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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bearbeitung eines Proteinmaterials,
genauer gesagt, ein Verfahren zur Entfernung von Rinderinsulin aus
einem aus Kuhmilch stammenden flüssigen
fettfreien Proteinmaterial. Die Erfindung betrifft zudem ein Proteinmaterial,
das im Wesentlichen frei von Rinderinsulin ist, das durch das oben
genannte Verfahren hergestellt wurde, sowie dessen Verwendung als
Proteinbestandteil einer Säuglingsanfangsnahrung
oder eines anderen speziellen Nährpräparates
oder als Rohmaterial bei Verzehrsmilch, anderen Milchgetränken oder
verschiedenen Milchpräparaten.
Bei der Herstellung dieser Produkte kann das fettfreie Proteinmaterial,
das im Wesentlichen frei von Rinderinsulin ist und das aus Kuhmilch
stammt und durch das obenstehend genannte Verfahren hergestellt
wird, als Proteinbestandteil verwendet werden.
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Da
die erfindungsgemäße Bearbeitung
den Geschmack des Produktes nicht wesentlich verändert, ist das fettfreie Proteinmaterial,
das im Wesentlichen frei von Rinderinsulin ist, das aus Kuhmilch stammt
und gemäß der vorliegenden
Erfindung erhalten wird, in den obenstehend genannten Produkten
ein optimal geeigneter Proteinbestandteil.
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Insulin-abhängige Diabetes
Mellitus (insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM) ist eine Krankheit,
die durch die Zerstörung
der Insulin-produzierenden Betazellen in den Langerhans-Inseln des
Pankreas hervorgerufen wird, wobei andere Zellen der Inseln intakt
bleiben (Castano L. und Eisenbarth GS. Annu. Rev. Immunol., 8 (1990)
647–79).
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Es
wird angenommen, dass sowohl genetische Faktoren als auch Umweltfaktoren
das Risiko beeinflussen, dass Kinder an IDDM erkranken. Zur Erklärung der
Entwicklung von IDDM ist der genetische Faktor wichtig, aber nicht
ausreichend. Das Risiko, dass einer von monozygoten Zwillingen im
Laufe seines Lebens an IDDM erkrankt, liegt nur zwischen 30 und
50%, wenn der andere Zwilling an IDDM erkrankt ist. Nur 10% der
neuen IDDM Fälle treten
in Familien auf, bei denen es bereits ein Fall von IDDM gab, und
90% der neuen Fälle
werden bei Patienten diagnostiziert, in deren Familien es noch keine
IDDM-Fälle
gab. In anderen Worten heißt
dies, dass umweltbedingte Faktoren bei der Entwicklung von IDDM
sogar noch eine größere Bedeutung
haben können
als genetische Faktoren.
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Verschiedene
epidemiologische Untersuchungen zeigen, dass die Aussetzung gegenüber Kuhmilchprotein
in einem frühen
Säuglingsalter
das Risiko einer Erkrankung an IDDM erhöht (Gerstein H., Diabetes Care
17 (1994) 13–19).
Epidemiologische Beobachtungen wurden bisher verwendet, um mehrere
Hypothesen hinsichtlich Mechanismen, in denen Kuhmilchproteine als
Faktoren für
Diabetes agieren könnten,
aufzustellen. Eine der neuesten ist eine Hypothese nach der das
Insulin in Kuhmilch eine Immunantwort, die irrtümlicherweise gegen die eigene
Insulinproduktion des Kindes gerichtet ist, verursachen kann (Vaarala,
O., Paronen, J., Otonkoski, T., Åkerblom, H. K., Scand. J.
Immunol. 47 (1998) 131–135).
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Oral
verabreichtes heterologes Insulin, das sich von autologem Insulin
leicht unterscheidet, kann die immunologische Toleranz gegen Betazellen
verletzen. Die Bildung von Lympozyten, die Insulin identifizieren,
kann bei Personen schädlich
sein, die eine erbliche Empfindlichkeit gegenüber IDDM haben, und die Aktivierung
solch einer Lympozytpopulation kann später im Leben zu einem autoimmunen
Angriff gegen insulinproduzierende Betazellen führen. Wir haben gezeigt, dass
die Verabreichung von Säuglingsanfangsnahrung
an Säuglinge
die Herstellung von Antikörpern
gegen Rinderinsulin induziert (Vaarala, O., Paronen, J., Otonkoski,
T. Åkerblom,
H. K., Scand. J. Immunol. 47 (1998) 131–135). Diese Antikörper kreuzreagieren
mit humanem Insulin. Da die Gegenwart von Insulinautoantikörpern (IAA)
dem Ausbruch von IDDM vorangeht und diesen voraussagt, kann die
Immunisierung hinsichtlich Insulin, die durch Milchprodukte erzeugt
wird, schädlich
sein und das Risiko einer Erkrankung an IDDM erhöhen. Daher könnten die
Milchprodukte, die kein immunreaktives Rinderinsulin enthalten,
als nicht-diabetogene Nahrungsmittel
angesehen werden.
