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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft monoklonale Antikörper (mAbs) mit reduzierter
Immunogenität
in Menschen.
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Hintergrund der Erfindung
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Viele
potentiell therapeutische mAbs werden aus Gründen von Geschwindigkeit und
Einfachheit zuerst in einem murinen Hybridomsystem erzeugt. Nicht-humane
mABs enthalten substantielle Abschnitte von Aminosäuresequenzen,
die bei Injektion in einen menschlichen Patienten immunogen sein
werden. Es ist allgemein bekannt, dass ein Patient nach der Injektion
eines fremden Antikörpers,
wie eines murinen Antikörpers, eine
starke humane anti-Maus-Antikörper-(HAMA)-Reaktion
aufweisen kann, die im wesentlichen den therapeutischen Nutzen des
Antikörpers
nach der anfänglichen
Behandlung sowie den Nutzen jedes anderen, nachfolgend verabreichten
murinen Antikörpers
eliminiert.
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Humanisierungstechniken
zur Erzeugung von mAbs, die eine reduzierte Immunogenität in Menschen aufweisen,
während
sie die Bindungsaffinität
des ursprünglichen
nicht-humanen parentalen mAb beibehalten, sind allgemein bekannt.
Siehe z.B. die in den US-PSen 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; und
5,225,539 offenbarten.
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Allgemein
hängen
diese Verfahren vom Austausch der Komplementaritätbestimmenden Regionen (CDRs)
der humanen variablen schweren und leichten Region gegen Antigen-spezifische
nicht-humane CDRs ab, einem als CDR-Grafting bekannten Verfahren. Es ist
ebenfalls allgemein bekannt, dass in CDR-Grafting-Experimenten die
Beibehaltung der ursprünglichen
Antigen-Bindungsaffinität gesteigert
wird und in vielen Fällen
von der Wahl humaner Akzeptorgerüstregionen
abhängt,
die mit den entsprechenden Gerüsten
des CDR-Donor-Antikörpers
am besten übereinstimmen.
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Da
jedoch das menschliche Genom ein beschränktes Repertoire von Gerüstregionen
der schweren und leichten Kette enthält, leiden diese Verfahren
an der Beschränkung
der verfügbaren
humanen Akzeptorgerüste.
Diese Beschränkung
des Akzeptorgerüstrepertoires
kann notwendigerweise den Übereinstimmungsgrad
zwischen dem nicht-humanen Donor- und dem humanen Akzeptorantikörper einschränken. Daher
sind CDR-Grafting-Verfahren durch das bekannte verfügbare Repertoire
von Gerüstregionen
der humanen variablen schweren (VH) und variablen leichten (VL)
Kette beschränkt.
Ersichtlich besteht ein Bedarf an einem erweiterten Bereich von
Akzeptor-V-Regionen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Somit
stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper bereit, der alle drei
CDRs, die aus einem Antigen-spezifischen Donor einer Nagetierart
stammen, Akzeptorgerüstreste,
die aus einem Menschenaffen-Primaten stammen, und eine humane konstante
Region umfasst.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 ist
eine Aminosäuresequenz
der gentechnisch hergestellten 4A6 VL-Region. Sternchen oberhalb
der 4A6-Sequenz zeigen die im gentechnisch hergestellten Molekül beibehaltenen
4A6-Gerüstreste
an. Fettgeschriebene und kursivgeschriebene Buchstaben zeigen die
CDRs an.
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2 ist
eine Aminosäuresequenz
der gentechnisch hergestellten 4A6 VH-Region. Sternchen oberhalb
der 4A6-Sequenz zeigen die im gentechnisch hergestellten Molekül beibehaltenen
4A6-Gerüstreste
an. Fettgeschriebene und kursivgeschriebene Buchstaben zeigen die
CDRs an.
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3 ist
eine Aminosäuresequenzangleichung,
die den murinen Antikörper
B9Vκ mit
den am besten übereinstimmenden
Vκ- und
ausgewählten
Jκ-Sequenzen des Schimpansen
vergleicht. Die CDR-Regionen sind durch fettgeschriebene und kursivgeschriebene
Buchstaben angezeigt. Lücken
sind durch Punkte angezeigt. Die Nummerierungskonvention ist aus
Kabat et al., nachfolgend, übernommen.
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5 ist
eine Aminosäuresequenzangleichung,
die den murinen Antikörper
3G9Vκ mit
den am besten übereinstimmenden
Vκ- und
ausgewählten
Jκ-Sequenzen des Schimpansen
vergleicht. Die CDR-Regionen sind durch fettgeschriebene und kursivgeschriebene
Buchstaben angezeigt. Lücken
sind durch Punkte angezeigt. Sternchen zeigen Gerüstreste
an, von denen vorhergesagt wird, dass sie mit CDRs wechselwirken
und die Antigen-Bindungsaffinität
beeinflussen. Die Nummerierungskonvention ist aus Kabat et al.,
nachfolgend, übernommen.
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6 ist
eine Aminosäuresequenzangleichung,
die den murinen Antikörper
3G9VH mit den am besten übereinstimmenden
VH- und ausgewählten
JH-Sequenzen des
Schimpansen vergleicht. Die CDR-Regionen sind durch fettgeschriebene
und kursivgeschriebene Buchstaben angezeigt. Lücken sind durch Punkte angezeigt.
Sternchen zeigen Gerüstreste
an, von denen vorhergesagt wird, dass sie mit CDRs wechselwirken und
die Antigen-Bindungsaffinität
beeinflussen. Die Nummerierungskonvention ist aus Kabat et al.,
nachfolgend, übernommen.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
molekularen genetischen Aspekte der Antikörperstruktur wurden von S.
Tonegawa in Nature 302: 575–581
(1983) rezensiert. Kurz gesagt sind Antikörper Heterodimere, die wenigstens
zwei schwere und zwei leichte Ketten umfassen. Die N-terminale Domäne jeder
schweren und leichten kette, als VH bzw. VL bezeichnet, falten sich
zusammen, um die Antigen-Bindungsstelle zu bilden. Auf der genetischen
Ebene wird die VL-Domäne
durch zwei unterschiedliche Gensegmente codiert, bezeichnet als
Vκ oder
Vl, und Jκ oder
Jl, die sich verbinden, um eine kontinuierliche VL-Region bilden.
In ähnlicher
Weise wird die VH-Domäne
durch drei Gensegmente codiert, VH, DH und JH, die sich verbinden,
um eine kontinuierliche VH-Region zu bilden. Somit können unterschiedliche
VL- und VH-Regionen durch unterschiedliche Kombinationen von Vκ oder Vl,
Jκ oder Jl
und VH, DH und JH codiert werden. Diese kombinatorische Vielfalt
ist teilweise das Mittel, durch das die Immunreaktion die tausendfache
Vielfalt unterschiedlicher Antikörpermoleküle und ihre
assoziierten Antigen-Spezifitäten
erzeugt.
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Auf
der Proteinebene kann jede Domäne
der schweren und leichten V-Region
weiter in drei CDRs unterteilt werden. Drei CDRs der schweren und
drei CDRs der leichten Kette falten sich zusammen, um die Antigenbindungsoberfläche und
einen Teil der darunterliegenden Trägerstrukturen zu bilden, die
erforderlich sind, um die genaue dreidimensionale Struktur der Antigenbindungsstelle
aufrechtzuerhalten. Flankierend zu jedem CDR sind Gerüstregionen,
die in den meisten Fällen
nicht direkt mit dem spezifischen Antigen wechselwirken, sondern
vielmehr zur Bildung des Gerüsts
dienen, das die Antigenbindungseigenschaften der CDRs stützt. Jede
schwere und leichte Kette hat vier Gerüstregionen, von denen drei
aus dem VH- oder VL-Gensegment stammen und die vierte aus dem JH-,
Jκ- oder
Jl-Gensegment stammt. Somit ist die Reihenfolge der Gerüste und
CDRs ab dem N-Terminus-Gerüst
I, CDR I, Gerüst
II, CDR II, Gerüst
III, CDR III, Gerüst
IV. Auf der genetischen Ebene wird alles von Gerüst I bis einschließlich Gerüst III durch
das Gensegment der V-Region codiert; CDR III wird zusammen durch
die Gensegmente sowohl der V-Region als auch der J-Region codiert;
Gerüst IV
wird vollständig
aus dem J-Gensegment codiert.
