DE69920981T2

DE69920981T2 - Knorpelresorptionsassays

Info

Publication number: DE69920981T2
Application number: DE69920981T
Authority: DE
Inventors: R. David EYRE
Original assignee: Washington Research Foundation
Current assignee: Washington Research Foundation
Priority date: 1999-06-17
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2019-12-11
Also published as: ATE278965T1; DE69920981D1; JP2003502672A; AU3118300A; DK1210606T3; WO2000079284A1; EP1210606A1; EP1210606B1; EP1571450A3; ES2229805T3; EP1571450A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Assays zum Nachweis von vernetzten Telopeptidanalyten, die eine Typ II Kollagen (Knorpel) Resorption in vivo anzeigen und stellt insbesondere Immunassays zur Messung und Unterscheidung zwischen Resorption von nicht mineralisiertem Knorpel und mineralisiertem Knorpel und zur Messung der Gesamtknorpelresorption in vivo zur Verfügung.
Hintergrund der Erfindung
Es wird Bezug auf die vorherigen US-Patente Nr. 4,973,666, Nr. 5,410,103, Nr. 5,300,434, Nr. 5,320,970, Nr. 5,817,755 und Nr. 5,702,909 des Anmelders genommen.
Es sind Immunassays zum Nachweis von Telopeptidanalyten bekannt, die eine Kollagenresorption in vivo anzeigen. Beispiele von solchen Typ I Kollagenassays zur Messung der Knochenresorption umfassen: WO 89/04491 (Eyre); WO 89/12824 (Robins); WO 91/08478 (Eyre); EP 0505210 A2 (Risteli & Risteli); WO 92/21698 (Eyre); WO 94/03813 (Naser et al.); WO 94/14844 (Baylink); WO 95/04282 Naser et al.): WO 95/08115 (Qvist & Bonde); WO 96/12193 (Bonde & Qvist); EP 0718309 A1 (Naser et al.) und WO 96/36645 (Eyre et al.).
Beispiele von Typ II Kollagentelopeptidassays zur Messung der Knorpelresorption umfassen WO 91/08478 (Eyre); WO 95/08115 (Qvist & Bonde) und WO 96/12193 (Bonde & Qvist).
Beispiele von Typ III Kollagentelopeptidassays umfassen: WO 88/08980 (Risteli & Risteli) und WO 91/08478 (Eyre).
Die folgenden Patentoffenbarungen sind auch von Interesse: US-Patent Nr. 4,628,027 (Gay) offenbart in vitro diagnostische Verfahren unter Verwendung monoclonaler Antikörper gegen Bindegewebsproteine. US-Patent Nr. 5,316,914 (Oshima et al.) offenbart einen Enzymsandwichimmunassay von menschlichen Typ III, IV und VI Kollagenen, der auf die Diagnose von hepatischen Erkrankungen anwendbar ist. WO 94/14070 (Poole & Hollander) offenbart einen Immunassay für die Messung der Kollagenspaltung in Knorpel. WO 94/18563 (Barrach et al.) offenbart Sandwichimmunassayverfahren zum Nachweis von Typ II Kollagen abgeleiteten Peptiden, die mit Arthritis assoziiert sind.
Von besonderem Interesse ist die vorherige internationale Anmeldung WO 91/0478 des Anmelders, welche die folgenden Urinresorptionsprodukte vom Typ II Kollagen offenbart:
worin die Klammern optionale Aminosäurereste anzeigen und der als Hyl-Hyl-Hyl gezeigte Vernetzungsrest Hydroxylysylpyridinolin (HP) ist, ein natürlicher 3-Hydroxypyridiniumrest, der in reifen Kollagenfibrillen von verschiedenen Geweben vorhanden ist. Diese Analyten sind von der C-terminalen vernetzten Telopeptidomäne von Typ II Kollagen abgeleitet und werden hierin kollektiv als „col2CTx" bezeichnet.
