ES2229702T3

ES2229702T3 - Nicotianamina sistasa y gen que codifica esta ultima.

Info

Publication number: ES2229702T3
Application number: ES99918274T
Authority: ES
Inventors: Satoshi Mori; Kyoko Higuchi; Kazuya Suzuki; Naoko Nishizawa; Hiromi Nakanishi
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2019-04-30
Also published as: US7192755B1; US7604972B2; CA2327261A1; AU759256B2; DE69920439T2; US20080233627A1; EP1077255A1; JP3893024B2; AU3627399A; EP1077255A4; EP1077255B1; CA2327261C; WO1999057249A1; US20070150981A1; DE69920439D1; US7396668B2

Abstract

Un enzima aislado que presenta actividad sintasa de nicotianamina, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: (a) SEC ID N:1, o de (b) una secuencia que es homóloga a la SEC ID N:1.

Description

Nicotianamina sintasa y gen que codifica esta última.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una sintasa de nicotianamina implicada en la ruta biosintética del ácido mugineico, a la secuencia de aminoácidos de la misma, a un gen que codifica la misma, a un vector, a un proceso para producir nicotianamina mediante la utilización del mismo, a transformantes, tales como plantas, transformados por el gen que codifica la sintasa de nicotianamina y a un anticuerpo contra la sintasa de nicotianamina.

Antecedentes

Las plantas gramíneas que absorben mediante quelación el Fe(III) en estado insoluble del suelo utilizando el ácido mugineico y adoptan el denominado mecanismo de adquisición de Fe Estrategia-II, secretan quelantes de Fe (fitosideróforos) por sus raíces para solubilizar el Fe soluble en pequeñas cantidades de la rizosfera (Roemheld, 1987). La cantidad de fitosideróforos secretados incrementa bajo el estrés por deficiencia de Fe. La familia del ácido mugineico es el único ejemplo de fitosideróforos conocidos hasta ahora (Takagi, 1976). Se cree que la tolerancia a la deficiencia de hierro de las plantas gramíneas depende de la cantidad de la familia del ácido mugineico secretada por las plantas (Takagi y col. 1984, Roemheld y Marschner 1986, Marschner y col. 1987, Mori y col. 1987, Kawai y col. 1988, Mori y col. 1988, Mihashi y Mori 1989 y Shingh y col. 1993).

La ruta biosintética del ácido mugineico en las plantas está mostrada en la Fig. 1. Se sintetiza S-adenosilmetionina a partir de metionina por la sintasa de S-adenosilmetionina. Posteriormente, se combinan tres moléculas de S-adenosilmetionina para formar una molécula de nicotianamina por la sintasa de nicotianamina. La nicotianamina generada es convertida posteriormente en 3''-cetoácido por la nicotianamina aminotransferasa y se sintetiza ácido 2'-desoximugineico por la acción posterior de una reductasa. Una serie adicional de etapas de hidroxilación produce los demás derivados del ácido mugineico, incluyendo el ácido mugineico a partir del ácido desoximugineico (Mori y Nishizawa 1987, Shojima y col. 1989, Shojima y col. 1990 y Ma y Nomoto 1993).

Un compuesto de la Fig. 1, el compuesto del ángulo inferior derecho, en el que R_{1} y R_{2} son hidrógeno y R_{3} es hidroxilo, es el ácido mugineico. Un compuesto en el que R_{1} es hidrógeno y R_{2} y R_{3} son hidroxilo, es el ácido 3-hidroximugineico. Además, un compuesto en el que R_{2} es hidrógeno y R_{1} y R_{3} son hidroxilo, es el ácido 3-epihidroximugineico.

Se aislaron tres genes de la sintasa de S-adenosilmetionina de raíces de cebada, pero estos genes no eran inducidos por deficiencia de Fe (Takizawa y col. 1996). Se sospecha que el gen Ids3, que es obtenido de la cebada por selección diferencial, es un gen que convierte el ácido desoximugineico en ácido mugineico por hidroxilación y es inducido potentemente por la deficiencia de Fe (Nakanishi y col. 1993). Además, se purificó y se aisló nicotianamina aminotransferasa de raíces de cebada deficientes en Fe, y se aislaron dos genes de la nicotianamina aminotransferasa, Naat-A y Naat-B (Takahashi y col. 1997). Se inducía la expresión de Naat-A en raíces deficientes en Fe.

La síntesis de nicotianamina a partir de S-adenosilmetionina es similar a la síntesis de poliamina a partir de descarboxi-S-adenosilmetionina. En contraste con la sintasa de poliamina, sin embargo, la sintasa de nicotianamina cataliza la combinación de tres moléculas de S-adenosilmetionina y la formación del anillo de acetidina al mismo tiempo (Fig. 1). Tal sintasa de nicotianamina es un nuevo tipo de enzima. Previamente, nosotros informamos de la purificación parcial de la sintasa de nicotianamina a partir de raíces de cebada deficientes en Fe y del patrón de expresión de la actividad (Higuchi y col. 1994, Higuchi y col. 1995, Kanazawa y col. 1995, Higuchi y col. 1996a y Higuchi y col. 1996b). Como la sintasa de nicotianamina es fácilmente descompuesta durante la extracción y la purificación, ha sido difícil purificar cantidades suficientes para la secuenciación de aminoácidos.

La presente invención permite la producción de una planta, especialmente de una planta gramínea, muy tolerante a la deficiencia de Fe, como resultado del aislamiento y purificación de una sintasa de nicotianamina, del clonaje del gen de este enzima, de la determinación de la secuencia de bases y de la secuencia de aminoácidos del mismo y de la utilización de dicho enzima.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un enzima aislado que presenta actividad sintasa de nicotianamina y que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a) SEC ID Nº: 1, o

(b) una secuencia que es homóloga a la SEC ID Nº: 1, preferiblemente un enzima procedente de la cebada y más preferiblemente un enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEC ID N^{os}:1, 3, 5, 7, 9, 11 ó 13), o un enzima procedente de Oryza sativa (y más preferiblemente un enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 15) o un enzima procedente de Arabidopsis (y más preferiblemente un enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEC ID N^{os}:17, 19 ó 21).

La presente invención proporciona además un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de dichos enzimas, o un ácido nucleico que codifica tal enzima que presenta actividad sintasa de nicotianamina, donde el ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada de:

(A) SEC ID Nº: 2,

(B) una secuencia que es homóloga a la SEC ID Nº: 2, preferiblemente un ácido nucleico procedente de la cebada (más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de bases de las SEC ID N^{os}:2, 4, 6, 8, 10, 12 ó 14) o un ácido nucleico procedente Oryza sativa (más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 16) o un ácido nucleico procedente de Arabidopsis (más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de bases de las SEC ID N^{os}: 18, 20 ó 22) y muy preferiblemente en el que el ácido nucleico es
ADN.

La presente invención proporciona además un vector que contiene un ácido nucleico como el definido anteriormente, preferiblemente un vector de expresión, y un transformante no humano transformado por los vectores, siendo preferiblemente el gen foráneo un gen que tiene la secuencia de bases de las SEC ID N^{os}:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22.

En otro aspecto la invención proporciona un proceso para la producción de nicotianamina que comprende la utilización del transformante anterior; un anticuerpo contra los enzimas descritos anteriormente, preferiblemente un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, y un método para la purificación de sintasa de nicotianamina que comprende: la utilización de un inhibidor de tiol proteasas, la utilización del tampón CHAPS, la utilización de los vehículos de cromatografía de intercambio iónico DEAE-Sepharose FF® o DEAE Sephacel®, la utilización del vehículo de cromatografía hidrofóbica TSK gel® Butyl Toyopearl® y la utilización del vehículo de cromatografía hidrofóbica TSK gel® Ether Toyopearl®, preferiblemente en el que el inhibidor de tiol proteasas es E-64.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra la ruta biosintética de la familia del ácido mugineico.