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Der
Begriff "Donor-Antikörper" bezeichnet einen
monoklonalen oder rekombinanten Antikörper, der die Nucleinsäuresequenzen
seiner variablen Regionen, CDRs oder anderer funktioneller Fragmente
oder Analoga davon zu einem gentechnisch hergestellten Antikörper beiträgt, um die
codierende Region des gentechnisch hergestellten Antikörpers und
den resultierenden exprimierten gentechnisch hergestellten Antikörper mit
der antigenen Spezifität
und Eigenschaft der neutralisierenden Aktivität des Donor-Antikörpers zu
versehen.
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Der
Begriff "Akzeptor-Antikörper" bezeichnet monoklonale
oder rekombinante Antikörper,
die zum Donor-Antikörper
heterolog sind und die gesamten oder einen Teil der Nucleinsäuresequenzen,
die seine Gerüstregionen
der schweren und/oder leichten Kette und/oder seine konstanten Regionen
der schweren und/oder leichten Kette codieren, oder Unterfamilie-consensus-Sequenzen der V-Region
zum gentechnisch hergestellten Antikörper beitragen.
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Ein "funktionelles Fragment" ist eine partielle
variable Sequenz der schweren oder leichten Kette (z.B. geringfügige Deletionen
am Amino- oder Carboxyterminus der variablen Immunglobulin-Region),
das die gleiche Antigenbindungsspezifität und -affinität wie der
Antikörper
beibehält,
aus dem das Fragment stammt.
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Ein "Analogon" ist eine durch wenigstens
eine Aminosäure
modifizierte Aminosäuresequenz,
worin die Modifikation chemisch oder eine Substitution sein kann
und die Modifikation der Aminosäuresequenz
erlaubt, die biologischen Eigenschaften, z.B. Antigenspezifität und hohe
Affinität,
der unmodifizierten Sequenz beizubehalten.
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Verfahren
werden bereitgestellt zur Herstellung gentechnisch hergestellter
Antikörper
mit reduzierter Immunogenität
in Menschen und Menschenaffen aus nicht-humanen Antikörpern. CDRs
aus Antigen-spezifischen nicht-humanen
Antikörpern,
typischerweise mit Nagetierursprung, werden auf homologe nicht-humane Primaten-Akzeptorgerüste gepfropft.
Bevorzugt sind die nicht-humanen Primaten-Akzeptorgerüste aus
Altwelt-Menschenaffen. Am meisten bevorzugt ist das Altwelt-Menschenaffen-Akzeptorgerüst aus Pan
troglodytes, Pan paniscus oder Gorilla gorilla. Besonders bevorzugt
ist der Schimpanse Pan troglodytes. Ebenfalls bevorzugt sind Altweltaffen-Akzeptorgerüste. Am
meisten bevorzugt sind die Altweltaffen-Akzeptorgerüste aus der
Gattung Macaca. Besonders bevorzugt ist der Cynomolgus-Affe Macaca
cynomolgus.
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Besonders
bevorzugte Gerüste
der variablen Region der schweren Kette (VH) des Schimansen (Pan troglodytes)
sind CPVH41-12 mit der in SEQ ID NO: 10 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 83 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CPVH41-1 mit der in SEQ ID NO: 11 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 85 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CVPH41-4 mit der in SEQ ID NO: 12 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III; CPVH41-7 mit der in SEQ ID NO: 13 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III; CPVH41-8 mit der in SEQ ID NO: 14 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III; CPVH41-9 mit der in SEQ ID NO: 15 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 81 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CPVH41-10 mit der in SEQ ID NO: 16 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 82 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CPVH41-18 mit der in SEQ ID NO: 17 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III; und CPVH41-19 mit der in SEQ ID NO: 18 gezeigten
Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 84 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV.
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Besonders
bevorzugte Gerüste
der variablen κ-Region
der leichten Kette (Vκ)
des Schimpansen (Pan troglodytes) sind CPVκ46-1 mit der in SEQ ID NO: 28
gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III; CPVκ46-3
mit der in SEQ ID NO: 29 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III; CPVκ46-4
mit der in SEQ ID NO: 30 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III; CPVκ46-5
mit der in SEQ ID NO: 31 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III; CPVκ46-6
mit der in SEQ ID NO: 32 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III und der in SEQ ID NO: 86 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CPVκ46-7
mit der in SEQ ID NO: 33 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III und der in SEQ ID NO: 87 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CPVκ46-8
mit der in SEQ ID NO: 34 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III; CPVκ46-11
mit der in SEQ ID NO: 35 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III; und CPVκ46-14
mit der in SEQ ID NO: 36 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III.
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Besonders
bevorzugte Gerüste
der variablen Region der schweren Kette (VH) von Cynomolgus (Macaca
cynomolgus) sind CYVH2-1 mit der in SEQ ID NO: 45 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 88 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CYVH2-3 mit der in SEQ ID NO: 46 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 89 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CYVH2-4 mit der in SEQ NO: 47 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 90 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CYVH2-5 mit der in SEQ ID NO: 48 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 93 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CYVH2-6 mit der in SEQ ID NO: 49 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 91 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CYVH2-7 mit der in SEQ ID NO: 50 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III; CYVH2-8 mit der in SEQ ID NO: 51 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III; und CYVH2-10 mit der in SEQ ID NO: 52 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III und der in SEQ ID NO: 92 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV.
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Besonders
bevorzugte Gerüste
der variablen κ-Region
der leichten Kette von Cynomolgus (Macaca cynomolgus) sind CYVκ4-2 mit der
in SEQ ID NO: 59 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III; CYVκ4-3
mit der in SEQ ID NO: 60 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III und der in SEQ ID NO: 94 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV; CYVx4-5 mit der in SEQ ID NO: 61 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
I, II und III; CYVκ4-6
mit der in SEQ ID NO: 62 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III und der SEQ ID NO: 95 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst IV; CYVκ4-10 mit
der in SEQ ID NO: 63 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III; und CYVκ4-11
mit der in SEQ ID NO: 64 gezeigten Aminosäuresequenz von Gerüst I, II
und III und der in SEQ ID NO: 96 gezeigten Aminosäuresequenz
von Gerüst
IV.
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Isolierte
Nucleinsäuremoleküle, die
die Aminosäuresequenzen
von VH- und Vκ-Akzeptorgerüst I, II und
III des Schimpansen mit SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 und die Aminosäuresequenzen
von Gerüst
IV mit SEQ ID NOs: 81, 82, 83, 84, 85, 86 oder 87 codieren, sind
ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Ferner sind ebenfalls
isolierte Nucleinsäuremoleküle, die
die Aminosäuresequenzen
von VH- und Vκ-Akzeptorgerüst I, II
und III von Cynomolgus mit SEQ ID Nos: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,
52, 59, 60, 61, 62, 63 oder 64 und die Aminosäuresequenzen von Gerüst IV mit
SEQ ID NOs: 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 oder 96 codieren, Teil
der vorliegenden Erfindung. Nucleinsäuresequenzen, die funktionelle
Fragmente oder Analoga der Aminosäuresequenzen des VH- und Vκ-Akzeptorgerüsts codieren,
sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
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Zusätzlich zu
hier beschriebenen isolierten Nucleinsäuresequenzen, die VH- und Vκ-Akzeptorgerüste codieren,
sind ebenfalls Nucleinsäuresequenzen,
die komplementär
zu diesen Gerüstregionen
sind, von der vorliegenden Erfindung umfasst. Nützliche DNA-Sequenzen schließen diejenigen
Sequenzen ein, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
mit den DNA-Sequenzen hybridisieren. Siehe T. Maniatis et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982),
S. 387–389.
Ein Beispiel für
eine solche stringente Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung
mit 4XSSC bei 65°C,
gefolgt von einer Spülung
in 0,1XSSC bei 65°C
für 1 Stunde.