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Falls
der Faktor, der die Autoimmunisierung aktiviert, Rinderinsulin ist,
das in kleinen Mengen in Kuhmilch vorhanden ist, ist es äußerst wichtig,
dass dieses aus den Säuglingsanfangsnahrungsmitteln entfernt
wird, um das Ausbrechen von IDDM bei Kindern zu verhindern. Dementsprechend
besteht Bedarf an im Handel erhältlichen
Kuhmilchprodukten und auf Kuhmilch basierenden Produkten, die kein immunreaktives
Rinderinsulin enthalten. Dies betrifft insbesondere Säuglingsanfangsnahrungsmittel,
die die ersten auf Kuhmilch basierenden Produkte sind, die von Säuglingen
verzehrt werden. Zudem betrifft es andere spezielle Nährpräparate und
verschiedene Milchgetränke
und Milchprodukte, wie zum Beispiel Speiseeis, Yoghurt und Käse.
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Desweiteren
wäre es
wünschenswert,
dass der in den Produkten verwendete Proteinteil deren gewohnten
Geschmack nicht wesentlich ändert.
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Wir
haben vorher gezeigt, dass Rinderinsulin durch einen Kationenaustausch
und nachfolgende optionale Hydrolyse und, nach der Hydrolyse, gefolgt von
einer optionalen chromatographischen Behandlung, die zum Beispiel
eine Behandlung mit einem Adsorptionsmedium sein kann (Finnische
Patentanmeldung 971872), aus einem fettfreien Proteinmaterial, das
aus Kuhmilch stammt, wie zum Beispiel aus Molke oder entrahmter
Milch entfernt werden kann. Unser finnisches Patent Nr. 94089 offenbart
auch eine Harzadsorptionsbehandlung eines Proteinhydrolysats.
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Nun
wurde überraschenderweise
herausgefunden, dass Rinderinsulin aus einem flüssigen fettfreien Proteinmaterial,
das aus Kuhmilch stammt, wie zum Beispiel Molke oder entrahmte Milch,
direkt durch eine Behandlung mit einem Adsorptionsmedium entfernt
werden kann. Dieses neue Verfahren entfernt Rinderinsulin vollständiger und ökonomischer
aus dem Proteinmaterial als bisher.
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Bei
dem neuen Verfahren wird nicht einmal eine Proteinhydrolyse benötigt. Dies
vermeidet zusätzliche
Kosten, die durch den Schritt der Hydrolyse verursacht werden, sowie
die Veränderung
des Geschmackes, die durch die Hydrolyseprodukte verursacht wird.
Die erhaltenen Hydrolyseprodukte sind gespaltene Proteine, die den
gewohnten Geschmack des Produktes, das erzeugt werden soll, verändern. So
schmeckt zum Beispiel Milch, dessen Proteinanteil wenigstens teilweise
durch Molke ersetzt wurde, die hydrolysiert wird und daher gespaltene
Proteine enthält,
nicht nach Milch. Im Gegensatz dazu schmeckt Milch, dessen Proteinanteil
wenigstens teilweise durch Molke ersetzt wurde, die durch das erfindungsgemäße Verfahren
behandelt wurde und ganze Proteine enthält, im Wesentlichen nach Milch.
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Kuhmilch
enthält
für gewöhnlich kleine
Mengen an Rinderinsulin. Der Gehalt schwankt je nach Analyseverfahren.
Es wurde jedoch zum Beispiel durch das ELISA-Verfahren (Enzyme Linked
Immuno Sorbent Assay) und das RIA-Verfahren (Radio Immuno Assay)
ein Gehalt von etwa 1 ng/ml festgestellt.