La Fig. 2 muestra una comparación de la purificación de la sintasa de nicotianamina a partir de raíces de cebada dependientes de Fe y de raíces de cebada control.

La Fig. 3 muestra una SDS-PAGE preparativa (electroforesis en gel de docecil sulfato de sodio-poliacrilamida, denominada de aquí en adelante SDS-PAGE) 30-35 kDa aproximadamente. La barra horizontal indica la actividad enzimática relativa detectada a partir de los geles.

La Fig. 4 muestra el patrón de elución de la actividad sintasa de nicotianamina a partir de la columna de filtración en gel.

Los círculos negros grandes (\medbullet) indican actividad enzimática.

La Fig. 5 muestra una comparación de seis secuencias de aminoácidos parciales determinadas para la sintasa de nicotianamina procedente de cebada y una secuencia similar de plantas gramíneas obtenida mediante búsqueda por ordenador en la base de datos. Los residuos de aminoácidos idénticos están mostrados con " : ".

La Fig. 6 muestra el ADNc de HvNAS1 de longitud completa y la secuencia de aminoácidos deducida del mismo. Las secuencias subrayadas indican secuencias de aminoácidos parciales idénticas de fragmentos de la Fig. 5 anterior. Los números de la secuencia de nucleótidos están indicados a la derecha de cada fila. Los números de los aminoácidos están indicados a la izquierda de cada fila.

La Fig. 7 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de los 7 ADNcs anteriores obtenidos de cebada. El asterisco " * " indica residuos de aminoácidos idénticos en todas las secuencias.

La Fig. 8 muestra los resultados del análisis cromatográfico en capa fina (TLC) de la actividad sintasa de nicotianamina obtenida de un extracto bruto de E. coli que expresa una proteína fusionada, proteína de unión a maltosa-HvNAS1.

La Fig. 9 muestra el análisis de hibridación Northern de HvNAS1 como sonda.

La Fig. 10 muestra el análisis de hibridación Southern de HvNAS1 como sonda.

La Fig. 11 muestra el análisis de transferencia Western del enzima bruto utilizado para la detección de actividad sintasa de nicotianamina.

La Fig. 12 muestra el análisis de transferencia Western de la proteína total extraída mediante ácido tricloroacético/acetona.

La Fig. 13 muestra la comparación de la purificación de sintasa de nicotianamina a partir de cebada deficiente en Fe y de cebada control después de DEAE-Sepharose FF.

La Fig. 14 muestra la comparación de la purificación de la sintasa de nicotianamina a partir de cebada deficiente en Fe y de cebada control después de Ether Toyopearl® 650M.

La Fig. 15 muestra los resultados del análisis cromatográfico en capa fina (TLC) de la actividad sintasa de nicotianamina obtenida de un extracto bruto de E. coli que expresa la proteína fusionada proteína de unión a maltosa - OsNAS1.

La Fig. 16 muestra el análisis de hibridación Northern de OsNAS1 como sonda.

La Fig. 17 muestra los resultados de un análisis cromatográfico en capa fina (TLC) de la actividad sintasa de nicotianamina obtenida de un extracto bruto de E. coli que expresa las proteínas fusionadas proteína de unión a maltosa - AtNAS1, AtNAS2 o AtNAS3.

La Fig. 18 muestra los resultados de una RT-PCR del ARN total extraído de las partes aéreas y de las raíces de Arabidopsis thaliana. El grupo de la derecha indica el control positivo.

Modo mejor de llevar a cabo la invención

Hemos intentado aislar la sintasa de nicotianamina (Higuchi y col., Plant & Soil, Vol. 165, p. 173-179, 1994), y como la sintasa de nicotianamina se descomponía fácilmente y era difícil de aislar y purificar, no pudimos obtener cantidades suficientes de proteína para determinar su secuencia de aminoácidos parcial. Posteriormente, se encontró que el inhibidor E-64 de las tiol proteasas (denominado de aquí en adelante E-64) era muy eficaz suprimiendo la degradación de la sintasa de nicotianamina (Higuchi y col., Plant & Soil, Vol. 178, p. 171-177, 1996a).

En la presente invención, como resultado de que las raíces congeladas fueron trituradas hasta obtener un polvo fino en N_{2} líquido y homogeneizadas luego rápidamente con tampón que contenía el inhibidor E-64 de las tiol proteasas 0,1 mM, pudo aislarse la proteína sintasa de nicotianamina y pudo aislarse también su gen.

Además, el enzima de la presente invención recuperó su actividad mediante la eliminación del SDS después del tratamiento de SDS-PAGE, pero la tasa de recuperación fue muy baja (Higuchi y col., Plant & Soil, Vol. 165, p. 173-179, 1994). Por consiguiente, el grado de purificación debía ser incrementado antes del tratamiento de SDS-PAGE. Por tanto, los procedimientos de cromatografía en columna fueron mejorados adicionalmente.

Hemos encontrado también que el enzima de la presente invención es relativamente hidrofóbico, y un tampón conteniendo el agente surfactante suave CHAPS incrementaba la tasa de recuperación. Se analizaron varios vehículos de cromatografía de intercambio iónico y se encontró que los más eficaces eran DEAE-Sepharose FF y DEAE-Sephacel. Además del TSK gel® Butyl Toyopearl®, otro vehículo de cromatografía hidrofóbica, el TSK gel® Ether Toyopearl® 650M, eliminaba eficazmente las impurezas del péptido de 30-35 kDa.

Se ha descrito que el enzima de la presente invención era el péptido de 30-35 kDa, cuya actividad fue recuperada eliminando el SDS después del tratamiento de SDS-PAGE, y la actividad fue detectada como un rango extenso de peso molecular de 30-35 kDa (consultar la Fig. 3). La Fig. 3 muestra el resultado de una SDS-PAGE preparativa en las fracciones que mostraban actividad enzimática. La SDS-PAGE se llevó a cabo utilizando placas de gel de acrilamida al 11%. Una porción del gel fue teñida con Azul Brillante de Coomassie y el resto del gel fue teñido con Cu. El gel que contenía proteínas entre 30-35 kDa de tamaño fue cortado en siete fragmentos (indicados por las líneas cortas). Las barras gruesas de la Fig. 3 indica las actividades enzimáticas relativas detectadas en cada fragmento de
gel.

Con el fin de identificar el péptido sintasa de nicotianamina a partir de las proteínas que tenían estos peso moleculares, los péptidos, que estaban contenidos en las fracciones de la sintasa de nicotianamina, purificados a partir de raíces de cebada deficientes en Fe y de raíces de cebada control, fueron comparados utilizando SDS-PAGE. De cada 200 g de raíces de cebada, se purificó el presente enzima de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 3 de la presente más adelante.

La actividad enzimática del control era una cuarta parte de la de las raíces deficientes en Fe.

La composición peptídica de la fracción enzimática activa procedente de cada etapa de purificación del presente enzima, fue analizada y comparada mediante SDS-PAGE y los resultados están mostrados en la Fig. 2, la Fig. 13 y la Fig. 14. La Fig. 2, la Fig. 13 y la Fig. 14 muestran la comparación con la fracción activa procedente de la etapa de purificación de 200 g de raíces de cebada deficientes en Fe [en la figura, mostrada con (-)] y con la fracción activa procedente de la etapa de purificación de 200 g de raíces de cebada control [en la figura, mostrada con (+)]. Se llevó a cabo una SDS-PAGE utilizando placas de gel de acrilamida al 12,5% (Laemmli, Nature, Vol. 227, p. 680-685, 1970). Los geles fueron teñidos con Azul Brillante de Coomassie. La Fig. 2 muestra una etapa antes de la DEAE-Sepharose. La fila superior muestra el enzima procedente de las raíces de cebada deficientes en Fe y la fila inferior muestra el enzima procedente de las raíces control. En cada una, se muestran las Calles 1, extracto bruto, 200 \mug de proteína; Calles 2, después de Butyl Toyopearl® 650M, 100 \mug de proteína; Calles 3, después de hidroxiapatita, 20 \mug de proteína; y Calles 4, después de Butyl Toyopearl® 650M, 15 \mug de proteína.

