DE69920439T2

DE69920439T2 - Nicotianamin synthase und für diese kodierendes gen

Info

Publication number: DE69920439T2
Application number: DE69920439T
Authority: DE
Inventors: Satoshi Mori; Kyoko Higuchi; Kazuya Suzuki; Naoko Nishizawa; Hiromi Nakanishi
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2019-05-01
Also published as: CA2327261C; JP3893024B2; DE69920439D1; US7192755B1; WO1999057249A1; EP1077255B1; AU759256B2; US20070150981A1; ES2229702T3; EP1077255A1; EP1077255A4; AU3627399A; US7604972B2; CA2327261A1; US20080233627A1; US7396668B2

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nicotianaminsynthase, die am Biosyntheseweg von Muginsäure beteiligt ist, außerdem deren Aminosäuresequenz, ein Gen, das dieselbe codiert, einen Vektor, einen Prozess zur Herstellung des Nicotianamins unter Verwendung derselben, Transformanden, wie z.B. Pflanzen, die durch das Gen transformiert sind, das die Nicotianaminsynthase codiert, als auch einen Antikörper gegen die Nicotianaminsynthase.
Hintergrund
Gramineen-Pflanzen, die durch Chelatieren des Fe(III) im unlöslichen Zustand im Boden mithilfe der Muginsäure absorbieren und den sogenannten Mechanismus der 2. Strategie zur Fe-Anreicherung anwenden, sekretieren Fe-Chelatoren (Phytosiderophore) aus ihren Wurzeln, um das kaum lösliche Fe in der Rhizosphäre anzulösen (Roemheld, 1987). Die Menge an sekretierten Phytosiderophoren steigt unter Fe-Defizienz-Stress. Die Muginsäure-Familie stellt das einzige bisher bekannte Beispiel von Phytosiderophoren dar (Takagi, 1976). Die Toleranz gegenüber einer Fe-Defizienz in Gramineen wird als von einer bestimmten Menge der Muginsäure-Familie, die von Pflanzen sekretiert wird, abhängig erachtet (Takagi et al. 1984, Roemheld und Marschner 1986, Marschner et al. 1987, Mori et a. 1987, Kawai et al. 1988, Mori et al. 1988, Mihasi und Mori 1989 und Shingh et al. 1993).
Der Biosyntheseweg der Muginsäure in Pflanzen ist in 1 gezeigt. S-Adenosylmethionin wird aus Methionin durch die S-Adenosylmethioninsynthase synthetisiert. Daraufhin werden drei Moleküle des S-Adenosylmethionins zur Bildung eines Moleküls des Nicotianamins durch die Nicotianaminsynthase kombiniert. Das erzeugte Nicotianamin wird dann zu 3''-Ketosäure durch Nicotianaminaminotransferase umgewandelt und dann 2'-Desoxymuginsäure durch die anschließende Wirkung einer Reduktase synthetisiert. Eine weitere Reihe von Hydroxylierungsschritten erzeugt die anderen Muginsäure-Derivate einschließlich der Muginsäure aus der Desoxymuginsäure (Mori und Nishizawa 1987, Shojima et al. 1989, Shojima et al. 1990 und Ma und Nomoto 1993).
Eine Verbindung in 1, die Verbindung in der unteren rechten Hälfte, worin R₁ und R₂ Wasserstoff sind und R₃ Hydroxyl ist, ist Muginsäure. Eine Verbindung, worin R₁ Wasserstoff ist und R₂ und R₃ Hydroxyl sind, ist 3-Hydroxymuginsäure. Außerdem ist eine Verbindung, worin R₂ Wasserstoff ist und R₁ und R₃ Hydroxyl sind, 3-Epihydroxymuginsäure.
Drei S-Adenosylmethioninsynthase-Gene wurden aus Gerstenwurzeln isoliert, doch wurden diese Gene durch eine Fe-Defizienz nicht induziert (Takizawa et al. 1996). Ein Gen, Ids3, welches aus der Gerste durch Differentialscreening erhalten wird, wird als ein Gen vermutet, welches Desoxymuginsäure durch Hydroxylierung zu Muginsäure umwandelt und das durch eine Fe-Defizienz stark induziert wird (Nakanishi et al. 1993). Weiterhin wurde Nicotianaminaminotransferase aus Fe-defizienten Gerstenwurzeln ausgereinigt und isoliert, und es wurden zwei Nicotianaminaminotransferase-Gene, Naat-A und Naat-B, isoliert (Takahashi et al. 1997). Die Naat-A-Expression wurde in Fe-defizienten Wurzeln induziert.
Die Synthese von Nicotianamin aus S-Adenosylmethionin ist ähnlich der Polyamin-Synthese aus Decarboxy-S-Adenosylmethionin. Im Gegensatz zur Polyaminsynthase katalysiert die Nicotianaminsynthase jedoch eine Kombination aus drei S-Adenosylmethionin-Molekülen und zugleich die Azetidin-Ringbildung (1). Daher handelt es sich bei der Nicotianaminsynthase um einen neuartigen Typ von Enzym. Zuvor haben wir von der teilweisen Ausreinigung von Nicotianaminsynthase aus den Wurzeln der Fe-defizienten Gerste und dem Expressionsmustern der Aktivität berichtet (Higuchi et al. 1994, Higuchi et al. 1995, Kanazawa et al. 1995, Higuchi et al. 1996a und Higuchi et al. 1996b). Da sich Nicotianaminsynthase während der Extraktion und Ausreinigung leicht zersetzt, war es schwierig, ausreichende Mengen für die Aminosäure-Sequenzierung zu reinigen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Erzeugung einer Pflanze, insbesondere einer Gramineen-Pflanze, mit einer hochgradigen Toleranz gegenüber einem Fe-Defizienz, als Ergebnis der Isolierung und Aufreinigung einer Nicotianaminsynthase, das Klonieren des Gens dieses Enzyms, das Bestimmen seiner Basensequenz und Aminosäuresequenz und das Verwenden des Enzyms.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Enzym, das eine Nicotianaminsynthase-Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus folgendem:

(a) SEQ ID NR. 1, oder
(b) einer Sequenz, die homolog zu SEQ ID NR. 1 ist, vorzugsweise ein Enzym, das aus Gerste stammt (und bevorzugter ein Enzym mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 1, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13) oder ein Enzym, das aus Oryza sativa stammt (und bevorzugter ein Enzym mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 15) oder ein Enzym, das aus Arabidopsis stammt (und bevorzugter ein Enzym der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 17, 19 oder 21).

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Gen bereit, das die Aminosäuresequenz des Enzyms codiert, oder eine Nukleinsäure, die dieses Enzym codiert, welches Nicotianaminsynthase-Aktivität aufweist, wobei die Nukleinsäure eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus folgendem:

(A) SEQ ID NR. 2
(B) einer Sequenz, die homolog zu SEQ ID NR. 2 ist, vorzugsweise eine Nukleinsäure, die aus Gerste stammt (bevorzugter eine Nukleinsäure mit der Basensequenz der SEQ ID NR. 2, 4, 6, 8, 10, 12 oder 14); oder eine Nukleinsäure, die aus Oryza sativa stammt (bevorzugter eine Nukleinsäure mit der Basensequenz der SEQ ID NR. 16) oder eine Nukleinsäure, die aus Arabidopsis stammt (bevorzugter eine Nukleinsäure mit der Basensequenz der SEQ ID NR. 18, 20 oder 22) und nicht bevorzugt, dass die Nukleinsäure DNA ist.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Vektor bereit, der eine Nukleinsäure umfasst, wie oben definiert, vorzugsweise eine Expressionsvektor, und einen nichthumanen Transformanden, der durch die Vektoren transformiert ist, worin das Fremdgen vorzugsweise ein Gen mit der Basensequenz der SEQ ID NR. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 oder 22 ist.
Bei anderen Aspekten stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines Nicotianamins bereit, welches die Verwendung des obigen Transformanden umfasst, eines Antikörpers gegen die Enzyme, wie oben angegeben, vorzugsweise eines polyklonalen Antikörpers oder eines monoklonalen Antikörpers, und ein Verfahren zur Aufreinigung der Nicotianaminsynthase, welches umfasst: die Verwendung eines Thiolprotease-Hemmers, die Verwendung von CHAPS-Puffer, die Verwendung der Ionenaustausch-Chromatographieträger DEAE-Sepharose FF^® oder DEAE Sephacel^®, die Verwendung des hydrophoben Chromatographieträgers TSK-Gel Butyl Toyopearl^® und die Verwendung des hydrophoben Chromatographieträgers TSK-Gel Ether Toyopearl^®, wobein der Thiolprotease-Hemmer vorzugsweise E-64 ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den Biosyntheseweg der Muginsäure-Familie.