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Alternativ
ist eine exemplarische stringente Hybridisierungsbedingung 50 %
Formamid, 4XSSC bei 42°C.
Bevorzugt sind diese hybridisierenden DNA-Sequenzen wenigstens ca. 18 Nucleotide
lang.
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Geeignete
Gerüste
werden durch eine computergestützte
Homologierecherche in Elementen einer Datenbank aus VH- und VL-Regionen
von Altwelt-Menschenaffen
oder -Affen ausgewählt.
Die Gerüstportionen
von Primaten-Antikörpern sind
nützlich
als Komponenten von therapeutischen Antikörpern. Außerdem werden Primaten-Antikörpergerüste toleriert
werden, wenn sie in der Behandlung von Menschen verwendet werden,
aufgrund der engen Sequenzhomologie zwischen denen Genen der Primaten
und Menschen. Daher sieht die vorliegende Erfindung das Pfropfen
von CDRs aus einem Antigen-spezifischen nicht-humanen Donor-Antikörper auf
aus nicht-humanen Primaten-Arten stammende Akzeptor-Regionen vor.
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Die
Antigenspezifizität
und Bindungskinetik des Donor-Antikörpers, der einen Nagetier-
oder jeden anderen nicht-humanen Ursprung haben kann, werden am
besten durch Auswahl von Primaten-Akzeptor-V-Regionen bewahrt, die
durch computergestützte
Homologierecherche als dem Donor-Antikörper am ähnlichsten bestimmt werden.
Alternativ kann der Akzeptor-Antikörper eine consensus-Sequenz,
die aus Unterfamilien der Primaten-V-Region erzeugt ist, oder Portionen
davon sein, die die höchste
Homologie mit dem Donor-Antikörper
zeigen.
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Die
resultierenden gentechnisch hergestellten Konstrukte, in denen die
Donor-CDRs auf Primaten-Akzeptorgerüste gepfropft sind, werden
anschließend
durch Analyse von dreidimensionalen Modellen auf Basis bekannter
Antikörper-Kristallstrukturen
verfeinert, wie sie z.B. in der Protein Data Bank gefunden werden.
Alternativ können
computererzeugte dreidimensionale Modelle des Donor-Antikörpers mittels
handelsüblicher Software,
wie z.B. "AbM" (Oxford Molecular,
Oxford, UK), berechnet werden.
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Die
Strukturanalyse dieser Modelle kann Donor-Gerüstreste, die CDR-kontaktierende Reste
sind und als wichtig in der Präsentation
von CDR-Schleifen
betrachtet werden, und deshalb Bindungsavidität aufzeigen. Ein CDR-kontaktierender
Rest ist ein solcher, den man in dreidimensionalen Modellen in Kontakt
mit dem van-der-Waals-Radius eines CDR-Restes kommen sieht, oder
der mit einem CDR-Rest über
eine Salzbrücke oder
durch hydrophobe Wechselwirkung wechselwirken könnte. Solche Donor-Gerüst-(CDR-kontaktierenden)-Reste
können
im gentechnisch hergestellten Konstrukt beibehalten werden.
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Die
Modellierungsexperimente können
ebenfalls zeigen, welche Gerüstreste
weitgehend der Lösungsmittelumgebung
exponiert werden. Die gentechnisch hergestellten Konstrukte können ferner
durch Substituieren einiger oder aller dieser Lösungsmittel-zugänglichen
Aminosäurereste
gegen diejenigen verbessert werden, die in der gleichen Position
in humanen V-Regionen gefunden werden, die mit dem gentechnisch
hergestellten Konstrukt am stärksten
homolog sind, wie in US-P5 5,639,641 offenbart.
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Die
gentechnisch hergestellten V-Regionen werden dann mit einer oder
mehreren unterschiedlichen konstanten Regionen von Mensch oder Altwelt-Menschenaffe verbunden,
abhängig
von den gewünschten
sekundären
Immunfunktionen, wie Komplementbindung oder Fc-Rezeptorbindung.
Humane konstante Regionen können
aus humanen Immunglobulinklassen und -isotypen ausgewählt werden,
wie IgG (Untertypen 1 bis 4), IgM, IgA und IgE. Eine IgG4-Untertyp-Variante, die die
Mutationen S228P und L235E (PE-Mutation) in der konstanten Region
der schweren Kette enthält,
die zu einer reduzierten Effektorfunktion führt, kann ebenfalls ausgewählt werden.
Sie US-PSen 5,624,821 und 5,648,260.
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Die
vollständigen
Gene der schweren und leichten Kette werden in geeignete Expressionsvektoren übertragen
und in geeigneten Wirtszellen, wie Ovarialzellen des chinesischen
Hamsters, COS- oder Myelomzellen, coexprimiert. Vom resultierenden
gentechnisch hergestellten Antikörper
wird erwartet, dass er eine substantiell reduzierte Immunogenität hat, wenn
er an Menschen verabreicht wird, und eine vollständige Bindungsaffinität für das Antigen
beibehält.
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Akzeptor-V-Regionen
können
spezifisch für
jede Donor-V-Region durch gerichtete PCR-Methodik isoliert werden,
wobei eine nicht-humane Primaten-cDNA-Bibliothek
auf Akzeptorgerüste
untersucht wird, die dem Donor-Antikörper am ähnlichsten
sind. Oligonucleotid-PCR-Primer, die homolog zum Donor-Antikörper-Gerüst I sind
(gepaart mit C-Region-3'-PCR-Primern)
werden zur Ausrichtung der PCR-Amplifikation einer Lymphozyten-cDNA-Bibliothek
eines nicht-humanen Primaten, z.B. Schimpansen, verwendet. Diese
würde auf
V-Regionen mit Regionen
von Gerüst
I selektiert, die ähnlich
dem Donor-Antikörper sind,
und die Sequenzanalyse der erhaltenen Klone würde die assoziierten Sequenzen
von Gerüst
II und III (und IV) zeigen. 3'-PCR-Primer
würden
dann auf Basis des Wissens der so erhaltenen, nicht-humanen Primaten-Sequenzen von
Gerüst
III geschaffen werden und zur Ausrichtung der PCR-Amplifikation
der ursprünglichen
cDNA-Bibliothek zusammen mit einem Vektor-spezifischen 5'-PCR-Primer verwendet.
Aus der zweiten Runde der PCR- Amplifikation
erhaltene cDNA-Klone würden
Sequenzen von Gerüst
I und III aufweisen, die dem Donor-Antikörper am ähnlichsten sind, und die Sequenzen
von Gerüst
II würden
einen ähnlichen
Grad der Sequenzhomologie zeigen.
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Die
vorliegende Erfindung wird jetzt unter Verweis auf die folgenden
spezifischen, nicht-einschränkenden
Beispiele beschrieben.
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Beispiel 1
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Statistische cDNA-Klonierung
und Sequenzanalyse von VH-Regionen des Schimpansen
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5
ml peripheres Blut von drei Schimpansen (Pan troglodytes) wurden
aufgefangen und vereinigt, und mononukleäre Zellen aus dem peripheren
Blut wurden durch Standard-Dichtezentrifugationsverfahren isoliert. Diese
Zellen, die Antikörper-erzeugende
Lympozyten einschließen,
wurden in TRIzol-Reagens (GIBCO, Gaithersburg, MD, USA) gelöst, und
vollständige
RNA wurde aus diesem Material durch Lösungsmittelextraktion und Ausfällung gemäß den Herstelleranweisungen
gewonnen.