Die vorliegende Offenbarung nimmt auch den Ein-Buchstaben-Symbolkode der Aminosäurekurzschrift an; somit werden die Glu-Hyl-Gly-Pro-Asp-(Pro)-(Leu)-Telopeptidkomponenten der oben gezeigten Analyten hiernach als EKGPD (SEQ ID NO: 1), EKGPDP (SEQ ID NO: 2) und EKGPDPL (SEQ ID NO: 3) bezeichnet. Des Weiteren stellt, wie es hierin verwendet, das Symbol „K" entweder im Falle von linearen Peptiden Lysin dar oder einen vernetzenden 3-Hydroxypyridiniumrest dar, der aus Hydroxylysylpyridinolin (HP) und Lysylpyridinolin (LP) ausgewählt ist.
Der Anmelder und Kollegen haben auch col2CTx in kürzlich erschienenen Abstracts beschrieben:
Eyre et al., Bone Miner. Res. I1(S1): S413, 1996 beschreibt vernetzte Telopeptide aus den Kollagenarten I, II und III in menschlichem Urin.
Atley et al., Arth. Rheum. 40(9S):584, 1997 berichtet, dass RS-130830, ein selektiver Hemmer der Kollagenase-3, die Freisetzung von Hydroxyprolin blockiert und ein Metallproteinase (MMP) spezifisches Neoepitop, col2CTx, aus Rinderknorpel, der IL-1α ausgesetzt ist.
Atley et al., Trans. Orthop. Res.Soc., New Orleans, 1998, berichtet von der Matrix-Metalloproteinase-vermittelten Freisetzung von immunreaktiven Telopeptiden aus Knorpel Typ II-Kollagen. Das Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, ob ein Immunoassay, basierend auf einem monoklonalen Antikörper (mAB) 2B4, der eine Domäne des α1(II) C-Telopeptids EKGPDP erkennt, MMP Spaltprodukte in Knorpel misst. Bezug nehmend auf 1 erkennt mAb2B4 das in vitro-Produkt des AFAGLGPREKGPDP (Matrilysinverdaus (SEQ ID NO: 4) des synthetischen Peptids AFAGLGPREKGPDPLQYMRA (SEQ ID NO: 5), nicht aber AFAGLGPREKGPDPLQ (SEQ ID NO: 6), AFAGLGPREKGPDPLQY (SEQ ID NO: 7), LQYMRS (SEQ ID NO: 8) oder YMRA (SEQ ID NO: 9). Die Autoren bemerkten auch den Nachweis von mAb2B4 Immunoreaktivität in synovialer Flüssigkeit, Serum und Urin. Sie schlossen daraus, dass dieses 2B4 Epitop das Potential hat, ein nützlicher Marker der Typ II Kollagenresorption in vivo zu sein.
Moskowitz et al., Amer. Coll. Rheum., San Diego, CA, Nov. 8–12, 1998, berichtet, dass das Typ II Kollagen C-Telopeptid 2B4 Epitop ein Marker zur Knorpelresorption in familiärer Osteoarthrose ist.
Eyre et al., 6^th International Meeting on Chemistry and Biology of Mineralized Tissues, Vittel, Frankreich, September 1998, diskutiert biochemische Marker des Knochen- und Kollagenabbaus einschließlich ein vernetztes Telopeptidsprodukt des Typ II Kollagenabbaus in Urin (col2CTx).
Atley et al., Third Combined Osthopaedic Research Societies Meeting, Hamamatsu, Japan, September 1998, diskutiert Kollagen Typ II vernetzte Telopeptide, einen viel versprechenden Marker für Knorpelabbau in Arthritis.
Zusätzlich werden den Berichten nach monoclonale Antikörper gegen das C-Telopeptid von Typ II Kollagen als diagnostische Marker für rheumatische Arthritis bei Osteometer Biotech A/S. BioWorld International, Seite 3, 03. Dezember 1997, entwickelt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt verbesserte Assays zur Messung der Typ II Kollagen (Knorpel)-Resorption in vivo zur Verfügung. Diese Immunsassays sind zur Unterscheidung zwischen der Resorption von nicht-mineralisiertem Knorpel und mineralisiertem Knorpel und zur Messung der gesamten Knorpelresorption in vivo nützlich. Die offenbarten Immunassays setzen entweder einen oder eine Kombination von zwei Antikörpern ein. Ein erster Antikörper bindet an DEKAGGA (SEQ ID NO: 21), nicht aber an GGFDEKAGGAQLG (SEQ ID NO: 27), worin das K-Symbol sich auf Lysinreste und/oder vorzugsweise auf vernetzte 3-Hydroxypyridiniumreste bezieht. Die Messung der Analytenbindung an den ersten Antikörper in Serum stellt eine Indikation der nicht-mineralisierten Knorpelresorption in vivo zur Verfügung.
