DE69837491T2

DE69837491T2 - Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut

Info

Publication number: DE69837491T2
Application number: DE69837491T
Authority: DE
Inventors: Mireya Fernandez; Jose J. Minguell
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1997-07-03
Filing date: 1998-07-01
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2018-07-02
Also published as: EP1028737B1; DK1028737T3; CA2294944A1; CY1106798T1; US6261549B1; EP1028737A1; AU8476698A; WO1999001145A1; PT1028737E; ATE358493T1; EP1028737A4; DE69837491D1; ES2285779T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Provisional Application SN 60/051,651 , Anmeldetag 3. Juli 1997. Die vorliegende Arbeit wurde von den Institutionen FONDECYT-Chile (Nr. 1950-238) und Fundacao Vitae-Brazil (Nr. B-l1487/43001) unterstützt. Dadurch haben diese Institutionen möglicherweise bestimmte Rechte an der Erfindung.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind die formativen pluripotenten Blastzellen, die unter anderem in Knochenmark, Blut, Dermis und Periosteum auftreten und zur Differenzierung zu mehr als einem spezifischen Typ von mesenchymalen Geweben oder Bindegeweben (d. h. Geweben des Körpers, die spezialisierte Elemente unterstützen; wie Fettgewebe, Knochengewebe, Stroma, Knorpelgewebe, elastische und faserige Bindegewebe), befähigt sind, und zwar je nach verschiedenen Einflüssen bioaktiver Faktoren, wie Cytokine. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) reagieren mit bestimmten monoklonalen Antikörpern, die als SH2, SH3 und SH4 bekannt sind (vergl. US-Patent 5 486 359 ).
Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind die formativen, pluripotenten Blastzellen, die unter anderem in Knochenmark und peripherem Blut auftreten und zur Differenzierung zu einem beliebigen der spezifischen Typen von hämatopoetischen oder Blutzellen, wie Erythrozyten, Lymphozyten, Makrophagen und Megakaryozyten, befähigt sind. Nach Mobilisierung von HSCs aus Knochenmark durch Verabreichung bestimmter Faktoren, wie G-CSF und GM-CSF, und anschließender Gewinnung aus peripherem Blut werden HSCs auch als periphere Blut-Progenitorzellen (PBPCs) bezeichnet. Humane hämatopoetische Stammzellen (hHSCs) und PBPCs reagieren mit bestimmten monoklonalen Antikörpern, von denen man jetzt weiß, dass sie für hämatopoetische Zellen spezifisch sind, z. B. CD34.
Somit sind hMSCs und hHSCs aufgrund ihrer immunospezifischen Profile leicht unterscheidbar. Sie werden aus Klarheitsgründen hier beispielsweise je nach Bedarf als SH2⁺-CD14^–-hMSCs oder SH2^–-CD14⁺-hHSCs bezeichnet.
Die Transplantation von humanen hämatopoetischen Stammzellen (hHSC) oder peripheren Blut-Progenitorzellen (PBPC) hat sich zu einem anerkannten Verfahren zur Dosis-Intensivierung bei der Behandlung verschiedener neoplastischer Krankheiten entwickelt^1,2. Verschiedene Verfahren werden für die hHSC-Mobilisierung und deren Entfernung aus dem Kreislauf durch Apherese herangezogen. Derzeit nützen die meisten Verfahren den Rebound an zirkulierenden Progenitorzellen, der nach einer zytotoxischen Chemotherapie erfolgt, aus³. Insgesamt verstärkt die kurzzeitige Verabreichung von GM-CSF oder G-CSF die Ausbeute an hHSC, gemessen durch die Anzahl an CD34⁺-Zellen^4,5,6, was bei Verwendung für die Autotransplantation mit ≥ 2,5 × 10⁶ CD34⁺-hHSC/kg Empfänger eine rasche hämatopoetische Erholung gewährleistet^4,5,6.
Mehrere Mechanismen scheinen an der durch Wachstumsfaktoren vermittelten Freisetzung von Knochenmark-Progenitorzelen beteiligt zu sein⁷. Es hat den Anschein, dass nach Einwirkung von G-CSF oder GM-CSF Haftmoleküle von der Oberfläche von im Knochenmark vorhandenen primitiven Multilinienzellen abgestoßen werden, was ihnen den Eintritt in den Kreislauf ermöglicht⁵. Dieses Konzept wurde durch mehrere Beobachtungen gestützt, die zeigen, dass Wachstumsfaktoren (wie G-CSF, GM-CSF, IL-3 und SCF) die Expression oder Funktion mehrerer zytoadhäsiver Moleküle an der Oberfläche von hämatopoetischen Progenitorzellen modulieren^8,9. Ferner gibt es Berichte darüber, dass Cytokine tiefgreifende morphologische und immunohistochemische Veränderungen im Knochenstroma und in der angrenzenden extrazellulären Matrix hervorrufen.
US-5 486 359 beschreibt ein Verfahren zur Isolation, Reinigung und Kulturexpansion von undifferenzierten humanen mesenchymalen Stammzellen mit der Fähigkeit zur Differenzierung zu mehr als einem Gewebetyp. US-5 486 359 beschreibt ferner monoklonale SH2-, SH3- und SH4-Antikörper, die mesenchymale Stammzellen erkennen, die SH2+, SH3+ und SH4+ sind.
