DEE0008456MA - - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 20. Januar 1954 Bekanntgemacht am 6. Oktober 1955

DEUTSCHES PATENTAMT

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige antibiotische Stoffe, insbesondere auf die Herstellung von Erythromycin B und seine Säureanlagerungssalze.

Erythromycin ist ein Antibiotikum mit breiter antibakterieller Wirksamkeit, das sich als wirksames therapeutisches Mittel für die Behandlung solcher Krankheiten erwiesen hat, die durch Mikroorganismen verursacht werden; es wird zur Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces erythreus auf künstlichem Nährboden hergestellt. Der Mikroorganismus und die für die Herstellung von Erythromycin geeigneten Nährmedien und Gärverfahren sind in dem Deutschen Patent Nr. 920 934 ausführlich beschrieben worden.

Es wurde nun noch ein neues Antibiotikum gefunden, das sich zusammen mit Erythromycin herstellen läßt, indem man Streptomyces erythreus auf künstlichem Nährboden züchtet. Das neue Antibiotikum wurde von seinen Erfindern mit »Erythromycin B;; bezeichnet und wird in der vorliegenden Beschreibung unter diesem Ausdruck geführt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Erythromycin B, bei dem man einen Erythromycin B erzeugenden Stamm des Streptomyces erythreus

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linier siibmersen aeroben Bedingungen in einem Nährniedium züchtet, das eine Quelle für assimilierbares Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, bis der genannte. Organismus im Nährmedium genügend antibiotisclie wirksame Stoffe erzeugt bat. Dann entfernt man das Mycel aus dem Nährmediutn, ZUiI11 alle wirksamen antibiotischen Stoffe mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren Lösungsmittel aus dem Medium aus, entfernt das Lösungsmittel und

ίο (rennt das Erythromycin I! von jeglichem anwesenden Erythromycin.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Antibiotikum, das aus einer stickstoffhaltigen Base oder deren Säureanlagcnmgssalzen besteht, wobei die Base

IS folgende Eigenschaften besitzt: Bei Titration in einer Li)SIiHg von Dimethylformamid in Wasser im Verhältnis.:: I ein l'lw/ von etwa 8,5; nach den Titrationsdaten ein Molekulargewicht von etwa 736 und in Chloroforinlösung mit einer Konzentration von etwa(),o Gewichtsvohimprozent folgender nnterscheidbaren Absorptionsmaxima in einem Infrarot-Absorptionsspektrum im Bereich zwischen 2,4 /1 und 12,0 /1:

■·2.^χ<>; λ.μ: 5.n<>; 5.<)o; 6,84; 7,24; 7,50; 7,79; 8,04; 8,54; 8,()8; 9,14; ⁽).-i8; 9,86; 10,24; ¹⁰,5°.' i<V/>; 11,22;

as 11,54 ^lnl(l 'i.'M-

Erythromycin B besitzt einige dem Erythromycin ähnliche Eigenschaften, weist jedoch in seiner chemischen Struktur bestimmte deutliche Unterschiede auf, die sich durch Vergleich der Infrarot-Absorptions-Spektren beider Stoffe leicht zeigen lassen. In den Zeichnungen bringt Fig. 1 einen Vergleich zwischen den Infrarot-Absorptionsspektren der Chloroformlösungen von Erythromycin und Erythromycin B. Außerdem zeichnet sich Erythromycin B durch eine größere Stabilität in stark sauren Lösungen aus.

Erythromycin B wird auf ähnliche Weise wie Erythromycin hergestellt, indem man den Mikroorganismus Streptomyces erythreus auf einem Nährmeilium züchtet, das Quellen für assimilierbaren Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, wobei eine Brühe entsteht, die das Antibiotikum Erythromycin B neben Erythromycin enthält. Die Brühe wird zur Entfernung des Mycels filtriert, und die Mischung der Antibiotika, nämlich von Erythroinycin B und Erythromycin, wird durch Extraktion mit einem nicht polaren, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel getrennt. Das in der Mischung enthaltene Erythromycin B läßt sich von Erythromycin durch Verfahren abtrennen, bei denen die verschiedenen Löslichkeiten beider Stoffe ausgenutzt worden, z. B. durch Adsorption und anschließende selektive Auswaschung, oder durch Gegenstromextraktion unter Verwendung mehrerer miteinander nicht mischbarer Lösungsmittel in einer Extraktionsanlage mit einer Vielzahl von Röhren.