Ein zweiter Antikörper bindet an GGFDEKAGGAQLG, nicht aber an DEKAGGA, worin die K-Symbole sich auch vorzugsweise auf vernetzende 3-Hydroxypyridiniumreste beziehen. Die Messung der Analytenbindung an den zweiten Antikörper in Serum stellt eine Indikation der mineralisierten Knorpelresorption in vivo zur Verfügung.
Eine Anzeige der gesamten (nicht-mineralisierten und mineralisierten) Knorpelresorption in vivo wird durch entweder die Messung der Analytenbindung an den ersten Antikörper im Urin oder durch Messung der gesamten Analytenbindung an den ersten und zweiten Antikörper in Serum zur Verfügung gestellt.
Diese Knorpelmarker werden vorzugsweise in Verbindung mit Knochenkollagenresorptionsmarkern gemessen, die aus aminoterminalen Telopeptiden von Typ I Kollagen, carboxyterminalen Telopeptiden von Typ I Kollagen und freien Lysylpyridinolin (Deoxypyridinolin)-Vernetzungen ausgewählt sind.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Als Einführung gedacht, erkennt der monoclonale Antikörper 2B4 ein C-terminales Eptiop in der Sequenz EKGPDP. Der Antikörper setzt für eine jegliche Bindung voraus, dass das C-terminale Prolin frei ist (d. h., Pro-COOH), und bevorzugt, dass K durch seine Seitenketten (Epsilon) Aminogruppe derivatisiert (z. B. vernetzt) ist. Das Vorhandensein von extra Aminosäuren C-terminal zu dem Prolin verhindert eine mAb2B4-Bindung an diese Peptiddomäne.
Verschiedene Matrixmetallproteinasen (MMPs), einschließlich Kollagenasen (MMP1 und MMP13), Gelatinasen (MMP2 und 9), Stromelysin (MMP3) und Matrilysin (MMP7) können das mAb2B4-Epitop aus Knorpel Typ II Kollagen oder einer synthetischen C-Telopeptiddomäne (AFAGLGPREKGPDPLQYMRA) generieren. Matrilysin (MMP7) ist basierend auf in vitro-Studien mit den rekombinanten Enzymen das stärkste.
Jedoch ist Cathepsin K nicht in der Lage, die für die 2B4-Epitopfreisetzung benötigte Spaltung der P-L-Bindung zu spalten, sondern generiert ein längeres Fragment EKGPDPLQ (SEQ ID NO: 10). Dieses ist signifikant, da Cathepsin K eine Protease ist, die im Wesentlichen nur durch Osteoclasten exprimiert wird und ist das Schlüsselenzym, dass für die Resorption von calzifiziertem Kollagen verantwortlich ist, wenn Osteoclasten Knochen resorbieren. Osteoclasten (oder eine sehr ähnliche Zelle) sind auch für den Abbau calzifizierten Knorpels verantwortlich. Calzifizierter Knorpel wird transient in Wachstumsplatten von heranwachsenden Tieren ausgebildet und ist auch im Skelett von Erwachsenen an den Grenzflächen zwischen Knochen und Knorpel in allen Arten von Gelenken vorhanden. In Arthritis wird eine beschleunigte Resorption und Knochenremodulierung in ausgiebiger Resorption calzifizierten Knorpels durch Osteoplasten resultieren. Dieses Verfahren kann in den Blutstrom Kollagen Typ II C-Telopeptide (EKGPDPLQ) freisetzen, die nicht durch 2B4 erkannt werden.
Da die urinäre Form des Typ II Kollagen Telopeptidanalyten EKGPDP oder kleiner ist, entfernen Proteasen in der Niere und/oder der Leber im Wesentlichen das gesamte C-terminale LQ vor der Freisetzung in den Urin. Daher können zwei Quellen von immunreaktivem col2CTx definiert werden: (1) Die direkte Generierung durch Chondrocyten, die aktiviert sind, um deren Matrixkollagen durch MMPs abzubauen, und (2), die sekundäre Generierung in der Niere und/oder der Leber aus den zirkulierenden Produkten der osteoclastischen Resorption von calzifiziertem Knorpel.
