とともに、工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている。

pEthr1保有形質転換株によＬ−イソロイシン生産は、従
来の発酵法によるＬ−イソロイシン製造に用いられる培
養方法により行うことができる。すなわち、該形質転換
株を炭素源，窒素源，無機物，アミノ酸，ビタミンなど
を含有する通常の培地中、好気的条件下、温度,pHなど
を調節しつつ培養を行えば、培養物中にイソロイシンが
精製蓄積するので、これを採取する。

炭素源としてはグルコース，グリセロール，フラクトー
ス，シュークロース，マルトース，マンノース，澱粉，
澱粉加水分解液，糖蜜などの種々の炭水化物、ポリアル
コール，ピルビン酸，フマール酸，乳酸，酢酸などの各
種有機酸が使用できる。更に菌の資化性によって、炭化
水素，アルコール類なども用いうる。とくに廃糖蜜は好
適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム，
硫酸アンモニウム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン,NZ−アミ
ン，肉エキス，酵母エキス，コーン・スチープ・リカ
ー，カゼイン加水分解物，フィッシュミールあるいはそ
の消化物，脱脂大豆粕あるいはその消化物，蛹加水分解
物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能であ
る。

さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム，燐酸第
二水素カリウム，硫酸アンモニウム，塩化アンモニウ
ム，硫酸マグネシウム，塩化ナトリウム，硫酸第一鉄，
硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。微
生物の生育に必要とするビタミン，アミノ酸源などは、
前記したような他の培地成分に従って培地に供給されれ
ば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
養中の培地のpHは中性付近に維持することが望ましい。
培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−イソロイシン
が蓄積する。

培養終了後、菌体を除去して活性炭処理，イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−イソロイシン
を回収する。

かくしてpEthr1を保有せしめたコリネバクテリウム属お
よびブレビバクテリウム属菌株を用いることにより、非
保有株に較べ高い収率でＬ−イソロイシンを生産するこ
とができる。

本発明の有用性は、スレオニン生合成に係わる遺伝子と
コリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌
種のベクターDNAとを形質発現できる形で組換えた組換
え体DNAをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属菌種に導入すればＬ−イソロイシン生産能を付与
あるいは強化できる点にある。本願明細書では大腸菌の
スレオニン・オペロンを用いる例を示したが、代わりに
他の生物のスレオニン生合成に係わる遺伝子を用いても
目的が達成される。それゆえ、スレオニン生合成に係わ
る遺伝子は本明細書で例示した大腸菌のスレオニン・オ
ペロンに限定されるものではない。またベクタープラス
ミドは組換え体として連結されたスレオニン生合成に係
わる遺伝子を安定に遺伝せしめるために、その自律複製
能を提供しているにすぎない。従って、本明細書に例示
したpCG11に限らずコリネバクテリウム属あるいはブレ
ビバクテリウム属で自律複製できるプラスミドも本願発
明方法のプラスミドに包括される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業上の重要性から、各研究者により、種々の菌名
が付されており、属名までも、コリネバクテリウム属あ
るいはブレビバクテリウム属など、種々である。しかし
ながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やDNA
の塩基組成が画一的であることから、同一の菌種である
ことが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌種間
には、70〜80％以上のDNAの相同性があることが明らか
にされ、非常に近縁な微生物であることが明白である。

〔Komatsu Y.:Report of the Fermentative Research I
nstitute,No.55,1（1980）およびSuzuki,K.,Kaneko,T.,
and Komagata,K.:Int.J Syst.Baoteriol.,31,131（198
1）参照〕。