Der für das erfindungsgemäße Gärverfahren benutzte Actinoniycet gehört nach der Klassifizierung in Bergeys "Manual of Determinative Bacteriology.; ((>. Ausgabe, S. 938, zur Gattung Streptomyces der Ordnung Actinomycetales. Seinen morphologischen Eigenschaften nach scheint der Organismus mit einem von Waksman (Soil Science 8, 71 bis 214 (1919) unter dem Namen "Actinomyces 181« beschriebenen Actinomyceten, der später von ihm mit Streptomyces erythreus bezeichnet wurde, nahe verwandt zu sein. Die Eigenschaften der Kulturen des von Waksman beschriebenen und des neuen isolierten Organismus nach vorliegender Erfindung weisen einige Unterschiede auf, und das neue isolierte Lebewesen nach vorliegender Erfindung wurde vorläufig als ein Stamm des Streptomyces erythreus klassifiziert. Eine der Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory überlassene Kultur des Organismus erhielt dort die Kulturennummer NRRL 2338.

Die vorliegende Erfindung wird unter besonderer Bezugnahme auf den obenerwähnten Stamm des Organismus beschrieben, es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäßen Gärverfahren der Erfindung nicht nur die Verwendung des Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 233S, sondern auch andere Erythromycin B erzeugender Stämme des Streptomyces erythreus einschließen, die sich durch bekannte. Isolier-und Stammodifizierverfahren, z.B. durch Auswahl gezüchteter Organismen sowie Einwirkung von Modifizierungsmitteln, wie Röntgenstrahlen, U. V.-Licht, und chemischen Mitteln, z. B. Stickstofflost, auf die Organismen leicht herstellen und isolieren lassen. Weitere Erythromycin B erzeugende Stämme sind z. B. die Streptomyces erythreus-Stämme NRRL 2359, 2360 und 2361.

Wie bereits erwähnt, kann man Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, zur Gewinnung wirksamer antibiotischer Mittel in einem Nährmedium züchten. Als Nährmedium lassen sich verschiedene Medien verwenden, da aus den oben beschriebenen Versuchen hervorgeht, daß der Organismus in der Lage ist, von verschiedenen Energiequellen zu leben. Bestimmte Nährmedien werden jedoch zur Gewinnung der Antibiotika aus wirtschaftlichen Gründen zur Erzielung höchster Ausbeuten und leichterer Isolierbarkeit der Antibiotika bevorzugt. Die nach vorliegender Erfindung als Ouellen für Kohlenhydrat bevorzugten Bestandteile der Nährmedien sind z. B. Stärke und Glukose. Andere Quellen sind Rohrzucker, Dextrin, Melasse u. dgl. Zu den bevorzugten Quellen für Stickstoff gehören Maiswasser, grobes oder feines Sojabohnenmehl und in Schlempe enthaltene lösliche Stoffe; andere geeignete Quellen dafür sind Casein, Aminosäuremischungen Peptone (sowohl von Fleisch wie auch von Soja herrührend) u. dgl. Ebenso können anorganische Quellen für Stickstoff, wie z. B. Nitratoder Ammoniumsalze, verwendet werden.

Zu den dem Medium einzuverleibenden anorganischen Nährsalzen gehören die üblichen, Ionen abgebenden Natrium-, Kalium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-, Sulfatsalzc u. dgl.

Wie es auch für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen erforderlich ist, sollten auch dem zur Züchtung des erfindungsgemäßen Actinomyceten Nährmedium die wichtigsten Spurenelemente zugesetzt werden. Derartige Spurenelemente sind aber gewöhnlich schon als Verunreinigungen in den anderen zugegebenen Bestandteilen des Mediums enthalten.

Zur Erzielung günstigsten Wachstums und höchster Entwicklung des Streptomyces erythreus, Stamm

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NRRL 2338, sollte man das Nährmedium vor der Impfung mit dem Organismus auf einen p_H-Wert zwischen 6,0 und 7,5, vorzugsweise etwa 6,5. einstellen. Man hat beobachtet, daß das Medium während der Wachstumszeit des Organismus und der Herstellung der Antibiotika allmählich alkalisch wird und eine Alkalinität von etwa p_H 7,2 bis etwa 8,5 oder mehr erreichen kann, wobei der endgültige p_H-Wert mindestens teilweise vom Anfangs-p_H-Wert des Mediums,

jo den im Medium anwesenden Puffersubstanzen und der Wachstumszeit des Organismus abhängt.