US-5 199 942 betrifft ein Verfahren zur autologen Transplantation von hämatopoetischen Zellen bei einem Patienten, der einer zytoreduktiven Therapie unterzogen wird. Das Verfahren beinhaltet die ex vivo-Expansion der hämatopoetischen Progenitorzellen mit einem Wachstumsfaktor.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die Erfindung ist auf die Verwendung eines Wachstumsfaktors, der aus der Gruppe G-CSF und GM-CSF ausgewählt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erhöhung der Menge an mesenchymalen Stammzellen im peripheren Blut abgestellt, wobei die humanen mesenchymalen Stammzellen SH2+, SH3+ und/oder SH4+ sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die mesenchymalen Stammzellen ferner CD14- und CD34-.
Dieser Wachstumsfaktor kann bei einem Verfahren zur Gewinnung von humanen mesenchymalen Stammzellen verwendet werden, wobei die humanen mesenchymalen Stammzellen aus peripherem Blut, das von einem Individuum erhalten worden ist, gewonnen werden. Insbesondere kann dieser Wachstumsfaktor bei einem Verfahren zur Gewinnung von peripherem Blut, das eine Population von Zellen mit einem verstärkten Anteil an humanen mesenchymalen Stammzellen enthält, von einem Individuum verwendet werden, wobei das Verfahren (i) die Verabreichung mindestens eines Wachstumsfaktors an das Individuum und anschließend (ii) die Gewinnung von hMSCs aus dem peripheren Blut des Individuums umfasst. Erfindungsgemäß verwendete Wachstumsfaktoren sind G-CSF, GM-CSF und Kombinationen davon.
Dieser Wachstumsfaktor kann bei einem Verfahren zur Gewinnung einer isolierten, in Kultur expandierten Population von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereicherten peripheren Blut eines Individuums verwendet werden, indem man (i) dem Individuum mindestens einen Wachstumsfaktor verabreicht; (ii) in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereichertes peripheres Blut des Individuums gewinnt; (iii) das in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereicherte periphere Blut oder eine Fraktion davon züchtet; und (iv) eine in Kultur expandierte Population von humanen mesenchymalen Stammzellen von anderen Zellen, die im in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereicherten peripheren Blut enthalten sind, isoliert. Die Stufen der Züchtung und Isolierung können auch in umgekehrter Reihenfolge vorgenommen werden. Dies bedeutet, dass mesenchymale Stammzellen aus dem peripheren Blut isoliert und anschließend in Kultur expandiert werden können. Zu Möglichkeiten für eine derartige Isolierung gehören die Leukopherese, die Dichtegradientenfraktionierung, die Immunoselektion und die differentielle Adhäsionstrennung. Bei dem Kulturmedium kann es sich um chemisch definierte, serumfreie Medien oder um ein "Komplettmedium", wie DMEM oder DMEM-1g enthaltendes Serum, handeln. Geeignete chemisch definierte, serumfreie Medien sind in der US-Patentanmeldung SN 08/464,599 (Anmeldetag 5. Juni 1995) beschrieben. "Komplettmedien" sind im US-Patent 5 486 359 (Ausgabetag 23. Januar 1996) beschrieben.
Dieser Wachstumsfaktor kann ferner bei einem Verfahren zur ex vivo-Konservierung einer isolierten, in Kultur expandierten Population von humanen mesenchymalen Stammzellen, die aus dem in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereicherten peripheren Blut eines Individuums stammen, verwendet werden, indem man (i) dem Individuum mindestens einen Wachstumsfaktor verabreicht; (ii) in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereichertes peripheres Blut des Individuums gewinnt; (iii) das in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereicherte periphere Blut züchtet; (iv) eine in Kultur expandierte Population von humanen mesenchymalen Stammzellen von anderen Zellen, die im in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereicherten peripheren Blut enthalten sind, isoliert; und (v) die isolierte, in Kultur expandierte Population von humanen mesenchymalen Stammzellen konserviert. Vorzugsweise wird die Konservierung durch Kryokonservierung vorgenommen.
Dieser Wachstumsfaktor kann ferner bei einem Verfahren zur Behandlung eines Individuums verwendet werden, das einer Behandlung mit einer isolierten, in Kultur expandierten Population von humanen mesenchymalen Stammzellen bedarf, indem man (i) dem Individuum mindestens einen Wachstumsfaktor verabreicht; (ii) in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereichertes peripheres Blut des Individuums gewinnt; (iii) das in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereicherte periphere Blut züchtet; (iv) eine in Kultur expandierte Population von humanen mesenchymalen Stammzellen von anderen Zellen, die in dem in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereicherten peripheren Blut enthalten sind, isoliert; und (v) die isolierte, in Kultur expandierte Population von humanen mesenchymalen Stammzellen dem Individuum verabreicht. Die Zellen können beispielsweise durch systemische Infusion oder lokale Implantation an einer Stelle, an der eine de novo-Gewebebildung angestrebt wird, z. B. durch ein freilegendes oder arthroskopisches Verfahren, verabreicht werden. Die Zellen können vor der Rückverabreichung konserviert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Phasenkontrastaufnahmen von gezüchteten stromalen Zellen aus mobilisierten PBPC-Ernten.
1A: Nach Züchtung (10 Tage) von PBPCs in geringer Dichte in Medium, das mit 20% FCS ergänzt war, wurde eine anhaftende Schicht mit einem Gehalt an fibroblastenartigen Zellen, Kolonien und kleinen runden Zellen erzeugt (a). (x10).