本明細書では、コリネバクテリウム・グルタミクムK40
とブレビバクテリウム・フラブムATCC14067にスレオニ
ン合成に係わる遺伝子の組換え体を導入し、その遺伝子
の形質発現に基づくＬ−イソロイシン生産性の向上につ
いて例示したが、上記の事実を踏まえればグルタミン酸
生産菌全般での効果が容易に類推される。その効果の有
無は組換え体DNAがグルタミン酸生産菌全般で自律的に
複製し、スレオニン合成に係わる遺伝子が形質発現でき
るか否かに係わり、グルタミン酸生産菌間のDNA相同性
などにおける若干の相違は何ら関係ない。しかるにこれ
らの菌種がプラスミドの複製と遺伝子発現に係わる機能
を等しく保持していることは、本発明者らが先に特許出
願（特開明57−183799）したコリネバクテリウム・グル
タミクム225−250株から分離され、スペクチノマイシン
および／またはストレプトマイシン耐性遺伝子を有する
プラスミドpCG4がコリネバクテリウム属およびブレビバ
クテリウム属菌種などグルタミン酸生産菌内で同じく複
製でき、またその耐性遺伝子が発現される（特開昭57−
186492）ことから明らかである。従って、本発明のスレ
オニン生合成に係わる遺伝子を含む組換え体DNAを導入
することによるＬ−イソロイシン生産菌の作製法を適用
し得る菌種は、コリネバクテリウム・グルタミクムK40
およびブレビバクテリウム・フラブムATCC14067に限ら
ずコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌
種を含むグルタミン酸生産菌全てが含まれる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例1. （１）大腸菌スレオニン・オペロン含有DNA断片のクロ
ーン化クローン化は大腸菌の宿主ベクター系にて実施する。ベ
クターとして使用したpGA22は本プラスミドを作製した
アンらの方法〔An,G.et al.:J.Bacteriol.,140,400（19
79）〕に従い、本プラスミドを保有する大腸菌Ｋ−12株
亜株の培養菌体から単離した。供与体DNAとなる染色体D
NAは大腸菌Ｋ−12株Hfr株（ATCC23740）の培養菌体か
ら、スミスのフェノール抽出法〔Smith,M.G.:Methods i
n Enzymology,12,partA,545（1967）〕に従って単離し
た。

pGA22プラスミドDNA4μｇを含む制限酵素Hind III反応
液（10mMトリス塩酸,7mM MgCl₂,60mM NaCl,pH7.5）60
μに0.4単位のHind III（宝酒造社製16単位／μ）
を添加し、37℃で30分間反応後、65℃で10分間加温して
反応を停止した。pGA22には２個所のHind III切断部位
があるが、同一条件でHind III消化した試料をアガロー
スゲル電気泳動で調べた結果、一断片に切断されている
ことが確認された。別に染色体DNA8μｇを含む制限酵素
Hind III反応液140μに４単位のHind IIIを添加し、3
7℃で60分間反応後、65℃で10分間加温して反応を停止
させた。両反応消化物を混合し、T4リガーゼ緩衝液〔ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと
略す）660mM,MgCl₂ 60mM,ジチオスレイトール100mM,pH
7.6〕40μ,ATP（5mM）40μ,T4リガーゼ（宝酒造社
製,1単位／μ）0.3μおよびH₂O120μを加え、12
℃で16時間反応させた。この反応混合物をTES緩衝液
（0.03Mトリス,0.005M EDTA,0.05M NaCl,pH8.0）で飽
和したフェノール400μで２回抽出し、TES緩衝液に対
して透析してフェノールを除外した。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌Ｋ−12株亜株GT−３
〔J.Bacteriol.,117,133（1974）〕（ホモセリンおよび
ジアミノピメリン酸要求性）の形質転換に供した。GT−
３のコンピテントセルはダジェルトらの方法〔Dagert,
M.et al.:Gene６,23（1979）〕で調製した。即ち、100
μg/mlとなるようにジアミノピメリン酸を補ったＬ培地
（バクトトリプトン10g,酵母エキス5g,ブトウ糖1gおよ
び塩化ナトリウム5gを水１含み、pH7.2に調整した培
地）50mlにGT−３株を植菌し、東京光電比色計で660nm
における吸光度（OD）が0.5になるまで37℃で培養し
た。培養液を氷水中で10分間冷却してから遠心集菌す
る。菌体を冷却した0.1M塩化カルシウム20mlに再懸濁
し、０℃に20分間置いた。菌体を再遠心し、0.1M 塩化
カルシウム0.5mlに懸濁し、０℃で18時間置いた。塩化
カルシウム処理した菌液400μに前記リガーゼ反応混
合物200μを添加混合し、０℃に10分間置いてから37
℃で５分間加温した。次いでＬ培地9mlを添加し、37℃
で２時間振盪培養した。生理食塩水で２回遠心洗滌後、
12.5μg/ml相当のカナマイシンを添加したM9最少寒天培
地（ブドウ糖2g,NH₄Cl 1g,Na₂HPO₄ 6g,KH₂PO₄ 3g,Mg
SO₄・7H₂O 0.1g,CaCl₂・2H₂O 15mg,サイアミン塩酸塩
4mgおよび寒天15gを水１含み、pH7.2に調整した培
地）に塗布し、37℃で３日培養した。出現した、ただ１
つのコロニーはpGA22の選択マーカーである薬剤アンピ
シリン25μg/ml,クロラムフェニコール 25μg/mlある
いはカナマイシン25μg/mlを含む寒天培地上でも生育す
ることが確認された。