2 zeigt einen Vergleich der Ausreinigung der Nicotianaminsynthase aus Feabhängigen und aus Kontroll-Gerstenwurzeln.
3 zeigt die präparative SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, im folgenden bezeichnet als SDS-PAGE) um 30 – 35 kDa. Die horizontalen Balken zeigen die relative Enzymaktivität, wie aus den Gelen nachgewiesen.
4 zeigt das Elutionsmuster der Nicotianaminsynthase-Aktivität aus der Gelfiltrationssäule.
Die großen ausgefüllten Kreise (•) zeigen die Enzymaktivität.
5 zeigt einen Vergleich mit einer Teilsequenz von sechs Aminosäuren, wie bestimmt anhand von Nicotianaminsynthase, die aus Gerste stammt, und einer ähnlichen Sequenz von Gramineen, wie durch Computerdurchsuche der Datenbank erhalten. Ein identischer Aminosäure-Rest ist in ":" gezeigt.
6 zeigt eine HvNAS1-cDNA der vollen Länge und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz. Die unterstrichenen Sequenzen geben die identischen partiellen Amino säuresequenzen der in obiger 5 gezeigten Fragmente an. Die Zahlen der Nukleotidsequenzen sind rechts jeder Reihe angegeben. Die Zahlen der Aminosäuren sind links jeder Reihe angegeben.
7 zeigt einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der obigen 7 cDNAs, die aus Gerste erhalten wurden. Sternchen "*" zeigt identische Aminosäure-Reste in allen Sequenzen auf.
8 zeigt die Ergebnisse der dünnschichtchromatographischen (TLC) Analyse der Nicotianaminsynthase-Aktivität, wie aus E. coli-Rohextrakt erhalten, die ein Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-HvNAS1-exprimiert.
9 zeigt die Northern-Hybridisationsanalyse von HvNAS1 als einer Sonde.
10 zeigt die Southern-Hybridisationsanalyse von HvNAS1 als einer Sonde.
11 zeigt die Western-Blot-Analyse des Rohenzyms, wie zum Nachweis der Nicotianaminsynthase-Aktivität verwendet.
12 zeigt die Western-Blot-Analyse des durch Trichloressigsäure/Aceton extrahierten Gesamtproteins.
13 zeigt einen Vergleich der Ausreinigung von Nicotianaminsynthase aus Fedefizienter Gerste und Kontroll-Gerste nach DEAE-Sepharose FF.
14 zeigt einen Vergleich der Ausreinigung von Nicotianaminsynthase aus Fedefizienter Gerste und Kontroll-Gerste nach Ether Toyopearl* 650M (* eingetragenes Markenzeichen).
15 zeigt die Ergebnisse der dünnschichtchromatographischen (TLC) Analyse der Nicotianaminsynthase-Aktivität, wie aus E. coli-Rohextrakt erhalten, die ein Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-OsNAS1-exprimiert.
16 zeigt die Northern-Hybridisationsanalyse von OsNAS1 als einer Sonde.
17 zeigt die Ergebnisse der dünnschichtchromatographischen (TLC) Analyse der Nicotianaminsynthase-Aktivität, wie aus E. coli-Rohextrakt erhalten, die Fusionsproteine mit dem Maltose-Bindungsprotein-AtNAS1, AtNAS2 oder AtNAS3-exprimiert.
18 zeigt die Ergebnisse der RT-PCR der Gesamt-RNA, die aus den über dem Boden befindlichen Teilen und den Wurzeln von Arabidopsis thaliana extrahiert wurden. Die rechte Gruppe gibt die positive Kontrolle wieder.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Wir haben versucht, Nicotianaminsynthase zu isolieren (Higuchi et al. Plant & Soil, Bd. 165, S. 173–179, 1994), doch da Nicotianaminsynthase sich leicht zersetzte und schwer zu isolieren und zu reinigen war, konnten wir keine ausreichenden Mengen an Protein erhalten, um seine partielle Aminosäuresequenz zu bestimmen. Später wurde festgestellt, dass ein Thiolprotease-Hemmer E-64 (im folgenden als E-64 bezeichnet) sehr wirksam im Unterdrücken des Abbaus von Nicotianaminsynthase war (Higuchi et al. Plant & Soil, Bd. 178, S. 171–177, 1996a).
Bei der vorliegenden Erfindung konnte als Folge des Zerstoßens von gefrorenen Wurzeln zu einem Feinpulver in Flüssig-N₂ und dann schnellen Homogenisierens mit Puffer, der 0,1 mM Thiolprotease-Hemmer E-64 enthielt, das Nicotianaminsynthase-Protein isoliert werden, ebenso wie sein Gen.
Ferner gewann das Enzym der vorliegenden Erfindung seine Aktivität durch Entfernen des SDS nach der SDS-PAGE-Behandlung zurück, doch war die Rückgewinnungsrate sehr niedrig (Higuchi et al. Plant & Soil, Bd. 165, S. 173–179, 1994). Folglich sollte der Grad der Ausreinigung vor der SDS-PAGE-Behandlung erhöht werden. Daraufhin wurden die säulenchromatographischen Verfahrensweisen weiter verbessert.
Wir haben außerdem festgestellt, dass das Enzym der vorliegenden Erfindung relativ hydrophob ist und ein Puffer, der ein mildes oberflächenaktives Mittel, CHAPS, enthielt, die Rückgewinnungsrate erhöhte. Verschiedene Ionenaustauscher-chromatograpische Träger wurden getestet, und DEAE-Sepharose FF und DEAE-Sephacel wurden als am wirksamsten befunden. Über TSK-Gel Butyl Toyopearl* hinaus entfernte auch ein anderer hydrophober chromatographischer Träger, TSK-Gel Ether Toyopearl* 650M, die Unreinheiten des 30 – 35 kDa wirksam.
Vom Enzym der vorliegenden Erfindung wurde berichtet, dass es das Peptid von 30 – 35 kDa war, dessen Aktivität durch Entfernen des SDS nach der SDS-PAGE-Behandlung wiederhergestellt wurde, wobei die Aktivität als ein breiter Molekulargewichtsbereich von 30 – 35 kDa nachgewiesen wurde (siehe 3). 3 zeigt ein Ergebnis der präparativen SDS-PAGE in den Fraktionen, die eine Enzymaktivität zeigen. SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 11% Acrylamid-Flachgelen vorgenommen. Eine Portion des Gels wurde mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt und der Rest des Gels mit Cu gefärbt. Das Gel, das Proteine von 30 – 35 kDa Größe enthielt, wurde in sieben Fragmente geschnitten (angegeben durch die kurzen Linien). Die dicken Balken in 3 zeigen die relativen Enzymaktivitäten an, die aus jedem Gelfragment bestimmt wurden.
Um das Nicotianaminsynthase-Peptid aus den Proteinen mit diesen Molekulargewichten zu identifizieren, wurden die Peptide, die in den Nicotianaminsynthase-Fraktionen, ausgereinigt aus Fe-defizienten und Kontroll-Gerstenwurzeln, enthalten waren, unter Anwendung von SDS-PAGE verglichen. Aus jeder Gerstenwurzel von 200 g wurde das vorliegende Enzym gemäß der in nachstehendem Beispiel 3 beschriebenen Methode ausgereinigt.
Die Enzymaktivität der Kontrolle betrug ein Viertel der bei den Fe-defizienten Wurzeln.
Die Peptidzusammensetzung der aktiven Enzymfraktion aus jedem Reinigungsschritt des vorliegenden Enzyms wurde analysiert und mittels SDS-PAGE verglichen, wobei die Ergebnisse in 2, 13 und 14 gezeigt sind. 2, 13 und 14 zeigen einen Vergleich mit der aktiven Fraktion aus dem Reinigungsschritt der Fe-defizienten Gerstenwurzeln von 200 g [in der Figur mit (–) gezeigt] und der aktiven Fraktion aus dem Reinigungsschritt der Kontroll-Gerstenwurzeln von 200 g [in der Figur mit (+) gezeigt]. SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 12,5% Acrylamid-Flachgelen durchgeführt (Laemmli, Nature, Bd. 227, S. 680–685, 1970). Die Gele wurden mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt. 2 zeigt einen Schritt vor der DEAE-Sepharose. Die obere Reihe zeigt das Enzym aus Fe-defizienten Gerstenwurzeln, und die untere Reihe zeigt das Enzym aus den Kontrollwurzeln. In jeder Bahn sind Bahnen 1, Rohextrakt, 200 μg Protein; Bahnen 2, nach Butyl Toyopearl 650M, 100 μg Protein; Bahnen 3, nach Hydroxyapatit, 20 μg Protein; und Bahnen 4, nach Butyl Toyopearl 650M, 15 μg Protein, gezeigt.