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V-Regionen
der schweren Kette des Schimpansen wurden aus der vollständigen RNA
unter Verwendung der Marathon RACE-Methodik (Clontech, Palo Alto,
CA, USA) unter genauer Befolgung des Herstellerprotokolls und unter
Verwendung von 3' Cgl-Gen-spezifischen
Primern kloniert. Nach RACE PCR-Amplifikation
wurden DNA-Banden der erwarteten Größe aus Agarose-Gelen geschnitten,
die DNA wurde gereinigt und in einen Plasmidvektor kloniert. Obwohl
diese cDNA-Bibliothek viele unterschiedliche Klone der V-Region
der schweren Kette enthält,
wurden statistisch neun zur Sequenzanalyse ausgewählt. Vollständige Nucleinsäuresequenzen
und vorhergesagte Proteinsequenzen der VH-cDNA-Klone des Schimansen
41-12, 41-1, 41-4, 41-7, 41-8, 41-9, 41-10, 41-18 und 41-19 sind
in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 bzw. 9 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen
der Region von der ersten Aminosäure
der reifen VH-Region bis zum zweiten konservierten Cysteinrest in
Position 92, benachbart zu CDR III dieser Klone, und zwar CPVH41-12,
CPVH41-1, CPVH41-4, CPVH41-7, CPVH41-8, CPVH41-9, CPVH41-10, CPVH41-18
und CPVH41-19, sind in SEQ ID Nos: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17
bzw. 18 gezeigt. Die Aminosäuresequenz
der das Gerüst
IV codierenden Region dieser Klone für CPVH41-9, CPVH41-10, CPVH41-12,
CPVH41-19 und CPV41-1 sind in SEQ ID NOs: 81, 82, 83, 84 bzw. 85
gezeigt.
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Die
VH-Aminosäuresequenzen
des Schimpansen vom reifen N-Terminus bis zum zweiten konservierten
Cysteinrest in Position 92, benachbart zu CDR III, wurden als Abfragesequenzen
in einer computergestützten
Homologierecherche der Kabat-Datenbank "Sequences of Proteins of Immunological
Interest" verwendet. Die
Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 1 gezeigt.
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In
jedem Fall war die engste Übereinstimmung
mit einer humanen VH-Region
und zeigte zwischen 76 % (41-1/HHC20G) und 94 % (41-10/HHC20Y) Sequenzidentität auf der
Aminosäureebene. Übereinstimmungen
wurden für
jede der drei humanen VH-Hauptuntergruppen gefunden, was zeigt,
dass das Schimpansen-VH-Repertoire wenigstens einige Elemente einschließt, die
homolog mit jeder der humanen Hauptuntergruppen sind. Die humane
Untergruppenhomologie ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle
1
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Die
Ergebnisse zeigen, dass die Gesamtsequenzidentität zwischen den VH-Regionen
von Schimpanse und Mensch von 76 bis 94 % mit einer mittleren Identität von 84
% reichte. Auf Basis dieser Beobachtung wird eine weitere Sondierung
mit der statistischen VH-Bibliothek des Schimpansen wahrscheinlich
eine substantiell größere Vielfalt
von VH-Sequenzen bereitstellen, aus denen optimale Akzeptorgerüste für jede besondere
Donor-VH-Region
gewählt
werden können.
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Beispiel 2
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Statistische cDNA-Klonierung
und Sequenzanalyse von Vκ-Region
des Schimpansen
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Vκ-Regionen
der leichten Kette des Schimpansen wurden aus der vollständigen RNA
unter Verwendung der Marathon RACE-Methodik (Clontech, Palo Alto,
CA, USA) unter genauer Befolgung des Herstellerprotokolls und mit
Cκ-3'-Gen-spezifischen Primern kloniert.
Nach RACE-PCR-Amplifikation wurden DNA-Banden der erwarteten Größe aus Agarose-Gelen
geschnitten, die DNA wurde gereinigt und in einen Plasmidvektor
kloniert. Obwohl diese cDNA- Bibliothek
viele unterschiedliche Klone der Vκ-Region der leichten Kette enthält, wurden
neun statistisch zur Sequenzanalyse ausgewählt. Vollständige Nucleinsäuresequenzen
und vorhergesagte Proteinsequenzen der Vκ-cDNA-Klone des Schimpansen 46-1, 46-3, 46-4,
46-5, 46-6, 46-7, 46-8, 46-11 und 46-14 sind in SEQ ID NOs: 19,
20, 21, 22, 23, 29, 25, 26 bzw. 27 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen der
Region von der ersten Aminosäure
der reifen Vκ-Region bis zum zweiten
konservierten Cysteinrest in Position 88, benachbart zu CDR III
dieser Klone, und zwar CPVκ46-1,
CPVκ46-3,
CPVκ46-4,
CPVκ46-5, CPVκ46-6, CPVκ46-7, CPVκ46-8, CPVκ46-11 und
CPVκ46-14
sind in SEQ ID NOs: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 bzw. 36 gezeigt.
Die Aminosäuresequenzen
der Region, die Gerüst
IV dieser Klone codiert, für
CPVκ46-6 und
CPVκ46-7
sind in SEQ ID NOs: 86 bzw. 87 gezeigt.
-
Die
Vκ-Aminosäuresequenzen
des Schimpansen, die den reifen N-Terminus und den zweiten konservierten
Cysteinrest in Position 88 umfassen, wurden als Abfragesequenzen
in der computergestützten
Homologierecherche der Kabat-Datenbank verwendet. Die Ergebnisse
dieser Analyse sind in Tabelle 2 gezeigt. In jedem Fall war die
engste Übereinstimmung
mit einer humanen Vκ-Region,
die zwischen 68 % (46-4/HKL310) und 97 % (46-11/HKL106) Sequenzidentität auf der
Aminosäureebene
zeigt. Es ist ersichtlich, dass die Vκ-Sequenzen des Schimpansen von
der in der Kabat-Datenbank gefundenen Sammlung von humanem Vκ verschieden
sind.
-
Die
Homologie der humanen Untergruppe ist in Tabelle 2 dargestellt.
Von den vier humanen Vκ-Hauptuntergruppen
wurden Übereinstimmungen
für die
zwei am häufigsten
isolierten gefunden, was zeigt, dass das Vκ-Repertoire des Schimpansen
zumindest homolog mit Elementen der Mehrzahl des humanen Vκ-Repertoires
ist. Eine weitere Untersuchung der Vκ-cDNA-Bibliothek des Schimpansen
wird wahrscheinlich eine größere Vielfalt
von Vκ-Regionen
des Schimpansen identifizieren, einschließlich solcher, die homolog
mit den verbleibenden zwei humanen Vκ-Untergruppen (VκII und VκIV) sind. Tabelle
2
-
Beispiel 3
-
Statistische cDNA-Klonierung
und Sequenzanalyse von VH-Regionen von Cynomolgus
-
Milz-RNA
wurde aus einem einzelnen Cynomolgus-Spenderaffen (Macaca cynomolgus)
mittels Standardlaborpraxis gewonnen. V-Regionen der schweren Kette
von Cynomolgus wurden aus der vollständigen RNA unter Verwendung
der Marathon RACE-Methodik (Clontech, Palo Alto, CA, USA) unter
genauer Befolgung des Herstellerprotokolls und unter Verwendung
von 3' Cg1 Genspezifischen
Primern kloniert. Nach RACE-PCR-Amplifikation wurden DNA-Banden
der erwarteten Größe aus Agarose-Gelen
geschnitten, die DNA wurde gereinigt und in einen Plasmidvektor
kloniert. Obwohl diese cDNA-Bibliothek viele unterschiedliche Klone
der schweren V-Region enthält,
wurden acht statistisch zur Sequenzanalyse ausgewählt. Vollständige Nucleinsäuresequenzen
und vorhergesagte Proteinsequenzen der VH-cDNA-Klone von Cynomolgus
2-1, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8 und 2-10 sind in SEQ ID NOs: 37,
38, 39, 40, 41, 42, 43 bzw. 44 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen
der Region von der ersten Aminosäure
der reifen VH-Region bis zum zweiten konservierten Cysteinrest in
Position 92, benachbart zu CDR III dieser Klone, und zwar CyVH2-1,
CyVH2-3, CyVH2-4, CyVH2-5, CyVH2-6, CyVH2-7, CyVH2-8 und CyVH2-10,
sind in SEQ ID NOs: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 bzw. 52 gezeigt.