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In
dieser Erfindung wurde Rinderinsulin durch das RIA-Verfahren von Proben
analysiert. Die Probenlösung
wurde gefriergetrocknet, als eine konzentrierten Lösung aufgelöst und durch
das RIA-Verfahren analysiert. Das ELISA-Verfahren wurde als zweites
unabhängiges
Verfahren verwendet, wobei die verwendeten Antikörper nicht dieselben waren wie
bei dem RIA-Verfahren. Die RIR-Analyse muss vor der Wärmebehandlung
durchgeführt
werden, damit zuverlässige
Ergebnisse erhalten werden. Die RIA- und ELISA-Verfahren ergaben
Ergebnisse, die im selben Bereich lagen.
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Flüssigkeitschromatographie
und eine Umkehrphasensäule
(Kroeff et al., J. Chromatogr. 461 (1989) 45–61; Poll und Harding, J. Chromatogr.
539 (1991) 37–45;
Cox, J. Chromatogr. 599 (1992) 195–203; Welinder, J. Chromatogr.
542 (1991) 83–99),
Gelfiltration oder eine Anionenaustauschsäule (WO 90/00176 und WO 90/00177)
oder eine schwache Kationenaustauschsäule (
DE 35 11 270 A1 und
GB 2173503A ) wurden
für gewöhnlich bei
der Reinigung von Insulin aus den Herstellungs- und Extraktions-Lösungen verwendet.
Außer
unserer obenstehend genannten finnischen Patentanmeldung 971872
hat bisher keine der Veröffentlichungen
die direkte Trennung von Rinderinsulin aus entrahmter Milch oder
Molke diskutiert. An sich ist die Umkehrphasenfiltrations- oder
Gelfiltrationschromatographie nicht zur Behandlung von Milch geeignet,
da die behandelte Milch für
Nahrungsmittel geeignet sein soll und einen angemessenen Preis haben
soll.
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Insulin
kann leicht durch eine Wärmebehandlung
immunologisch inaktiviert werden. So inaktivieren zum Beispiel die
Pasteurisierung (72°C)
und die Ultrahocherhitzung (UHT Behandlung, 135–140°C) die Mehrheit des Insulins
in eine Form, die durch das RIA-Verfahren nicht feststellbar ist.
Es wurde jedoch festgestellt, dass Säuglinge, denen Säuglingsanfangsnahrung
gegeben wurde, eine Immunisierung gegen Rinderinsulin durch die
Säuglingsanfangsnahrung
erhalten haben (Vaarala, O., Paronen, J., Otonkoski, T., Åkerblom,
H. K., Scand. J. Immunol. 47 (1998) 131–135), bei deren Herstellung das
Meiste des Insulins in dem Erhitzungsschritt nicht durch das RIA
detektierbar wurde.
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Die
Anmelderin hat nun herausgefunden, wie Rinderinsulin effektiver
als bisher aus flüssigem fettfreiem
Proteinmaterial, das aus Kuhmilch stammt, entfernt werden kann.
In diesem Fall wird, bei angemessenen Kosten, eine Proteinzusammensetzung erhalten,
die aus Kuhmilch stammt und die für Nahrungsmittel geeignet ist
und im Wesentlichen frei von Rinderinsulin ist, und die zur Verwendung
als Proteinteil insbesondere in einer Säuglingsanfangsnahrung geeignet
ist, aber auch in anderen speziellen Nährpräparaten, oder als Rohmaterial
in Milch zum Verzehr, anderen Milchgetränken und verschiedenen Milchprodukten,
wie zum Beispiel Speiseeis, Yoghurt oder Käse, und die ihren Geschmack
nicht von dem gewohnten Geschmack verändert.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Entfernung von Rinderinsulin aus einem aus Kuhmilch stammenden
flüssigen
fettfreien Proteinmaterial ist dadurch gekennzeichnet, dass das
aus Kuhmilch stammende flüssige
fettfreie Proteinmaterial, wobei das Material einen pH-Wert von
2 bis 8 aufweist, bei einer Temperatur, die unter 65°C liegt,
mit einem Adsorptionsmedium in Kontakt gebracht wird, wobei das
Gewichtsverhältnis
des Proteinmaterials, das mit dem Adsoptionsharz behandelt werden
soll, höchstens
100:1 beträgt,
und dadurch gekennzeichnet, dass mit der Mediumbehandlung wenigstens
eine Ultra- und Diafiltrationsbehandlung des Proteinmaterials kombiniert
wird, und dadurch gekennzeichnet, dass, wenn nötig, das so erhaltene flüssige Material zu
einem Proteinkonzentrat konzentriert wird und optional zu einem
Pulver getrocknet wird.