La Fig. 13 muestra cada calle después de DEAE-Sepharose FF, 25 \mug de proteína. La Fig. 14 muestra después de Ether Toyopearl® 650M, en la cual la izquierda muestra la fracción inactiva y la derecha muestra la fracción activa, y 1/25 de cada fracción es sometido a electroforesis.

Como resultado, no se observó casi diferencia entre las raíces deficientes en Fe y las raíces control antes de la etapa de DEAE-Sepharose (consultar la Fig. 2). Después de la etapa de DEAE-Sepharose estaba claro que los péptidos de 30 y 31 kDa fueron inducidos por la deficiencia en Fe (consultar la Fig. 13). Después de la etapa de Ether Toyopearl®, el péptido de 31 kDa fue eliminado de la fracción activa. Se encontró que los péptidos de 32 y 33 kDa acababan de ser inducidos por la deficiencia en Fe (consultar la Fig. 14). Se detectaron actividades procedentes de los péptidos de 32 y 33 kDa, pero no se detectó actividad procedente del péptido de 30 kDa (consultar la Fig. 3).

El peso molecular del enzima de la presente invención fue determinado mediante filtración en gel.

Se informó que el peso molecular estimado por filtración en gel de la sintasa de nicotianamina era 40.000-50.000 (Higuchi y col., Plant & Soil, Vol. 165, p. 173-179, 1994). Pero éste no se correspondía con el valor calculado mediante SDS-PAGE.

En el presente estudio, el tampón que contenía CHAPS aumentaba eficazmente la resolución y se estimó que el peso molecular del presente enzima era 35.000 (consultar la Fig. 4); éste se corresponde bien con el valor calculado mediante SDS-PAGE.

La Fig. 4 muestra el patrón de elución de la sintasa de nicotianamina a partir de la columna de filtración en gel. Los círculos negros (\medbullet) indican la actividad enzimática y la línea continua indica absorción a 280 nm. La fracción activa después de la cromatografía en hidroxiapatita fue aplicada a una columna de Sephacryl S300HR (Pharmacia) (1,5 cm x 71 cm, 125 ml), equilibrada con tampón de revelado (Tris 50 mM, EDTA 1 mM, KCl 0,1 M, CHAPS 0,05%, p-APMSF 0,1 mM y DTT 3 mM, pH 8,0). Los marcadores de peso molecular utilizados fueron tiroglobulina (Mr 670.000), \gamma-globulina (Mr 158.000), ovoalbúmina (Mr 44.000) y mioglobina (Mr 17.000). El flujo lineal fue de 10 cm/hora.

La secuencia de aminoácidos parcial fue determinada a partir de la sintasa de nicotianamina purificada.

Los péptidos de 30 kDa, 32 kDa y 33 kDa anteriormente explicados fueron purificados a partir de 1 kg de raíces de cebada deficientes en Fe utilizando el método del Ejemplo 3 de la presente descrito posteriormente. Éstos fueron degradados parcialmente utilizando el método del Ejemplo 4 de la presente descrito posteriormente. Aunque los péptidos de 32 y 33 kDa no pudieron ser separados completamente entre sí, éstos podrían tener una secuencia similar o se supuso que el péptido de 32 kDa era el producto de degradación del péptido de 33 kDa, y los dos fueron degradados juntos.

Las secuencias de aminoácidos parciales determinadas indicaban que estos péptidos eran muy similares entre sí (Fig. 5). Además, como los pesos moleculares de los fragmentos de 33 kDa y 32 kDa (1) tenían un peso molecular casi inalterado comparado con el de antes de la degradación, esta secuencia podría ser la región N-terminal del presente enzima. Como resultado de una búsqueda en la base de datos mediante ordenador, se encontró que existía un gen de función desconocida que tenía una secuencia muy similar a estas secuencias en Oryza sativa y Arabidopsis thaliana. Especialmente, los clones D23792 y D24790 de ADNc-EST de Oryza sativa eran muy similares, con un 80,0% de identidad en un solapamiento de 33 aminoácidos en el primero y un 68,4% de identidad en un solapamiento de 19 aminoácidos en el último (Fig. 5).

La Fig. 5 muestra una comparación de seis secuencias de aminoácidos parciales determinadas para la sintasa de nicotianamina procedente de cebada y una secuencia similar de plantas gramíneas obtenida mediante búsqueda de la base de datos por ordenador. Un residuo de aminoácido idéntico está mostrado en " : ". La parte de las secuencias de nucleótidos indicadas por las flechas fue aplicada para las secuencias del cebador utilizado en PCR.

Se llevó a cabo el clonaje y la determinación de las secuencias de nucleótidos de los clones de ADNc que codificaban la sintasa de nicotianamina.

Se realizó una amplificación por PCR de ADNc total preparado a partir de raíces de cebada deficientes en Fe utilizando cebadores degenerados diseñados a partir de la secuencia de aminoácidos parcial obtenida del método anteriormente explicado, pero el ADN diana no pudo ser amplificado. Posteriormente se sintetizaron los cebadores que tenían una única secuencia de nucleótidos (mostrados por flechas en la Fig. 5) a partir de las secuencias de Oryza sativa, D23792 y D24790, y se llevó a cabo la amplificación por PCR. El fragmento de 205 pb fue amplificado por PCR utilizando los cebadores NF y NR y el fragmento de 278 pb fue amplificado por PCR utilizando los cebadores IF e IR, y éstos contenían las secuencias diana. Se sometió a selección una biblioteca de ADNc preparada utilizando ARN poli(A)^{+} procedente de raíces de cebada deficientes en Fe y se obtuvieron 19 clones positivos utilizando la sonda del fragmento de 205 pb y 88 clones positivos utilizando la sonda del fragmento de 274 pb.

Entre los clones así obtenidos, el clon denominado HvNAS1 contenía una región traducida de 985 pb y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma tenía 328 residuos de aminoácidos, con un peso molecular deducido de 35.144. Esto se correspondía bien con el valor estimado mediante SDS-PAGE y filtración en gel. Las secuencias de aminoácidos parciales de los péptidos de 32 kDa y 33 kDa estaban incluidas totalmente en HvNAS1 (Fig. 6).

El pI pronosticado de 5,2 coincidía bien con el valor calculado mediante electroforesis de enfoque isoeléctrico nativa. Se obtuvieron también seis clones que tenían una secuencia muy similar distintos de HvNAS1, esto es, HvNAS2, HvNAS3, HvNAS4, HvNAS5, HvNAS6 y HvNAS7 (Tabla 1, Figura 7).

La Fig. 7 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de los 7 ADNc anteriores obtenidos de cebada. Un asterisco " * " indica residuos de aminoácidos idénticos en todas las secuencias.

Las secuencias de nucleótidos de estos clones están mostradas en las SEC ID Nº: 2 (HvNAS1), SEC ID Nº: 4 (HvNAS2), SEC ID Nº: 6 (HvNAS3), SEC ID Nº: 8 (HvNAS4), SEC ID Nº: 10 (HvNAS5), SEC ID Nº: 12 (HvNAS6) y SEC ID Nº: 14 (HvNAS7), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de estas secuencias de aminoácidos están mostradas en las SEC ID Nº: 1 (HvNAS1), SEC ID Nº: 3 (HvNAS2), SEC ID Nº: 5 (HvNAS3), SEC ID Nº: 7 (HvNAS4), SEC ID Nº: 9 (HvNAS5), SEC ID Nº: 11 (HvNAS6) y SEC ID Nº: 13 (HvNAS7), respectivamente.