Die Aminosäuresequenzen
der Region, die Gerüst
IV dieser Klone codiert, für
CyVH2-1, CyVH2-3, CyVH2-4, CyVH2-6, CyVH2-10 und CyVH2-5 sind in
SEQ ID NOs: 88, 89, 90, 91, 92 bzw. 93 gezeigt.
-
Die
VH-Aminosäuresequenzen
von Cynomolgus vom reifen N-Terminus bis zum zweiten konservierten
Cysteinrest in Position 92, benachbart zu CDRIII, wurden als Abfragesequenzen
in der computergestützten Homologierecherche
der Kabat-Datenbank verwendet. Die Ergebnisse dieser Analyse sind
in Tabelle 3 gezeigt. In jedem Fall war die engste Übereinstimmung
mit einer humanen VH-Region, die zwischen 62 % (2-6/HHC20E) und
84 % (2-5/HHC20F) Sequenzidentität
auf der Aminosäureebene
zeigte. Es ist ersichtlich, dass die VH-Sequenzen von Cynomolgus
unterschiedlich gegenüber
der in der Kabat-Datenbank gefundenen Sammlung von humanem VH sind. Übereinstimmungen
wurden für
jede der drei humanen VH-Hauptuntergruppen gefunden, was zeigt,
dass das VH-Repertoire von Cynomolgus zumindest einige Elemente
ein schließt,
die homolog mit jeder der humanen Hauptuntergruppen sind. Die humane
Untergruppenhomologie ist in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle
3
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Gesamtsequenzidentität zwischen den VH-Regionen
von Cynomolgus und Mensch von 62 bis 84 % mit einer mittleren Identität von 77
% reichte. Auf Basis dieser Beobachtung wird eine weitere Untersuchung
der statistischen VH-Bibliothek von Cynomolgus wahrscheinlich eine
substantiell größere Vielfalt
von VH-Sequenzen liefern, aus der optimale Akzeptorgerüste für jede besondere
Donor-VH-Region gewählt
werden können.
-
Beispiel 4
-
Statistische eDNA-Klonierung
und Sequenzanalyse von Vκ-Regionen
von Cynomolgus
-
Vκ-Regionen
der leichten Kette von Cynomolgus wurden aus der vollständigen Milz-RNA
unter Verwendung der Marathon RACE-Methodik (Clontech, Palo Alto,
CA, USA) unter genauer Befolgung des Herstellerprotokolls und unter
Verwendung von Cκ 3'-Gen-spezifischen
Primern kloniert. Nach RACE PCR-Amplifikation wurden DNA-Banden
der erwarteten Größe aus Agarosegelen
geschnitten, die DNA wurde gereinigt und in einen Plasmidvektor
kloniert. Obwohl diese cDNA-Bibliothek viele unterschiedliche Klone
der Vκ-Region
der leichten Kette enthält,
wurden sechs statistisch zur Sequenzanalyse ausgewählt. Vollständige Nucleinsäuresequenzen
und vorhergesagte Proteinsequenzen der Vκ-cDNA-Klone von Cynomolgus 4-2,
4-3, 4-5, 4-6, 4-10 und 4-11 sind in SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 56,
57 bzw. 58 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen
der Region von der ersten Aminosäure
der reifen Vκ-Region
bis zum zweiten konservierten Cysteinrest in Position 88, benachbart
zu CDRIII, dieser Klone, und zwar CyVκ4-2, CyVκ4-3, CyVκ4-5, CyVκ4-6, CyVκ4-10 und CyVκ4-11, sind in SEQ ID NOs: 59,
60, 61, 62, 63 bzw. 64 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen, die die Region
von Gerüst
IV dieser Klone codieren, für
CyVκ4-3,
CyVκ4-6
und CyVκ4-11
sind in SEQ ID NOs: 94, 95 bzw. 96 gezeigt.
-
Die
Vκ-Aminosäuresequenzen
von Cynomolgus, die den reifen N-Terminus und den zweiten konservierten
Cysteinrest in Position 88 umfassen, wurden als Abfragesequenzen
in der computergestützten
Homologierecherche der Kabat-Datenbank verwendet. Die Ergebnisse
dieser Analyse sind in Tabelle 4 gezeigt. In jedem Fall war die
engste Übereinstimmung
mit einer humanen Vκ-Region,
die zwischen 73 % (4-11/HKL10S) und 94 % (4-3/HKL400) Sequenzidentität auf der
Aminosäureebene
zeigte. Es ist ersichtlich, dass die Vκ-Sequenzen von Cynomolgus unterschiedlich
gegenüber
der Sammlung von in öffentlichen
genetischen Datenbanken gefundenem humanem Vκ sind. Die humane Untergruppen-Homologie
ist in Tabelle 4 dargestellt. Übereinstimmungen
wurden für
drei der vier humanen Vκ-Hauptuntergruppen
gefunden, was anzeigt, dass das Vκ-Repertoire
von Cynomolgus weitgehend homolog mit Elementen der Mehrheit des
humanen Vκ-Repertoires
ist. Eine weitere Untersuchung der Vκ-cDNA-Bibliothek von Cynomolgus wird
wahrscheinlich eine größere Vielfalt
von Vκ-Regionen
von Cynomolgus identifizieren, einschließlich solcher, die homolog
mit der verbleibenden humanen Vκ-Untergruppe
(VκIII)
sind. Tabelle
4
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Gesamtsequenzidentität zwischen den Vκ-Regionen
von Cynomolgus und Mensch von 73 bis 94 % mit einer mittleren Identität von 85
% reichte. Auf der Basis dieser Beobachtung wird eine weitere Untersuchung
der statistischen Vκ-Bibliothek
von Cynomolgus wahrscheinlich eine substantiell größere Vielfalt
von Vκ-Sequenzen
bereitstellen, aus denen optimale Akzeptorgerüste für jede besondere Donor-Vκ-Region gewählt werden
können.
-
Beispiel 5
-
Herstellung von gentechnisch
hergestellten monoklonalen anti-IL-5-Antikörpern
-
Die
Vκ- und
VH-Gene des Ratte-anti-Interleukin-5 (IL-5)-Antikörpers 4A6
sind in SEQ ID NOs: 65 bzw. 66 gezeigt. Diese Gene codieren einen
hochaffinen neutralisierenden monoklonalen Antikörper, der spezifisch für humanes
IL-5 ist, nützlich
zur Behandlung von Asthma. Siehe US-PS 5,693,323.
-
Die
leichte Kette von 4A6 wurde wie folgt konstruiert. Die Sequenz des
Donor-Antikörpers
Vκ4A6 (SEQ
ID NO: 65) wurde mit der Vκ-Region
der leichten Kette des Akzeptor-Antikörpers aus dem Mab C108G des
Schimpansen angeglichen (Mol. Immunol. 32: 1081–1092 (1995)) (SEQ ID NO: 67),
wie in 1 gezeigt. Da natives Vκ4A6 eine
besondere Deletion von Rest 10 aufweist, schloss die Sequenzangleichung
die Insertion einer Lücke
in dieser Position ein. Die CDR-Reste wurden wie durch die Konvention
von Kabat et al, definiert identifiziert (Sequences of Proteins
of Immunological Interest, 4. Auflage, U.S. Department of Health
and Human Services, National Institutes of Health (1987)).
-
Gerüstreste,
die die CDR-Darstellung beeinflussen könnten, wurden durch Analyse
von dreidimensionalen Modellen auf Basis bekannter Antikörper-Kristallstrukturen
identifiziert, Die Reste dieses CDR-kontaktierenden Satzes wurden
unter den angeglichenen Vκ4A6-
und VκC108G-Sequenzen
verglichen, und die Positionen des Satzes, die sich zwischen Vκ4A6 und VκC108G unterschieden,
wurden markiert (1, Sternchen). Die CDRs und
die markierten Gerüstreste
von Vκ4A6
(der Donor-Antikörper)
wurden unter Austausch der entsprechenden Reste von VκC108G (der
Akzeptor-Antikörper) übertragen.