この形質転換株の培養菌体から前記のpGA22を単離した
のと同一の方法によりプラスミドDNAを単離した。この
プラスミドDNAを制限酵素消化とアガロースゲル電気泳
動で解析した結果、第１図にpGH2として示した構造を有
していた。pGA22に挿入されたDNA断片は、既にクローン
化さた大腸菌オペロン含有DNA断片〔Cossart,P.et al.:
Molec.Gen.Genet.,175,39（1979）参照〕と同一の制限
酵素切断部位を有していることからpGH2がスレオニンオ
ペロンを含有することが確認された。

（２）pCG11とpGH2の試験管内組換え pCG11を保有するコリネバクテリウム・グルタミクムLA1
03/pCG11（ATCC39022）を400ml NB培地（粉末ブイヨン
20g,酵母エキス5gを水１に含みpH7.2に調整した培
地）でOD約0.8になるまで生育させた。培養液から菌体
を集菌し、TES緩衝液で洗浄後、リゾチーム液（25％シ
ョ糖,0.1M NaCl,0.05Mトリス,0.8mg/mlリゾチーム:pH
8.0）で10mlに懸濁し、37℃で４時間反応させた。反応
液に5M NaCl 2.4ml,0.5M EDTA（pH8.5）0.6ml,4％ウ
ラリル硫酸ナトリウムと0.7M NaClからなる溶液4.4ml
を順次添加し、緩やかに混和してから氷水中に15時間置
いた。溶解物全量を遠心管に移し、４℃で60分間69,400
×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収した。これに重量百
分率10％相当のポリエチレングリコール（PEG）6,000
（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶解後、
氷水中に置いた。10時間後、1,500×ｇで10分間遠心分
離してペレットを回収した。TES緩衝液5mlを加えてペレ
ットを静かに再溶解してから、1.5mg/mlエチジウムブロ
マイド2.0mlを添加し、これに塩化セシウムを加えて静
かに溶解し、密度を1.580に合わせた。この溶液を105,0
00×g,18℃で48時間超遠心分離にかけた。この密度勾配
遠心により共有結合で閉じられた環状のDNAは、紫外線
照射することによって遠心チューブ中下方の密度の高い
バンドとして見出された。このバンドを注射器で遠心チ
ューブの側面から抜きとることによってプラスミドpCG1
1が分離された。ついで、分離液を等容量のイソプロピ
ルアルコール液〔容量百分率90％イソプロピルアルコー
ル,10％TES緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシ
ウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイドを
抽出除去し、しかる後に、TES緩衝液に対して透析し
た。こうしてpCG11プラスミドDNAを得た。