In Arthritis (rheumatoide Arthritis (RA) und Osteoarthritis (OA)) sind MMPs als Schlüsselagenzien in der Zerstörung der kollagenen Matrizes von Gelenkknorpel bekannt. In beiden Formen von Arthritis ist die Knochenstruktur stark betroffen. In RA ist Osteoporose eine übliche Konsequenz, sowohl direkt aus dem Erkrankungsprozess selbst durch die Wirkungen von entzündlichen Zytokinen und als eine Nebenwirkung der cortikosteroiden Therapie. Die beschleunigte Knochenresorption wird am deutlichsten in den involvierten Gelenken ausgeprägt sein und wird das Entfernen der unter dem calzifizierten Knorpel liegenden Gelenkoberflächen umfassen. In OA zeigen sich Osteophyten (Knochenauswüchse) oft prominent in der Gelenkpathologie. Auch hier werden calzifizierter Knorpel gebildet und dann als Teil des Osteophytenwachstums abgebaut (letzteres durch Osteoclasten). Daher wäre es zur Beobachtung und Kontrolle beider Hauptformen von Arthritis wünschenswert, MMP-vermittelte und Osteoclasten-vermitelte (Cathepsin K) Kollagen Typ II Zerstörung differenziell zu messen. In Blut oder synovialer Flüssigkeit kann die Messung von col2CTx (EKGPDP) die erste genannte Aktivität indexieren, wohingegen die Messung des Osteoclaustenprodukts (EKGPDPLQ) in Blut letztere indizieren kann. Zusätzlich kann urinäres col2CTx einen Index der Gesamtresorption (sowohl von nicht-mineralisiertem wie auch mineralisiertem Knorpel) zur Verfügung stellen. Solche Urinassays umfassen vorzugsweise die Schritte der Bestimmung des Creatiningehalts der Urinprobe und das Korrelieren des Verhältnisses der nachgewiesenen Bindung des Antikörpers zu dem Creatiningehalt, um einen Urinindex der gesamten Typ II Kollagenresorption, unabhängig vom Urinvolumen zur Verfügung zu stellen.
Die differenziellen Messungen von EKGPDPD- und EKGPDPLQ-Immunreaktivitäten haben einen diagnostischen Wert in der Beurteilung der Krankheitsaktivität in dem einzelnen Patienten. In Kombination mit der Messung eines Typ I Kollagenmarkers zur Untersuchung der gesamten Knochenresorptionsreaktivität und/oder Messung eines Typ II Kollagenmarkers zur Untersuchung anderer Quellen von nicht-mineralisiertem Bindegewebeabbau, kann eine geeignete Therapie verschrieben werden und ihre gewünschte Wirkung beobachtet werden. In ähnlicher Weise können solche unterscheidenden Assays verwendet werden, um neue mögliche Medikamente zu identifizieren (in vitro und in Tieren) und um Ersatzmarker in klinischen Untersuchungen zum Nachweis gewünschter vorteilhafter Wirkungen auf Zielgewebe und zelluläre Prozesse zur Verfügung zu stellen.
Repräsentative Assays für Typ I Kollagenabsorptionsmarker für diesen Zweck umfassen aminoterminale Telopeptide des Typ I Kollagens (Osteomark^®, Ostex International, Seattle, WA), carboxy-terminale Telepeptide des Typ I Kollagens (CrossLaps^®, Osteometer Biotech, Herlev, Dänemark) und freie Lysylpyridinolin-Vernetzungen (Pyrilinks^®-D, Metra Biosystems, Mountain View, CA).
Repräsentative Assays für Typ III Kollagenresorptionsmarker umfassen aminoterminale Telopeptide des Typ III Kollagens und carboxyterminale Telopeptide des Typ III Kollagens. Solche Assays werden in dem US-Patent Nr. 5,532,169 und dem US-Patent Nr. 5,641,687 offenbart. Typ III Kollagenresorptionsmarker können verwendet werden, um vasculären Kollagenabbau (Atherosclerose), Lungengewebeabbau (z. B. Emphysem und andere destruktive Lungenerkrankungen), Muskelschwund, Zerbrechlichkeitssyndrome Älterer, Lebererkrankungen, Schilddrüsenüberfunktion, sekundäre Auswirkungen von Diabetes auf Bindegewebe und andere entzündliche und infektiöse Zustände, die eine Gesamtknochenresorptionsaktivität beschleunigen, zu untersuchen.