Wie bei der Erzeugung größerer Mengen anderer Antibiotika bevorzugt man es auch für die Gewinnung großer Mengen Erythromycin B, die Kulturen unter submersen aeroben Bedingungen zu züchten. Zur Herstellung begrenzter Mengen dieser Stoffe kann man Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen züchten. Weiterhin ist es bei Kulturen in großen Behältern bekanntlich vorteilhaft, zum Impfen dieser Behälter die vegative Form des Organismus zu verwenden, um die Bildung des Antibiotikums zu beschleunigen und dadurch die Anlage möglichst gut auszunutzen. Deshalb ist es erwünscht, zuerst einen vegetativen Impfstoff des Organismus herzustellen, indem man eine verhältnismäßig kleine Menge Kulturnährmediun mit der Sporenform des Organismus impft und nach Bildung des frischen aktiven Impfstoffes diesen aseptisch in die großen Behälter einführt. Das Medium, in dem der vegetative Impfstoff hergestellt wird, kann das gleiche oder ein anderes als das für die Herstellung des Antibiotikums verwendete sein.

Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, läßt sich gut bei Temperaturen zwischen etwa 25 und 37⁰ züchten. Die höchsten Ausbeuten des Antibiotikums erhält man, wenn man das Nährmedium der Kultur auf etwa 26 bis 30° hält.

Bei der Herstellung von Antibioticis unter submersen Bedingungen ist es üblich, sterile Luft durch das Nährmedium der Kultur zu blasen. Zur Erzielung wirksamen Wachstums des Organismus und Gewinnung des Antibiotikums beträgt das Volumen der für die Bildung von Erythromycin und Erythromycin B eingeleiteten Luft vorzugsweise über 0,1 Raumteil Luft in der Minute je Raumteil des Kulturnährmediums. Das Wachstum und die Bildung des Antibiotikums sind noch besser, wenn mindestens 0,4 Raumteile Luft auf ι Raumteil des Kulturmediums durchgeleitet werden.

Die Entstehungsgeschwindigkeit der antibiotischen Stoffe und die Konzentration der antibiotischen Wirkstoffe im Nährmedium der Kultur läßt sich während der Wachstumszeit des Mikroorganismus leicht verfolgen, wenn man Proben des Kulturnährmediums auf ihre antibiotische Wirksamkeit gegenüber Organismen prüft, von denen man weiß, daß sie auf das Antibiotikum reagieren, z. B. von Staphylococcus aureus und Myobacterium tuberculosis. Für diese Untersuchungen empfiehlt es sich derart vorzugehen, daß man Proben der Kultur fortschreitend immer mehr verdünnt, bestimmte Mengen der so verdünnten Proben einem geschmolzenen Nähragar zusetzt, dann diesen Agar in einer Petrischale erstarren läßt, mit einer frischen Kultur des S. aureus oder M. tuberculosis impft und diejenige stärkste Verdünnung des Nährmediums der Kultur feststellt, bei der das Wachstum des Organismus auf dem Agarnährboden noch gänzlich gehemmt wird.

Man kann die erfindungsgemäßen antibiotischen Stoffe auch nach turbidimetrischen Versuchs verfahren erzeugen, wie sie gewöhnlich zur Herstellung anderer Antibiotika angewandt werden.

Die Anwesenheit von Erythromycin B und Erythromycin läßt sich durch chromatographische Verfahren bestimmen. Bei einem Verfahren dieser Art löst man etwa 0,2 bis 0,5 γ der zu untersuchenden Probe in einer kleinen Menge eines Lösungsmittels, z. B. Alkohol, bringt einen Tropfen der konzentrierten Lösung auf ein Ende eines Streifens Filterpapier, trocknet den entstehenden Fleck und entwickelt ihn nach dem üblichen papierchromatographischen Verfahren.