Die vervollständigte
gentechnisch hergestellte V-Region der leichten Kette von 4A6 ist
in SEQ ID NO: 68 gezeigt. Sechs Donor-Gerüstreste wurden im gentechnisch
hergestellten Molekül
in den Resten 1 bis 4, 49 und 60 zurückbehalten.
-
In
analoger Weise wurde ein ähnliches
Verfahren zur gentechnischen Herstellung der schweren Kette von
4A6 verwendet. Die Sequenz des Donor-Antikörpers VH4A6 (SEQ ID NO: 66)
wurde mit der V-Region der schweren Kette des Akzeptor-Antikörpers aus
dem Mab C108G des Schimpansen (SEQ ID NO: 69) wie in 2 gezeigt
angeglichen, Eine große
Lücke wurde
in die VH4A6 CDRIII-Angleichung eingeführt, da CDRIII von VHC108G
10 Reste länger
ist. CDR-Reste wurden wie durch die Konvention von Kabat et al.
(siehe oben) definiert identifiziert.
-
Gerüstreste,
die die CDR-Darstellung beeinflussen könnten, wurden durch Analyse
von dreidimensionalen Modellen auf Basis bekannter Antikörper-Kristallstrukturen
identifiziert. Die Reste dieses CDR-kontaktierenden Satzes wurden
unter den angeglichenen VH4A6- und VHC108G-Sequenzen verglichen,
und die Positionen des Satzes, die sich zwischen VH4A6 und VHC108G
unterschieden, wurden markiert (2, Sternchen).
Insgesamt wurden 11 solcher CDR-kontaktierender Reste, die sich
zwischen VH4A6 und VHC108G unterschieden, ausgewählt und markiert. Die CDRs
und die markierten CDR-kontaktierenden
Gerüstreste
von VH4A6 (der Donor-Antikörper)
wurden unter Austausch der entsprechenden Reste von VHC108G (der
Akzeptor-Antikörper) übertragen.
Die vervollständigte
V-Region der schweren Kette von 4A6 ist in SEQ ID NO: 70 gezeigt.
Elf Donor-Gerüstreste
wurden im gentechnisch hergestellten Molekül in den Resten 27, 30, 38,
49, 66, 67, 69, 71, 73, 78 und 94 zurückbehalten.
-
Das
gentechnisch hergestellte 4A6 kann in Zellen unter Verwendung von
den Fachleuten allgemein bekannten Verfahren exprimiert werden.
Kurz gesagt können
Gene, die die vollständigen
gentechnisch hergestellten VH- und Vκ-Regionen von 4A6 codieren, aus langen
synthetischen Oligonucleotiden zusammengesetzt und in geeignete
eukaryontische Expressionsvektoren ligiert werden, die die gewünschten
konstanten Regionen des Antikörpers
enthalten. Ein solcher Expressionsvektor wird selektierbare Marker,
z.B. für
Neomycinresistenz, und Regulationssequenzen, z.B, den CMV-Promotor,
enthalten, die zur Ausrichtung der Expression der schweren und leichten
Ketten des Antikörpers
voller Länge
erforderlich sind. Anschließend
würde eine Transfektion
der geeigneten Wirtszelle, z.B. Ovarialzellen des chinesischen Hamsters,
zur Expression des vollständig
aktiven gentechnisch hergestellten 4A6 führen.
-
Beispiel 6
-
Herstellung von gentechnisch
hergestellten monoklonalen anti-Integrin-Antikörpern
-
Die
Vκ- und
VH-Gene des murinen anti-Integrin-Antikörpers B9 sind in SEQ ID NOs:
71 bzw. 72 gezeigt. Diese Gene codieren einen hochaffinen neutralisierenden
monoklonalen Antikörper,
der spezifisch für humanes
Integrin ανβ3 ist, nützlich zur
Behandlung von Gefäßkrankheiten.
-
Die
leichte Kette von B9 wurde wie folgt gentechnisch hergestellt. Die
Aminosäuresequenz
von Donor-Antikörper
VκB9 (SEQ
ID NO: 72) wurde mit jeder der oben beschriebenen neun Vκ-Sequenzen
des Schimpansen verglichen und die prozentuale Sequenzidentität durch
computergeschützte
Homologiere cherchen unter Verwendung des LASERGENE-Programms "MEGALIGN" (DNASTAR, Inc.,
Madison, WI) bestimmt. Die Klone CPVκ46-3 (SEQ ID NO: 29) und CPVκ46-14 (SEQ ID NO: 36)
wurden als die Vκ-Regionen des
Schimpansen mit der höchsten
Gesamtsequenzähnlichkeit
(77 %) mit dem Donor-Vκ von
B9 identifiziert. CPVκ46-3
wurde als Akzeptor-Gerüst
ausgewählt.
-
In ähnlicher
Weise wurde das Jκ-Gensegment
des Schimansen von CPVκ46-1
(SEQ ID NO: 97) als Akzeptorgerüst
IV ausgewählt.
Die Sequenzen der V-Regionen von Donor VκB9 und Akzeptor CPVκ46-3, CPVκ46-1 wurden
angeglichen, und die Positionen ihrer jeweiligen Gerüste und
CDRs wurden wie in 3 gezeigt bestimmt.
-
Die
CDR-Reste wurden wie durch die Konvention von Kabat et al. (siehe
oben) definiert identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass VκB9 und CPVκ46-3 77 %
Gesamtsequenzidentität
teilen, wobei die Gerüstregionen
I bis III 81 % Sequenzidentität
teilen.
-
Gerüstreste,
die die CDR-Darstellung beeinflussen könnten, wurden durch Analyse
von dreidimensionalen Modellen auf Basis bekannter Antikörper-Kristallstrukturen
identifiziert. Die Reste dieses CDR-kontaktierenden Satzes wurden
unter den angeglichenen VLB9- und Cmpk46-3-Sequenzen verglichen,
und von keiner aus diesem Satz wurde gefunden, dass sie sich zwischen
VLB9 und Cmp46-3 unterschied. Entsprechend wurden nur die CDRs von
VLB9 (der Donor-Antikörper)
unter Austausch der entsprechenden Reste von Cmp46-3 (der Akzeptor-Antikörper) übertragen.
Schließlich
ersetzten die Sequenzen von Gerüst
IV von Cmp46-1 die entsprechenden Reste von Gerüst IV der variablen Region
der leichten Kette von B9. Die vervollständigte gentechnisch hergestellte
V-Region der leichten Kette von B9 ist in SEQ ID NO: 73 gezeigt.
Keine Donor-Gerüstreste
wurden in der gentechnisch hergestellten variablen Region der leichten
Kette zurückbehalten.
-
Die
schwere Kette von B9 wurde in analoger Weise konstruiert. Die Aminosäuresequenz
von Donor-Antikörper
VHB9 (SEQ ID NO: 71) wurde mit jeder der oben beschriebenen neun
VH-Sequenzen des Schimpansen durch computergestützte Homologierecherche verglichen.
Klon AMP41CL18 (SEQ ID NO: 17) wurde als die VH-Region des Schimpansen
mit der höchsten
Gesamtsequenzähnlichkeit
(58 %) mit dem Donor-VH von B9 identifiziert.
-
Das
JH-Gensegment des Schimpansen AMP41CL10 (SEQ ID NO: 82) wurde als
Akzeptorgerüst
IV ausgewählt.
Die Sequenzen der V-Regionen von Donor VHB9 und Schimpansen-Akzeptor
wurden angeglichen und die Positionen ihrer jeweiligen Gerüste und
CDRs wie in 4 gezeigt bestimmt.
-
Die
CDR-Reste wurden wie durch die Konvention von Kabat et al. (siehe
oben) definiert identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass VHB9
und AMP41CL18 58 % Gesamtsequenzidentität teilen, wobei die Gerüstregionen
I bis III 65 % Sequenzidentität
teilen.