1B: Kolonien werden durch fibroblastenartige Zellen, große, flache runde Zellen und kleine runde Zellen, die oben auf großen flachen, runden Zellen verteilt sind oder sich dort befinden, gebildet (x100).
1C: Nach 20 Tagen in Kultur ist eine fast konfluente, anhaftende einlagige Schicht (Monolager) von fibroblastenartigen Zellen sichtbar (x10).
2: Immunofärbung auf Fibronectin, Kollagen I, ICAM-1, VCAM-1 und mesenchymales Antigen SH2 in Kulturen von Stromazellen, die sich von mobilisierten PBPC-Ernten ableiten.
Die Mikrogramme zeigen die in situ-Immunofluoreszenzfärbung auf Fibronectin (2A), Kollagen I (2B), ICAM-1 (2C), VCAM-1 (2D) und mesenchymales Antigen SH2 (2E). Ursprüngliche Vergrößerung x40.
3: Repräsentative FACScan-Histogramme zur Feststellung der Expression von mesenchymalen Stammzell-Oberflächenantigenen.
Anhaftende Zellen von 10-tägigen Kulturen peripherer Blut-Progenitorzellen (PBPC) und Knochenmark wurden mit EDTA freigesetzt und auf die Expression von mit mesenchymalen Stammzellen assoziierten Oberflächenantigenen, die durch die monoklonalen Antikörper SH-2 und SH-3 erkannt werden, analysiert. Wir zeigen das Streuungsdiagramm von FSC gegen SSC für periphere Blut-MSCs (3A) und Knochenmark-MSCs (3D), um das Gating von SH-2⁺/CD14^– zu ermöglichen. Das Fluoreszenzprofil in jeder der 3B, 3C, 3E und 3F zeigt die negative Kontrolle ohne Färbung (jeweils linker Peak) und die positive Kontrolle für gefärbte Zellen (jeweils rechter Peak).
4: Korrelation zwischen der Anzahl von CD34⁺- und SH-2⁺-Zellen in mit Wachstumsfaktor mobilisierten Aphereseprodukten.
Die Daten von Aphereseprodukten von 14 Brustkrebspatienten wurden analysiert. Die Zahlenwerte für CD34⁺ und SH-2⁺ wurden auf 10⁴ mononukleare Zellen pro ml einer jeden Ernte normiert. Die Linie gibt den Trend wieder (Korrelationskoeffizient 0,92).
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Nachstehend finden sich repräsentative Beispiele für Cytokine, die verwendet werden können: IL-1 kann in einer Menge verwendet werden, die eine Anreicherung der hMSC-Population in peripherem Blut bewirkt; im allgemeinen beträgt eine derartige Menge mindestens 20 pg/ml und muss 1 ng/ml nicht übersteigen, wobei die Menge vorzugsweise 1 ng/ml beträgt; IL-6 kann in einer Menge verwendet werden, die eine Anreicherung der hMSC-Population in peripherem Blut bewirkt; im allgemeinen beträgt eine derartige Menge mindestens 1 pg/ml und muss 50 ng/ml nicht übersteigen, wobei die Menge vorzugsweise 10 ng/ml beträgt; IL-3 kann in einer Menge verwendet werden, die eine Anreicherung der hMSC-Population in peripherem Blut bewirkt; im allgemeinen beträgt eine derartige Menge mindestens 500 pg/ml und muss 50 ng/ml nicht übersteigen, wobei die Menge vorzugsweise 500 pg/ml beträgt; G-CSF kann erfindungsgemäß in einer Menge verwendet werden, die eine Anreicherung der hMSC-Population in peripherem Blut bewirkt; im allgemeinen beträgt eine derartige Menge mindestens 100 pg/ml und muss 1 ng/ml nicht übersteigen, wobei die Menge vorzugsweise 200 pg/ml beträgt. GM-CSF kann erfindungsgemäß in einer Menge verwendet werden, die die hMSC-Population in peripherem Blut anreichert; im allgemeinen beträgt eine derartige Menge mindestens 100 pg/ml und muss 1 ng/ml nicht übersteigen, wobei die Menge vorzugsweise 200 pg/ml beträgt; c-kit-Ligand kann in einer Menge verwendet werden, die eine Anreicherung der hMSC-Population in peripherem Blut bewirkt; im allgemeinen beträgt eine derartige Menge mindestens 1,0 ng/ml und muss 500 ng/ml nicht übersteigen, wobei die Menge vorzugsweise 100 ng/ml beträgt. Derartige Cytokine können allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Weitere Cytokine, wie LIF und SCF sowie Kombinationen davon, können ebenfalls zur Mobilisierung von hMSCs in peripheres Blut verwendet werden.
Die aus peripherem Blut gewonnenen hMSCs können auf verschiedene Weise verwendet werden. Beispielsweise können derartige hMSCs als Bestandteil einer Zellersatztherapie verwendet werden. Speziell können die expandierten und kultivierten hMSCs allein infundiert werden oder zu Knochenmarkzellen für Knochenmark-Transplantationsverfahren zugesetzt werden. Weitere Anwendungen, insbesondere orthopädischer Art, kommen ebenfalls in Betracht. Hierzu gehören beispielsweise die Behandlung von Osteoarthritis, Osteoporose, traumatischen oder pathologischen Zuständen, bei denen beliebige Bindegewebe beteiligt sind. Es kommt ebenfalls in Betracht, dass exogenes genetisches Material in die Zellen in einem ex vivo-Zustand eingeführt werden kann und die Zellen als Bestandteil eines gentherapeutischen Verfahrens rückverabreicht werden. Die genetische Manipulation von mesenchymalen Stammzellen wird ausführlich im US-Patent 5 591 625 (Ausgabetag 7. Januar 1997) erörtert.