このpCG11DNAを用い、各種制限酵素による単独消化およ
び複数の制限酵素による多重消化で生成するDNA断片を
アガロースゲル電気泳動で解析し、分子量およびプラス
ミド分子中の各制限酵素に対する切断部位を求めた結
果、第１図に示す制限酵素切断地図を有することがわか
った。

pCG11プラスミドDNA2μｇを含む制限酵素Bgl II反応緩
衝液（10mMトリス塩酸,7mM MgCl₂,60mM NaCl,7mM ２
−メルカプトエタノール,pH7.5）100μに２単位のBgl
II（宝酒造社製,6単位／μ）を添加し、37℃で60分
間反応させた。別にpGHプラスミドDNA ２μｇを含む制
限酵素BamH I反応緩衝液（10mMトリス塩酸,7mM MgCl₂,
100mM NaCl,2mMメルカプトエタノール,0.01％ウシ血清
アルブミン,pH8.0）100μに２単位のBamH I（宝酒造
社製,6単位／μ）を添加し、37℃で60分間反応させ
た。両消化物を65℃で10分間加温した後、混合し、T4リ
ガーゼ緩衝液40μ,ATP（5mM）40μ,T4リガーゼ（宝
酒造社製,4単位／μ）0.2μおよびH₂O 120μを
加え、12℃で16時間反応させた。この混合物をTES緩衝
液で飽和したフェノール400μで２回抽出し、TES緩衝
液に対して透析してフェノールを除外した。

（３）pEthr1の取得形質転換はコリネバクテリウム・グルタミクムLA201株
（ホモセリン・ロイシン要求株）のプロトプラストを用
いて行った。コリネバクテリウム・グルタミクムLA201
株の種培養をNB培地に植菌し、30℃で振盪培養した。OD
0.6になった時点で、該細胞をRCGP培地〔グルコース5g,
カザミノ酸5g,酵母エキス2.5g,K₂HPO₂ 3.5g,KH₂PO₄
1.5g,MgCl₂・6H₂O 0.41g,FeSO₄・7H₂O 10mg,MnSO₄・
４〜6H₂O 2mg,ZnSO₄・7H₂O 0.9mg,（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4
H₂O 0.04mg,ビオチン30μg,サイアミン塩酸塩2mg,コハ
ク酸二ナトリウム135g,ポリビニルピロリドン（分子量1
0,000）30gを水１に含む培地〕に1mg/mlのリゾチーム
を含む液（pH7.6）に約10⁹細胞/mlとなるように懸濁
し、Ｌ型試験管に移して30℃で５時間緩やかに振盪反応
してプロトプラスト化した。

このプロトプラスト菌液0.5mlを小試験管にとり、2,500
×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝液〔10mM塩化マグネ
シウム,30mM塩化カルシウム,50mMトリス,400mMショ糖,p
H7.5〕1mlに再懸濁して遠心洗滌後、TSMC緩衝液0.1mlに
再懸濁した。この菌液に２倍濃度のTSMC緩衝液と上記リ
ガーゼ反応DNA混合物の１対１混合液100μを加えて混
和し、次いでTSMC緩衝液中に20％PEG6,000を含む液0.8m
lを添加して混合した。３分後、RCGP培地（pH7.2）2ml
を添加し、2,500×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み
液を除去し、沈降したプロトプラストを1mlのRCGP培地
に懸濁してから30℃で２時間緩やかに振盪した。つい
で、このプロトプラスト懸濁液の0.1mlをカナマイシン4
00μg/mlを含むRCGP寒天培地（RCGP培地に1.4％寒天を
含む培地,pH7.2）に塗抹し、30℃で６日間培養した。