13 zeigt jede Bahn nach DEAE-Sepharose FF, 25 μg Protein. 14 zeigt nach Ether Toyopearl* 650M, wobei im linken Teil die inaktive Fraktion gezeigt ist und im rechten Teil die aktive Fraktion gezeigt ist, wobei 1/25 jeder Fraktion elektrophoretisch behandelt ist.
Als Ergebnis wurde nahezu kein Unterschied sowohl bei Fe-defizienten als auch Kontrollwurzeln vor dem DEAE-Sepharose-Schritt beobachtet (siehe 2). Nach dem DEAE-Sepharose-Schritt wurde klar, dass die 30- und 31-kDa-Peptide durch Fe-Defizienzl induziert wurden (siehe 13). Nach dem Ether Toyopearl*-Schritt wurde das 31-kDa-Peptid aus der aktiven Fraktion eliminiert. Die 32- und 33-kDa-Peptide wurden durch Fe-Defizienz als neu induziert festgestellt (siehe 14). Aktivitäten wurden bei den 32- und 33-kDa-Peptiden nachgewiesen, doch wurde keine Aktivität beim 30-kDa-Peptid festgestellt (siehe 3).
Das Molekulargewicht des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde durch Gelfiltration bestimmt.
Das mittels Gelfiltration beurteilte Molekulargewicht der Nicotianaminsynthase betrug berichtetermaßen 40.000 – 50.000 (Higuchi et al. Plant & Soil, Bd. 165, S 173–179, 1994). Dies stimmte allerdings nicht dem durch SDS-PAGE bestimmten Wert überein.
In der vorliegenden Studie erhöhte der Puffer, der CHAPS enthielt, die Auflösung effektiv, und das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde mit 35.000 bewertet (siehe 4). Dies entspricht dem mittels SDS-PAGE erhaltenen Wert.
4 zeigt das Elutionsmuster der Nicotianaminsynthase aus der Gelfiltrationssäule. Die schwarzen Kreise (•) geben die Enzymaktivität an, und die durchgezogene Linie gibt die Extinktion bei 280 nm an. Die aktive Fraktion wurde nach der Hydroxyapatit-Chromatographie auf eine Sephacryl S300HR-(Pharmacia)-Säule (1,5 cm × 71 cm, 125 ml) aufgebraucht, äquilibriert mit Entwicklerpuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,1 M KCl, 0,05% CHAPS, 0,1 mM p-APMSF und 3 mM DTT, pH 8,0). Die verwendeten Molekulargewichts-Marker waren Thyroglobulin (MR 670.000), γ-Globulin (MR 158.000), Oval bumin (MR 44.000) und Myoglobin (MR 17.000). Der lineare Fluss betrug 10 cm/Stunde.
Die partielle Aminosäuresequenz wurde aus gereinigter Nicotianaminsynthase bestimmt.
Die oben erläuterten 30-kDa-, 32-kDa- und 33-kDa-Peptide wurden aus 1 kg Fedefizienten Gerstenwurzeln unter Anwendung der hierin in Beispiel 3 beschriebenen Methode ausgereinigt. Diese wurden unter Anwendung der hierin in Beispiel 4 beschriebenen Methode teilweise zerlegt. Obschon 32- und 33-kDa-Peptide nicht vollständig voneinander getrennt werden konnten, könnten diese eine ähnliche Sequenz aufweisen, oder war das 32-kDa-Peptid vermutlich das Abbauprodukt des 33-kDa-Peptids, und beide wurden gemeinsam zerlegt.
Die bestimmten partiellen Aminosäuresequenzen zeigten, dass diese Peptide sehr ähnlich zueinander waren (5). Da außerdem die Molekulargewichte der 33-kDa- und 32-kDa-(1)-Fragmente nahezu unverändert im Vergleich zu vor der Zerlegung waren, könnte diese Sequenz die N-terminale Region des vorliegenden Enzyms sein. Als Ergebnis der Computerdurchsuche der Datenbank wurde ein Gen von unbekannter Funktion mit sehr ähnlicher Sequenz zu diesen Sequenzen gefunden, dass in Oryza sativa und Arabidogsis thaliana vorliegt. Insbesondere die EST-cDNA-Klone D23792 und D24790 von Oryza sativa waren sehr ähnlich bei 80,0% Identität bei einer 33-Aminosäuren-Überlappung bei ersterem und 68,4% Identität bei einer 19-Aminosäuren-Überlappung bei letzterem (5).
5 zeigt einen Vergleich mit einer Teilsequenz aus sechs Aminosäuren, wie bei aus Gerste stammender Nicotianaminsynthase bestimmt, und einer ähnlichen Sequenz von Gramineen, wie durch Computerdurchsuche der Datenbank erhalten. Ein identischer Aminosäure-Rest ist in ":" gezeigt. Der durch die Pfeile angegebene Teil der Nukleotidsequenzen wurde für die Sequenzen des bei der PCR verwendeten Primers verwendet.
Das Klonieren der Nukleotidsequenzen der cDNA-Klone, die Nicotianaminsynthase codieren, wurde vorgenommen und bestimmt.
Die PCR-Amplifikation der Gesamt-cDNA, die aus Fe-defizienten Gerstenwurzeln unter Verwendung degenerierter Primer erhalten wurde, wie aus der partiellen Aminosäuresequenz konstruiert, die mittels der zuvor erörterten Methode erhalten worden war, wurde durchgeführt, doch konnte die Ziel-DNA nicht amplifiziert werden. Daraufhin wurden die Primer mit einer einzelnen Nukleotidsequenz (durch Pfeile in 5 gezeigt) aus Sequenzen von Oryza sativa, D23792 und D24790, synthetisiert und die PCR-Amplifikation vorgenommen. Das 205-bp-Fragment wurde mittels PCR unter Verwendung von NF- und NR-Primern amplifiziert und das 274-bp-Fragment mittels PCR unter Verwendung von IF- und IR-Primern amplifiziert, wobei diese die Zielsequenzen enthielten. Eine unter Verwendung von Poly(A)⁺ RNA aus Fe-defizienten Gerstenwurzeln hergestellte cDNA-Bank wurde gescreent und 19 positive Klone unter Verwendung der 205-bp-Fragment-Sonde und 88 positive Klone unter Verwendung der 274-bp-Fragment-Sonde erhalten.
Unter den derart erhaltenen Klonen enthielt der als HvNAS1 bezeichnete Klon eine translatierte Region von 985 bp, wobei die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ein Rest aus 328 Aminosäuren war mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von 35.144. Dies entsprach dem mittels SDS-PAGE und Gelfiltration bestimmten Wert gut. Die partiellen Aminosäuresequenzen der 32-kDA- und 33-kDa-Peptide waren vollständig in HvNAS1 enthalten (6).
6 zeigt die HvNAS1-cDNA der vollen Länge und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Die unterstrichenen Sequenzen zeigen die identischen partiellen Aminosäuresequenzen der in obiger 5 gezeigten Fragmente. Die Zahlen der Nukleotidsequenzen sind rechts jeder Reihe angegeben. Die Zahlen der Aminosäuren sind links jeder Reihe angegeben.
Der vorhergesagte pI von 5.2 entsprach dem durch native isoelektrische Fokussierungs-Elektrophorese geschätzten Wert gut. Die sechs anderen Klone als HvNAS1, nämlich HvNAS2, HvNAS3, HvNAS4, HvNAS5, HvNAS6 und HvNAS7, mit sehr ähnlicher Sequenz wurden ebenfalls erhalten (Tabelle 1, 7).
7 zeigt einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der obigen 7 aus Gerste erhaltenen cDNA. Sternchen, "*" weist auf identische Aminosäure-Reste in allen Sequenzen hin.