Die Zellen können vor oder nach dem Einfrieren expandiert werden, z. B. gemäß dem Verfahren von Caplan et al. ( US-Patent 5 486 359 , Ausgabetag 23. Januar 1996). Nach einer Chemotherapie können die expandierten Zellen dem Patienten durch bekannte Verfahren reinfundiert werden.
Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung und Beschreibung der vorliegenden Erfindung vorgelegt. Der Schutzumfang der Erfindung wird jedoch hierdurch nicht beschränkt.
Beispiel 1
Isolierung von hMSCs aus peripherem humanem Blut
In der vorliegenden Studie stellten wir die Anwesenheit von hMSCs in durch Wachstumsfaktor mobilisierten hHSC-Ernten von Brustkrebspatienten fest. Zu diesem Zweck bedienten wir uns eines Verfahrens, das das Züchten von hMSCs und ihre quantitative Bestimmung durch Fließzytometrie unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen durch von Knochenmark abgeleitete hMSCs exprimierte Oberflächenantigene, d. h. SH2 und SH3, umfasste. Ein ähnlicher Weg wurde bereits eingeschlagen, um nachzuweisen, dass Knochenmarkzellen die primitiven mesenchymalen Stammzellen umfassen.
Patientenpopulation und hHSC-Ernteverfahren
14 weibliche Patienten mit histologisch gesichertem Brustkrebs des Stadiums II mit 10 oder mehr betroffenen Achsellymphknoten wurden (i) durch Chemotherapie⁶ und anschließend (ii) mit rekombinantem humanem G-CSF (Neupogen^®, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Schweiz) oder GM-CSF (Leucomax^®, Schering Plough-Sandoz Pharma Ltd., Basel, Schweiz) in Dosen von 5 μg/kg/Tag subkutan einen Tag nach Beendigung der Chemotherapie behandelt. Anschließend wurde eine hHSC-Ernte während einer Knochenmarkentnahme gewonnen, sobald eine eindeutige Population von CD34⁺ (≥ 10/1) im peripheren Blut nachweisbar war, wobei ein Haemonetics-V50-Blutseparator (Braintree, MA) verwendet wurde. Eine Aliquotmenge der hHSC-Ernte wurde ausgezählt und für die morphologische Prüfung, den CFU-GM-Test¹⁶ und die Bestimmung des CD34-Gehalts durch direkte Immunofluoreszenz vorbereitet (vergl. die nachstehenden Ausführungen). Eine weitere Aliquotmenge wurde für die Züchtung und phänotypische Analyse von SH2⁺-hMSCs beiseitegestellt. Die hHSC-Ernten wurden durch Zentrifugation einer Volumenverringerung unterzogen, in einem Gemisch aus autologem Plasma und 10% DMSO verdünnt, in einem geschwindigkeitsgesteuerten Gefriergerät (Cryomed; Forma Scientific, Marietta, OH, USA) eingefroren und in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff bis zur Reinfusion kryokonserviert.
Gewinnung von Knochenmark
Übriggebliebenes Material wurde aus heparinisierten Knochenmarkzellen (BM)-Zellen von normalen Individuen, die einer BM-Ernte für eine allogene Transplantation unterzogen worden waren, erhalten.
Zellen in Medium 199 mit einem Gehalt an 20 U/ml Heparin wurden 2-mal gewaschen, in Medium ohne Zusatz resuspendiert und zur Züchtung von von Knochenmark abgeleiteten hMSCs verwendet.
Sämtliche Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der Ethikkommission von Clinica Las Condes durchgeführt. Die einzelnen Patienten waren informiert und gaben ihre Zustimmung.
Züchtung von peripheren Blut-hHSCs und von Knochenmark abgeleiteten hMSCs
Die hMSCs wurden gemäß Literaturangaben gezüchtet^12,13. Kurz zusammengefasst, mononukleare Zellen von Aphereseprodukten und von BM-Ernten wurden einer Dichtetrennung durch Zentrifugation an 1,077 g/cm³-Ficoll-Hypaque (Sigma, St. Louis, MO, USA) unterzogen. Zellen von geringer Dichte wurden in α-MEM mit einem Gehalt an 20% fötalem Kälberserum (FCS, Sigma, St. Louis, MO, USA) suspendiert und in 35 mm-Petri-Schalen in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/Schale bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit einem Gehalt an 5% CO₂ gezüchtet. Nach 10-tägiger Züchtung (wobei das Medium am 4. Tag ausgetauscht wurde) wurden Zellen in der anhaftenden Schicht für eine Phänotypanalyse entweder in situ oder nach Ablösen der Zellen mit 0,02% EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verwendet.
Phänotypanalyse
Eine lichtmikroskopische Prüfung wurde an gemäß Wright-Giemsa gefärbten Zellen entweder in der Kulturplatte oder in Cytospin-Präparaten von mit EDTA abgelösten Zellen durchgeführt. Eine histochemische Färbung wurde gemäß üblichen Verfahren unter Verwendung von diagnostischen Kits (Sigma) für Sudanschwarz, Periodsäure-Schiff (PAS), α-Naphthylbutyratesterase, saure Phosphatase und alkalische Phosphatase durchgeführt.