Zu den Lösungsmitteln, die zur Entwicklung des Papierstreifens, d. h. zum Auseinanderziehen der Adsorptionszonen dienen können, gehören: 1: 99 (V/V) · konzentrierte ' Ammoniumhydroxydlösung; destilliertes, mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser; destilliertes, mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser mit Zusatz von 2% (V/V) Piperidin; 0,1 molekulare, mit Methylisobutylketon gesättigte Boratpufferlösung mit einem p_H-Wert von 9,9; 0,15 η mit Methylisobutylketon gesättigte Natronlauge; 0,1 molekulare saure Kaliumphosphat-Pufferlösung mit 3 Volumprozent Äthanolgehalt u. dgl. Die Entwicklungsdauer ist etwa 4 bis 5 Stunden oder so lange, bis die Lösungsmittelfront das Ende des Streifens erreicht. Nach der Entwicklung stellt man die Lage der antibiotischen Substanz auf dem Streifen mit einem Bioautogramm fest. Hierbei legt man den entwickelten Filterpapierstreifen auf die Oberfläche eines etwa 3 mm dicken, in einer großen Glasschale befindlichen Agarnährbodens, den man durch Impfen eines warmen sterilen Agarnährmediums mit Bacillus subtilis hergestellt hatte. Das Antibiotikum dringt vom Papier aus in das Agar ein. Nach 10 Minuten wird der Papierstreifen entfernt, die Schale gekippt und die Lage des Filterpapierstreifens sowie der Lösungsmittelfront und die Stelle, an der die Versuchslösung aufgetragen wurde, direkt außen auf der Unterseite der Glasschale vermerkt. Das Agarmedium wird über Nacht bei etwa 37⁰ in umgekehrter Lage bebrütet. Das Auftreten klarer Zonen im Medium, d. h. von Streifen, die frei von bakteriellem Wachstum sind, zeigt die Lage der antibiotischen Substanz entsprechend deren Verteilung auf dem Filterpapier an. Durch Messen der von dem Antibiotikum und dem Lösungsmittel zurückgelegten Entfernungen bestimmt man den Rf-Wert oder das Verhältnis der Wanderungsgeschwindigkeit des Antibiotikums zu der des Lösungsmittels. Es wurde gefunden, daß sich Erythromycin B bei diesem Versuch weniger schnell bewegt als Erythromycin. Bei Anwesenheit einer Mischung von Erythromycin B und Erythromycin erscheinen im Bioautogramm zwei klare Zonen; ist jedoch nur eine Zone frei vom Bakterienwachstum, so kann man durch Vergleich der Lage dieser Zone mit der Lage einer unter genau den-

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selben Bedingungen mil reinem Erythromycin B oder !Erythromycin erhaltenen Zone feststellen, welches der beiden Antibiotika vorhanden ist. Unter günstigsten Bedingungen beträgt der Kf-Wert von Erythromyein ü etwa drei Viertel desjenigen von Erythromycin.

In den Zeichnungen zeigt Fig. 2 ein mit einem l'apierchromatogranim hergestelltes Bioautogramm, auf dem gleichzeitig Erythromycin B, Erythromycin

ίο und eine Mischung aus annähernd gleichen Mengen !erythromycin und Erythromycin B chromatographiert wurden. Für die Entwicklung, d. h. Zonentrennung, benutzte man hierbei als Lösungsmittel eine i°/_oige wäürige Lösung von konzentriertem Ammoniumhydroxyd, die mit Methylisobutylketon gesättigt war. Die schwarzen Flächen bedeuten Zonen, in denen keinerlei bakterielles Wachstum auftrat.

Im allgemeinen ist die gesamte antibiotische Wirksamkeit bei subniersen aeroben Kulturen innerhalb

ao von etwa 2 bis 5 lagen nach Impfung desNährmediums am gröLSten, bei Oberflächen- oder Schüttelkulturen erst innerhalb etwa 5 bis 10 Tagen.

Gewöhnlich entstehen im Nährinedium der Kultur annähernd gleiche Mengen Erythromycin und Erythroinycin B; dieses Verhältnis hängt jedoch von der Dauer der Hebrütungszeit ab. Kürzere Wachstumszeiten, etwa von 1 oder 2 Tagen, begünstigen die überwiegende Bildung von Erythromycin B. Eine Verlängerung der Bebrütungszeit führt zu einer relativen Verminderung der Erythromycin B-Menge im Vergleich zu der des Erythromycins und kann sogar einen absoluten Rückgang der Gesamtmenge des im Nährmedium der Kultur vorhandenen Erythromycins B verursachen. Der Grund für diese relative oder absolute Abnahme ist nicht bekannt.