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Die
Entfernung von Fett und Kasein aus der Milch führt zu einer Molke, die die
Molkeproteine umfasst. Von dem Gesamtprotein der Milch sind etwa 20%
Molkeprotein und der Rest ist Kasein. Die Molke, die bei der Käseherstellung
erhalten wird, wird Käsemolke
genannt und die Molke, die bei der Kaseinherstellung erhalten wird,
wird wiederum Kaseinmolke genannt.
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Die
Erfindung ist am Besten zur Behandlung von Molke geeignet. Die in
der Erfindung verwendete Molke kann eine beliebige aus Kuhmilch
stammende Molke sein, wie zum Beispiel Käsemolke, Labkaseinmolke, saure
Kaseinmolke oder Sauerkäsemolke. Bevorzugt
ist die Molke eine Käsemolke.
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Das
fettfreie Proteinmaterial, das aus Kuhmilch stammt, kann auch eine
ultra- und diafiltrierte Molke sein, d.h. ein Molkeproteinkonzentrat.
In diesem Fall ist das Flüssigkeitsvolumen,
das mit Harz behandelt werden soll, kleiner und der Grad der Rinderinsulinentfernung
ist etwa so hoch wie bei der Molkebehandlung.
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Zusätzlich zu
den oben genannten können bei
der Erfindung entrahmte Milch oder eine aus fettfreiem Milchpulver
hergestellte wässrige
Lösung oder
eine aus Milchkasein hergestellte wässrige Lösung, d.h. eine Kaseinlösung als
das fettfreie Proteinmaterial, das aus Kuhmilch stammt, verwendet werden.
In diesem Fall ist jedoch der Grad an Rinderinsulinentfernung nicht
der Gleiche wie bei der Molkebehandlung.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird Rinderinsulin aus einem fettfreien Proteinmaterial,
das aus Kuhmilch stammt, bevorzugt aus Molke oder einem Molkeproteinkonzentrat,
entfernt, indem das zu behandelnde Material mit einem Adsorptionsmedium in
Kontakt gebracht wird. Als Adsorptionsmedium, an welches das Rinderinsulin
gebunden wird, wird ein auf Styrol basierendes oder auf Acryl basierendes Adsorptionsmedium
verwendet, das bevorzugt makroretikulär ist. Geeignete Adsorptionsmedien
umfassen Dowex XUS 40285.00 (Porengröße etwa 50 Å; Hersteller Dow Inc., Deutschland)
und Amberlite XAD 7 (Porengröße zwischen
450 und 500 Å;
Hersteller Rohm & Haas,
Frankreich).
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Die
Behandlung mit einem Adsorptionsmedium kann entweder durchgeführt werden,
indem das zu behandelnde Proteinmaterial durch eine Säule, die
mit einem Adsorptionsmedium gefüllt
ist, hindurchgeleitet wird, oder indem das Proteinmaterial in einem
Mischbehälter
mit einem Adsorptionsmedium in Kontakt gebracht wird. Bei der Adsorptionsmediumbehandlung
beträgt
der pH-Wert 2 bis 8, geeigneterweise 4 bis 6,7, und die Temperatur
liegt unter 65°C,
für gewöhnlich bei
2 bis 30°C,
und geeigneterweise bei 2 bis 10°C.
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Wenn
die Adsorptionsmediumbehandlung in einer Säule durchgeführt wird,
wird die Säule
mit einem Adsorptionsmedium gefüllt,
das geeigneterweise mit NaOH und HCl regeneriert ist. Das zu behandelnde
Proteinmaterial wird bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 bis
20 Säulenvolumen
(BV)/Std., geeigneterweise bei einer Fließgeschwindigkeit von 6 bis
8 Säulenvolumen/Stunde,
durch eine Säule,
die mit dem Adsorptionsmedium gefüllt ist, hindurchgeleitet. Das
Gewichtsverhältnis
des in dieser Mediumbehandlung zu behandelnden Proteinmaterials
zu dem Adsorptionsmedium beträgt
höchstens
100:1, geeigneterweise 10:1 bis 40:1.
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Wenn
die Adsorptionsmediumbehandlung in einem Mischbehälter durchgeführt wird,
werden das auf die obenstehend beschriebene Art und Weise regenerierte
Adsorptionsmedium und das zu behandelnde Proteinmaterial in den
Mischbehälter eingebracht,
in dem sie durch ein geeignetes leichtes Vermischen miteinander
in Kontakt gebracht werden. Das Gewichtsverhältnis des in der Mediumbehandlung
zu behandelnden Proteinmaterials zu dem Adsorptionsmedium beträgt höchstens
100:1, geeigneterweise 10:1 bis 40:1, und die Dauer des Kontaktes beträgt weniger
als 2 Stunden, geeigneterweise 60 Minuten.
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Wenigstens
eine Ultra- und Diafiltrationsbehandlung des flüssigen fettfreien Proteinmaterials, das
aus Kuhmilch stammt, wird mit der obenstehend genannten Adsorptionsmediumbehandlung
kombiniert. Das flüssige
Material kann durch Ultra- und Diafiltration zur Trocknung oder
anderer Weiterverarbeitung konzentriert werden, gleichzeitig kann
die Ultra- und Diafiltration jedoch auch verwendet werden, um die
Entfernung des Rinderinsulins aus dem zu behandelnden Material zu
vervollständigen.
Semipermeable 5.000 bis 25.000 D-Cut-off-Membranen, geeigneterweise
10.000 D Cut-off-Membranen werden bei der Ultra- und Diafiltration
verwendet. Membranmaterialien, die für die Ultrafiltration geeignet
sind, umfassen Polysulfon, Polyethersulfon, und hydrophil beschichtete
Materialien.
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Die
Menge, die durch Ultra- und Diafiltration an Insulin entfernt wird,
steigt, wenn das Konzentrationsverhältnis ansteigt. Ein geeignetes
Konzentrationsverhältnis
wird für
jeden besonderen Fall ausgewählt.
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Molke
oder ein anderes verdünntes
Ausgangsmaterial kann vor der obenstehend genannten Adsorptionsmediumbehandlung
durch die obenstehend genannte Ultra- und Diafiltration in Molkeproteinkonzentrat
beziehungsweise in ein anderes konzentriertes Ausgangsmaterial konzentriert
werden. Andererseits kann die Ultra- und Diafiltration nach der
obenstehend genannten Adsorptionsmediumbehandlung durchgeführt werden,
wobei ein Proteinkonzentrat erhalten wird, das zu Pulver getrocknet werden
kann, geeigneterweise durch Sprüh-
oder Gefriertrocknung.
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Bei
der Behandlung des Ausgangsmaterials kann das Gesamtkonzentrationsverhältnis zum
Beispiel etwa 24 betragen (Konzentrationsverhältnis zuerst 6 und dann 4),
jedoch kann bei der Konzentration des Materials in ein Proteinkonzentrat
das Gesamtkonzentrationsverhältnis
zum Beispiel etwa 120 betragen (Konzentrationsverhältnis zuerst
10 und dann 12).
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Ultra- und Diafiltration vor und/oder nach der Adsorptionsmediumbehandlung
durchgeführt.
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Vor
dem Kontakt mit einem Adsorptionsmedium kann das flüssige fettfreie
proteinhaltige Material, das aus Kuhmilch stammt, bevorzugt Molke,
vorbehandelt werden, indem es bei einer Temperatur unter 65°C geklärt wird,
geeigneterweise durch Mikrofiltration, Ultrafiltration oder Zentrifugation.
Diese Vorbehandlung wird bevorzugt durch Filtern des zu behandelnden
Materials durch Mikrofiltrationsmembrane durchgeführt, wobei
die Membranen 0,05 bis 1,4 Mikrometermembranen sind, bevorzugt 0,1
Mikrometermembranen. In diesem Fall können Kaseinstaub oder denaturierte
Molkeproteine, die optional vorliegen, und mit denen zusammen ein
Teil der makromolekularen Proteine, an welche Insulin häufig gebunden
ist, besonders von der Molke entfernt werden. Bei der Ultrafiltration
können
wiederum Membranen mit einem Cut-off Wert von 50.000 bis 200.000
D verwendet werden, wobei die Rotationsgeschwindigkeit bei der Zentrifugation
bevorzugt zwischen 1.000 und 10.000 Runden pro Minute liegt.
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Eine
Klärungsbehandlung
senkt zudem leicht den Rinderinsulingehalt des zu behandelnden Materials.
Der Rinderinsulingehalt der Molke beträgt bei der obenstehend genannten
Klärungsbehandlung
zum Beispiel 6 bis 10%.
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Bei
der am meisten bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird Molke durch ein Adsorptionsmedium behandelt und
diese Mediumbehandlung wird mit einer Ultra- und Diafiltrationsbehandlung
kombiniert, die entweder vor oder nach der Mediumbehandlung durchgeführt wird.