Für Immunofluoreszenzstudien wurden Zellen mit einem Fixierungs/Permeabilisierungs-Reagenz (Cytoperm^®, Serotech Ltd., Oxford, England) verarbeitet und mit geeigneten freien oder FITC-konjugierten, monoklonalen Antikörpern (vergl. die nachstehenden Ausführungen) markiert und unter UV-Beleuchtung bei 50 nm mit einer Quecksilber-Gaslampe unter einem Nikon-Mikroskop abgelesen. Für die fließzytometrische Analyse wurden mit EDTA abgelöste Zellen oder Zellen in den Aphereseprodukten entweder mit reinen oder mit FITC- oder PE-konjugierten monoklonalen Antikörpern gefärbt. Nicht-spezifische, in Bezug auf den Isotyp passende Antikörper wurden zur Bestimmung der Hintergrundfluoreszenz verwendet. Die Zellen wurden an einem FACScan-Fließzytometer (Becton Dickinson, BD) analysiert und die Datengewinnung wurde mit der FACScan-Lysis II-Forschungssoftware (BD) durchgeführt. Bei jeder Messung waren mindestens 30 000 Zellen enthalten.
Die folgenden monoklonalen Antikörper wurden verwendet: anti-CD-45-FITC, anti-CD14-PE und anti-CD34-PE wurden von der Fa. Becton Dickinson bezogen; anti-Kollagen I, anti-Kollagen III und anti-Fibronectin wurden von der Fa. Sigma bezogen; anti-Kollagen VI wurde von der Fa. Gibco BRL (Grand Island, NY, USA) bezogen; anti-ICAM-1 (CD54) und anti-VCAM-1 (CD106) wurden von der Fa. R & D Systems (Minneapolis, MN, USA) bezogen. Kontroll-Mäuse-IgG₁-PE, IgG₁-FITC, IgG₂a-PE und F(ab')₂-PE wurden von der Fa. Becton Dickinson bezogen. Die monoklonalen Antikörper SH-2 (IgG₁) und SH-3 (IgG_2b) wurden freundlicherweise von Dr. A. I. Caplan (Case Western Reserve University, Cleveland, OH, USA) und von der Fa. Osiris Therapeutics Inc. (Baltimore, MD, USA) zur Verfügung gestellt. Diese Antikörper erkennen Antigene an der Zelloberfläche von von Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Progenitorzellen, reagieren aber nicht mit von Knochenmark abgeleiteten hämatopoetischen Zellen sowie mit der Zelloberfläche von Osteoblasten oder Osteozyten^12,14,15.
Ergebnisse
Ex vivo-Erzeugung von hMSCs aus mobilisierten hHSC-Ernten
Mononukleare Zellen geringer Dichte aus hHSC-Ernten wurden in Kultur in Gegenwart von FCS, jedoch in Abwesenheit von Gucocorticoiden oder Wachstumsfaktoren, die die Replikation/Differenzierung von stromalen bzw. hämatopoetischen Vorläufern begünstigen, gezüchtet^15,17. Nach Entfernung nicht-haftender Zellen durch Ersetzen des Mediums (4. Züchtungstag) wurde in der Kulturplatte ein kleiner Bereich von anhaftenden nukleierten Zellen sichtbar, die sich nach 10-tägiger Züchtung zu einer anhaftenden Schicht mit einem Gehalt an in reichlichem Umfang dispergierten fibroblastenartigen Zellen und mehreren großen Kolonien entwickelten (1A).
Bei Prüfung mit dem Phasenkontrastmikroskop ergab sich, dass der Kern einer jeden Kolonie vorwiegend durch mehrere fibroblastenartige Zellen und durch wenige große, flache, runde Zellen gebildet war. Kleine runde Zellen waren ebenfalls sichtbar, die entweder innerhalb der Kolonien oder auf den großen, flachen, runden Zellen verteilt waren (1B). Sämtliche Zelltypen, die eine Kolonie bildeten, waren schwach positiv auf Sudanschwarz und negativ auf alkalische Phosphatase. Nach 20-tägiger Züchtung hatten sich die Zellen vermehrt und tendierten zur Bildung einer nahezu kontinuierlichen Schicht, die vorwiegend fibroblastenartige Zellen umfasste. Zu diesem Zeitpunkt waren große flache Zellen verteilt und stellten nur eine untergeordnete Population dar (1C).
Wie sich durch die histochemische Analyse (nicht dargestellt) ergab, waren die stromalen Zellen positiv auf α-Naphthylbutyrat-esterase, Periodsäure-Schiff (PAS) und saure Phosphatase; schwach positiv auf Sudanschwarz und negativ auf Membran-alkalische Phosphatase. Zwischen fibroblastenartigen und großen, flachen, runden Zellen wurden keine signifikanten histochemischen Unterschiede festgestellt.

Die immunologische Charakterisierung von von PBPC abgeleiteten stromalen Zellen wurde durch indirekte Immunofluoreszenz durchgeführt, wobei eine Gruppe von monoklonalen Antikörpern, die derzeit zum Nachweis von stromalen Knochenmarkzellen verwendet werden, eingesetzt wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 Immunofluoreszenzuntersuchungen an gezüchteten stromalen Zellen, die aus mobilisierten PBPC-Ernten erzeugt worden waren

	Zelltyp:
Marker	Fibroblastenartig	Groß, flach, rund
Fibronectin	+++	++*
Kollagen I	++	+*
Kollagen III	+	+
Kollagen VI	++	+
ICAM-1	+++	++
VCAM-1	++	+
Mesenchymale Zellen (SH2)	++	++
Mesenchymale Zellen (SH3)	+++	++
CD14	–	–
CD34	–	–

Nach in situ-Färbung mit dem geeigneten Antikörper wurden die Zellen in Bezug auf positive (+) und negative (–) Färbung bewertet.