Die Nukleotidsequenzen dieser Klone sind in SEQ ID NR. 2 (HvNAS1), SEQ ID NR. 4 (HvNAS2), SEQ ID NR. 6 (HvNAS3), SEQ ID NR. 8 (HvNAS4), SEQ ID NR. 10 (HvNAS5), SEQ ID NR. 12 (HvNAS6) bzw. SEQ ID NR. 14 (HvNAS7) gezeigt. Die Aminosäuresequenzen dieser Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NR. 1 (HvNAS1), SEQ ID NR. 3 (HvNAS12, SEQ ID NR. 5 (HvNAS3), SEQ ID NR. 7 (HvNAS4), SEQ ID NR. 9 (HvNAS5), SEQ ID NR. 11 (HvNAS6) bzw. SEQ ID NR. 13 (HvNAS7) gezeigt. Tabelle 1 Eigenschaften der nas-Klone
Die aus dem 30-kDa-Peptid bestimmten partiellen Aminosäuresequenzen waren alle in HvNAS5 enthalten. Die 5'- und 3'-nicht-translatierten Regionen dieser Klone waren nicht ähnlich zueinander.
D23792 und D24790 ähnlich der Nicotianaminsynthase von Oryzae sativa wurden von etwa 80% Identität zu HvNAS1 festgestellt. AC003114 und AB005248 von Arabidopsis thaliana wurden von etwa 45% Identität zu HvNAS1 festgestellt.
Das erhaltene HvNAS1-Protein wurde in E. coli exprimiert.
Die PCR-Amplifikation von HvNAS1 ORF wurde mit Vektor pMAL-c2 kloniert, um C-terminal mit dem Maltose-Bindungsprotein fusioniertes HvNAS1 zu exprimieren. Die Expression des Fusionsproteins wird durch IPTG stark induziert.
Der Rohextrakt wurde aus dem transformierten E. coli erhalten und die Nicotianaminsynthase-Aktivität im Zustand des Fusionsproteins untersucht. Im Rohextrakt aus dem mit lediglich dem Vektor transformierten Stamm konnte die Aktivität nicht nachgewiesen werden, wohingegen im Fall der Insertion von HvNAS1 ORF die Aktivität nachgewiesen wurde. Das Ergebnis ist in 8 gezeigt.
8 zeigt die Ergebnisse der dünnschichtchromatographischen (TLC) Analyse der Nicotianaminsynthase, die aus E. coli-Rohextrakt erhalten wurde, welche ein Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-HvNAS1-exprimiert. In 8, Bahn 1: eine standardmäßige Nicotianaminsynthase; Bahn 2: E. coli, exprimierend Maltose-Bindungsprotein (SAM); und Bahn 3: E. coli, exprimierend mit dem Maltose-Bindungsprotein fusioniertes Protein-HvNAS1.
Die mittels der in untenstehendem Beispiel 7 beschriebenen Methode durchgeführte Northern-Hybridisationsanalyse zeigte, dass dieses Gen in Fe-defizienten Wurzeln stark induziert wurde (9). Dies stimmt mit dem Expressionsmuster der vorliegenden Enzymaktivität überein (Higuchi et al. 1994). 9 zeigt ein Ergebnis der Northern-Hybridisationsanalyse unter Verwendung von HvNAS1 als einer Sonde. Die Gesamt-RNA wurde aus Gerstenblätter und -Wurzeln nach einwöchiger Fe-defizienter Behandlung und Kontroll-Gerstenblätter und -Wurzeln extrahiert, und in jeder Bahn wurden 5 μg RNA elektrophoretisch behandelt.
Die Southern-Hybridisationsanalyse der Gersten-Genom-DNA wurde gemäß der in untenstehendem Beispiel 8 beschriebenen Methode vorgenommen. Das Schneiden der DNA mit BamHI, EcoRI oder HindIII erzeugte eine Vielzahl von Fragmenten, wobei allerdings keiner der derzeit erhaltenen Klone mit BamHI und EcoRI verdaut werden konnte, weshalb folglich das Nicotianaminsynthase-Gen in multipler Kopienzahl in den Genomen von Gerste und Reis vorliegen könnte (10).
10 zeigt die Southern-Hybridisationsanalyse von HvNAS1 als einer Sonde. Genomische DNAs von Gerste und Reis wurden mit BamHI (Bahnen B), EcoRI (Bahnen R) und HindIII (Bahnen H) verdaut, und 10 μg davon wurden in jeder Bahn elektrophoretisch behandelt.
Weiterhin wurden unter Verwendung von Antigen, das mittels der in nachstehendem Beispiel 9 beschriebenen Methode erhalten worden war, eine Western-Blot-Analyse gemäß der in Beispiel 10 beschriebenen Methode vorgenommen. Es wurde festgestellt, dass das vorliegende Enzymprotein während des Vorgangs im Rohextrakt schnell zersetzt wurde, welcher zum Nachweis der vorliegenden Enzymaktivität zubereitet worden war (11). Das Färbungsmuster stimmte mit der Tatsache überein, dass die vorliegende Enzymaktivität in dem breiten Bereich von 30 – 35 kDa gemäß SDS-PAGE nachgewiesen wurde (siehe 3).
11 zeigt die Western-Blot-Analyse des zum Nachweis der Aktivität verwendeten Rohenzyms. SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 125% Acrylamid-Flachgel durchgeführt. 100 μg des Proteins wurden elektrophoretisch behandelt.
Der aus denaturiertem Protein gemäß der in nachstehendem Beispiel 10 beschriebenen Methode erhaltene Rohextrakt wurde als nahezu einzige Bande mit 35 – 36 kDa nachgewiesen (12). Dieser Wert stimmt mit dem hergeleiteten Wert aus der Aminosäuresequenz überein.
12 zeigt die Western-Blot-Analyse des durch Trichloressigsäure/Aceton extrahierten Gesamtproteins. SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 12,5% Acrylamid-Flachgel durchgeführt. 100 μg Protein wurden elektrophoretisch behandelt. 200 μg aus Wurzeln extrahierte Proteine und 500 μg aus Blättern extrahierte Proteine wurden elektrophoretisch behandelt.
Die Western-Blot-Analyse nach zweidimensionaler Elektrophorese ergibt den Nachweis mehrerer Flecken. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass eine Vielzahl von Nicotianaminsynthase-Genen erhalten wird. Alle Flecken waren in Fe-defizienten Wurzeln induziert.
Als Ergebnis dessen, dass die cDNA-Bank aus Fe-defizienter Reiswurzel-Poly(A) + RNA unter Verwendung von Sonden gescreent wurde, die durch Schneiden von HvNAS1 mit Restriktionsenzymen ApaLI und XhoI hergestellt wurden, wurden 20 Klone erhalten. Diese Klone wurden in 3 Typen von Klonen entsprechend ihren Sequenzen eingeteilt, von denen lediglich ein Typ ORF der vollen Länge enthielt, welcher als OsNAS1 bezeichnet wurde. Die Nukleotidsequenz von OsNAS ist in SEQ ID NR. 16 gezeigt, und die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR. 15 gezeigt.
Die PCR-Amplifikation von OsNAS1 ORF wurde mit einem Vektor pMAL-c2 kloniert, um eine C-terminal mit dem Maltose-Bindungsprotein fusionierte Form zu exprimieren. Das Fusionsprotein wird durch IPTG in seiner Expression stark induziert.
Ein Rohextrakt des transformierten E. coli mit dem Fusionsprotein wurde erhalten und die Nicotianaminsynthase-Aktivität im Zustand des Fusionsproteins untersucht. Dieselbe Aktivität wie bei HvNAS1 wurde nachgewiesen. Das Ergebnis ist in 15 gezeigt. 15 zeigt die Ergebnisse der dünnschichtchromatographischen (TLC) Analyse der aus E. coli-Rohextrakt erhaltenen Nicotianaminsynthase, die ein Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-OsNAS1-exprimiert. In 15, Bahn 1: ein standardmäßiges Nicotianamin (NA); Bahn 2: ein Extrakt aus E. coli, das das Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-OsNAS1-exprimiert; und Bahn 3: ein Extrakt aus E. coli, das das Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-HvNAS1-exprimiert.
Die mittels der in nachstehendem Beispiel 7 beschriebenen Methode durchgeführte Northern-Hybridisationsanalyse ergab, dass im Gegensatz zu Gerste die Expression in Reis durch eine Fe-defiziente Behandlung nicht nur in den Wurzeln, sondern auch in den Blättern induziert wurde (16). 16 zeigt das Ergebnis der Northern-Hybridisationsanalyse unter Verwendung von OsNAS1 ORF als einer Sonde. Die Ge samt-RNA wurde nach zwei Wochen der Fe-defizienten Behandlung und Kontroll-Reisblättern und -Wurzeln extrahiert, und in jeder Bahn wurden 5 μg RNA elektrophoretisch behandelt.