寒天培地上全面に生育したカナマイシン耐性形質転換株
をかき集め、生理食塩水で遠心洗滌後、ロイシン50μg/
mlを補充した最少寒天培地M1〔ブドウ糖10g,NH₄H₂PO₄
1g,KCl 0.2g,MgSO₄・7H₂O 0.2g,FeSO₄・7H₂O 10mg,M
nSO₄・４〜6H₂O 0.2mg,ZnSO₄・7H₂O 0.9mg,CuSO₄・5H
₂O 0.4mg,Na₂B₄O₇・10H₂O 0.09mg,（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4
H₂O 0.04mg,ビオチン50μg,p−アミノ安息香酸2.5mg,
サイアミン塩酸塩1mg,寒天16gを水１中に含み、pH7.2
に調整した培地〕上に再塗布して30℃で３日間培養し
た。出現したコロニーの中からカナマイシン20μg/mlお
よびスペクチノマイシン100μg/mlを含むNB寒天培地上
で生育できる株が得られた。

任意に選んだ３株を400ml NB培地でOD約0.8になるまで
生育させ、集菌後、その培養細胞から実施例１（２）記
載のエチジウムブロマイドセシウムクロライド密度勾配
遠心により、プラスミドを単離した。いずれの株からも
40〜55μｇのプラスミドDNAが取得された。

これらのプラスミドDNAを制限酵素消化とアガロースゲ
ル電気泳動で解析し、分子量と制限酵素Pst I,EcoR I,
およびHho Iの切断点を同定した。一株から得られたプ
ラスミドをpEthr1と命名し、その構造を第１図に示す。
pEthr1はpCG11にpGH2のスレオニンオペロンを含むBamH
I切断片を結合した構造を有することが判明した。残り
の２株中、１株はpEthr1と同一プラスミドを保有してい
るが、他の一株はpEthr1とはpGH2のスレオニンオペロン
含有BamH I切断片の結合向きが逆向きに挿入されている
プラスミドを保有している。

これらのプラスミドDNAを用いてコリネバクテリウム・
グルタミクムLA201株を前記と同様に再形質転換した結
果、ホモセリン非要求性が高頻度（再生した生菌あたり
約10^-3）で得られ、それらは全てカナマイシンとスペク
チノマイシン耐性形質を獲得しており、各種制限酵素切
断様式で特徴付けられる供与プラスミドと同一のプラス
ミドを保有していた。

（４）pEthr1保有株によるＬ−イソロイシンの生産コリネバクテリウム・グルタミクムK40とブレビバクテ
リウム・フラブムATCC14067のプロトプラストを形質転
換してpEthr1を導入した。コリネバクテリウム・グルタ
ミクムK40およびブレビバクテリウム・フラブムATCC140
67をNB培地にて30℃で16時間振盪培養し、その種培養0.
1mlを10mlのSSM培地〔ブドウ糖10g,NH₄Cl 4g,尿素2g,
酵母エキス1g,KH₂PO₄ 1g,K₂HPO₄ 3g,MgCl₂・6H₂O 0.
4g,FeSO₄・7H₂O 10mg,MnSO₄・４〜6H₂O 0.2mg,ZnSO₄
・7H₂O 0.9mg,CuSO₄・5H₂O 0.4mg,Na₂B₄O₇・10H₂O
0.09mg,（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O 0.04mg,ビオチン30μg,
サイアミン塩酸塩1mgを純水１に含みpH7.2に調整した
培地〕の入ったＬ字型試験管に接種し、モノ−型培養槽
にて30℃振盪培養した。ODが0.15になった時点で0.5単
位/mlになるようにペニシリンＧを添加した。さらに培
養を続け、OD約0.6になったところで細胞を集菌し、RCG
P培地に1mg/mlのリゾチームを含む液（pH7.6）2mlに懸
濁し、Ｌ字型試験管に移して30℃で14時間緩やかに振盪
してプロトプラスト化した。

このプロトプラスト菌液1mlを小試験管にとり2,500×ｇ
で15分間遠心分離し、沈澱物をTSMC緩衝液1mlに再懸濁
して遠心（2,500×ｇ）洗滌後、TSMC緩衝液の0.1mlを加
えて再懸濁した。これに２倍濃度のTSMC緩衝液と上記で
単離したpEthr1DNA液の１対１混合液100μを加えて混
和し、実施例１（３）と同様にPEG6,000を介した形質転
換転換を行い、形質発現させた後、0.1mlをスペクチノ
マイシン400μg/mlを含むRCGP寒天培地に塗抹し、30℃
で10日間培養した。出現したコロニーの中からスペクチ
ノマイシン100μg/minおよびカナマイシン20μg/mlを含
むNB寒天培地上で生育できる株が得られた。