*: Hochgradige Expression um die Kerne herum.

Gleichermaßen sind Mikrogramme zur Darstellung ausgewählter Immunofluoreszenzfärbungen (d. h. Fibronectin, Kollagen I, ICAM-1, VCAM-1 und mesenchymales Antigen SH-2) in 2 dargestellt. Im allgemeinen ergab das Färbungsmuster die Erzeugung von extrazellulären Matrixmolekülen und die Expression von Adhäsionsliganden. Zusammen exprimieren stromale Zellen, die CD14^– und CD34^– sind, mesenchymale Antigene, die durch die monoklonalen Antikörper SH2 und SH3 erkannt werden. Ausnahmslos wurden keine immunophänotypischen Unterschiede zwischen fibroblastenartigen und großen, flachen, runden Zellen beobachtet.
Kleine, runde Zellen, die innerhalb von Kolonien beobachtet wurden, erwiesen sich als CD45⁺ und CD34^– und wurden nicht weiter analysiert.
Eine fließzytometrische Analyse von nach 10-tägiger Züchtung mit EDTA freigesetzten stromalen Zellen zeigte, dass mehr als 85% der Zellen besondere humane mesenchymale Stammzellen-Oberflächenproteine exprimieren, die durch die monoklonalen Antikörper SH-2 und SH-3 nachgewiesen wurden (3A). Insgesamt ergab die fließzytometrische Analyse von mit EDTA freigesetzten stromalen Zellen keine Expression von mit Progenitorzellen oder reifen hämatopoetischen Zellen assoziierten Antigenen, wie CD34, CD45 und CD14. 3B zeigt das Färbungsmuster von mit EDTA freigesetzten stromalen Knochenmarkzellen nach Markierung mit den Antikörpern SH2 und SH3.
Daher sind auf der Grundlage der Morphologie und des Oberflächenmembran-Phänotyps ex vivo erzeugte hMSCs aus mobilisierten hHSC-Ernten nicht von von Knochenmark abgeleiteten, humanen mesenchymalen Stammzellen unterscheidbar.
Quantitative Bestimmung von hMSCs in hHSC-Ernten nach Mobilisierung durch Wachstumsfaktoren
Der Gehalt an hMSCs in mit Wachstumsfaktor mobilisierten hHSC-Ernten wurde fließzytometrisch unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers SH2 gemessen. SH2⁺-hMSCs wurden im höheren Lymphozytenteil und im unteren Teil des Monozyten-Zellclusters in einem Vorwärts- und Seiten-Streuungspunktdiagramm lokalisiert. Um die enge Überlappung zwischen SH2⁺- und CD14⁺-Zellen und die nichtspezifische Bindung des sekundären Antikörpers (IgG₁) an Monozyten zu vermeiden, wurde um die obere Zone eine Sperre gelegt, um CD14⁺-Zellen auszuschließen und SH-2⁺/CD14^–-Zellen zu zählen.
SH2⁺-hMSCs wurden in 11/14 hHSC-Ernten festgestellt. Der prozentuale Median der SH2⁺-Zellen in Aphereseprodukten betrug 0,63% (Bereich 0,02–2,32). Es wurde keine Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil von SH2⁺-Zellen oder der Gesamtmenge an SH2⁺-Zellen pro Ernte und dem Typ des Wachstumsfaktors (GM-CSF oder G-CSF), der zur Mobilisierung der hHSC-Ernten verwendet wurde, festgestellt.
Um festzustellen, ob der Wirkungsgrad der hHSC-Mobilisierung (gemessen als Menge der gewonnenen CD34⁺-Zellen) mit der Menge an SH2⁺-Zellen pro Apherese korrelierte, wurde der Typ der Beziehung zwischen beiden Variablen analysiert. Wie aus 4 ersichtlich ist, stellten wir bei Berücksichtigung der gesamten Gruppe von 14 untersuchten Patienten eine sehr starke Korrelation (r = 0,92, P < 0,001) zwischen der absoluten Anzahl an CD34⁺-Zellen und der von SH2⁺-Zellen in jedem Aphereseprodukt fest. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die SH2⁺-Anzahl aus der CD34⁺-Zellzahl mit hoher Aussagewahrscheinlichkeit vorhergesagt werden kann.
Aus dem Blut von 3 normalen Spendern präparierte mononukleare Zellen waren negativ auf SH2⁺-Zellen, während mononukleare Zellen, die aus einer Nicht-Brustkrebs-Patientin präpariert worden waren, nach 5-tägiger Stimulation mit G-CSF 0,11% SH2⁺-hMSCs enthielten.
Diskussion
Während in mit Wachstumsfaktor mobilisierten Aphereseprodukten die Anwesenheit von hämatopoetischen Progenitorzellen sowie die von zusätzlichen Immun- und Tumorzellen gut dokumentiert ist^5,6,18,19,29, gibt es unserer Kenntnis nach keine früheren Berichte über die Anwesenheit von hMSCs in hHSC-Ernten.