TABLA 1 Propiedades de los clones de nas

1

Las secuencias de aminoácidos parciales determinadas a partir del péptido de 30 kDa estaban todas incluidas en HvNAS5. Las regiones 5' y 3' no traducidas de estos clones no eran similares unas a otras.

Se encontró que D23792 y D24790 similares a la sintasa de nicotianamina de Oryza sativa tenían un 80% de identidad aproximadamente con HvNAS1. Se encontró que AC003114 y AB005245 de Arabidopsis thaliana tenían un 45% de identidad aproximadamente con HvNAS1.

La proteína HvNAS1 obtenida fue expresada en E. coli.

La amplificación por PCR del ORF de HvNAS1 fue clonada con el vector pMAL-c2 para expresar HvNAS1 fusionada con el extremo C-terminal de la proteína de unión a maltosa. La expresión de la proteína fusionada es inducida potentemente por IPTG.

El extracto bruto fue obtenido de E. coli transformadas y la actividad sintasa de nicotianamina fue analizada en el estado de proteína fusionada. En el extracto bruto de la cepa transformada solamente con el vector no pudo detectarse la actividad, mientras que se detectó la actividad en el caso de la cepa que tenía insertado el ORF de HvNAS1. El resultado está mostrado en la Fig. 8.

La Fig. 8 muestra resultados del análisis cromatográfico en capa fina (TLC) de la sintasa de nicotianamina obtenida del extracto bruto de E. coli que expresaba una proteína fusionada, proteína de unión a maltosa -HvNAS1. En la Fig. 8, Calle 1: sintasa de nicotianamina estándar; Calle 2: E. coli que expresa la proteína de unión a maltosa (SAM); y Calle 3: E. coli que expresa la proteína fusionada proteína de unión a maltosa - HvNAS1.

El análisis de hibridación Northern realizado por el método descrito posteriormente en el Ejemplo 7 indicaba que este gen era inducido potentemente en las raíces deficientes en Fe (Fig. 9). Esto coincide con el patrón de expresión de la actividad del presente enzima (Higuchi y col. 1994). La Fig. 9 muestra el resultado de un análisis de hibridación Northern utilizando como sonda HvNAS1. El ARN total fue extraído de hojas y raíces de cebada después de una semana de tratamiento deficiente en Fe y de hojas y raíces de cebada control, y se sometieron a electroforesis 5 \mug de ARN en cada calle.

El análisis de hibridación Southern del ADN genómico de cebada fue realizado de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 8 mencionado en la presente posteriormente. El corte del ADN con BamHI, EcoRI o HindIII produjo una pluralidad de fragmentos, sin embargo ninguno de los clones obtenidos actualmente pudo ser digerido por BamHI ni por EcoRI, y por consiguiente el gen de la sintasa de nicotianamina podría existir con múltiples copias en los genomas de la cebada y del arroz (Fig. 10).

La Fig. 10 muestra el análisis de hibridación Southern de HvNAS1 como sonda. Los ADNs genómicos de cebada y arroz fueron digeridos con BamHI (Calles B), EcoRI (Calles R) y HindIII (Calles H) y 10 \mug de los mismos fueron sometidos a electroforesis en cada calle.

Además, utilizando antígeno preparado por el método descrito en el Ejemplo 9 posterior de la presente, se realizó análisis de transferencia Western de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 10. Se encontró que la presente proteína enzimática era descompuesta rápidamente durante la operación en el extracto bruto preparado para detectar la presente actividad enzimática (Fig. 11). Los patrones de tinción coincidían con el hecho de que la presente actividad enzimática era detectada en un amplio rango entre 30 y 35 kDa después de SDS-PAGE (consultar la Fig. 3).

La Fig. 11 muestra el análisis de transferencia Western del enzima bruto utilizado para la detección de la actividad. Se llevó a cabo una SDS-PAGE utilizando una placa de gel de acrilamida al 12,5%. Se sometieron a electroforesis 100 \mug de proteína.

El extracto bruto obtenido a partir de la proteína desnaturalizada de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 10 de la presente posteriormente, fue detectado como casi una única banda con 35-36 kDa (Fig. 12). Este valor coincidía con el valor deducido a partir de la secuencia de aminoácidos.

La Fig. 12 muestra un análisis de transferencia Western de la proteína total extraída mediante ácido tricloroacético/acetona. Se realizó una SDS-PAGE utilizando una placa de gel de acrilamida al 12,5%. Se sometieron a electroforesis 100 \mug de proteína. Se sometieron a electroforesis 200 \mug de proteínas extraídas de las raíces y 500 \mug de proteínas extraídas de las hojas.

El análisis de transferencia Western después de electroforesis bidimensional reveló la detección de varias manchas. Esto coincidía con el hecho de la obtención de una pluralidad de genes de la sintasa de nicotianamina. Todas las manchas eran inducidas en las raíces deficientes en Fe.

Como resultado del proceso de selección de la biblioteca de ADNc procedente de ARN poli(A)^{+} de raíces de arroz deficientes en Fe utilizando sondas preparadas cortando HvNAS1 con los enzimas de restricción ApaLI y XhoI, se obtuvieron 20 clones. Estos clones fueron divididos en 3 tipos de clones de acuerdo con sus secuencias y, entre ellos, solamente un tipo contenía el ORF de longitud completa, que fue denominado OsNAS1. La secuencia de nucleótidos de OsNAS1 está mostrada en la SEC ID Nº: 16 y la secuencia de aminoácidos está mostrada en la SEC ID Nº: 15.

La amplificación por PCR del ORF de OsNAS1 fue clonada con un vector pMAL-c2 para expresar una forma fusionada con el extremo C-terminal de la proteína de unión a maltosa. La expresión de la proteína fusionada es inducida potentemente por IPTG.

Se obtuvo el extracto bruto de E. coli transformada con la proteína fusionada y se analizó la actividad sintasa de nicotianamina en el estado de proteína fusionada. Se detectó la misma actividad con HvNAS1. El resultado está mostrado en la Fig. 15. La Fig. 15 muestra los resultados del análisis cromatográfico en capa fina (TLC) de la sintasa de nicotianamina obtenida del extracto bruto de E. coli que expresaba una proteína fusionada, proteína de unión a maltosa - OsNAS1. En la Fig. 15, Calle 1: nicotianamina (NA) estándar; Calle 2: extracto de E. coli que expresa la proteína fusionada proteína de unión a maltosa - OsNAS1; y Calle 3: extracto de E. coli que expresa la proteína fusionada proteína de unión a maltosa - HvNAS1.

El análisis de hibridación Northern realizado mediante el método descrito en el Ejemplo 7 de la presente posteriormente indicaba que, en contraste con la cebada, en el arroz la expresión era inducida por el tratamiento deficiente en Fe no sólo en las raíces sino también en las hojas (Fig. 16). La Fig. 16 muestra el resultado de un análisis de hibridación Northern utilizando como sonda el ORF de OsNAS1. Se extrajo el ARN total de hojas y raíces de arroz después de dos semanas de tratamiento deficiente en Fe y de hojas y raíces de arroz control, y se sometieron a electroforesis 5 \mug de ARN en cada calle.