Untersuchungen haben ergeben, dass das obenstehende Verfahren zur
Entfernung des Rinderinsulins aus Molke durch Behandlung von Käse oder
Kaseinmolke, der/die ein Adsorptionsmedium aufweist, wie zum Beispiel
Dowex XUS 40285.00 (Dow Inc., Deutschland) oder Amberlite XAD 7
(Rohm & Haas,
Frankreich) führt.
Das Insulin wurde an das Medium gebunden, indem die Molke bei einem
pH-Wert von 2 bis 8 durch ein Adsorptionsmedium geleitet wurde,
das mit NaOH and HCl regeneriert war. Die so behandelte Molke wurde
bei einem pH-Wert von 6,5 ultrafiltriert, um ein Molkeproteinkonzentrat
zu erhalten, das evaporiert und zu Pulver eingetrocknet wurde. Die
Behandlung wurde ferner durchgeführt,
indem zuerst die Molke ultra- und diafiltriert wurde und dann das erhaltene
Proteinkonzentrat durch das Adsorptionsmedium behandelt wurde. Bei
der Behandlung sank der Insulingehalt der Molke von 21 auf 3 ng/g
Protein, bestimmt durch das RIA-Verfahren, d.h. auf etwa 85% im
Verhältnis
zum Protein.
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Durch
die auf obenstehende Weise behandelte Molke wurde eine Molkeproteinpräparation
erzeugt, die, hinsichtlich des Rinderinsulins, wesentlich reiner
war als ein entsprechendes herkömmliches Säuglingsnahrungspulver
(etwa 22 bis 30 ng/g Protein), Milchpulver (etwa 30 ng/g Protein)
oder ultra- oder diafiltriertes Molkeproteinpulver (Proteingehalt 70
bis 80%) (15 bis 25 ng/g Protein). Das auf diese Weise erhaltene
im Wesentlichen rinderinsulinfreie Molkeproteinpräparat ist
zur Verwendung als Rohmaterial und als alleinige Proteinquelle bei Säuglingsanfangsnahrung
geeignet, da Molkeprotein ernährungsphysiologisch
eine extrem hohe Qualität aufweist
und keine anderen Proteine benötigt,
um den Nährstoffgehalt
zu vervollständigen.
Ferner ist das im Wesentlichen insulinfreie Proteinmaterial, das gemäß der vorliegenden
Erfindung erhalten wird, zur Verwendung als Rohmaterial und Proteinanteil
in verschiedenen speziellen Nährstoffpräparaten,
verschiedenen Milchgetränken,
wie zum Beispiel Trinkmilch, und verschiedenen anderen Milchpräparaten, wie
zum Beispiel Speiseeis, Joghurt und Käse geeignet.
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Herkömmlicherweise
sind Säuglingsanfangsnahrung,
die ersten auf Kuhmilch basierenden Produkte, die von Säuglingen
konsumiert werden, aus Milch, Sahne, Gemüseöl, Molkepulver mit geringem
Salzgehalt, Mineralien und Vitaminen zusammengesetzt, von denen
Milch, Sahne und das Molkepulver mit geringem Salzgehalt Rinderinsulin
umfassen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
eine wesentliche Verringerung des Rinderinsulingehalts bei Säuglingsanfangsnahrung
oder anderen auf Kuhmilch basierenden speziellen Nährpräparaten,
Milchgetränken
und anderen Milchpräparaten, und
in deren Rohmaterialien.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung einer im Wesentlichen rinderinsulinfreien Säuglingsanfangsnahrung
oder anderen speziellen Nährpräparaten
oder Verzehrmilch, anderen Milchgetränken oder anderen Milchpräparaten
oder deren Rohmaterialien ist durch die Verwendung eines im Wesentlichen
rinderinsulinfreien fettfreien proteinhaltigen Materials gekennzeichnet,
das von Kuhmilch stammt, wobei der durch das erfindungsgemäße Verfahren
gewonnene Proteinanteil bei der Herstellung eines Produktes verwendet
wird.
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Beispiele
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BEISPIEL 1 (Vergleichsbeispiel)
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Entfernung von Rinderinsulin
aus Molke mit einem makroretikulären
auf Styrol basierenden Adsorptionsmedium, Dowex XUS 40285,00 bei
einem pH-Wert von 5,8.
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Das
Adsorptionsmedium XUS 40285.00 wurde mit 2% NaOH + 2% HCl regeneriert,
auf Neutral gespült
und in eine 20-ml Säule
eingebracht. 20 Säulenvolumen
(BV), d.h. 400 ml frische Käsemolke, wurden
bei einem pH-Wert von 5,8 durch die Säule geleitet.