Die in der Kultur des Str. erythreus-Stammes NKKL 2Jj₁S entstehenden Antibiotika lassen sich durch Extraktions- oder Adsorptionsverfahren aus dem Nährmedium gewinnen. Hierbei werden die erst-

41) genannten Verfahren deshalb bevorzugt, weil sie schneller und billiger sind. Für die Extraktion der Antibiotika aus dem Nährmedium der Kultur werden mit Wass('r nicht mischbare, polare organische Lösungsmittel bevorzugt, z. B. von Fettsäurealkylester, wie Äthyl- und Amylacetat; chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Dichloräthylen; Alkohole mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Butanol und Amylalkohol; Ketone mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Melhylamylketon, und andere. Verbindungen, wie Äthyläther und Dibutyläther. Es können aber auch andere Lösungsmittel von ähnlicher Beschaffenheit verwendet werden. Vorzugsweise wird die filtrierte Nährbrühe vor der Extraktion auf einen p_H-\Vert von etwa 9,5 oder höher eingestellt.

Das Erythromycin B läßt sich leicht von dem Erythromycin unter Ausnutzung der unterschiedlichen Löslichkeit und Adsorptionseigenschaften der beiden Verbindungen abtrennen. So wird ■/.. B. Erythromycin B auf Cellulose stärker als Erythromycin adsorbiert. Deshalb erscheint bei Adsorption einer Mischung von Erythromycin und Erythromycin B aus deren gemeinsamer Lösung auf einer Säule aus Cellulose und Auswaschung dieser Säule mit einem geeigneten Lösungsmittel das Erythromycin bereits im ersten Waschwasser, während Erythromycin B auf der Säule bleibt und erst bei längerem Auswaschen gewonnen wird. Bei einer anderen Durchführungsform des Verfahrens kann man die beiden Verbindungen durch selektive Extraktionsverfahren in einer Gegenstromanlage unter Gewinnung von Erythromycin B trennen.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Isolierung und der Eigenschaften von Erythromycin B:

Beispiel 1

Eine Sporen enthaltende Kultur des Streptomyces erythreus. Stamm NRRL 2338, wird hergestellt, indem man den Organismus auf einem Agarschrägnährbodcn folgender Zusammensetzung züchtet:

Dextrin 15 g

Trypton 5 g

Agar 20 g

Betain 0,5 g

gelöste Mineralmischung*) 2 ecm

Wasser zur Auffüllung auf 1 Liter

*) Die Mineralmischung enthält folgende Bestandteile :

K₂HPO₁ 100,0 g

NaCl 100,0 g

MgSO₁ 100,0 g

FeSO₄-7ILO 2,0 g

ZnSO₄ -7 H„0 1,0 g

CuSO₄-5 H^O o,5g

MnCl₂-4H₀O 0,5 g

CoCl₂-O H₂O 0,1 g

CaCl₂ 40,0 g

Wasser zur Auffüllung auf 1 Liter

Der Schrägnährboden wird 10 Tage lang bei 33⁰ bebrütet. Man gewinnt die Sporen in Form einer wäßrigen Suspension, indem man den Schrägnährboden mit einer kleinen Menge sterilem destilliertem Wasser bedeckt und die Sporen vorsichtig von der Oberfläche des Nährbodens abschabt.

Etwa ι ecm der auf diese Weise erhaltenen Sporensuspension verwendet man zur Impfung des folgenden sterilisierten Nährmediums unter sterilen Bedingungen :

Casein-Pancreatin-hydrolysat ig

Melasse 2 g _iXt

K₂HPO₄ 0,15 g

Wasser 100 ecm

Das geimpfte Nährmedium wird etwa 72 Stunden lang bei etwa 28⁰ bebrütet, bis gute vegetative Entwicklung zu beobachten ist. Etwa 5 ecm des tlas vegetative Wachstum enthaltenden Nährmeditims benutzt man zur Impfung eines 250 ecm fassenden Erlenmeyerkolbens, der etwa 75 ecm eines sterilisierten Gärmediums folgender Zusammensetzung enthält:

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Rohrzucker .................... 45 g

Sojabohnenmehl 20 g

Aus kondensierter Melasseschlempe

gewonnene lösliche Stoffe ..... 2 g

Natriumchlorid 5 g

Calciumcarbonat ..,..,,..., 2 g

Cobaltochloridhexahydrat , 0,001 g

Wasser zur Auffüllung auf ...... 1 Liter

Der Kolben mit dem geimpften Nährmedium wird in einen auf etwa 28^? gehaltenen Brutraum gestellt und 6 Tage lang auf einer sich drehenden Schüttelvorrichtung mit einem Schüttelhub von etwa 5 cm und einer Geschwindigkeit von 240 Umdrehungen in der Minute geschüttelt. Von Zeit zu Zeit werden Proben des Nährmediums auf die Gesamtmenge der darin enthaltenen antibiotisehen Wirkstoffe untersucht. Erreicht die Menge des wirksamen Anti^- biotikums im Schüttelkolben einen Wert von etwa 250 bis 300 y/ccm der Brühe, so filtriert man diese zur Entfernung des Mycels.