Die Nukleotidsequenz von Arabidopsis thaliana ähnlich der von HvNAS1, wie durch Computerdurchsuche der Datenbank erhalten, wurde als ein Primer verwendet. Die PCR-Amplifikation der genomischen DNA von Arabidopsis thaliana führte zum Erhalt dreier Nicotianaminsynthase-Gene. Diese wurden als AtNAS1, AtNAS2 und AtNAS3 bezeichnet.
Die Nukleotidsequenzen dieser Gene sind in SEQ ID NR. 18 (AtNAS1), SEQ ID NR. 20 (AtNAS2) und SEQ ID NR. 22 (AtNAS3) gezeigt. Diese Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NR. 17 (AtNAS1), SEQ ID NR. 19 (AtNAS2) und SEQ ID NR. 21 (AtNAS3) gezeigt.
AtNAS1, AtNAS2 und AtNAS3 ORF wurden mit PCR amplifiziert und mit dem Vektor pMAL-c2 kloniert. Es wurde versucht, jeden von ihnen in der C-terminal mit dem Maltose-Bindungsprotein fusionierten Form zu exprimieren. Die Expression des Fusionsproteins wurde durch IPTG stark induziert.
Ein Rohextrakt aus dem transformierten E. coli mit dem Fusionsprotein wurde erhalten und die Nicotianaminsynthase-Aktivität im Zustand des Fusionsproteins untersucht. Die Aktivität wurde nachgewiesen. Das Ergebnis ist in 17 gezeigt. 17 zeigt die Ergebnisse der TLC-Analyse der Nicotianaminsynthase-Aktivität, wie aus E. coli-Rohextrakt erhalten, das ein Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-AtNAS1-exprimierte. In 17, Bahnen 1: ein standardmäßiges Nicotianamin (NA) und S-Adenosylmethionin; Bahnen 2: ein Extrakt aus E. coli, das lediglich Maltose-Bindungsprotein exprimiert; Bahnen 3: ein Extrakt aus E. coli, das das Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-AtNAS1-exprimiert; Bahnen 4: ein Extrakt aus E. coli, das das Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-AtNAS2-exprimiert; und Bahnen 5: ein Extrakt aus E. coli, das das Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein-AtNAS3-exprimiert.
Eine RT-PCR wurde gemäß der in nachstehendem Beispiel 11 beschriebenen Methode durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass AtNAS1 in den Wurzeln und den über dem Boden befindlichen Teilen von Arabidopsis thaliana exprimiert wurde, wohingegen AtNAS2 weder in den Wurzeln noch in den über den Boden gelegenen Teilen exprimiert wurde, und AtNAS3 wurde lediglich in den Wurzeln exprimiert (18). In 18 zeigt Bahn M den Molekulargewichts-Marker. Die Genexpression erfolgte in den über dem Boden gelegenen Teilen, den Wurzeln und den positiven Kontrollen In der Figur, Bahnen C: AtNAS1 und AtNAS2 ORF der vollen Länge wurden amplifiziert; Bahnen 1: AtNAS1-spezifische Amplifikationsfragmente; Bahnen 2: AtNAS2-spezifische Amplifikationsfragmente; und Bahnen 3: AtNAS3-spezifische Amplifikationsfragmente.
Die Menge an sekretierter Muginsäure wurde auf bis zu 20 mg Muginsäure/g Wurzeln Trockengewicht/Tag erhöht berichtet (Takagi, 1993). Die von den vorliegenden Erfindern nachgewiesene Roh-Nicotianaminsynthase-Aktivität war ausreichend, um dies zu erfüllen. Da die vorliegenden Enzymproteine in mehr als einigen Typen vorhanden sind und ein 30-kDa-Peptid ohne Aktivität vorliegt, kann gemutmaßt werden, dass als Folge der Aggregation dieser Peptide die konstruierte Struktur, die zum Binden mit 3 Molekülen S-Adenosylmethionin bevorzugt ist, eine maximale Aktivität zeigt. Das mittels Gelfiltration bewertete Molekulargewicht betrug 35.000 (4).
Ein Anstieg der Aktivität durch Reaggregation der Untereinheiten wurde bisher nicht beobachtet. Da das Fusionsprotein mit Maltose-Bindungsprotein und Untereinheiten eine Aktivität zeigte, verfolgen wir derzeit den Gedanken, dass das vorliegende Enzym ein Monomer sein könnte. Die Möglichkeit jedoch, dass eine große Aktivität durch Konstruieren eines Multimers entfaltet werden kann, ist nicht komplett von der Hand zu weisen.
Der Reaktionsmechanismus bei der Synthese von Nicotianamin aus S-Adenosylmethionin kann ähnlich einer Methyltransfer-Reaktion unter Verwendung von S-Adenosylmethionin als einem Methyl-Donor und einer Reaktion zur Synthese von Spermidin und Spermin aus decarboxyliertem S-Adenosylmethionin sein. Die gemeinsame katalytische Domäne dieser Enzyme wurde bezüglich der äquivalenten Aminosäure- Konfiguration erörtert, bei der ähnliche Positionen in Strukturen einer höheren Ordnung besetzt sind (Hashimoto et al. 1998 und Schluckebier et al. 1995).
In der Zukunft könnte die katalytische Domäne als Ergebnis eines Vergleichs mit der Nicotianaminsynthase von anderen Pflanzenarten oder der Röntgenkristallographie geklärt werden.
Die Induktion der Nicotianaminsynthase-Aktivität durch Fe-Defizienz stellt ein spezifisches Phänomen bei Gramineen dar und ist für die Massenproduktion der Muginsäure-Familie wesentlich. Bei Oryza sativa handelt es sich um eine Pflanze, in der die mengenmäßig geringste Sekretion der Muginsäure-Familie von den wichtigeren Gramineen erfolgt, weshalb sie sehr wenig ausgeprägt hinsichtlich der Fe-Defizienz in Kalkboden ist.
Folglich kann als Ergebnis der Schaffung von Oryza sativa-Transformanden mit einer Toleranz gegenüber einer Fe-Defizienz, indem das Nicotianaminsynthase-Gen der vorliegenden Erfindung in Gramineen, insbesondere Oryza sativa, eingeführt wird und diese bei Fe-Defizienz eine große Menge davon exprimieren, die Kultivierung von Reis in Kalkboden möglich werden.
Hiervor stellte man sich von Nicotianamin in Gramineen vor, dass es lediglich eine Rolle als ein Vorläufer für die Synthese der Muginsäure-Familie spielt. Da jedoch die vorliegende Erfindung die Erkenntnis gebracht hat, dass das Nicotianaminsynthase-Gen die multiple Genfamilie darstellte, kann es weitere wichtige Rollen in Gramineen spielen.
Bei Pflanzen, denen die Sekretionsfähigkeit der Muginsäure-Familie fehlt, ausgenommen der Gramineen, wurde vorgeschlagen, dass Nicotianamin eine Schlüsselrolle als ein endogener Chelator von zweiwertigen Metallkationen wie Fe²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ und Mn²⁺ spielt und dass es zur Homöostasie dieser Metalle beiträgt (Stephan et al. 1994). Folglich könnte es dieselbe Rolle in Gramineen spielen.
Die Nicotianaminsynthase-Aktivität wird in Dikotyledonen nicht induziert, weshalb wohl die Expression des Gens der vorliegenden Erfindung durch Fe-Defizienz nicht induziert wird. Wir haben Nicotianaminsynthase-Gene von Arabidogsis thaliana kloniert. Die Zusammensetzung der Promoter-Regionen in diesen Genen kann den Mechanismus der Genexpression, wie durch Fe-Defizienz bewirkt, erleuchten, und das Gen der vorliegenden Erfindung kann eine wichtige Funktion nicht nur in Gramineen, sondern auch in Dikotyledonen spielen.
SEQ ID NR. 1 zeigt die Aminosäuresequenz der Nicotianaminsynthase der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine Nicotianaminsynthase mit der in SEQ ID NR. 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Allerdings ist die vorliegende Erfindung nicht auf die obige Nicotianaminsynthase beschränkt. Die Nicotianaminsynthase der vorliegenden Erfindung enthält, sofern sie nicht ihre Nicotianaminsynthase-Aktivität verliert, die Peptide, in denen ein Teil der Aminosäuresequenz des Peptids, vorzugsweise 50% oder weniger, bevorzugter 30% oder weniger, oder sogar noch bevorzugter 10% oder weniger in den gesamten Aminosäuren, deletiert ist oder durch andere Aminosäuren substituiert ist, oder zu denen weitere Aminosäuren addiert sind oder in denen diese Deletion, Substitution und Addition kombiniert sein kann.
Die für die Nicotianaminsynthase der vorliegenden Erfindung codierende Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NR. 2 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung umfasst nicht nur ein für Nicotianaminsynthase codierendes Gen, wie in SEQ ID NR. 2 gezeigt, sondern auch die für Nicotianaminsynthase codierenden Gene, die im folgenden genannt werden.
Der Vektor der vorliegenden Erfindung zur Einführung des obigen Gens unterliegt keiner speziellen Beschränkung, weshalb verschiedene Vektoren verwendet werden können. Ein bevorzugter Vektor ist der Expressionsvektor.
Verschiedene Zellen können in bequemer Weise unter Verwendung des rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung transformiert werden. Die Massenproduktion von Nicotianamid kann unter Verwendung der derart erhaltenen Transformanden vorgenommen werden. Diese Merhoden sind einem Fachmann des Gebiets wohlbekannt.
Beispiele für die Wirte zur Einführung des Gens der vorliegenden Erfindung sind Bakterien, Hefen und Zellen. Ein bevorzugter Wirt sind Pflanzen, insbesondere Gramineen.
Die Methode zur Einführung des Gens unterliegt keiner Beschränkung. Diese kann unter Verwendung eines Vektors erfolgen, oder das Gen kann direkt in das Genom eingeführt werden.
Ein Antikörper der vorliegenden Erfindung gegen Nicotianaminsynthase kann in herkömmlicher Weise unter Verwendung der Nicotianaminsynthase der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. Der Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper oder, wenn erforderlich, ein monoklonaler Antikörper sein.
Weiterhin kann eine selektive Zucht von Pflanzen, vorzugsweise Gramineen, unter Verwendung des Gens der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden. Insbesondere kann das Gen der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung der Varietäten, die selbst in Fe-defizientem Boden wachsen können, angewendet werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sollen zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind aber nicht als Beschränkung der vorliegenden Erfindung gedacht.
Beispiel 1. (Präparierung des Pflanzenmaterials)
Gerstensamen (Hordeum vulgare L. cv Ehimehadakamugi Nr. 1) wurden auf feuchtem Filterpapier auskeimen gelassen und in eine standardmäßige Wassernährlösung (Mori und Nishizawa, 1987) in einem Glashaus bei Umgebungstemperatur unter natürlichem Licht übertragen. Der pH-Wert der Wassernährlösung wurde auf 5,5 mittels 0,5 N HCl täglich eingestellt. Als sich die dritten Blätter entwickelten, wurden die Pflanzen in eine Wasserkulturlösung ohne Fe-Gehalt übertragen. Der pH-Wert wurde auf 7,0 durch 0,5 N NaOH täglich gehalten. Die Kontrollpflanzen wurden ebenfalls in der standardmäßigen Kulturlösung kontinuierlich kultiviert. Die Kulturlösung wurde einmal pro Woche erneuert. Zwei Wochen nach Beginn der Fe-defizienten Behandlung, als sich eine schwere Eisenchlorose auf den 4. und 5. Blättern signifikant zeigte, wurden die Wurzeln geerntet und in Flüssig-N₂ eingefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
Beispiel 2. (Assay der Nicotianaminsynthase-Aktivität)
Es wurde die zuvor von den vorliegenden Erfindern berichtete modifizierte Assay-Methode (Higuchi et al. 1996a) angewendet. Die Enzymlösungen wurden mit Reaktionspuffer [50 mM Tris 1 mM EDTA, 3 mM Dithiothreitol (im folgenden bezeichnet als DTT), 10 μM (p-Amidinophenyl)methansulfonylfluorid (im folgenden bezeichnet als p-APMSF) und 10 μM trans-Epoxysuccinylleucylamido-(4-guanidino)butan (im folgenden bezeichnet als E-64), pH 8,7] äquilibriert. Der Pufferaustausch wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationseinheit, Ultrafree C3LGC NMWL10000 (Millipore Co.) vorgenommen. Mit¹⁴C in der Carboxylgruppe markiertes S-Adenosylmethionin (Amsersham Inc.) wurde der Enzymlösung bei einer Endkonzentration von 20 μM zugegeben und dies bei 25°C für 15 Minuten gehalten. Die Reaktionsprodukte wurden durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel LK6 (Whatman Inc.) unter Verwendung von Entwickler (Phenol : Butanol : Ameisensäure : Wasser = 12 : 3 : 2 : 3) aufgetrennt. Die Radioaktivität der Reaktionsprodukte wurde mittels des Bildanalysegerätes BAAS-2000 (Fuji Film Co.) bestimmt. Der Proteingehalt wurde mittels der Bradford-Methode unter Verwendung des Protein Assay Kit (Bio Rad Inc.) untersucht.
Beispiel 3 (Ausreinigung der Nicotianaminsynthase)
Die folgenden Vorgänge wurden bei 4°C vorgenommen; E-64 wurde den Nicotianaminsynthase-enthaltenden Fraktionen bei einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben.
Die gefrorenen Wurzeln wurden zu einem Feinpulver in Flüssig-N₂ zerstoßen und in einem Haushalts-Entsafter mit 200 ml Extraktionspuffer [0,2 M Tris, 10 mM EDTA, 5 (Vol/Vol) Glycerol, 10 mM DTT, 0,1 mM E-64, 0,1 mM p-APMSF und 5% (Gew/Vol) unlösliches Polyvinylpyrrolidon (PVP), pH 8,0] pro 100 g Wurzeln homogenisiert. Das Homogenat wurde 30 Minuten lang bei 22.500 × g zum Erhalt des Überstands zentrifugiert. Ammoniumsulfat wurde dem Überstand zu einer Endkonzentration von 0,4 M zu gegeben und dies 1 Stunde lang stehengelassen. Das Gemisch wurde nochmals 30 Minuten lang bei 22.500 × g zum Erhalt des Überstands zentrifugiert.
Der Überstand wurde auf eine TSK Gel* Butyl Toyopearl 650M-Säule aufgebracht (10 ml Bettvolumen pro 100 g Wurzeln), mit dem Adsorptionspuffer äquilibriert [20 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM DTT, 0,4 M (NH₄)₂SO₄ und 0,1 mM p-APMSF, pH 8,0] und mit Elutionspuffer eluiert [10 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM DTT, 0,1 mM p-APMSF, 5% Glycerol und 0,05% 3-[(3-Chloramidopropyl)dimethylammonio]propansulfonsäure (im folgenden bezeichnet als CHAPS), pH 8,0].
KCl wurde der aktiven Fraktion zu einer Endkonzentration von 0,4 M zugegeben, und 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) wurde zu einer Endkonzentration von 1 mM KCl zugegeben. Ein Hydroxyapatit-100-350-Mesh (Nacalai Tesque), äquilibriert mit dem Adsorptionspuffer (1 mM K-P, 10 mM KCl, 3 mM DTT und 0,1 mM p-APMSF, pH 8,0) wurde zu 10 ml pro 100 mg Protein zubereitet und die die Nicotianaminsynthase enthaltenden Fraktionen aufgebracht. Die Nicotianaminsynthase wurde ohne Adsorption durchgeleitet. Die durchgeleitete Fraktion wurde auf eine TSK-Gel* Butyl Toyopearl 650M-Säule aufgebracht (1 ml Bettvolumen pro 10 mg Protein), und die Nicotianaminsynthase wurde in der oben beschriebenen Weise eluiert.
Die aktive Fraktion wurde auf eine DEAE-Sepharose-FF-Säule aufgeladen (5 ml Bettvolumen pro 25 mg Protein, Pharmacia), mit dem Adsorptionspuffer äquilibriert (20 mM Tris, 1 mM EDTA, 3mM DTT, 0,1 mM p-APMSF und 0,05% CHAPS, pH 8,0) und bei schrittweiser Gradientenelution einer Kaliumchloridkonzentration von 0,05 M, 0,1 M, 0,15 M und 0,2 M eluiert. Die Nicotianaminsynthase eluierte bei 0,15 M der KCl-Konzentration.
Die aktive Fraktion wurde auf eine Ether Toyopearl* 650M-Säule aufgebracht (10 ml Bettvolumen pro 100 Wurzeln), mit Adsorptionspuffer äquilibriert [20 mM Tris, 1 mN EDTA, 3 mM DTT, 1,2 M (NH₄)₂SO₄ und 0,1 mM p-APMSF, pH 8,0]. Die Nicotianaminsynthase wurde nicht adsorbiert und wanderte durch die Säule. Die durchgewanderte Fraktion wurde auf eine TSK-Gel* Butyl Toyopearl* 650M-Säule aufgebracht und die die Nicotianaminsynthase enthaltenden Fraktionen eluiert. Die Peptide in der die Nicotianaminsynthase enthaltenden aktiven Fraktionen, welche mittels den obigen säulenchromatographischen Behandlungen gereinigt worden war, wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (im folgenden bezeichnet als SDS-PAGE) unter Verwendung von 11% Acrylamid-Flachgelen aufgetrennt. Nach der SDS-PAGE wurde das Gel mit 0,3 M Kupferchlorid angefärbt (Dzandu et al. 1988) und die aufgetrennten Bande ausgeschnitten. Die Gelfragmente wurden mit 0,25 M EDTA/0,25 M Tris (pH 9,0) entfärbt und mit dem Extraktionspuffer (1% SDS, 25 mM Tris und 192 mM Glycin) homogenisiert. Jedes Homogenat wurde mit SDS-freiem Puffer (25 mM Tris und 192 mM Glycin) elektroeluiert und das Peptid rückgewonnen.
Beispiel 4. (Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz)
Die isolierte Nicotianaminsynthase wurde mit Cyanogenbromid chemisch verdaut (Gross 1967).
Nach der SDS-PAGE-Behandlung wurde ein 10-faches Volumen an 70% (Vol/Vol) Ameisensäure und 1% (Gew/Vol) Cyanogenbromid den die Nicotianaminsynthase enthaltenden Gelfragmenten hinzugefügt und dies bei 4°C über Nacht zersetzt. Nach Beendigung des Verdaus wurde der flüssige Teil entnommen und in vacuo getrocknet. Die getrocknete Substanz wurde in SDS-PAGE-Probenpuffer gelöst und bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen, dann das verdaute Produkt mittels SDS-PAGE unter Verwendung von 16,5% Acrylamidgel, das Tricin enthielt (Schagger und Jagow, 1987) aufgetrennt. Die Peptide wurden auf eine PVDF-Membran mittels Elektroblotting (Towbin et al. 1979) übertragen und mit Amidoschwarz angefärbt. Die gefärbten Bande wurden ausgeschnitten und die Aminosäuresequenz von der N-terminalen Seite jedes Peptids durch Edman-Abbau im Gasphasen-Sequenzierer (Modell 492A-Proteinsequenzierer, Applied Biosystems Inc.) bestimmt.
Beispiel 5. (Klonierung der Nicotianaminsynthase-Gene)
Die PCR-Amplifikation wurde für aus Fe-defizienten Gerstenwurzeln stammender cDNA unter Verwendung von Primern vorgenommen, die auf der Basis der erhaltenen partiellen Aminosäuresequenz synthetisiert wurden. Eine aus der Poly(A)⁺RNA der Fe defizienten Gerstenwurzeln hergestellte pYH23-cDNA-Bank wurde mit den derart erhaltenen DNA-Fragmenten des PCR-Produkts gescreent, welches mit [α-³²P]dATP unter Verwendung des Random Primer Kit (Takara Shuzo Co.) als den Primern markiert war. Die isolierten cDNA-Klone wurden mittels des Cycle Sequencing Kits (Shimadzu Bunko Co.) unter Verwendung des Shimadzu DNA-Sequenzierers DSQ-2000L sequenziert.
Die PCR-Amplifikation wurde für die genomische DNA von Arabidopsis thaliana unter Verwendung von Primern durchgeführt, die auf der Basis der Nukleotidsequenzen von AC003114 und AB005245 von Arabidopsis thaliana synthetisiert wurden. Die derart erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit dem Cycle Sequencing Kit (Shimadzu Bunko Co.) unter Verwendung des Shimadzu DNA-Sequenzierers DSQ-1000L sequenziert.
Die bestimmte Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NR. 2 gezeigt.
Beispiel 6. (Expression des NAS1-Proteins in E. coli)
Ein Fragment, in dem die EcoRI-Stelle flussaufwärts des ersten ATG der HvNAS1-cDNA eingeführt wurde und die PstI- und BamHI-Stellen flussabwärts des Stoppcodons der HvNAS1-cDNA eingeführt wurden, wurde mittels PCR amplifiziert. Das derart erhaltene amplifizierte Produkt wurde in das pBluescriptII SK- unter Verwendung der EcoRI-Stelle und der BamHI-Stelle subkloniert und die korrekte Nukleotidsequenz bestätigt. Das Fragment zwischen der EcoRI-Stelle und der PstI-Stelle wurde in pMAL-c2 kloniert, um eine Expression in Form des Fusionierens des HvNAS1 an den C-Terminus des Maltose-Bindungsproteins zu erreichen.
Ein Fragment, in dem die EcoRI-Stelle flussaufwärts des ersten ATG des OsNAS1 eingeführt wurde und die HIndIII-Stelle flussabwärts des Stoppcodons des OsNAS1 eingeführt wurde, wurde mittels PCR amplifiziert. Das derart erhaltene amplifizierte Produkt wurde in das pBluescriptII SK- unter Verwendung der EcoRI-Stelle und der HindIII-Stelle subkloniert und die korrekte Nukleotidsequenz bestimmt. Das Fragment zwischen der EcoRI-Stelle und der HindIII-Stelle wurde in pMAL-c2 kloniert, um die Expression in Form des Fusionierens des OsNAS1 an den C-Terminus des Maltose-Bindungsproteins zu erreichen.
Ein Fragment, in dem die EcoRI-Stelle flussaufwärts des ersten ATG von AtNAS1, AtNAS2 und AtNAS3 eingeführt wurde und die XbaI-Stelle flussabwärts des Stoppcodons von AtNAS1, AtNAS2 und AtNAS3 eingeführt wurde, wurde mittels PCR amplifiziert. Die derart erhaltenen amplifizierten Produkte wurden in das pBLuescriptII SK- subkloniert, und die korrekten Nukleotidsequenzen wurden bestätigt. Das Fragment zwischen der EcoRI-Stelle und der XbaI-Stelle wurde in pMAL-c2 kloniert, um die Expression in Form des Fusionierens von AtNAS1, AtNAS2 und AtNAS3 jeweils an den C-Terminus der Maltose-Bindungsproteine zu erreichen.
Der E. coli-Stamm XL1-Blue wurde als ein Wirt zum Exprimieren des Fusionsproteins verwendet. pMAL-c2-HvNAS bzw. pMAL-c2 wurden in XL1-Blue eingeführt. Die derart erhaltenen rekombinanten Bakterien wurden in LB-Medium, das Ampicillin und Tetracyclin zu jeweils 50 μg/ml enthielt, bei 37°C kultiviert, bis die OD 600 der Kultur 0,5 erreicht hatte. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wurde zu einer Endkonzentration von 0,3 mM hinzugefügt und kontinuierlich bei 37°C für 3 Stunden gezüchtet und die Bakterienzellen abgesammelt. Die Zellen wurden in 10 mM Tris-Puffer suspendiert, der 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA, 3 mM DTT und 0,1 mM E-64, pH 7,4, enthielt, und mit Flüssigstickstoff eingefroren. Dies wurde in Eiswasser angetaut, und eine Ultrabeschallung für 15 Sekunden wurde 10-mal wiederholt. Die Nicotianaminsynthase-Aktivität des derart erhaltenen Rohextrakts wurde gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Methode untersucht und die Enzymaktivität bestätigt.
Beispiel 7. (Northern-Hybridisation)
Die Northern-Hybridisation der Gersten-RNA wurde unter Verwendung des DNA-Fragments vorgenommen, welches durch Ausschneiden von HvNAS1-cDNA mit HindIII und NotI präpariert und mit [α-³²P]dATP als einer Sonde markiert wurde. Die Gesamt-RNA wurde aus Gerste extrahiert (Naito et al. 1988). Die extrahierte RNA wurde mittels 1,4% Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und auf Hybond-N^–-Membranen (Amersham) aufgeblottet. Die Northern-Hybridisation der Reis-RNA wurde unter Verwendung von OsNAS1 ORF vorgenommen, die mit [α-³²P]dATP als einer Sonde markiert wurde. Die Gesamt-RNA wurde aus Reis extrahiert. Die extrahierte RNA wurde mittels 1,4 Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und auf Hybond-N⁺-Membranen (Amersham) aufgeblottet. Die Membran wurde mit der Sonde in 0,5 M Church-Phosphatpuffer (Church und Gilbert 1984), 1 mM EDTA, 7% (Gew/Vol) SDS mit 100 μg/ml Lachssperma-DNA bei 65°C über Nacht hybridisiert. Die Membran wurde mit Puffer, der 40 mM Church-Phosphatpuffer und 1% (Gew/Vol) SDS enthielt, bei 65°C für 10 Minuten gewaschen. Anschließend wurde das Waschen nochmals wiederholt und die Membran mit Puffer, der 0,2 × SSPE und 0,1% (Gew/Vol) SDS enthielt, bei 65°C für 10 Minuten gewaschen. Die Radioaktivität wurde unter Verwendung des Bildanalysegerätes BAS-2000 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 9 und 16 gezeigt.