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Bei
der Behandlung wurden 45% des Rinderinsulins aus der Molke entfernt.
Die Proteinausbeute betrug bei der Behandlung 93%, d.h. der Insulingehalt
wurde proportional zum Protein um 42% gesenkt.
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BEISPIEL 2 (Vergleichsbeispiel)
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Entfernung von Rinderinsulin
aus Molke mit dem Adsorptionsmedium XUS 40285.00 bei pH-Werten von 4,
5,8 und 6,4.
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Das
Adsorptionsmedium XUS 40285.00 wurde mit 2% NaOH + 2% HCl regeneriert
und auf Neutral gespült.
145 ml Käsemolke,
die auf einen pH-Wert von 4, 5,8 oder 6,4 eingestellt wurde, und
25 ml Harz wurden in einen Erlenmeyer-Kolben eingebracht, der in
einem Schüttler
angeordnet war. Nach einem Schüttelvorgang
von 60 Minuten wurde das Harz von der Molke getrennt und der Rinderinsulingehalt
der Molke wurde durch das RIA-Verfahren analysiert.
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Bei
der Behandlung wurden 57% des Rinderinsulins bei einem pH-Wert von
4,0 entfernt, 71% wurden bei einem pH-Wert von 5,8 entfernt, und
58% wurden bei einem pH-Wert von 6,4 entfernt. Die Proteinausbeute
betrug 69% bei einem pH-Wert von 4,0, 66% bei einem pH-Wert von
5,8 and 63% bei einem pH-Wert von 6,4, d.h. im Verhältnis zum
Protein sank der Insulingehalt um 39%, 47%, bzw. 37%. Die Untersuchung
zeigt, dass Rinderinsulin innerhalb einer weiten pH-Spanne durch
ein Adsorptionsmedium aus der Molke entfernt werden kann.
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BEISPIEL 3 (Vergleichsbeispiel)
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Entfernung des Rinderinsulins
aus Molke unter Verwendung eines makroretikulären auf Acryl basierenden Adsorptionsmediens,
Amberlite XAD 7.
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Ein
XAD 7 Adsorptionsmedium wurde mit 4% NaOH + 0, 09% HCl regeneriert,
auf Neutral gespült und
in eine 20 ml-Säule
eingebracht. 20 Säulenvolumen
(BV), d.h. 400 ml an Frischkäsemolke
wurden bei einem pH-Wert von 6,4 durch die Säule geleitet.
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Bei
der Behandlung wurden 76% des Rinderinsulins entfernt. Die Proteinausbeute
betrug bei der Behandlung 90%, d.h. der Insulingehalt wurde proportional
zum Protein um 68% gesenkt.
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BEISPIEL 4
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Entfernung von Rinderinsulin
aus einem Molkeproteinkonzentrat mit einem Adsorptionsmedium XUS 40285.00
bei einem pH-Wert von 5,8.
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Ein
XUS 40285.00 Adsorptionsmedium wurde mit 4% NaOH + 0,09 HCl regeneriert,
auf Neutral gespült
und in eine 20 ml-Säule
eingebracht. 20 Säulenvolumen
(BV), d.h. 400 ml eines mikrofiltrierten (1,4 Mikrometer) Molkeproteinkonzentrates
(Trockenmasse 5%, Protein 32% der Trockenmasse) wurde bei einem
pH-Wert von 5,8 durch die Säule
geleitet. Bei der Behandlung wurden 46% des Rinderinsulins aus dem
Molkeproteinkonzentrat entfernt. Die Proteinausbeute betrug bei
der Behandlung 98%, d.h. der Insulingehalt wurde proportional zum
Protein um 45% gesenkt.
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BEISPIEL 5
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Entfernung von Rinderinsulin
aus einem Molkeproteinkonzentrat mit einem makroretikulären auf
Acryl basierenden Adsorptionsmedium, Amberlite XAD 7.
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XAD
7 Adsorptionsmedium wurde mit 4% NaOH + 0,09 HCl regeneriert, auf
Neutral gespült und
in eine 20 ml-Säule
eingebracht. 20 Säulenvolumen
(BV), d.h. 400 ml eines frischen Molkeproteinkonzentrates (Proteingehalt
2%) wurden bei einem pH-Wert von 6,4 durch die Säule geleitet.