;Etwa I¹Z₂ Liter der filtrierten Kulturbrühe werden mit Natronlauge auf einen p_H-Wert von 9,5 gebracht und mit 0,75 Liter Amylacetat ausgezogen. Der Amylacetatextrakt, in dem praktisch alle in der ursprünglichen Gärbrühe vorhandenen antibiotisehen Wirkstoffe enthalten sind, wird durch Vakuumeindampfung auf ein Volumen von etwa 10 ecm eingeengt. Der konzentrierten Amylacetatlösung setzt man 0,5 g gereinigte Cellulosefaser zu und trocknet die Mischung über Nacht im Vakuum. Die trockene, feinpulverige Cellulose, auf der alle antibiotisehen Wirkstoffe der Brühe absorbiert sind, wird auf die

■ Oberseite einer etwa 3,2 Χ 38 cm messenden chromatographischen Adsorptionssäule gelegt, die etwa 161 g trockene gereinigte Cellulosefaser enthält. Die Säule wird mit o,i%iger wäßriger, mit Methylisobutylketon gesättigter Ammoniumhydroxydlösung chromatographiert. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt, die auf ihre antibiotische Wirksamkeit gegen S. aureus als Prüf Organismus untersucht werden. Die Anwesenheit von Erythromycin und/oder Erythromycin B wird unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems wie oben durch chromatographische Analyse mit Filterpapier bestimmt. Dabei zeigt sich, daß die ersten 120 ecm der Auswaschflüssigkeit nur Erythromycin, die zweiten 120 ecm jedoch eine Mischung aus Erythromycin und Erythromycin B enthalten. Die folgenden aktiven Eluatfraktionen enthalten nur Erythromycin B; diese werden vereinigt und mit Chloroform ausgezogen. Der Chloroformauszug wird im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der nur aus Erythromycin B bestehende Rückstand wird mit einer Menge Hexan gewaschen und in 25 ecm Äther aufgenommen. Die ätherische Lösung wird filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Den Rückstand löst man in einer möglichst kleinen Menge warmen Acetons und läßt abkühlen, wobei sich Kristalle des Erythromycins B abscheiden.

Dieses kristalline Antibiotikum enthält (ebenso wie das Erythromycin) eine bestimmte Menge gebundenes Kristallisationslösungsmittel, Bringt man die kristalline Verbindung unter Bedingungen zur Entfernung dieses Lösungsmittels, so hat dies den Verlust des Lösungsmittels und damit der kristallinen Eigenschäften des Antibiotikums zur Folge.

Beispiel 2

Man stellt ein sterilisiertes Nährmedium her, das folgende Bestandteile enthält:

Dextrose 15 g

Sojabohnenmehl 15 g

Maisfeststoffe ...,,.,,..,.,.,.,. 5,0 g

Calciumcarbonat .,,.,,..',....,,. 2,0 g

Natriumchlorid .,,.,. 5,0 g

Wasser zur Auffüllung auf ...... 1 Liter

Das Nährmedium wird mit einer Sporensuspension geimpft, die man herstellt, indem man Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren auf einem Agarschrägnährboden züchtet und die Sporen zusammen mit einer kleinen Menge sterilen destillierten Wassers abschabt. Das in einer 2-Liter-Flasche befindliche geimpfte Nährmedium wird etwa 26 Stunden lang bei etwa 28° unter Schütteln der Flasche in einer sich hin und her bewegenden Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 5 cm und einer Geschwindigkeit von 114 vollständigen Ausschlägen in der Minute bebrütet. Das erhaltene vegetative Mycel-Wachstum wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und in etwa 1 Liter sterilem destilliertem Wasser erneut suspendiert. Der auf diese Weise hergestellte Impfstoff wird zur Impfung eines 40 Liter fassenden Gärgefäßes verwendet, das etwa 20 Liter einer sterilisierten Gärbrühe von folgender Zusammensetzung enthält:

Glykokoll 150 g

Rohrzucker 1370 g

dl-a-Alanin 17,8 g

primäres Natriumphosphat 100 g

Natriumchlorid 100 g

Magnesiumsulfat 10 g

Ferrosulfat-heptahydrat 0,4 g

Zinksulfat-heptahydrat 0,2 g

Magnesiumchlorid-tetrahydrat .... 0,032 g

Cobaltochlorid-hexahydrat 0,2 g

Wasser zur Auffüllung auf 20 Liter

Die Mischung aus anorganischen Salzen, Glykokoll und dl-a-Alanin wird zusammen sterilisiert und der p_H-Wert der Nährlösung nach der Sterilisation auf etwa 7,5 eingestellt. Der Rohrzucker wird getrennt sterilisiert und der sterilisierten Nährlösung aseptisch zugesetzt.