Es werden unten lineare Peptide (SEQ ID NO: 11 – 20), die mit den Telopeptidkomponenten der Abbauprodukte von Typ II Kollagen übereinstimmend synthetisiert wurden, beschrieben.
Das prinzipielle col2CTx-Abbauprodukt ist vernetztes EKGPDP. Das weitere Abbauprodukt, vernetztes EKGPD, ist üblicherweise in Urin in geringeren Mengen vorhanden. Das vernetzte EKGPDPL-Abbauprodukt ist eine kleinere Komponente im Vergleich zu vernetztem EKGPDP.
Höhere als normale Mengen an vernetztem EKGPDPLQ in Blut können einen Abbau von mineralisiertem Knorpel anzeigen, der mit aktiver Osteophytenbildung in Osteoarthritis assoziiert ist.
Die durch SEQ ID NO: 11 – 13 dargestellten Telopeptidsequenzen resultieren aus Metalloproteinasen (MMP)-Spaltung der G–L-Bindung an dem Aminoende des α1(II)C-Telopeptids (SEQ ID NO: 5) in Kombination mit MMP-Schnitten von P–L-, Q–Y- oder Y–M-Bindungen an dem Carboxyende des Telopeptids. SEQ ID NO: 14 – 16 stellen verwandte Telopeptide aus MMP-Spaltungen zwischen der A–F-Bindung dar. SEQ ID NO: 17 – 19 stellen längere Telopeptide aus MMP-Spaltung zwischen der G–I-Bindung dar. Die Aminoenden dieser längeren Telopeptide werden im Allgemeinen in den Lymphknoten, Leber und/oder Niere weiter metabolisiert.
Die Telopeptidsequenz, die durch SEQ ID NO: 20 dargestellt wird, resultiert aus der Serinproteasespaltung der R–E-Bindung aminoterminal zu dem vernetzten K-Rest in Kombination mit Serinproteasespaltung der R–A-Bindung an dem Carboxyende des Telopeptids.
Solche vernetzten Abbauprodukte der SEQ ID NO: 11 – 19 (worin die zwei Telopeptidkomponenten unabhängig voneinander aus SEQ ID NO: 11 – 19 ausgewählt sind) und SEQ ID NO: 20 resultieren im Allgemeinen aus dem Abbau von nicht-mineralisiertem Knorpel und sind primär in synovialer Flüssigkeit und Blut und in einem geringeren Ausmaß in Urin zu finden. Höhere als normale Mengen dieser Abbauprodukte in Körperflüssigkeiten zeigen aktiven Knorpelabbau an, der mit rheumatischer Arthritis, Osteoarthritis und anderen Arthrititsarten korrelieren kann.
Die Verfahren der Erfindung verwenden Antikörper, die gegen vernetzte Aminotelopeptidabbauprodukte von Typ II Kollagen gerichtet sind sowie lineare Peptide (SEQ ID NO: 21 – 31), die synthetisiert wurden, um zu den Telopeptidkomponenten der Abbauprodukte zu passen. Die Verfahren der Erfindung stellen Assays zum Knorpelabbau unter Verwendung der Antikörper und linearen Peptide zur Verfügung.

N: = nicht-mineralisierter Knorpel;
M: = mineralisierter Knorpel;
N + M: = gesamter Knorpelabbau; und
–: = abwesend oder nur in Spurenmengen.

Die Telopeptidsequenzen, die durch SEQ ID NO: 21 – 23 dargestellt sind, resultieren aus Metallproteinase (MMP)-Spaltung der F–D-Bindung an dem Aminoende des α1(II)N-Telopeptids in Kombination mit MMP-Schnitten an den A–Q-, Q–L- oder L–G-Bindungen an dem Carboxyende des Telopeptids. SEQ ID NO: 24 – 26 stellen verwandte Telopeptide aus MMP-Spaltung zwischen der G–F-Bindung an dem Aminoende dar. Die Amino- und Carboxyenden der längeren Telopeptide (SEQ ID NO: 22 – 26) werden im Allgemeinen weiter in den Lymphknoten, Leber und/oder Niere metabolisiert. Als ein Ergebnis sind die prinzipiellen col2NTx-Abbauprodukte in Urin vernetztes DEKAGGA und FDEKAGGA.
Die in SEQ ID NO: 27 – 28 dargestellten Telopeptidsequenzen resultieren aus Cathepsin K-Spaltung der G–V-Bindung an dem Carboxyende des Telopeptids in Kombination mit Cathepsin K-Spaltung der A–G-Bindung an dem Aminoende des Telopeptids im Falle von SEQ ID NO: 27. Im dem Falle von SEQ ID NO: 28 ist der aminoterminale J-Rest blockiert. Höhere als normale Mengen an vernetztem GGFDEKAGGAQLG und QMAGGFDEKAGGAQLG im Blutstrom können einen Abbau von mineralisiertem Knorpel anzeigen, der mit aktiver Osteophytenbildung in Osteoarthritis assoziiert ist. Proteasen in der Niere und/oder Leber entfernen den carboxyterminalen G-Rest vor der Freisetzung in den Urin.
Die durch SEQ ID NO: 29 – 31 dargestellten Telopeptide resultieren aus Metallproteinasespaltung der V–M-Bindung an dem Carboxyende des Telopeptids in Kombination mit MMP-Spaltung der G–F- oder F–D-Bindung an dem Aminoende des Telopeptids in dem Falle der SEQ ID NO: 30 – 31. Größere Abbauprodukte, die SEQ ID NO: 29 – 31 umfassen, zuzüglich einiger zusätzlicher helicaler Sequenzen) können auch in synovialer Flüssigkeit und Blut vorhanden sein. Diese vernetzten Telopeptide werden im Allgemeinen weiter in den Lymphknoten, Leber und/oder Niere metabolisiert und kommen dementsprechend nur in Spurenmengen in Urin vor.
Wie oben angezeigt, werden vernetzte α(II)N Telopeptide, die durch die SEQ ID NO: 27 – 31 dargestellt werden, an dem(den) Orten) des Knorpelabbaus hergestellt, aber weiter während der Passage durch die Lymphknoten, Leber und/oder Niere abgebaut. Die resultierenden kleineren Abbauprodukte haben zwei Telopeptidkomponenten, die unabhängig voneinander aus SEQ ID NO: 21 – 26 ausgewählt werden können. Höhere als normale Mengen dieser Abbauprodukte in Urin zeigen einen Gesamtknorpelabbau an, der mit rheumatischer Arthritis, Osteoarthritis und anderen Arthritisarten korrelieren kann.
Somit stellt die Erfindung in einer ersten Ausführungsform ein verbessertes Verfahren zur Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe auf das Vorhandensein eines Analyten, der einen physiologischen Zustand anzeigt, zur Verfügung, das die Schritte des Inkontaktbringens der Körperflüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der den Analyten bindet, das Nachweisen der Bindung des Antikörpers in der Körperflüssigkeitsprobe und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit dem physiologischen Zustand umfasst, wobei die Verbesserung das Inkontaktbringen einer Serumprobe mit einem Antikörper, der an
bindet, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit der Resorption von nicht mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo umfasst.
In einer zweiten Ausführungsform stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe auf das Vorhandensein eines Analyten, der einen physiologischen Zustand anzeigt, zur Verfügung, das die Schritte des Inkontaktbringens der Körperflüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der den Analyten bindet, das Nachweisen der Bindung des Antikörpers in der Körperflüssigkeitsprobe und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit dem physiologischen Zustand umfasst, wobei die Verbesserung das Inkontaktbringen einer Serumprobe with einem Antikörper, der an
bindet, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit der Resorption von mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo, umfasst.
In einer dritten Ausführungsform stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe auf das Vorhandensein eines Analyten, der einen physiologischen Zustand anzeigt, zur Verfügung, das die Schritte des Inkontaktbringens der Körperflüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der den Analyten bindet, das Nachweisen der Bindung des Antikörpers in der Körperflüssigkeitsprobe und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit dem physiologischen Zustand umfasst, wobei die Verbesserung das Inkontaktbringen einer Urinprobe mit einem Antikörper, der an
bindet, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit der Resorption von sowohl nicht mineralisiertem wie auch mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo umfasst.