La secuencia de nucleótidos de Arabidopsis thaliana similar a HvNAS1 obtenida mediante búsqueda de la base de datos por ordenador fue utilizada como cebador. La amplificación por PCR del ADN genómico de Arabidopsis thaliana tuvo como resultado la obtención de tres genes de la sintasa de nicotianamina. Estos fueron denominados AtNAS1, AtNAS2 y AtNAS3.

Las secuencias de nucleótidos de estos genes están mostradas en las SEC ID Nº: 18 (AtNAS1), SEC ID Nº: 20 (AtNAS2) y SEC ID Nº: 22 (AtNAS3). Estas secuencias de aminoácidos están mostradas en las SEC ID Nº: 17 (AtNAS1), SEC ID Nº: 19 (AtNAS2) y SEC ID Nº: 21 (AtNAS3).

Los ORF de AtNAS1, AtNAS2 y AtNAS3 fueron amplificados por PCR y fueron clonados con un vector pMAL-c2. Se intentó expresar cada uno de ellos en forma de fusión con el extremo C-terminal de la proteína de unión a maltosa. La expresión de la proteína fusionada era inducida potentemente por IPTG.

Se obtuvo el extracto bruto de la E. coli transformada con la proteína fusionada y se analizó la actividad sintasa de nicotianamina en el estado de proteína fusionada. La actividad fue detectada. El resultado se muestra en la Fig. 17. La Fig. 17 muestra los resultados del análisis por TLC de la actividad sintasa de nicotianamina obtenida del extracto bruto de E. coli que expresaba una proteína fusionada, proteína de unión a maltosa - AtNAS. En la Fig. 17, Calles 1: nicotianamina (NA) estándar y S-adenosilmetionina; Calles 2: un extracto de E. coli que expresa solamente la proteína de unión a maltosa; Calles 3: un extracto de E. coli que expresa la proteína fusionada proteína de unión a maltosa - AtNAS1; Calles 4: un extracto de E. coli que expresa la proteína fusionada proteína de unión a maltosa - AtNAS2; y Calles 5: un extracto de E. coli que expresa la proteína fusionada proteína de unión a maltosa - AtNAS3.

Se llevó a cabo una RT-PCR de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 11 de la presente más adelante. Se encontró que AtNAS1 se expresaba en las raíces y en las partes aéreas de Arabidopsis thaliana, mientras que AtNAS2 no se expresaba ni en las raíces ni en las partes aéreas y AtNAS3 se expresaba solamente en las raíces (Fig. 18). En la Fig. 18, la Calle M muestra un marcador de peso molecular. La expresión génica se llevó a cabo en las partes aéreas, en las raíces y en los controles positivos. En la figura, Calles C: se amplificaron los ORF de longitud completa de AtNAS1 y AtNAS2; Calles 1: fragmentos de amplificación específicas de AtNAS1; Calles 2: fragmentos de amplificación específica de AtNAS2 y Calles 3: fragmentos de amplificación específica de AtNAS3.

Se ha descrito que la cantidad de ácido mugineico secretado aumentaba hasta 20 mg de ácido mugineico/g de peso seco de las raíces/día (Takagi, 1993). La actividad sintasa de nicotianamina bruta detectada por los presentes inventores era suficiente para satisfacer la misma. Como las presentes proteínas enzimáticas existen en más de varios tipos y existe un péptido de 30 kDa sin actividad, puede especularse que como resultado de la agregación de estos péptidos la estructura construida, que es preferiblemente para unirse a 3 moléculas de S-adenosilmetionina, revela una actividad máxima. El peso molecular estimado por filtración en gel fue de 35.000 (Fig. 4).

Actualmente no se ha observado un incremento de la actividad por reagregación de las subunidades. Como la proteína fusionada con la proteína de unión a maltosa y las subunidades mostraban su actividad, nosotros tenemos actualmente la idea de que el presente enzima podría ser un monómero. Sin embargo, no puede rechazarse completamente la posibilidad de que pueda revelarse una gran actividad mediante la construcción de un multímero.

El mecanismo de reacción de la síntesis de nicotianamina a partir de S-adenosilmetionina puede ser similar al de la reacción de transferencia de metilos utilizando S-adenosilmetionina como donante de metilo, y al de la reacción de síntesis de espermidina y espermina a partir de la S-adenosilmetionina descarboxilada. El dominio catalítico común de estos enzimas ha sido discutido con relación a la configuración de aminoácidos equivalentes que ocupan posiciones similares en estructuras de orden superior (Hashimoto y col. 1998 y Schluckebier y col. 1995).

En el futuro, el dominio catalítico puede ser elucidado como resultado de la comparación con sintasa de nicotianamina de otras especies de plantas o por cristalografía de rayos X.

La inducción de la actividad sintasa de nicotiamina por una deficiencia de Fe es un fenómeno específico de las plantas gramíneas y es esencial para la producción en masa de la familia del ácido mugineico. Oryza sativa es una planta en la que la secreción de la familia del ácido mugineico es la mínima entre las plantas gramíneas principales, por consiguiente es muy débil para la deficiencia de Fe en suelos calcáreos.

Por consiguiente, como resultado de la creación de Oryza sativa transformante que tiene tolerancia a la deficiencia de Fe por la introducción del gen de la sintasa de nicotianamina de la presente invención en las plantas gramíneas, especialmente Oryza sativa, y la expresión de una gran cantidad cuando hay deficiencia en Fe, puede ser posible el cultivo de arroz en un suelo calcáreo.

Hasta ahora se ha pensado que, en las plantas gramíneas, la nicotianamina tiene solamente un papel como precursora de la síntesis de la familia del ácido mugineico. Sin embargo, como la presente invención ha elucidado que el gen de la sintasa de nicotianamina constituía la familia de genes múltiples, puede desempeñar otras funciones importantes en las plantas gramíneas.

Se ha propuesto que en las plantas, que carecen de la capacidad para secretar la familia del ácido mugineico, excepto las plantas gramíneas, la nicotianamina desempeña una función clave como agente quelante endógeno de cationes metálicos divalentes tales como Fe^{2+}, Cu^{2+}, Zn^{2+} y Mn^{2+}, y que contribuye a la homeostasis de esos metales (Stephan y col. 1994). Por consiguiente, puede desempeñar el mismo papel en las plantas gramíneas.

La actividad sintasa de nicotianamina no es inducida en las dicotiledóneas, y la expresión del gen de la presente invención puede no ser inducida por una deficiencia en Fe. Nosotros hemos clonados los genes de la sintasa de nicotianamina de Arabidopsis thaliana. La composición de las regiones promotores de estos genes puede aclarar el mecanismo de la expresión génica causada por la deficiencia en Fe, y el gen de la presente invención puede desempeñar una función importante no sólo en las plantas gramíneas sino también en las dicotiledóneas.

La SEC ID Nº: 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la sintasa de nicotianamina de la presente invención.

La presente invención incluye la sintasa de nicotianamina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1. Sin embargo, la presente invención no se limita a la sintasa de nicotianamina anterior. La sintasa de nicotianamina de la presente invención incluye, a no ser que pierdan su actividad sintasa de nicotianamina, los péptidos en los que una parte de la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos está eliminada, preferiblemente un 50% o menos, más preferiblemente un 30% o menos, o incluso más preferiblemente un 10% o menos de los aminoácidos totales, o está sustituida por otros aminoácidos, o a la que se han añadido además otros aminoácidos, o en la que pueden combinarse estas deleciones, sustituciones y adiciones.

La secuencia de nucleótidos que codifica la sintasa de nicotianamina de la presente invención está mostrada en la SEC ID Nº: 2.

La presente invención incluye también no sólo un gen que codifica la sintasa de nicotianamina mostrado en la SEC ID Nº: 2, sino también genes que codifican la sintasa de nicotianamina mencionada en la presente anteriormente.