スペクチノマイシンとカナマイシンとに同時に耐性にな
った形質転換株を400ml SSM培地で振盪培養し、ODが0.
15になったところで0.5単位/mlとなるようにペニシリン
Ｇを添加し、さらにODが0.65まで培養し、集菌した菌体
から実施例１（２）のpCG11の単離法と同様な方法でプ
ラスミドを単離した。これらのプラスミドを制限酵素消
化とアガロースゲル電気泳動で解析した結果、各種制限
酵素切断様式で特徴付けられるpEthr1と同一の構造を有
するものがあることがわかった。このような形質転換株
がコリネバクテリウム・グルタミクムK41（FERM BP−4
56），ブレビバクテリウム・フラバムK42（FERM BP−3
55）である。

コリネバクテリウム・グルタミクムK40,ブレビバクテリ
ウム・フラブムおよびそれらのpEthr1保有株のＬ−イソ
ロイミン生産試験を行った。NB培地中で30℃,16時間振
盪培養した種培養0.5mlを生産培地〔ブドウ糖100g,（NH
₄）₂SO₄ 20g,KH₂PO₄ 0.5g,K₂HPO₄ 0.5g,MgSO₄・7H₂O
1g,FeSO₄・7H₂O 10mg,MnSO₄・４〜6H₂O 10mg,ビオ
チン100μg,炭酸カルシウム30gを水１に含み、pH7.2
に調整した培地〕の入った試験管に接種し、30℃で72時
間振盪培養した。培養後、培養瀘液をペーパークロマト
グラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して
Ｌ−イソロイシン生成量を測定した。

結果を第１表に示す。

大腸菌由来のアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロ
ゲナーゼ、ホモセリンキナーゼおよびスレオニンシンタ
ーゼをコードする遺伝子をコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物に導入し、発現さ
せることにより、コリネバクテリウム・グルタミクムに
おいては約2.3倍（2.7mg/ml）、ブレビバクテリウム・
フラブムにおいては、検出可能な量のＬ−イソロイシン
を菌体外に排出できなかったものが0.8mg/mlと著しい生
産性の向上を示した。

特開昭58−893号公報に、イソロイシンアンタゴニスト
耐性関与遺伝子領域を組み込んだコリネホルム・タイプ
の形質転換微生物によるＬ−イソロイシンの生産量が記
載されているが、最大生産量は1.45mg/mlであり、本発
明は特開昭58−893号公報よりも優れた生産結果を示し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はpEthr1の制限酵素切断地図とそれの作製工程を
示す。破線で示したBgl II/BamH Iは両制限酵素切断で
生じる同一接着末端での連結部位である。制限酵素切断
地図作製に用いた制限酵素はPst I,EcoR IおよびXho I
である。プラスミドの分子量はキロベース（Kb）で表示
されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:13）Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:13） (56)参考文献特開昭58−893（ＪＰ，Ａ) 特公昭37−47954（ＪＰ，Ｂ１) 特公昭43−14938（ＪＰ，Ｂ１) アミノ酸・核酸集談会編「アミノ酸発酵下各編」（昭47．４．５）共立出版Ｐ. 170

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エッシェリヒア属に属する微生物由来のア
スパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモ
セリンキナーゼおよびスレオニンシンターゼをコードす
る遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNA
を保有し、かつＬ−イソロイシン生産能を有するコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微
生物を培地中に培養し、培養物中にＬ−イソロイシンを
生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−イソロイシンを採取
することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法。
【請求項２】該ベクターが、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物に由来するベク
ターならびにその誘導体であることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項３】該ベクターがpCG1、pCG2、pCG4、pCG11、p
CE54およびpCB101から選ばれることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の製造法。