In einer vierten Ausführungsform stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe auf das Vorhandensein eines Analyten, der einen physiologischen Zustand anzeigt, zur Verfügung, das die Schritte des Inkontaktbringens der Körperflüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der den Analyten bindet, das Nachweisen der Bindung des Antikörpers in der Körperflüssigkeitsprobe und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit dem physiologischen Zustand umfasst, wobei die Verbesserung das Inkontaktbringen einer Serumprobe mit einem ersten Antikörper, der an
bindet, und das Inkontaktbringen der Serumprobe mit einem zweiten Antikörper, der an
bindet, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren der gesamten nachgewiesenen Bindung der ersten und zweiten Antikörper mit der Resorption von sowohl mineralisiertem wie auch nicht mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo umfasst.
In einer fünften Ausführungsform stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe auf das Vorhandensein eines Analyten, der einen physiologischen Zustand anzeigt, zur Verfügung, das die Schritte des Inkontaktbringens der Körperflüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der den Analyten bindet, das Nachweisen der Bindung des Antikörpers in der Körperflüssigkeitsprobe und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit dem physiologischen Zustand umfasst, wobei die Verbesserung das Inkontaktbringen einer Serumprobe mit einem ersten Antikörper, der an
bindet, und das Inkontaktbringen einer Urinprobe mit einem zweiten Antikörper, der an
nicht aber
bindet, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren der gesamten nachgewiesenen Bindung der ersten und zweiten Antikörper mit der Resorption von sowohl mineralisiertem wie auch nicht mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo umfasst.
Der Begriff „Antikörper" in dieser Offenbarung ist dahingehend vorgesehen, polyclonale Antikörper, monoclonale Antikörper und Antigen-bindende Fragmente davon zu umfassen. Solche [EKGPDP]LQ-bindenden und EKGPDP-bindenden Antikörper oder GGFDEKAGGAQLG-bindenden und DEKAGGA-bindenden Antikörper können durch Standardverfahren, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, hergestellt werden. Es folgt ein repräsentatives Protokoll.
EKGPDPLG-Hybridomentwicklung: Es wurden weibliche RFB/DnJ-Mäuse intraperitoneal (ip) mit einer Emulsion aus vollständigem Freund's Adjuvanz und EKGPDPLQ synthetischem Peptid, das an ein Trägerprotein, „keyhole limpet hemacyanin (KLH)" über Glutaraldehyd (KLH-EKGPDPLQ) gebunden ist, injiziert. Einen Monat später wird eine Verstärkungsinjektion von KLH-EKGPDPLQ in einer Emulsion mit unvollständigem Freund's Adjuvanz ip gegeben. Ungefähr 8 Wochen später werden die Mäuse geopfert und Milzzellen durch Polyethylenglycol an die FOX-NY murine Myelomzelllinie (ATCC CRL-1732) fusioniert. Die Fusionszellen werden in 96er Wellplatten in Selektionsmedien wachsen gelassen, das Adenin, Aminopterin und Thymidin (AAT) enthält.
Ungefähr eine Woche nach der Fusion werden Hybridomkoloniekulturüberstände in ELISA auf Reaktivität gegen das synthetische EKGPDPLQ Peptid, das über Glutaraldehyd an Rinderserumalbumin (BSA-EKGPDPLQ) vernetzt ist, getestet. Hybridomkolonien, die Antikörper produzieren, die mit BSA-EKGPDPLQ reaktiv sind, werden sekundär auf Spezifität einer Reaktion imn ELISA gegen andere synthetische Peptidsequenzen getestet. Unter diesen getesteten sind das synthetische EKGPDP Peptid, das über Glutaraldehyd an BSA vernetzt ist (BSA-EKGPDP). Hybridomkolonien, die positiv auf BSA-EKGPDPLQ und negativ auf BSA-EKGPDP reagieren, werden cryokonserviert. Repräsentative Hybridome werden auf Monoclonalität durch das eingeschränkte Verdünnungsverfahren cloniert.