El vector de la presente invención que introduce el gen anterior no está limitado específicamente, y pueden introducirse diferentes vectores. El vector preferible es un vector de expresión.

Diferentes células pueden ser transformadas de manera convencional mediante la utilización del vector recombinante de la presente invención. Puede llevarse a cabo un producción masiva de nicotianamina mediante la utilización del transformante así obtenido. Estos métodos son bien conocidos por las personas expertas en la técnica.

Ejemplos de huéspedes para introducir el gen de la presente invención son bacterias, levaduras y células. El huésped preferible es una planta, especialmente una planta gramínea.

El método para introducir el gen no está limitado. Puede realizarse utilizando un vector o puede ser introducido directamente en el genoma.

Pueden prepararse de manera convencional anticuerpos de la presente invención contra la sintasa de nicotianamina mediante la utilización de la sintasa de nicotianamina de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o, si es necesario, anticuerpos monoclonales.

Además, puede producirse un cultivo selectivo de plantas, preferiblemente plantas gramíneas, mediante la utilización del gen de la presente invención. Especialmente, el gen de la presente invención puede ser aplicado para la mejora de variedades, las cuales pueden crecer incluso en un suelo deficiente en Fe.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes ilustran la presente invención, pero no deben ser interpretados como limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación del material de las plantas

Semillas de cebada (Hordeum Vulgare L. cv Ehimehadakamugi Nº 1) fueron germinadas sobre un papel de filtro húmedo y transferidas a la solución estándar para cultivo hidropónico (Mori y Nishizawa, 1987) en un invernadero a temperatura natural bajo luz natural. El pH de la solución del cultivo hidropónico fue ajustado a 5,5 con HCl 0,5 N diariamente. Cuando se desarrollaron las terceras hojas, las plantas fueron transferidas a la solución para cultivo hidropónico que no contenía Fe. El pH fue mantenido diariamente a 7,0 con NaOH 0,5 N. Se cultivaron también plantas control continuamente en la solución estándar de cultivo. La solución de cultivo fue renovada una vez a la semana. Dos semanas después del inicio del tratamiento deficiente en Fe, cuando aparecía significativamente una clorosis férrica grave en las hojas 4ª y 5ª, se recogieron las raíces y se congelaron en N_{2} líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su utilización.

Ejemplo 2 Ensayo de la actividad sintasa de nicotianamina

Se utilizó un método de ensayo modificado descrito previamente por los presentes inventores (Higuchi y col. 1996a). Las soluciones enzimáticas fueron equilibradas con tampón de reacción [Tris 50 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 3 mM (denominado de aquí en adelante DTT), fluoruro de (p-aminidinofenil) metanosulfonilo (denominado de aquí en adelante p-APMSF) 10 \muM y trans-epoxisuccinil-leucilamido-(4-guanidino) butano (denominado de aquí en adelante E-64) 10 \muM, pH 8,7]. El cambio de tampón se realizó utilizando una unidad de ultrafiltración, Ultrafree C3LGC NMWL10000 (Millipore Co.). Se añadió a la solución enzimática S-adenosilmetionina marcada con ^{14}C en el grupo carboxilo (Amersham Inc.) a una concentración final de 20 \muM y se mantuvo a 25EC durante 15 minutos. Los productos de la reacción fueron separados utilizando cromatografía en capa fina en gel de sílice LK6 (Whatman Inc.) utilizando un revelador (fenol:butanol:ácido fórmico:agua = 12:3:2:3). La radioactividad de los productos de reacción fue detectada por el Analizador de Imagen BAS-2000 (Fuji Film Co.). El contenido de proteína fue analizado mediante el método de Bradford utilizando un Kit de Ensayo de Proteínas (Bio Rad Inc.).

Ejemplo 3 Purificación de la sintasa de nicotianamina

Las operaciones siguientes se llevaron a cabo a 4ºC y el E-64 fue añadido a las fracciones que contenían sintasa de nicotianamina a una concentración final de 10 \muM.

Las raíces congeladas fueron trituradas hasta dar un polvo fino en N_{2} líquido y homogeneizadas en un exprimidor eléctrico doméstico con 200 ml de tampón de extracción [Tris 0,2 M, EDTA 10 mM, glicerol 5% (v/v), DTT 10 mM, E-64 0,1 mM, p-APMSF 0,1 mM y polivinilpirrolidona (PVP) insoluble 5% (p/v), pH 8,0] por 100 g de raíces. El homogenado fue centrifugado durante 30 minutos a 22.500 x g para obtener un sobrenadante. Se añadió al sobrenadante sulfato de amonio para dar una concentración final de 0,4 M y se dejó reposar durante 1 hora. De nuevo la mezcla fue centrifugada durante 30 minutos a 22.500 x g para obtener un sobrenadante.

El sobrenadante fue cargado en una columna de TSK gel® Butyl Toyopearl® 650M (10 ml de volumen de lecho por cada 100 g de raíces), equilibrada con el tampón de adsorción [Tris 20 mM, EDTA 1 mM, DTT 3 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,4 M y p-APMSF 0,1 mM, pH 8,0] y eluida con tampón de elución [Tris 10 mM, EDTA 1 mM, DTT 3 mM, p-APMSF 0,1 mM, glicerol 5% y ácido 3-[(3-cloramidopropil)dimetil-amonio]propanosulfónico (denominado de aquí en adelante CHAPS) 0,05%, pH 8,0].

Se añadió KCl a la fracción activa para dar una concentración final de 0,4 M, y se añadió tampón fosfato de potasio 1 M (pH 8,0) a una concentración final de KCl 1 mM. Se preparó hidroxiapatita de retícula 100 - 350 (Nacalai Tesque), equilibrada con tampón de adsorción (K-P 1 mM, KCl 10 mM, DTT 3 mM y p-APMSF 0,1 mM, pH 8,0), a 10 ml por cada 100 mg de proteína, y se cargaron las fracciones que contenían sintasa de nicotianamina. La sintasa de nicotianamina pasaba directamente sin ser adsorbida. La fracción que pasaba sin ser adsorbida fue cargada en una columna de TSK gel® Butyl Toyopearl® 650M (1 ml de volumen de lecho por 10 mg de proteína), y la sintasa de nicotianamina fue eluida de la manera anteriormente descrita.

La fracción activa fue cargada en una columna de DEAE-Sepharose FF (5 ml de volumen de lecho por 25 mg de proteína, Pharmacia) equilibrada con el tampón de adsorción (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, DTT 3 mM, p-APMSF 0,1 mM y CHAPS 0,05%, pH 8,0) y eluida con un gradiente de elución gradual de cloruro de potasio de concentraciones 0,05 M, 0,1 M, 0,15 M y 0,2 M. La sintasa de nicotianamina era eluida a una concentración 0,15 M de KCl.

La fracción activa fue cargada en la columna de Ether Toyopearl® 650M (10 ml de volumen de lecho por 100 g de raíces), equilibrada con tampón de adsorción [Tris 20 mM, EDTA 1 mM, DTT 3 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,2 M y p-APMSF 0,1 mM, pH 8,0]. La sintasa de nicotianamina no era adsorbida y pasaba libremente a través de la columna. La fracción que pasó libremente fue cargada en una columna de TSK gel® Butyl Toyopearl® 650M y se eluyeron las fracciones que contenían sintasa de nicotianamina. Los péptidos de la fracción activa que contenía sintasa de nicotianamina, que fue purificada mediante los tratamientos cromatográficos en columna anteriores, fueron separados mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio - poliacrilamida (denomina de aquí en adelante SDS-PAGE), utilizando placas de geles de acrilamida al 11%. Después de la SDS-PAGE el gel fue teñido con cloruro de cobre 0,3 M (Dzandu y col. 1988) y se cortaron las bandas separadas. Los fragmentos de gel fueron decolorados con EDTA 0,25 M/Tris 0,25 M (pH 9,0) y homogeneizados con el tampón de extracción (SDS 1%, Tris 25 mM y glicina 192 mM). Cada homogenado fue electroeluido con tampón sin SDS (Tris 25 mM y glicina 192 mM) y el péptido fue recuperado.