-
Gerüstreste,
die die CDR-Darstellung beeinflussen könnten, wurden durch Analyse
von dreidimensionalen Modellen auf Basis bekannter Antikörper-Kristallstrukturen
identifiziert. Die Reste dieses CDR-kontaktierenden Satzes wurden
unter den angeglichenen VHB9- und AMP41CL18-Sequenzen verglichen,
und die neun Reste des Satzes, die sich zwischen VHB9 und den Schimpansen-Akzeptorgerüsten unterschieden,
wurden markiert. Die CDRs und die markierten Gerüste des Donor-Antikörpers VHB9
wurden unter Austausch der entsprechenden Reste von AMP41CL18 (der
Akzeptor-Antikörper) übertragen.
Schließlich
ersetzten die Sequenzen von Gerüst
IV von AMP41CL10 die entsprechenden Reste von Gerüst IV der
variablen Region der schweren Kette von B9. Die vervollständigte gentechnisch
hergestellte V-Region der schweren Kette von B9 ist in SEQ ID NO:
74 gezeigt. Neun Donor-Gerüstreste
wurden in der gentechnisch hergestellten variablen Region der schweren
Kette in den Positionen 24, 27, 38, 48, 66, 67, 69, 93 und 94 beibehalten.
-
Beispiel 7
-
Expression und Charakterisierung
von gentechnisch hergestellten monoklonalen anti-Integrin-Antikörpern
-
Der
gentechnisch hergestellte B9-Antikörper wurde in Zellen unter
Verwendung von den Fachleuten allgemein bekannten Verfahren exprimiert.
Kurz gesagt wurden Gene, die die vollständigen gentechnisch hergestellten
B9 VH- und Vκ-Regionen
codieren, aus langen synthetischen Oligonucleotiden zusammengesetzt und
in geeignete eukaryontische Expressionsvektoren ligiert, die konstante
Regionen von IgG1,κ-Antikörper enthielten.
Der Expressionsvektor enthielt einen selektierbaren Marker für Neomycinresistenz
und CMV-Promotor-Regulationssequenzen. Eine anschließende Transfektion
einer COS-Wirtszelle führte
zur Expression des gentechnisch hergestellten B9 (CPB9).
-
Die
relative Bindungsavidität
von CPB9 wurde mit derjenigen des ursprünglichen murinen B9-Antikörpers wie
folgt verglichen. CPB9-Antikörper,
die in Kulturüberständen aus
Zellen vorhanden waren, die in Kultur für 5 Tage nach Transfektion
mit den Expressionskonstrukten gehalten wurden, wurden mit dem parentalen murinen
B9-Antikörper
unter Verwendung der ORIGEN-Technologie verglichen (IGEN Inc., Gaithersburg,
MD). Kurz gesagt wurden unterschiedliche Verdünnungen der B9-Varianten mit
gereinigtem huma nem ανβ3-Integrin,
das zuvor biotinyliert worden war, und einer für die Antikörper-C-Regionen spezifischen
elektrochemolumineszenten TAG-Einheit inkubiert. B9-Antikörpervariante,
die an das Integrin gebunden war, wurde durch Einfangen der Immunkomplexe
auf Streptavidinperlen gefolgt von Analyse am ORIGEN-Instrument
gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die CPB9- und die murinen B9-Bindungskurven nur
ca. 3-fach verschoben waren, was anzeigt, dass die gesamte spezifische
Bindungsavidität
von CPB9 und murinem B9 für ανβ3 innerhalb
3-fach zueinander sind. Entsprechend zeigen die Ergebnisse, dass
die CDR-Pfropfung von Nagetier-CDRs auf Schimpansen-Gerüste, wie
in der vorliegenden Erfindung beschrieben, beinahe die gesamte Bindungsavidität des parentalen
Nagetier-mAb bewahrt.
-
Beispiel 8
-
Herstellung von gentechnisch
hergestellten monoklonalen anti-Erythropoietinrezeptor-Antikörpern
-
Die
VH- und Vκ-Gene
des murinen anti-Erythropoietinrezeptor-Antikörpers 3G9 sind in SEQ ID NOs: 75
bzw. 76 gezeigt. Diese Gene codieren einen hochaffinen neutralisierenden
monoklonalen Antikörper,
der spezifisch für
den humanen Erythropoietinrezeptor (EPOr) ist, nützlich zur Behandlung von hämatopoetischen Störungen.
-
Die
leichte Kette von 3G9 wurde wie folgt gentechnisch hergestellt.
Die Aminosäuresequenz
des Donor-Antikörpers
VL3G9 (SEQ ID NO: 76) wurde mit jeder der oben beschriebenen neun
Schimpansen-Vκ-Sequenzen
durch computergestützte
Homologierecherche wie oben beschrieben verglichen. Die Klone CPVκ46-3 (SEQ
ID NO: 29), CPVκ46-5
(SEQ ID NO: 31), CPVκ46-8
(SEQ ID NO: 34) und CPVκ46-14
(SEQ ID NO: 36) wurden als Schimpansen-Vκ-Regionen mit der höchsten Gesamtsequenzähnlichkeit
(65 %) mit dem Donor-Vκ von
3G9 identifiziert. CPVκ46-14
wurde als Akzeptorgerüst
ausgewählt.
-
Das
Schimpansen-Jκ-Gensegment
von Vκ46-14
war identisch mit demjenigen von CPVκ46-1 (SEQ ID NO: 97) und wurde
als Akzeptorgerüst
IV ausgewählt.
Die Sequenzen der Donor-VL3G9- und Akzeptor-Vκ46-14-V-Regionen wurden angeglichen,
und die Positionen ihrer jeweiligen Gerüste und CDRs wurden wie in 5 gezeigt
bestimmt.
-
Die
CDR-Reste wurden wie durch die Konvention von Kabat et al. (siehe
oben) definiert identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass VL3G9
und Vκ46-14
65 % Gesamtsequenzidentität
teilen, wobei die Gerüstregionen
I bis III 73 % Sequenzidentität
teilen.
-
Gerüstreste,
die die CDR-Darstellung beeinflussen könnten, wurden Analyse von dreidimensionalen Modellen
auf Basis bekannter Antikörper-Kristallstrukturen
identifiziert. Die Reste dieses CDR-kontaktierenden Satzes wurden
unter den angeglichenen VL3G9- und Vκ46-14-Sequenzen verglichen,
und die Positionen dieses Satzes, die sich zwischen VL3G9 und Vκ46-3 unterschieden,
wurden markiert. Die CDRs und markierten Reste von VL3G9 (der Donor-Antikörper) wurden
unter Austausch der entsprechenden Reste von Vκ46-14 (der Akzeptor-Antikörper) übertragen.
Schließlich
ersetzten die Sequenzen von Vκ46-14
die entsprechenden Reste von Gerüst
IV der variablen Region der leichten Kette von 3G9. Die vervollständigte gentechnisch
hergestellte V-Region der leichten Kette von 3G9 ist in SEQ ID NO:
77 gezeigt. Drei Donor-Gerüstreste
wurden in der gentechnisch hergestellten variablen Region der leichten
Kette in den Positionen 3, 46 und 60 zurückbehalten.
-
Die
schwere Kette von 3G9 wurde in analoger Weise gentechnisch hergestellt.
Die Aminosäuresequenz
von Donor-Antikörper
VH3G9 (SEQ ID NO: 75) wurde mit jeder der oben beschriebenen neun
Schimpansen-VH-Sequenzen durch computergestützte Homologierecherche verglichen.
Klon chimp41-18 (SEQ ID NO: 17) wurde als die Schimpansen-VH-Region
mit der höchsten
Gesamtsequenzähnlichkeit
(53 %) mit dem 3G9-Donor-VH identifiziert.
-
Das
Schimpansen-JH-Gensegment von chimp41-18 war identisch mit CPVH41-9
(SEQ ID NO: 81) und wurde als Akzeptorgerüst IV ausgewählt. Die
Sequenzen der Donor-VH3G9- und Schimpansen-Akzeptor-V-Regionen wurden
angeglichen und die Positionen ihrer jeweiligen Gerüste und
CDRs wie in 6 gezeigt bestimmt.