Wir bedienten uns hier einer doppelten Vorgehensweise, die die ex vivo-Erzeugung von hMSCs und ihre phänotypische Charakterisierung umfasst, um die Anwesenheit von hMSCs in mit Wachstumsfaktor mobilisierten hHSC-Ernten von Brustkrebs-Patientinnen zu untersuchen.
Mononukleare Zellen geringer Dichte aus hHSC-Ernten führen bei Züchtung in Gegenwart von FCS zu einer Population von stark anhaftenden Zellen, die sowohl isolierte als auch kolonienbildende fibroblastenartige Zellen umfassen, die im letztgenannten Fall zusammen mit großen, flachen, runden Zellen wachsen. Typische Knochenmarkstroma-Differenzierungsmarker, z. B. eine positive Reaktion auf Sudanschwarz und alkalische Phosphatase²³, werden in von einer PBPC-Ernte abgeleiteten, anhaftenden Zellen nur schwach exprimiert oder sind abwesend. Frühe oder späte myeloide Progenitorantigene, wie CD34, CD45 und CD14, werden von diesen Zellen nicht exprimiert. Andererseits werden die von hHSC-Ernten abgeleiteten hMSCs durch die Antikörper SH2 und SH3 erkannt, die mit Antigenen an der Oberfläche von von Knochenmark abgeleiteten humanen mesenchymalen Stammzellen reagieren, jedoch nicht mit von Knochenmark abgeleiteten hämatopoetischen Zellen reagieren¹³. Ferner zeigen unsere Untersuchungen, dass die phänotypischen Eigenschaften von von hHSC-Ernten abgeleiteten hMSCs ähnlich denen von von Knochenmark abgeleiteten hMSCs sind.
Literatur

1. Goldman J, "Peripherblut-Stammzellen für die Allotransplantation", Blond 1995; 85: 1413–1415.
2. Schmitz N, Gratwohl A, Goldman J, "Allogene und autologe Transplantation bei hämatologischen Krankheiten, festen Tumoren und Immunstörungen. Derzeitige Praxis in Europa im Jahr 1996 und Vorschläge für eine Operationsklassifikation", BMT 1996; 17: 471–477.
3. Richman CM, Winer RS, Yankee Rk, "Zunahme an zirkulierenden Stammzellen im Anschluss an eine Chemotherapie beim Menschen", Blond 1976; 47: 1031–1039.
4. Siena S, Bregni M, Brando B et al., "Zirkulation von hämatopoetischen CD34+-Stammzellen im peripheren Blut von mit hohen Dosen an Cyclophosphamid behandelten Patienten: Verstärkung durch intravenöse Gabe von rekombinantem humanem Granulozyten-Makrophagen-Kolonienstimulierendem Faktor", Blond 1989; 74: 905–1914.
5. Chao NJ, Schriber JR, Grimes K et al., "Mit Granulozyten-Kolonienstimulierendem Faktor "mobilisierte" Peripherblut-Vorläuferzellen beschleunigen die Erholung von Granulozyten und Blutplättchen nach hochdosierter Chemotherapie", Blond 1993; 81: 2031-2135.
6. Peters WP, Rosner G, Ross M, et al., "Wirkungsvergleich von Granulozyten-Makrophagen-Kolonien-stimulierendem Faktor (GM-CSF) und Granulozyten-Kolonien-stimulierendem Faktor (G-CSF) auf die Entwicklung von Blutvorläuferzellen zur Verwendung zusammen mit autologem Knochenmark nach hochdosierter Chemotherapie", Blond 1993; 81: 1709–1719.
7. Sutherland HJ, Eaves CJ, Lansdorp PM et al., "Kinetik der Mobilisierung von festgelegten und primitiven Blutvorläuferzellen nach Chemotherapie und Behandlung mit Wachstumsfaktor und deren Verwendung bei Autotransplantaten", Blood 1994; 83: 3808–3814.
8. Mohle R, Haas R, Hunstein W, "Expression von Haftmolekülen und c-Kit an hämatopoetischen CD34+-Vorläuferzellen: Vergleich von Cytokinmobilisierten Blutstammzellen mit normalem Knochenmark und peripherem Blut", J. Hematother. 1993; 2: 483–489.
9. Fernandez M, Minguell JJ, "Adhäsive Wechselwirkungen im hämatopoetischen System: Regulation durch Cytokine", Proc Soc Exp Biol Med 1996; 313–323.
10. Orazi A, Cattoretti G, Schiro R et al., "In vivo-Verabreichung von rekombinantem humanem Interleukin-3 und rekombinantem humanem Granulozyten-Makrophagen-Kolonien-stimulierendem Faktor nach hochdosierter Cyclophosphamid-Krebs-Chemotherapie: Einfluss auf die Hämatopoese und die Mikroumgebung in humanem Knochenmark", Blood 1992; 79: 2610–2619.
11. Dedhar S, Gaboury L, Galloway P, Eaves C, "Humaner Granulozyten-Makrophagen-Kolonien-stimulierende Faktor ist ein Wachstumsfaktor, der bei einer Reihe von Zelltypen nicht-hämatopoetischen Ursprungs aktiv ist.", Proc Natl Acad Sci (USA) 1988; 85: 9253,–9257.
12. Haynesworth SE, Baber MA, Caplan Al., "Zelloberflächenantigene an humanen, von Knochenmark abgeleiteten, mesenchymalen Zellen werden durch monoklonale Antikörper nachgewiesen", Bone 1992; 13: 69–80.