Nach Abkühlung der sterilisierten Nährlösung setzt man den nach dem oben beschriebenen Verfahren vegetativ hergestellten Impfstoff aseptisch zu. Der Organismus wird in der Nährlösung etwa 4 Tage lang bei einer Temperatur von etwa 28⁰ gezüchtet. Während der Wachstumszeit wird die Nährlösung gerührt und sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 Raumteilen Luft auf 1 Raumteil Flüssigkeit in der Minute hindurchgeblasen. Mikrobiologische Versuche mit S. aureus als Versuchsorganismus zeigen, daß der Gesamtgehalt an antibiotisehen Wirkstoffen in der

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Nährlösung zuletzt etwa 250 y/ccm beträgt, wovon etwa 50⁰/,, aus Erythromycin B bestellen, wie sich durch Papierchnmialograpliie und Bioautogramm beweisen laut. Die Nährlösung wird zur Entfernung des Myecls nitriert, und aus dem klaren Filtrat läßt sich nunmehr Erythromycin B gewinnen.

i'/.J der so erhaltenen filtrierten Erythromycin und Erythromycin B enthaltenden Nährlösung werden mit wäßriger Natronlauge auf einen p_ir\Vert von 9,5 eingestellt und mit etwa 0,75 1 Amylacetat ausgezogen. Der Amylacctatextrakt wird im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in etwa 250 ecm Chloroform aufgenommen, filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Nun wird ein

»5 Lösungsmittelsystcm hergestellt, indem man 20 Teile Methylisobutylketon, 20 Teile einer 0,1 molekularen Phosphat pufferlösung mit einem p_ir\Vert von 6,5 und τ Teil Aceton miteinander mischt. Läßt man diese Mischung stehen, so bildet sich ein Zweischiehtensystem, das man in eine ganz aus (ilas bestehende, 200 ecm fassende ooröhrige Craig-Gegenstrom-Extraktionsanlagc gibt. Der Verdampfungsrückstand des Chloroformextraktes wird in 10 ecm der oberen Phase gelöst und in die erste Röhre der Extraktionsanlage

as gegeben. Nun wird in üblicher Weise im Gegenstrom extrahiert. Die Fraktionen werden wieder papierchroinatographisch und mikrobiologisch unter Verwendung von S. aureus als Versuchsorganismus analysiert. Dabei zeigt sich, daß die Fraktionen Nr. 27 bis 40 nur Erythromycin B enthalten. Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum bis auf 130 ecm eingedampft. Diese Rückstandslösung wird auf io"/,, Natriumchloridgehalt aufgefüllt, von mit verdünnter Natronlauge auf p_M-Wert 9,8 eingestellt und zweimal mil je 75 ecm Chloroform ausgezogen. Die vereinigten Chloroforniextrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Den Verdampfungsrückstand löst man bei 47° in möglichst wenig Aceton auf, läßt langsam abkühlen und gewinnt kristallines Erythromycin B aus der Lösung.

Das auf diese Weise gewonnene Erythromycin B schmolz bei 190 bis 191⁰ auf der Kofler-Heizbank. Die Elementaranalyse einer drei Stunden lang bei 6o° im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrockneten Probe ergab folgende Werte: 61,54% C; 9.45 °/o^H; 2,0% N und (als Differenzwert) 28,01 % O.

Die elektromctrische Titration in 66°/_(liger wäßriger Diinethylfonnainidlösung zeigte die Anwesenheit einer titrieibai'i'ii Gruppe mit einem pK' α von 8,5 an.

Das nach den Titrationsdaten ermittelte Molekulargewicht beträgt etwa 736.

Das U.V.-Absorptionsspektrum des in absolutem Methanol gelösten Erythromycins B zeigte ein Maximum bei 286 /iii, ein Minimum bei 259//// und E₂,,,.-- 59. Eine mikrobiologische Prüfung auf S. aureus als Versuchsorganismus zeigt, daß ein Milligramm Erythromycin B die gleiche antibiotische Wirksamkeit | wie etwa 750 γ Erythromycin hat.