-
Die
CDR-Reste wurden wie durch die Konvention von Kabat et al. (siehe
oben) definiert identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass VH3G9
und Chimp41-18 53 % Gesamtsequenzidentität teilen, wobei die Gerüstregionen
I bis III 62 % Sequenzidentität
teilen.
-
Gerüstreste,
die die CDR-Darstellung beeinflussen könnten, wurden durch Analyse
von dreidimensionalen Modellen auf Basis bekannter Antikörper-Kristallstrukturen
identifiziert. Die Reste dieses CDR-kontaktierenden Satzes wurden
unter den angeglichenen VH3G9- und Chimp41-18-Sequenzen verglichen,
und die 12 Reste des Satzes, die sich zwischen VH3G9 und den Schimpansen-Akzeptorgerüsten unterschieden,
wurden markiert. Die CDRs und die markierten Gerüstreste von Donor-Antikörper VH3G9
wurden unter Austausch der entsprechenden Reste von Chimp41-18 (der
Akzeptor-Antikörper) übertragen.
Schließlich
ersetzten die Sequenzen von Gerüst
IV von Chimp41-18
die entsprechenden Reste von Gerüst
IV der variablen Region der schweren Kette von 3G9. Die vervollständigte gentechnisch
hergestellte V-Region der schweren Kette von 3G9 ist in SEQ ID NO:
78 gezeigt. Zwölf
Donor-Gerüstreste
wurden in der gentechnisch hergestellten variablen Region der schweren
Kette in den Positionen 24, 27, 30, 38, 48, 66–69, 71, 73 und 94 beibehalten.
-
Beispiel 9
-
Expression und Charakterisierung
von gentechnisch hergestellten monoklonalen anti-Erythropoietinrezeptor-Antikörpern
-
Der
gentechnisch hergestellte 3G9-Antikörper wurde in Zellen unter
Verwendung von den Fachleuten allgemein bekannten Verfahren exprimiert.
Kurz gesagt wurden Gene, die die vollständig gentechnisch hergestellten
VH- und Vκ-Regionen
von 3G9 codierten, aus langen synthetischen Oligonucleotiden zusammengesetzt
und in geeignete eukaryontische Expressionsvektoren ligiert, die
konstante Regionen von IgG1,κ-Antikörper enthielten.
Der Expressionsvektor enthielt einen selektierbaren Marker für Neomycinresistenz
und CMV-Promotor-Regulationssequenzen. Anschließende Transfektion von COS-Wirtszellen führte zur
Expression von gentechnisch hergestelltem 3G9 (CP3G9).
-
Kulturüberstände aus
COS-Zellen, die transient mit Gerüst von dem gentechnisch hergestelltem
3G9 des Schimpansen transfiziert wurden, wurden mit einer anderen
3G9-Variante auf die Fähigkeit
zur Bindung von humanem EPOr verglichen. Die gesamte extrazelluläre Domäne des EPOr
wurde als rekombinantes Protein exprimiert, gereinigt und auf Vertiefungen
von ELISA-Platten
adsorbiert. Verdünnungen
unterschiedlicher Antikörper
wurden dann auf die Fähigkeit
zur spezifischen Bindung an das Festphasen-assoziierte EPOr getestet.
-
HZ3G9
ist eine humanisierte Variante von 3G9, in der humane Gerüste in herkömmlichen
CDR-Pfropfexperimenten verwendet wurden. Die Aminosäuresequenz
der schweren Kette von humanisiertem 3G9 ist in SEQ ID NO: 79 gezeigt.
Die Sequenz der leichten Kette von humanisiertem 3G9 ist in SEQ
ID NO: 80 gezeigt. Frühere
Experimente zeigten, dass HZ3G9 die vollständige Bindungsaffinität und -avidität des parentalen
murinen 3G9 beibehielt. Da HZ3G9G1 identisch mit der Schimpansen-Version
in allen Aspekten ausgenommen die V-Region-Kassette ist, wurde es
entsprechend in den vorliegenden vergleichenden Bindungsexperimenten als
Ersatz für
murines 3G9 verwendet. Anti-körper
als Negativkontrolle wurden ebenfalls getestet, einschließlich HZD12,
das ein für
humanes Integrin spezifischer humanisierter Antikörper ist,
und CPB9, das ein oben beschriebenen, für humane Integrine spezifischer
gentechnisch hergestellter Antikörper
mit Gerüst
des Schimpansen ist. Unterschiedliche Konzentrationen der 3G9-Varianten
und Kontroll-Antikörper wurden
für 1 Stunde inkubiert.
Nach dem Waschen wurden die gebundenen Antikörper durch Inkubation mit anti-humanem H+L-Antikörper-Enzymkonjugat,
einer letzten Spülung
und Zugabe von Chromagen nachgewiesen.
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Die
für CP3G9
und HZ3G9 erhaltenen Bindungskurven waren überlagerbar. Dieses Ergebnis
zeigt an, dass die gentechnisch hergestellten Versionen von Mensch-
und von Schimpansen-Gerüst
von 3G9 eine identische Gesamtbindungsavidität für das spezifische Antigen humanes
EPOr haben. Da die konstanten Regionen von HZ3G9 und CP3G9 identisch
sind, legen diese Ergebnisse ebenfalls nahe, dass die volle Bindungsaffinität des ursprünglichen
Nagetier-3G9 in
der Schimpansenversion von 3G9 beibehalten ist. Entsprechend zeigen
die Ergebnisse, dass die CDR-Pfropfung von Nagetier-CDRs auf Schimpansen-Akzeptorgerüste, wie in
der vorliegenden Erfindung beschrieben, die volle Bindungsavidität des parentalen
Nagetier-Antikörpers
beibehielt.
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Eine
BIAcore-Analyse (Pharmacia) wurde zur Bestimmung der Bindungsaffinität für humanes
EPOr durch murines 3G9 und CP3G9 durchgeführt. Die Wechselwirkung von
CP3G9 sowie humanem 3G9 mit EPOr wurde unter Verwendung eines BIAcore
1000-Biosensors charakterisiert. Beschreibungen der Instrumentierung
und der Sensoroberflächen
werden in Brigham-Burke et al., Anal. Biochem., 205: 125–131 (1992)
beschrieben.
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CP3G9
wurde auf einer Sensoroberfläche
von immobilisiertem Protein A gefangen. Die kinetischen Bindungskonstanten
wurden durch Leiten von Lösungen
von monomerem EPOr über
die Oberfläche
und Überwachung
der Bindung als Funktion der Zeit bestimmt. Die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante
für die Wechselwirkung
wurde dann aus dem Verhältnis
der kinetischen Konstanten abgeleitet. Das parentale murine 3G9
wurde auf einer Oberfläche
von Protein A-gefangenem Kaninchen-anti-Maus-Fc-spezifischem polyklonalem
Antikörper
gefangen. Die Kinetik und Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung
mit EPOr wurden wie oben beschrieben bestimmt. Alle Messungen wurden
in 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,2, 3 mM EDTA und 0,005
% Tween 20 vorgenommen. Die Fließgeschwindigkeit betrug 60 μl/min. Die
Temperatur betrug 20°C.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die für
die murinen und Schimpansen-Gerüstversionen
von 3G9 bestimmten Dissoziationsgleichgewichtskonstanten innerhalb
3-fach zueinander sind. Diese Daten sind in guter Übereinstimmung mit
den Ergebnissen der oben beschriebenen Untersuchung auf ELISA-Basis.
Entsprechend zeigen die Ergebnisse, dass das in der Erzeugung der
Schimpansen-Version von 3G9 verwendete Verfahren weitgehend die
Bindungsaffinität
des ursprünglichen
Nagetier-mAb beibehielt.
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Die
vorliegende Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ohne Abweichung
vom Geist oder wesentlicher Attribute davon verkörpert werden, und entsprechend
sollte eher auf die anhängenden
Ansprüche
als auf die vorhergehende Beschreibung zur Angabe des Umfangs der
Erfindung verwiesen werden. Sequenzprotokoll