Ejemplo 4 Determinación de la secuencia de aminoácidos parcial

La sintasa de nicotianamina aislada fue digerida químicamente con bromuro de cianógeno (Gross 1967).

Después del tratamiento de SDS-PAGE, se añadieron un volumen de 10 veces de ácido fórmico al 70% (v/v) y bromuro de cianógeno al 1% (p/v) a los fragmentos de gel que contenían la sintasa de nicotianamina y se descompusieron a 4ºC durante una noche. Después de la finalización de la digestión, se recogió la parte líquida y se secó in vacuo. La sustancia secada fue disuelta en tampón de muestra de SDS-PAGE y se dejó estar a temperatura ambiente durante una noche, posteriormente el producto digerido fue separado mediante SDS-PAGE utilizando un gel de acrilamida al 16,5% que contenía Tricina (Schagger y Jagow, 1987). Los péptidos fueron transferidos a una membrana de PVDF mediante electrotransferencia (Towbin y col. 1979) y teñidos con Negro Amido. Las bandas teñidas fueron cortadas y se determinó la secuencia de aminoácidos del lado N-terminal de cada péptido por degradación de Edman en un secuenciador de fase gaseosa (secuenciador de proteínas Modelo 492A, Applied Biosystems
Inc).

Ejemplo 5 Clonaje de los genes de la sintasa de nicotianamina

Se llevó a cabo una amplificación por PCR del ADNc originado a partir de las raíces de cebada deficientes en Fe utilizando unos cebadores que fueron sintetizados sobre la base de la secuencia de aminoácidos parcial obtenida. Se sometió a selección una biblioteca de ADNc de pYH23 preparada a partir del ARN poli (A)^{+} de raíces de cebada deficientes en Fe con los fragmentos de ADN así obtenidos del producto de la PCR, que fue marcado con [\alpha-^{32}P]dATP utilizando el kit de cebadores aleatorios (Takara Shuzo Co.), como cebadores. Los clones de ADNc aislados fueron secuenciados con el kit de secuenciación cíclica (Shimadzu Bunko Co.) utilizando el secuenciador de ADN DSQ-2000L de Shimadzu.

Se realizó una amplificación por PCR del ADN genómico de Arabidopsis thaliana utilizando cebadores que fueron sintetizados sobre la base de las secuencias de nucleótidos de AC003114 y AB005245 de Arabidopsis thaliana. Los fragmentos de ADN así obtenidos fueron secuenciados con el kit de secuenciación cíclica (Shimadzu Bunko Co.) utilizando el secuenciador de ADN DSQ-1000L de Shimadzu.

La secuencia de nucleótidos determinada está mostrada en la SEC ID Nº: 2.

Ejemplo 6 Expresión de la proteína NAS1 en E. coli

Un fragmento, en el que se había introducido un sitio de EcoRI corriente arriba del primer ATG del ADNc de HvNAS1 y en el que se habían introducido sitios de PstI y BamHI corriente abajo del codón de parada del ADNc de HvNAS1, fue amplificado por PCR. El producto amplificado así obtenido fue subclonado en pBluescriptII SK- utilizando el sitio de EcoRI y el sitio de BamHI, y se confirmó la secuencia de nucleótidos correcta. El fragmento entre el sitio de EcoRI y el sitio de PstI fue clonado en pMAL-c2 para producir la expresión en forma de fusión de HvNAS1 con el extremo C-terminal de la proteína de unión a maltosa.

Un fragmento, en el que se había introducido un sitio de EcoRI corriente arriba del primer ATG de OsNAS1 y en el que se había introducido un sitio HindIII corriente abajo del codón de parada de OsNAS1, fue amplificado por PCR. El producto amplificado así obtenido fue subclonado en pBluescriptII SK- utilizando un sitio de EcoRI y un sitio de HindIII, y se confirmó la secuencia de nucleótidos correcta. El fragmento entre el sitio de EcoRI y el sitio de HindIII fue clonado en pMAL-c2 para producir la expresión en forma de fusión de OsNAS1 con el extremo C-terminal de la proteína de unión a maltosa.

Un fragmento, en el que se había introducido un sitio de EcoRI corriente arriba del primer ATG de AtNAS1, AtNAS2 y AtNAS3 y en el que se había introducido un sitio de XbaI corriente abajo del codón de parada de
AtNAS1, AtNAS2 y AtNAS3, fue amplificado por PCR. Los productos amplificados así obtenidos fueron subclonados en pBluescriptII SK-, y se confirmaron las secuencias de nucleótidos correctas. El fragmento entre el sitio de EcoRI y el sitio de XbaI, fue clonado en pMAL-c2 para producir la expresión en forma de fusión de AtNAS1, AtNAS2 y AtNAS3 con el extremo C-terminal de proteínas de unión a maltosa, respectivamente.

Se utilizó E. coli cepa XL1-Blue como huésped para expresar dicha proteína fusionada. Se introdujeron
pMAL-c2-HvNAS1 y pMAL-c2, respectivamente, en XL1-Blue. Las bacterias recombinantes así obtenidas fueron cultivadas en medio LB que contenía ampicilina y tetraciclina, 50 \mug/ml de cada una, a 37ºC hasta que la DO 600 del cultivo llegó a 0,5. Se añadió isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,3 mM, y se cultivaron continuamente a 37ºC durante 3 horas, y se recogieron las células bacterianas. Las células fueron suspendidas en tampón Tris 10 mM que contenía NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM, DTT 3 mM y E-64 0,1 mM, pH 7,4, y se congelaron con nitrógeno líquido. Éste fue fundido en agua de hielo y se repitió 10 veces una ultrasonicación durante 15 segundos. La actividad sintasa de nicotianamina del extracto bruto así obtenido fue analizada de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2, y se confirmó la actividad enzimática.

Ejemplo 7 Hibridación Northern

Se realizó una hibridación Northern de ARN de cebada utilizando como sonda un fragmento de ADN, que fue preparado cortando el ADNc de HvNAS1 con HindIII y NotI y marcándolo con [\alpha-^{32}P]dATP. Se extrajo el ARN total de cebada (Naito y col. 1988). El ARN extraído fue separado mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,4% y transferido a membranas Hybond-N^{+} (Amersham). Se llevó a cabo una hibridación Northern de ARN de arroz utilizando como sonda el ORF de OsNAS1, que fue marcado con [\alpha-^{32}P]dATP. Se extrajo el ARN total del arroz. El ARN extraído fue separado mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,4% y transferido a membranas Hybond-N^{+} (Amersham). La membrana fue hibridada con la sonda en tampón fosfato de Church 0,5 M (Church y Gilbert 1984), EDTA 1 M, SDS 7% (p/v) con 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón a 65ºC durante una noche. La membrana fue lavada con tampón que contenía tampón fosfato de Church 40 mM y SDS 1% (p/v) a 65ºC durante 10 minutos. Posteriormente el lavado se repitió una vez más, la membrana fue lavada con tampón que contenía SSPE 0,2X y SDS 0,1% (p/v) a 65ºC durante 10 minutos. La radioactividad fue detectada utilizando el analizador de imagen
BAS-2000.

Los resultados están mostrados en la Fig. 9 y en la Fig. 16.