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Bei
der Behandlung wurden 86% des Rinderinsulins aus dem Molkeproteinkonzentrat
entfernt. Die Proteinausbeute betrug bei der Behandlung 85%, d.h.
der Insulingehalt wurde proportional zum Protein um 73% gesenkt.
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BEISPIEL 6 (Vergleichsbeispiel)
Entfernung von Rinderinsulin aus entrahmter Milch mit dem Adsorptionsmedium
Amberlite XAD 7 bei einem pH-Wert von 6,7.
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Das
Adsorptionsmedium XAD 7 wurde mit 4% NaOH + 0,09 HCl regeneriert,
auf Neutral gespült und
in eine 20-ml Säule
eingebracht. 20 Säulenvolumen
(BV), d.h. 400 ml entrahmter Milch (Trockenmasse 9%, Protein 35%
der Trockenmasse) wurden bei einem pH-Wert von 6,7 durch die Säule geleitet.
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Bei
der Behandlung wurden proportional zum Protein 40% des Rinderinsulins
entfernt. Die Untersuchung ergibt, dass Rinderinsulin auch aus Milch entfernt
werden kann, jedoch ist der Grad der Entfernung von Insulin geringer
als bei der Behandlung von Molke.
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BEISPIEL 7 (Vergleichsbeispiel)
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Entfernung von Rinderinsulin
aus einer Kaseinlösung mit
dem Adsorptionsmedium Amberlite XAD 7 bei einem pH-Wert von 6,7.
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Das
Adsorptionsmedium XAD 7 wurde mit 4% NaOH + 0,09% HCl regeneriert,
auf Neutral gespült
und in eine 20-ml Säule
eingebracht. 20 Säulenvolumen
(BV), d.h. 400 ml an Natriumkaseinatlösung (Trockenmasse 3%, Protein
89% der Trockenmasse) wurden bei einem pH-Wert von 6,7 durch die
Säule geleitet.
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Bei
der Behandlung wurden 50% des Rinderinsulins entfernt.
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BEISPIEL 8
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14
l Frischkäsemolke
wurden bei 40°C
durch ein Labstak-Ultrafiltriergerät bei einem
Konzentrationsverhältnis
von 6 ultra- und diafiltriert, wobei GR81PP Membrane (6,000 D Cut-off-Membrane) verwendet
wurden, auf das Ausgangsvolumen gelöst und bei einem Konzentrationsverhältnis von
4 erneut filtriert, d.h. das Gesamtkonzentrationsverhältnis betrug
24. Der Rinderinsulingehalt wurde durch das RIA-Verfahren analysiert
und der Proteingehalt wurde aus der Ausgangsmolke analysiert und
das Molkeproteinkonzentrat wurde als das Endretentat erhalten. Die
Ausgangsmolke umfasste 21,2 ng Rinderinsulin pro g an Protein, und
das Molkeproteinkonzentrat, das nach der Ultra- und Diafiltration
erhalten wurde, umfasste 14,8 ng Insulin pro g an Protein.
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Daher
verringerte die Ultra- und Diafiltration den Rinderinsulingehalt
proportional zum Protein um 30%.
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BEISPIEL 9 (Vergleichsbeispiel)
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5,040
kg Molkeproteinpulver, das aus Molke hergestellt wurde, die gemäß Beispiel
1 behandelt worden war, 11,423 kg einer Gemüsefettmischung, 11,232 kg gereinigter
Laktose, 12,260 kg Maltodextrin (DE 21), 135 g einer Vitamin- und
Mineralvormischung (enthaltend Vitamine A, D, E, K, B1, B2, B6, B12,
Niacin, Folsäure,
Pantothensäure,
Biotin, Ascorbinsäure,
Cholin, Inositol, Ferrogluconat, Zinksulphat, Mangansulfat, Natriumselenit,
Kupfergluconat, und 70 g Calciumchlorid, 300 g Calciumphosphat,
65 g Magnesiumsulfat, 125 g Natriumchlorid und 620 g Kaliumcitrat
wurden in 60 Litern Wasser (50°C)
aufgelöst.
Der Gehalt an Trockenmasse der Mischung betrug etwa 40%.
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Die
auf diese Weise erhaltene Mischung wurde einem Homogenisator zugeführt (150/50
Bar) und durch einen Sprühtrockner
bei Trocknungstemperaturen von 180/75°C auf einem Fließbett bei 70/120/30°C zu einem
Pulver getrocknet. Zusammensetzung, Enderscheinung und Geschmack
des Produktes entsprachen denjenigen eines herkömmlichen Säuglingsanfangsnahrungspulvers.