Beispiel 8. (Southern-Hybridisation)
Die genomische DNA wurde aus den Blättern von Gerste und Reis extrahiert. Der Extrakt wurde mit BamHI, EcoRI oder HindIII verdaut, mit 0,8% (Gew/Vol) Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Hybond-N⁺-Membranen (Amersham) übertragen. Die Hybridisation wurde gemäß der in Beispiel 7 beschriebenen Methode vorgenommen und die Radioaktivität bestimmt. Das Ergebnis ist in 10 gezeigt.
Beispiel 9. (Herstellung des polyklonalen Antikörpers)
Zwei Ratten wurden unter Verwendung des Antigens immunisiert, das etwa 100 μg isolierte Nicotianaminsynthase enthielt. Das Antigen stellte dieselbe Probe dar, wie zur Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz verwendet. Komplettes Freund-Adjuvans wurde für die erste Immunisierung verwendet, und für die zweite Immunisierung wurde inkomplettes Freund-Adjuvans verwendet. Alle Bestandteile des Bluts wurden gesammelt, nachdem die Ratten viermal immunisiert worden waren, und das erhaltene Serum wurde bei –80°C konserviert.
Beispiel 10. (Western-Blotting-Analyse)
Das Gesamtprotein wurde unter Verwendung von Trichloressigsäure und Aceton extrahiert (Damerval et al. 1986). Die Pflanzen wurden in Flüssigstickstoff zerstoßen, bis ein Pulver erhalten war, und mit Aceton vermischt, das 0,1% (Vol/Vol) 2-Mercaptoethanol enthielt. Das Protein wurde ausgefällt, indem es bei –20°C für 1 Stunde stehen durfte, und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 30 Minuten abgesammelt. Das Präzipitat wurde in Aceton suspendiert, das 0,1% (Vol/Vol) 2-Mercapto ethanol enthielt, und bei –20°C für 1 Stunde stehengelassen, woraufhin das Präzipitat durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 30 Minuten gesammelt wurde. Das Präzipitat wurde in vacuo getrocknet und in Probenpuffer [9,5 M Harnstoff, 2% (Gew/Vol) Triton X-100 und 5% (Vol/Vol)-ME] gelöst, dann bei 16.000 × g für 10 Minuten zum Erhalt des Überstands zentrifugiert. Die im Überstand enthaltenen Proteine wurden mittels SDS-PAGE oder der denaturierenden zweidimensionalen Elektrophorese (O'Farrell 1975) aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Western-Blotting-Analyse wurde durch Aufbringen des primären Antikörpers, der Anti-Nicotianaminsnythase-Antikörper enthielt, wie in Beispiel 9 präpariert, und des sekundären Antikörpers, der Meerrettich-bindenden Ziege-Anti-Maus-IgG-(H + L)-Antikörper (Wako Pure Chemicals Co.) enthielt, auf die Membran und Färben mit Diaminobenzidin vorgenommen.
Das Ergebnis ist in 12 gezeigt. Die SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 12,5 Acrylamid-Flachgel vorgenommen. 100 μg Protein wurden elektrophoretisch behandelt. Die Proteine aus 200 μg Wurzeln und 500 μg Blättern wurden elektrophoretisch behandelt.
Beispiel 11. (RT-PCR)
Die Gesamt-RNA wurde aus Arabidogsis thaliana extrahiert. Die RT-PCR wurde mit 1 μg RNA als einer Template unter Verwendung des EZ rTth RNA PCR-Kits (Parkin Elmer Inc.) vorgenommen. Spezifische Primer für AtNAS1, AtNAS2 bzw. AtNAS3 wurden verwendet.
Das Ergebnis ist in 18 gezeigt.
Industrielle Anwendbarkeit
Verschiedene Zellen werden gemäß der herkömmlichen Methode unter Verwendung der rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung transformiert. Die Massenproduktion von Nicotianamin kann unter Verwendung des erhaltenen Transformanden vorgenommen werden. Diese Methoden können gemäß der einem Fachmann des Gebiets bekannten Methode durchgeführt werden.
Eine selektive Züchtung von Pflanzen, vorzugsweise Gramineen, kann ebenfalls unter Verwendung der Gene der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. Insbesondere können die Gene der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung der Varietäten, die auf Fe-defizientem Boden wachsen können, angewendet werden. SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes Enzym, das eine Nicotianaminsynthase-Aktivität zeigt, umfassend eine Aminosäuresequenz, gewählt aus: (a) SEQ ID NR.1, oder (b) eine Sequenz, die homolog zu SEQ ID NR.1 ist.
Enzym nach Anspruch 1, wobei das Enzym von Gerste stammt.
Enzym nach Anspruch 2, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 1 aufweist.
Enzym nach Anspruch 2, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 3 aufweist.
Enzym nach Anspruch 2, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 5 aufweist.
Enzym nach Anspruch 2, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 7 aufweist.
Enzym nach Anspruch 2, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 9 aufweist.
Enzym nach Anspruch 2, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 11 aufweist.
Enzym nach Anspruch 2, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 13 aufweist.
Enzym nach Anspruch 1, wobei das Enzym von Oryza sativa-Reis stammt.
Enzym nach Anspruch 10, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 15 aufweist.
Enzym nach Anspruch 1, wobei das Enzym von Arabidopsis (Ackerschmalwand) stammt.
Enzym nach Anspruch 12, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 17 aufweist.
Enzym nach Anspruch 12, wobei das Enyzm die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 19 aufweist.
Enzym nach Anspruch 12, wobei das Enyzm die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 21 aufweist.
Gen, das für die Aminosäuresequenz des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 15 kodiert.
Nukleinsäure, die für ein Enzym kodiert, welches eine Nicotianaminsynthase-Aktivität zeigt, wobei die Nukleinsäure eine Sequenz umfasst, gewählt aus: (A) SEQ ID NR. 2 (B) Sequenz, die homolog zu SEQ ID NR. 2 ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 17, wobei die Nukleinsäure von Gerste stammt.
Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 2 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 4 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 6 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 8 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 10 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 12 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 14 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 17, wobei die Nukleinsäure von Oryza sativa-Reis stammt.
Nukleinsäure nach Anspruch 26, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 16 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 17, wobei die Nukleinsäure von Arabidopsis stammt.
Nukleinsäure nach Anspruch 28, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 18 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 28, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 20 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 28, wobei die Nukleinsäure die Basensequenz von SEQ ID NR. 22 aufweist.
Nukleinsäure nach Ansprüchen 17 bis 31, wobei die Nukleinsäure DNA ist.
Vektor, welcher eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 17 bis 32 umfasst.
Vektor nach Anspruch 33, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.
Nicht-humaner Transformand, transformiert durch den Vektor nach Anspruch 33 oder 34.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 2 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 4 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 6 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 8 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 10 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 12 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 14 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 16 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 18 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 20 ist.
Transformand nach Anspruch 35, welcher ein Fremdgen umfasst, das ein Gen mit der Basensequenz von SEQ ID NR. 22 ist.
Transformand nach einem der Ansprüche 35 bis 46, wobei der Wirt eine Bakterie ist.
Verfahren zur Herstellung von Nicotianamin, welches die Verwendung des Transformanden nach einem der Ansprüche 35 bis 47 umfasst.
Antikörper gegen ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
Antikörper nach Anspruch 49, wobei der Antikörper polyklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 49, wobei der Antikörper monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren zur Reinigung von Nicotianaminsynthase, welches umfasst: die Verwendung von Thiolprotease-Hemmer, die Verwendung von CHAPS-Puffer, die Verwendung der Ionenaustausch-Chromatographieträger DEAE- Sepharose FF^® oder DEAE-Sephacel^®, die Verwendung des hydrophoben Chromatographieträgers TSK-Gel Butyl-Toyopearl^® und die Verwendung des hydrophoben Chromatographieträgers TSK-Gel Ether Toyopearl^®.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei der Thiolprotease-Hemmer E-64 ist.