Ejemplo 8 Hibridación Southern

Se extrajo el ADN genómico de hojas de cebada y arroz. El extracto fue digerido con BamHI, EcoRI o HindIII, separado mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% (p/v) y transferido a membranas Hybond-N^{+} (Amersham). La hibridación se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 7 y se detectó la radioactividad. El resultado está mostrado en la Fig. 10.

Ejemplo 9 Preparación de anticuerpos policlonales

Se inmunizaron dos ratas utilizando el antígeno que contenía 100 \mug aproximadamente de sintasa de nicotianamina aislada. El antígeno era la misma muestra que la utilizada para determinar la secuencia de aminoácidos parcial. Se utilizó adyuvante completo de Freund para la primera inmunización y se utilizó adyuvante incompleto de Freund para la segunda inmunización. Se recogieron todos los constituyentes de la sangre después de que las ratas fueran inmunizadas cuatro veces, y el suero obtenido se conservó a -80ºC.

Ejemplo 10 Análisis de transferencia Western

Se extrajo la proteína total utilizando ácido tricloroacético y acetona (Damerval y col. 1986). Las plantas fueron trituradas en nitrógeno líquido hasta que se obtuvo un polvo que se mezcló con acetona que contenía un 0,1% de 2-mercaptoetanol (v/v). La proteína fue precipitada mediante reposo a -20ºC durante 1 hora, y el precipitado fue recogido mediante centrifugación a 16.000 x g durante 30 minutos. El precipitado fue suspendido en acetona que contenía un 0,1% de 2-mercaptoetanol (v/v) y se dejó reposar a -20ºC durante 1 hora; posteriormente se recogió el precipitado por centrifugación a 16.000 x g durante 30 minutos. El precipitado fue secado in vacuo y disuelto en tampón de muestra [urea 9,5 M, Triton X-100 2% (p/v) y ME 5% (v/v)], posteriormente fue centrifugado a 16.000 x g durante 10 minutos para obtener el sobrenadante. Las proteínas contenidas en el sobrenadante fueron separadas mediante SDS-PAGE o mediante electroforesis bidimensional desnaturalizante (O'Farrell 1975) y transferidas a una membrana de PVDF. Se llevó a cabo un análisis de transferencia Western aplicando el anticuerpo primario que contenía el anticuerpo anti-sintasa de nicotianamina preparado en el Ejemplo 9 y el anticuerpo secundario que contenía anticuerpo anti-IgG de ratón (H + L) producido en cabra unido a peroxidasa de rábano picante (Wako Pure Chemicals Co.) sobre la membrana y tiñendo con diaminobencidina.

El resultado está mostrado en la Fig. 12. Se llevó a cabo una SDS-PAGE utilizando una placa de gel de acrilamida al 12,5%. Se sometieron a electroforesis 100 \mug de proteína. Se sometieron a electroforesis proteínas de 200 \mug de raíces y de 500 \mug de hojas.

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Ejemplo 11 RT-PCR

Se extrajo el ARN total de Arabidopsis thaliana. Se realizó una RT-PCR con 1 \mug de ARN como molde mediante la utilización del kit de PCR para ARN EZ rTth (Perkin Elmer Inc.). Se utilizaron cebadores específicos para AtNAS1, AtNAS2 y AtNAS3, respectivamente.

El resultado está mostrado en la Fig. 18.

Aplicabilidad industrial

Diferentes células son transformadas de acuerdo con el método convencional mediante la utilización de los vectores recombinantes de la presente invención. La producción en masa de nicotianamina puede ser realizada utilizando el transformante obtenido. Estos métodos pueden ser llevados a cabo de acuerdo con el método conocido por las personas expertas en la técnica.

Puede llevarse a cabo también el cultivo selectivo de plantas, preferiblemente plantas gramíneas, utilizando los genes de la presente invención. Especialmente, los genes de la presente invención pueden ser aplicados para la mejora de variedades, las cuales pueden crecer en un suelo deficiente en Fe.

<110> Japan Science And Technology Corporation

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<120> Sintasa de nicotianamina, genes que codifican la sintasa de nicotianamina

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<130> PA906235

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<160> 22

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<210> 1

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<211> 328

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<212> PRT

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<213> Hordeum vulgare L.

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 1295

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<212> ADN

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<213> Hordeum vulgare L.

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<400> 2

3

4

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<210> 3

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<211> 335

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<212> PRT

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<213> Hordeum vulgare L.

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<400> 3

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5

6

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<210> 4

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<211> 1342

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<212> ADN

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<213> Hordeum vulgare L.

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<400> 4

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7

8

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<210> 5

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<211> 335

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<212> PRT

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<213> Hordeum vulgare L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 1314

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<212> ADN

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<213> Hordeum vulgare L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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11

12

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 329

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<212> PRT

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<213> Hordeum vulgare L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare L.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

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<210> 9

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<211> 282

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<212> PRT

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<213> Hordeum vulgare L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 1044

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Hordeum vulgare L.

\newpage

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<400> 10

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18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Hordeum vulgare L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1352

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare L.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Oryza sativa L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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29

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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<211> 963

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 963

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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36

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 320

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

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37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 963

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

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38

Claims

1. Un enzima aislado que presenta actividad sintasa de nicotianamina, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a) SEC ID Nº: 1, o de

(b) una secuencia que es homóloga a la SEC ID Nº: 1.

2. El enzima de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho enzima procede de cebada.

3. El enzima de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.

4. El enzima de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3.

5. El enzima de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5.

6. El enzima de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7.

7. El enzima de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9.

8. El enzima de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 11.

9. El enzima de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 13.

10. El enzima de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho enzima procede de Oryza sativa.

11. El enzima de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 15.

12. El enzima de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho enzima procede de Arabidopsis.

13. El enzima de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 17.

14. El enzima de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 19.

15. El enzima de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicho enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 21.

16. Un gen que codifica la secuencia de aminoácidos del enzima de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Un ácido nucleico que codifica un enzima que presenta actividad sintasa de nicotianamina, donde el ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada de:

(A) SEC ID Nº: 2,

(B) una secuencia que es homóloga a la SEC ID Nº: 2.

18. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 17, donde el ácido nucleico procede de cebada.

19. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 2.

20. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 4.

\newpage

21. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 6.

22. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 8.

23. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 10.

24. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 12.

25. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 14.

26. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 17, donde el ácido nucleico procede de Oryza sativa.

27. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 26, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 16.

28. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 17, donde el ácido nucleico procede de Arabidopsis.

29. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 18.

30. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 20.

31. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 22.

32. El ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 17 a 31, donde el ácido nucleico es ADN.

33. Un vector que contiene un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 32.

34. El vector de acuerdo con la reivindicación 33, donde dicho vector es un vector de expresión.

35. Un transformante no humano transformado por el vector de acuerdo con la reivindicación 33 ó 34.

36. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 2.

37. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 4.

38. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 6.

39. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 8.

40. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 10.

41. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 12.

42. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 14.

43. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 16.

44. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 18.

45. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 20.

46. El transformante de acuerdo con la reivindicación 35, que contiene un gen foráneo que es un gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 22.

47. El transformante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 46, donde el huésped es una bacteria.

48. Un proceso para la producción de nicotianamina que comprende la utilización del transformante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 47.

49. Un anticuerpo contra un enzima de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

50. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 49, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

51. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 49, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

52. Un método para la purificación de sintasa de nicotianamina que comprende: la utilización de un inhibidor de tiol proteasas, la utilización de tampón CHAPS, la utilización de los vehículos para cromatografía de intercambio iónico DEAE-Sepharose FF® o DEAE Sephacel®, la utilización del vehículo para cromatografía hidrofóbica TSK gel Butyl Toyopearl® y la utilización del vehículo para cromatografía hidrofóbica TSK gel Ether Toyopearl®.

53. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en el que el inhibidor de tiol proteasas es E-64.