In einem Kompetitions-ELISA wird festgestellt, dass menschliche Seriumspezies sowie lösliches BSA-EKGPDPLQ mit dem Festphasen BSA-EKGPDPLQ um entsprechende Antikörper kompetitieren.
Ein Cathepsin K-Verdau von Typ II Kollagen kann auch zu Immunisierungs- und Screeningzwecken hergestellt werden. Proteoglycane werden aus einer Gewebeprobe aus menschlichem Knorpel mit einem Proteindenaturierungsmittel wie 4M Guanidin HCl extrahiert. Der Rest wird mit Wasser gewaschen und mit rekombinantem Cathepsin K (37 °C, pH 5,8) verdaut. Der Verdau wird durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie, z. B. durch Umkehrphasen, fraktioniert und Fraktionen, die Pyridinolinvernetzungen enthalten, werden durch Fluoreszenzemission bei 390 nm (297 nm Anregung) beobachtet. Die fluoreszierende Fraktion, die die vernetzten C-Telopeptide der Sequenz EKGPDPLQ enthält, wird durch N-terminate Sequenzanalyse identifiziert. Diese Fraktion kann zu Screeningzwecken und zur Validierung der Antikörperspezifität verwendet werden.
Die jeweiligen Antikörper können in einer Reihe von Immunassayformaten eingesetzt werden, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind. Siehe z. B.: Harlow & Lane, Antibodies: A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 553 – 612, 1988; Principles and Practice of Immunoassay, Price & Newman (Eds.), Stockton Press, 1991 und Immunoassay, Diamandis & Christopoulos (Eds.), Academie Press, 1996.
Sequenzauflistung

Claims

Ein Verfahren zur Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe auf das Vorhandensein eines Analyten, der einen physiologischen Zustand anzeigt, das die Schritte des Inkontaktbringens der Körperflüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der den Analyten bindet, das Nachweisen der Bindung des Antikörpers in der Körperflüssigkeitsprobe und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit dem physiologischen Zustand umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Verfahren das Inkontaktbringen einer Serumprobe mit einem Antikörper umfasst, der
bindet, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit der Resorption von nicht mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo.
Ein Verfahren zur Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe auf das Vorhandensein eines Analyten, der einen physiologischen Zustand anzeigt, dass die Schritte des Inkontaktbringens der Körperflüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der den Analyten bindet, das Nachweisen der Bindung des Antikörpers in der Körperflüssigkeitsprobe und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit dem physiologischen Zustand umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Verfahren das Inkontaktbringen einer Serumprobe mit einem Antikörper umfasst, der
bindet, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit der Resorption von mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo.
Ein Verfahren zur Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe auf das Vorhandensein eines Analyten, der einen physiologischen Zustand anzeigt, dass die Schritte des Inkontaktbringens der Körperflüssigkeitsprobe mit einem Antikörper, der den Analyten bindet, das Nachweisen der Bindung des Antikörpers in der Körperflüssigkeitsprobe und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit dem physiologischen Zustand umfasst, das das Inkontaktbringen einer Urinprobe mit einem Antikörper umfasst, der
umfasst, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung mit der Resorption von sowohl nicht mineralisiertem wie auch mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo.
Ein Verfahren, wie es in Anspruch 2 beansprucht wird, worin besagtes Verfahren auch das Inkontaktbringen der Serumprobe mit einem zweiten Antikörper umfasst, der
bindet, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren der gesamten nachgewiesenen Bindung der ersten und zweiten Antikörper mit der Resorption von sowohl mineralisiertem wie auch nicht mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo.
Ein Verfahren, wie es in Anspruch 2 beansprucht wird, worin besagtes Verfahren auch das Inkontaktbringen einer Urinprobe mit einem zweiten Antikörper umfasst, der an
bindet, worin K-K-K Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin ist, und das Korrelieren jeglicher nachgewiesener Bindung des ersten Antikörpers mit der Resorption von mineralisiertem Kollagen Typ II in vivo, und jegliche nachgewiesene Bindung des zweiten Antikörpers mit der Resorption von sowohl mineralisiertem als auch nicht mineralisiertem Typ II Kollagen in vivo.
Synthetisches Peptid DEKAGGA (SEQ ID NO: 21).
Synthetisches Peptid GGFDEKAGGAQLG (SEQ ID NO: 27).