13. Chichester, CO, Fernandez M. Minguell JJ, "Extrazelluläre Matrix-Genexpression durch Knochemmark-Stroma und Knochenmark-Fibroblasten", Cell Adhesion Commum 1993, 1: 93–99.
14. Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL et al., "Ex vivo-Expansion und anschließende Infusion von humanen, von Knochenmark abgeleiteten, stromalen Vorläuferzellen (mesenchymalen Vorläuferzellen): Bedeutung für die therapeutische Anwendung", BMT 1995; 16: 557–564.
15. Haynesworth SE, Baber MA, Caplan Al., "Zelloberflächenantigene an humanen, von Knochenmark abgeleiteten, mesenchymalen Zellen werden durch monoklonale Antikörper nachgewiesen", Bone 1992; 13: 69–80.
16. Simmons PJ, Torok-Storb B, "Identifizierung von stromalen Zellvorläufern in humanem Knochenmark durch einen neuartigen monoklonalen Antikörper", STRO-1. Blond 1991; 78: 55–62.
17. Bradt J, Srour EF, van Besien K et al., "Cytokin-abhängige Langeitkultur von hochgradig angereicherten hämatopoetischen Vorläuferzellen aus humanem Knochenmark" J Clin Invest 1990; 86: 932–941.
18. Greenberger JD, "Die hämatopoetische Mikroumgebung", Critic Rev Oncol/Hematol 1991; 11: 65–84.
19. Prockop DJ, "Knochenmark-Stroma-Zellen als Stammzellen für nicht-hämatopoetische Gewebe", Science 1997; 276: 71–74.
20. Siena S, Di Nicola M, Bregni M et al., "Massive ex vivo-Erzeugung von funktionellen dendritischen Zellen aus mobilisierten CD34-Blutvorläuferzellen für die Antikrebs-Therapie," Exper. hematol 1995; 23: 1463–1471.
21. Silva MR, Parreira A, Ascensao JL, "Anzahl und Aktivität von natürlichen Killerzellen in mobilisierten peripheren Blutzell-Transplantaten: Bedingungen für die in vitro-Expansion", Exper Hematol 1995; 23: 1676–1681.
22. Ross AA, Cooper BW, Lazarus HM et al., "Nachweis und Lebensfähigkeit von Tumorzellen in Peripherblut-Stammzellpräparaten von Brustkrebspatienten unter Anwendung von immunozytochemischen und klonogenen Testtechniken, Blond 1993; 82: 2605–2610.
23. Pereira RF, Halford KW, O'Hara MD et al., "Gezüchtete adhäsive Zellen aus Knochenmark können als lange beständige Vorläuferzellen für Knochen, Knorpel und Lunge in bestrahlten Mäusen verwendet werden", Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 4857–4861.
24. Gronthos S, Greaves SE, Ohta S, Simmons PJ, Die SRO-L+-Fraktion von adultem humanem Knochenmark enthält die osteogenen Vorläufer", Blood 1994; 84: 4164–4173.
25. Galmiche MC, Koteliansky VE, Briere J, et al., "Stromale Zellen aus humanen Langzeit-Knochenmarkkulturen sind mesenchymale Zellen, die unter Einhaltung eines Differenzierungswegs für vaskuläre glatte Muskulatur differenzieren", Blood 1993; 82: 66–76.
26. Wilkins BS, Jones DB, "Immunohistochemische Charakterisierung von intakten stromalen Lagers in Langzeitkulturen von humanem Knochenmark," Br J Haematol 1995; 90: 757–766.
27. Verfaille C, Nurley R, Bhatia R et al., "Die Rolle von Knochenmark-Matrix bei normaler und abnormaler Hämatopoese, Critic Rev Oncol/Hematol 1994; 16: 201–224.
28. Zipori D, "Gezüchtete stromale Zelllinien aus hämatopoetischen Geweben", in Tavassoli M (Herausg.), Handbook of the hemopoietic microenvironment, Humana Press: Clifton, New Jersey, 1989, pp 287–329.
29. Leavesley DI, Oliver JM, Svmrt BW, et al., "Signale des Blutplättchen/Endothelzellen-Haftmoleküls verstärken die Adhäsionsaktivität des sehr späten Antigen-4-Integrins von humanen hämatopoetischen CD34+-Vorläuferzellen", J Immunol 1994; 153: 4673–4683.
30. Klein G, Muller CA, Tillet E, et al., "Kollagen-Typ VI in der humanen Knochenmark-Mikroumgebung: Eine stark zytoadhäsive Komponente", Blood 1995; 86: 1740–1748.
31. Fernandez M, Minguell JJ, "G-CSF reguliert die Expression von mRNA für die Erzeugung von Kollagen-Typ VI und Kollagen VI in humanen Knochenmark-Stromazellen, Hematology 1997; in press.

Claims

Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen, die SH2+, SH3+ und/oder SH4+ sind, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Zellersatztherapie, Gentherapie, Knochenmarktransplantation, für orthopädische Anwendungen und zur Behandlung von Osteoarthritis, Osteoporose und traumatischen oder pathologischen Zuständen des Bindegewebes, wobei die mesenchymalen Stammzellen aus dem peripheren Blut nach Verabreichung einer wirksamen Menge eines Wachstumsfaktors, der aus der Gruppe G-CSF und GM-CSF ausgewählt ist, erhalten worden sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die mesenchymalen Stammzellen ferner CD14- und CD34- sind.