Das Infrarot-Absorptionsspektrum einer 6%igen Lösung von Erythromycin B in Chloroform, auf Gewichts-Volumen-Grundlage, hat zwischen 2,4// und 12// folgende unterscheidbare Absorptionsmaxima:

2,50; 3,34; 5,8o; 6,84; 7,24; 7,50; 8,04; 8,54; 8,98; 9,14; 9,48; 9,86; 10,24; 10.56; 10,96; 11,22; 11,54 ^und 11,94. In Fig. ι der Zeichnung wird diese Infrarot-Absorptionskurve durch die ausgezogene Linie dargestellt.

Stellt man gleichzeitig Chromatogramme von Erythromycin B- und Erythromycinproben unter Verwendung von ammoniakalischem, mit Methylisobutylketon gesättigtem destilliertem Wasser als Entwicklungs-Lösungsmittel auf Filterpapierstreifen her, so ist das Verhältnis der Geschwindigkeiten, mit denen sich die beiden Antibiotika bewegen, folgendes:

Rf Erythromycin B
Rf Erythromycin

0,75·

Erythromycin B ist in saurer Lösung viel beständiger als Erythromycin. Wenn man wäßrige Lösungen mit je etwa 38 Einheiten Erythromycin B und Erythromycin in Kubikzentimeter auf verschiedene p_H-Werte einstellt und jedesmal eine Stunde lang bei etwa 25⁰ stehenläßt, zeigen die Lösungen von Erythromycin B eine viel größere Beständigkeit gegenüber Säuren.

Die Säureanlagerungssalze von Erythromycin B lassen sich herstellen, indem man eine wäßrige Lösung einer Erythromycin-B-Base mit einer äquivalenten Menge einer Säure behandelt und die Lösung im Vakuum zur Trockene eindampft. Bei einer anderen Durchführungsform des Verfahrens kann man die Lösung der Erythromycin-B-Base in einem organischen Lösungsmittel mit der Säure oder deren Lösung behandeln; das Erythromycinsalz fällt dann direkt aus der Lösung aus. Bei der Herstellung von Säureanlagerungssalzen starker Säuren ist darauf zu achten, daß nicht während der Anlagerung der Säure an das Antibiotikum örtlich zu hohe Konzentrationen der Säure auftreten, da sich ein Teil des Erythromycins B zersetzen kann, wenn der p,_rWert geraume Zeit unter etwa 2 sinkt. Geeignete Erythromycin-B-Salze sind das Hydrochlorid, Sulfat, Citrat, Mandclat, Succinat, Oleat, Palmitat, Myristat, Stearat, Oxalat, Thiocyanat und Glucoheptonat. Weitere ähnliche Salze lassen sich nach den obenerwähnten Verfahren leicht herstellen. Für therapeutische Zwecke sollten die verhältnismäßig ungiftigen Salze ausgewählt werden. Das Hydrochlorid des Erythromycins B ζ. Β. wird hergestellt, indem man eine Äthanollösung der anti- no biotischen Base mit einer äquivalenten Menge wäßriger Salzsäure behandelt und die Lösung unter Abscheidung des festen Salzes im Vakuum zur Trockene eindampft. Das Salz wird durch Umkristallisation aus einer Mischung von Äthanol und Aceton gereinigt. .

Das Erythromycin B und seine Salze sind wirksame Antibiotika, die unter Berücksichtigung des erhöhten Molekulargewichts der Salze etwa dieselbe breite antibakterielle Wirksamkeit wie Erythromycin besitzen.

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur Herstellung von Erythromycin B und seinen Säureanlagerungssalzen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Erythromycin-B-erzeugenden Stamm des Streptomyccs erythreus

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   in Nährmedien bekannter Zusammensetzung unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, das Mycel aus dem die Kultur enthaltenden Medium entfernt, die gesamten antibiotischen Wirkstoffe mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren Lösungsmittel aus dem Medium extrahiert, das Lösungsmittel entfernt, das Erythromycin B von jeglichem anwesenden Erythromycin abtrennt und gegebenenfalls das Erythromycin B durch Behandlung seiner Lösung mit einer Säure in ein Säureanlagerungssalz überführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces erythreus NRRL 2338 verwendet.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen