CH328603A - Verfahren zur Herstellung von Erythromycin B - Google Patents

Description

  Verfahren zur Herstellung von     Erythromycin    B         Er,ythromyein    ist ein Antibiotikum mit  breiter antibakterieller Wirksamkeit, das  sich als wirksames therapeutisches Mittel für  die Behandlung solcher Krankheiten erwiesen  hat, die durch Mikroorganismen     verursaclit     werden; es wird durch Züchtung des     '-Nlikro-          organismus        Streptomyces        erythreus    auf     künst-          liehem    Nährboden hergestellt.

   Der Mikroorga  nismus und die für die Herstellung von     Ery-          thromycin    geeigneten Nährmedien und Gär  verfahren sind im amerikanischen Patent       Nr.    2<B>653 899</B> ausführlich beschrieben worden.  



  Es wurde nun gefunden,     dass    sieh zusam  men mit     Erythromyein    noch ein weiteres,  neues Antibiotikum herstellen     lässt.    Das neue  Antibiotikum wurde von seinen Entdeckern  als      Erythromyeln    B  bezeichnet.  



  Die vorliegende Erfindung betrifft ein  Verfahren     zur        Ilerstellung    von     Erythromy-          ein    B, das dadurch gekennzeichnet ist,     dass     man einen     Erythromycin    B erzeugenden  Stamm von     Streptomyees        erythreus,    vorzugs  weise unter     submersen        aeroben    Bedingungen,  in einem Nährmedium züchtet, das     assimilier-          bare    Kohlenhydrate, eine     Stickstoffquelle    und  anorganische Salze enthält,

       dass    man dann das       Myeel    aus dem Nährmedium entfernt, alle  entstandenen antibiotisch wirksamen Stoffe       ausdem    Medium isoliert, zweckmässig mittels  mit Wasser nicht mischbaren polaren Lösungs  mitteln und anschliessender Entfernung des    Lösungsmittels und das     Erythromycin    B vom       mitentstandenen        Erythromycin    abtrennt.

       Ery-          thromycin    B     lässt    sich von     Erythromycin    zum  Beispiel durch Verfahren abtrennen, bei  denen die verschiedenen     Lösliehkeiten    oder  die unterschiedlichen     Adsorptionseigenschal-          ten    der beiden Stoffe ausgenutzt werden, z. B.       dureli        Adsorption    und anschliessende selektive  Auswaschung oder durch     Gegenstromvertei-          lung    unter Verwendung mehrerer miteinander  nicht mischbarer Lösungsmittel in einer Ex  traktionsanlage mit einer Vielzahl von Röh  ren.  



  Die neue     stickstoffhaltige    Base     Erythro-          mycin    B besitzt folgende Eigenschaften: Bei       Titration    in einer Lösung von     DimethyMorm-          amid    in Wasser im Verhältnis 2:<B>1</B> ein     pK'o,     -von etwa<B>8,5;</B> nach den     Titrationsdaten    ein       Molekulargewicht    von etwa<B>736;

  </B> und in       Chloroformlösung    mit einer Konzentration  von etwa<B>6,0</B>     Gewichtsvolumenprozent    fol  gende unterscheidbaren     Absorptionsmaxima    in  einem     lii.frarot-Absorptionsspektrum    im Be  reich zwischen 2,4 und 12,0 u:<B>2,80;</B> 3,34;  <B>5,80; 5,90;</B> 6,84; 7,24;<B>7,50; 7,79;</B> 8,04;     8,54-,     <B>8,98;</B> 9,14; 9,48;<B>9,86;</B> 10,24;<B>10,56;</B>     10,96,';     11,22; 11,54 und 11,94.  



       Erythromycin    B besitzt einige dem     Ery-          t'hromyein    ähnliche Eigenschaften, weist<B>je-</B>  doch in seiner chemischen Struktur bestimmte  deutliche Unterschiede auf, die sich durch      Vergleich der     Infrarot-Absorptionsspektren     von     Chloroformlösungen.    der beiden Stoffe  leicht zeigen lassen (siehe     Fig.1    der Zeich  nung). Ausserdem zeichnet sich     Erythromycin     B durch eine grössere Stabilität in stark sau  ren Lösungen aus.  



  Der für das erfindungsgemässe     Verfahreh     benutzte     Aetinomycet    gehört nach der     Klas-          #sifizierung    in     Bergeys     Manual     of        Determina-          tive        Baeteriology    <B>(6.</B> Ausgabe, Seite<B>938)</B> zur  Gattung     Streptomyces    der Ordnung     Aetino-          mycetales.    Seinen morphologischen Eigen  schaften nach scheint der Organismus mit  einem von     Waksman        [Soil        Seience   <B>8,

  </B> 71-214  <B>(1919) ]</B> unter dein Namen      Aetinomyces   <B>181 </B>  beschriebenen     Actinomycet,    der später von  ihm mit     Streptomyces        erythreus    bezeichnet  wurde, nahe verwandt zu sein. Die Eigen  schaften der Kulturen des     -#on        'Waksman    be  schriebenen     und    des neuen isolierten Organis  mus nach vorliegender Erfindung weisen  einige Unterschiede auf. Das neue isolierte  Lebewesen<B>,</B> nach vorliegender Erfindung  wurde vorläufig als ein Stamm von     Strepto-          myces        erythreus    klassifiziert.

   Eine der     Kul-          turensann-nlung    des     Northern    Regional     Re-          search        Laborätory    überlassene Kultur des  Organismus erhielt dort die     Kulturennummer          NRRL   <B>2338.</B>  



  Die vorliegende Erfindung wird unter     be2          sonderer    Bezugnahme auf den     obenerwähn-          ten    Stamm     NRRL   <B>2338</B> beschrieben.

   Es     kön-          neu    jedoch auch andere     Erythromycin    B er  zeugende Stämme von     Streptomyces        eryth-          reus    verwendet werden,     z.B.    solche, die sieh  durch bekannte Isolier- lind     Stammodifizier-          verfahren,        z.B.    durch Auswahl gezüchteter  Organismen sowie Einwirkung von     Modifizie-          rungsmitteln,    wie Röntgenstrahlen,     UV-Liellt     und     dhen-dschen    Mitteln, z.

   B.     Stickstofflost,     auf die Organismen, leicht herstellen und iso  lieren lassen. Weitere     Erythromycin    B erzeu  gende Stämme sind zum Beispiel die     Strepto-          myces        erythreus-Stämme        NRRL   <B>2359, 2360</B>  und<B>2361.</B>  



  Als Nährmedium lassen sich verschiedene  Medien der angegebenen Art verwenden, da  der Organismus in der Lage ist, von verschie-    denen Energiequellen zu leben. Bestimmte  Nährmedien werden jedoch aus wirtschaft  lichen Gründen zur Erzielung höchster Aus  beuten und im Hinblick auf die Isolierung  der Antibiotika bevorzugt. Bevorzugte Kohlen  hydrate sind zum Beispiel Stärke und     Glu-          kose.    Andere     C-Quellen    sind Rohrzucker,     Dex-          trin,    Melasse.

   Zu den bevorzugten Quellen für  Stickstoff gehören Maisquellwasser, grobes  oder feines Sojabohnenmehl und in     Schlempe     enthaltene lösliche Stoffe; andere geeignete       N-Quellen    sind Casein,     Aminosäuremischun-          gen,        Peptone    (sowohl von Fleisch wie auch  von Soja herrührend). Ebenso können anor  ganische Quellen für Stickstoff, wie z. B. Ni  trate oder     Ammoniumsalze,    verwendet werden.  



  Als anorganische Salze kann man die übli  chen Natrium-, Kalium-,     Caleium-,    Phosphat-,  Chlorid-,     Suliationen    abgebenden Salze ver  wenden.  



  Wie es auch für das Wachstum anderer  Mikroorganismen erforderlich ist, werden auch       zür    Züchtung des erfindungsgemäss eingesetz  ten     Aetinomyeeten    dem Nährmedium vorteil  haft die wichtigsten Spurenelemente zugesetzt.  Derartige Spurenelemente sind aber gewöhn  lich schon als Verunreinigungen in den an  dern zugegebenen Bestandteilen des Mediums  enthalten.  



  Zur Erzielung     gü4stigsten    Wachstums und  höchster Entwicklung des     Streptomyces        eryth-          reus,    Stamm     NRRL   <B>2338,</B> wird das Nähr  medium vor der Impfung mit dem Organis  mus zweckmässig auf einen     pH-Wert    zwischen  <B>6,0</B> und<B>7,5,</B> vorzugsweise etwa<B>6,5,</B> eingestellt.

    Man hat beobachtet,     dass    das Medium wäh  rend der Wachstumszeit des Organismus und  der Herstellung der Antibiotika allmählich  alkalisch wird und eine     Alkalinität    von etwa       pH   <B>7,2</B> bis etwa<B>8,5</B> oder mehr erreichen kann,  wobei der     endgÜltige        pH-Wert    mindestens teil  weise vom     Anlangs-pH-'#Vert    des Mediums,  den im Medium anwesenden Puffersubstanzen  und der     Waehstumszeit    des Organismus ab  hängt.  



  Wie bei der Erzeugung grösserer Mengen  anderer Antibiotika bevorzugt man es auch  für die Gewinnung grosser Mengen Erythro-           inyeln    B, die Kulturen unter     submersen        aero-          ben    Bedingungen zu züchten. Zur Herstellung  begrenzter Mengen dieser Stoffe kann man  Schüttelkolben verwenden oder Oberflächen  kulturen in Flaschen züchten.

   Bei Züchtung  von     Submerskulturen    in grossen Behältern ist  es bekanntlich vorteilhaft, zum Impfen die  vegetative Form des Organismus zu verwen  den, um die Bildung des Antibiotikums zu  beschleunigen und dadurch die Anlage mög  lichst gut auszunutzen.     Deslialb    ist es     zweek-          mässig,    zuerst einen vegetativen Impfstoff des  Organismus herzustellen, indem man eine ver  hältnismässig kleine Menge Nährmedium mit  der     Sporenform    des Organismus impft und  nach Bildung des frischen aktiven Impfstof  fes diesen aseptisch in die grossen Behälter  einführt.

   Das Nährmedium, in dem der vege  tative Impfstoff hergestellt wird, kann das  gleiche wie das für die Herstellung des Anti  biotikums verwendete oder ein anderes sein.  



       Streptomyces        erythreus,    Stamm     NRRL     <B>2338,</B>     lässt    sich gut bei Temperaturen zwischen  etwa<B>25</B> und<B>370 C</B> züchten. Die höchsten Aus  beuten des Antibiotikums erhält man, wenn  man das Nährmedium auf etwa     26-3011   <B>C</B>  hält.  



  Bei der Herstellung von Antibiotika unter       submersen        aeroben    Bedingungen ist es üblich,  sterile Luft durch das Nährmedium zu blasen.  Vorzugsweise beträgt das Volumen der für  die Bildung von     Erythromycin    und     Erythro-          inye,in    B eingeleiteten Luft über<B>0,1</B> Raumteil  Luft in der Minute<B>je</B>     Ratunteil    des Nähr  mediums. Das Wachstum und die Bildung des  Antibiotikums sind noch besser, wenn minde  stens 0,4 Raumteile Luft auf<B>1</B> Raumteil des  Kulturmediums durchgeleitet werden.  



  Die Entstehungsgeschwindigkeit und die  Konzentration der     antibiotisclien    Wirkstoffe  im Nährmedium     lässt    sich während der Wachs  tumszeit des Mikroorganismus leicht verfolgen,  wenn man Proben des Mediums auf ihre anti  biotische Wirksamkeit gegenüber Organismen  prüft, von denen man weiss,     dass    sie     auf'das     Antibiotikum reagieren, z.

   B. von     Staphylo-          coccus        aureus    und     Myobacterium        tubereulosis.     Für diese Untersuchungen empfiehlt es sich,    derart vorzugehen,     dass    man Proben der Kul  tur fortschreitend immer mehr verdünnt, be  stimmte Mengen der so verdünnten Proben  einem geschmolzenen     Nähragar    zusetzt, dann  diesen     Agar    in einer     Petrischale    erstarren       lässt,    mit einer frischen Kultur des<B>S.</B>     aureus     oder M.

       tubdreulosis    impft und diejenige  stärkste Verdünnung des Nährmediums der  Kultur feststellt, bei der das Wachstum des  Organismus auf dem     Agar-Nährboden    noch  gänzlich gehemmt wird.  



  Die Bildung der Antibiotika kann auch  mittels     turbidimetrischer    Prüfung kontrolliert  werden, wie sie auch, bei der Herstellung an  derer Antibiotika durchgeführt wird.  



  Die Anwesenheit von     Erythromyein    B und       Erythromycin        lässt    sich durch     ehromatogra-          phische    Verfahren bestimmen. So löst man  etwa 0,2 bis<B>0,5 y</B> der zu untersuchenden Probe  in einer kleinen Menge eines Lösungsmittels,  z. B. in Alkohol, bringt einen Tropfen der  konzentrierten Lösung auf ein Ende eines  Streifens Filterpapier, trocknet den entstehen  den Fleck und entwickelt ihn nach dem übli  chen     papierehromatographischen    Verfahren.  



  Zu den Lösungsmitteln, die zur Entwick  lung des, Papierstreif     ens,    das heisst zum     Aus-          einanderziehen    der     Adsorptionszonen    dienen  können, gehören:<B>1 : 99</B>     (V/V)        Ammonium-          hydroxydlösung;    destilliertes, mit     Methyliso-          butylketon    gesättigtes Wasser;

   destilliertes,  mit     Methylisobutylketon    gesättigtes Wasser  mit Zusatz von 2     11/o        (V/V)        Piperidin;   <B>0,1</B> mole  kulare, mit     Methylisobutylketon    gesättigte     Bo-          ratpullerlösung    mit einem pH-Wert von<B>9,9;</B>  <B>0,15</B> n mit,     Methylisobutylketon    gesättigte Na  tronlauge;<B>0,1</B> molekulare saure     Kaliumphos-          phat-Pufferlösung    mit<B>3</B> Volumenprozent  Äthanol.

   Die     Entwicklungsdauer    ist etwa 4  bis<B>5</B> Stunden oder so lange, bis die     Lösungs-          mittelfront    das Ende des. Streifens erreicht.  Nach der Entwicklung stellt man die Lage  der     antibiotischen    Substanz auf dem Streifen  mit einem Bioautogramm fest.

   Hierbei legt  man den entwickelten     Filterpapierstreifen    auf  die Oberfläche eines etwa<B>3</B> mm dicken, in  einer grossen Glasschale befindlichen     Agar-          Nährbodens,    den man durch Impfen eines war-           men    sterilen     Agar-Nährmediums    mit     Baeillus          subtilis    hergestellt hat. Das Antibiotikum  dringt vom Papier aus in das     Agarmedium     ein.

   Nach<B>10</B> Minuten wird der Papierstreifen  entfernt, die Schale gekippt und die Lage des  Filterpapierstreifens sowie der     Lösungsmittel-          front,    und die Stelle, an der die Versuchs  lösung aufgetragen wurde, direkt aussen auf  der Unterseite der     Glassehale    vermerkt. Das       Agar-Medium    wird über Nacht bei etwa<B>371 C</B>  in umgekehrter Lage bebrütet. Das Auftreten  klarer Zonen im Medium, das heisst von Strei  fen, die frei von bakteriellem Wachstum sind,  zeigt die Lage der antibiotischen Substanz  entsprechend deren Verteilung auf dem Fil  terpapier an.

   Durch Messen der vom Anti  biotikum und vom Lösungsmittel zurückgeleg  ten Wege bestimmt man den     Ri--Wert,    das  heisst das Verhältnis der Wanderungsgeschwin  digkeit des     Antibiotiktims    zu der des Lösungs  mittels. Es wurde gefunden,     dass    sieh     Erythro-          mycin    B bei diesem Versuch weniger schnell  bewegt als     Erythromyein.    Bei Anwesenheit  einer Mischung von     Erythromycin    B und       Erythromycin    erscheinen im Bioautogramm  zwei klare Zonen;

   ist jedoch nur eine Zone  frei von Bakterienwachstum, so kann man  durch Vergleich der Lage dieser Zone mit  der Lage einer -unter genau denselben Bedin  gungen mit reinem     Erythromycin    B oder       Erythromycin    erhaltenen Zone feststellen,  welches der beiden Antibiotika vorhanden ist.

    Unter günstigen Bedingungen beträgt der     Ri-          Wert    von     Erythromycin    B etwa drei Viertel  desjenigen von     Erythromycin.        -          Fig.    2 der Zeichnung zeigt ein mit einem       Papierehromatogramm    hergestelltes     Bioauto-          gramm,        auf    dein gleichzeitig     Erythromycin    B,

         Erytliromycin    und eine Mischung aus an  nähernd gleichen Mengen     Erythromycin    und       Erythromvein    B     chromatographiert    -wurden.  Für die Entwicklung, das heisst die Zonen  trennung, benutzte man hierbei als     Löstings-          mittel        eine   <B>1</B>     %ige        wässrige        Lösung        vo        Ü        kon-          zentriertem        Anunoni-Lunhydroxyd,

      die mit     Me-          thylisohlitylketon    gesättigt war. Die     sc'hwar-          zen    Flächen bedeuten Zonen, in denen keiner  lei bakterielles Wachstum     auftrat.       Im allgemeinen ist die gesamte antibio  tische Wirksamkeit bei     subinersen        aeroben     .Kulturen innerhalb von etwa<B>2-5</B> Tagen  nach Impfung des     Nährinediums    am grössten,  bei Oberflächen- oder Schüttelkulturen erst  innerhalb von etwa<B>5-10</B> Tagen.  



  Gewöhnlich entstehen im Nährmedium an  nähernd gleiche Mengen     Erythromycin    und       Erythromycin    B; dieses Verhältnis hängt<B>je-</B>  doch von der Dauer der     Fermentationszeit    ab.       E:-ärzere    Wachstumszeiten, etwa von<B>1</B> oder 2  Tagen, begünstigen die überwiegende Bildung  von     Erythromyein    B. Eine Verlängerung der       Ferinentationszeit    führt zu -einer relativen  Verminderung der     Erythromycin-B-Menge    im  Vergleich zu der des     Erythromycins    und kann  sogar einen absoluten Rückgang der Menge  des im Nährmedium anfänglich vorhandenen       Erythromycins    B verursachen.

   Der Grund  Tür diese relative oder absolute Abnahme ist  nicht bekannt.  



  Die in der Kultur des     S.-erythreus-Stam-          mes        NRRL   <B>2338</B> entstehenden Antibiotika las  sen sich durch     Extraktions-    oder     Adsorptions-          verfahren    aus dem     Nährinediuni    isolieren.  Hierbei werden die erstgenannten Verfahren  deshalb bevorzugt, weil sie schneller und bil  liger sind. Für die Extraktion der Antibiotika  aus dem Nährmedium der Kultur werden mit  Wasser nicht mischbare, polare organische  Lösungsmittel bevorzugt, z.

   B.     Fettsäurealkyl-          ester,    wie     Äthyl-    und     Amylaeetat;    chlorierte       Kohlenwasserstoffe,    wie Chloroform und     Di-          chloräthylen;    Alkohole mit geringer Wasser  löslichkeit, wie     Butanol        und        Amylalkohol;          Ketone    mit geringer Wasserlöslichkeit, wie       Methylamylketon;

      Lind andere Verbindungen,  wie     Äthyläther    und     Dibutyläther.    Vorzugs  weise wird die filtrierte Nährbrühe vor der  Extraktion auf     einei#        pil-Wert    von etwa<B>9,5</B>  oder höher eingestellt.  



  Das     Erythromycin    B     lässt    sich leicht von,  dem     Erythromycin    unter Ausnutzung der  unterschiedlichen Löslichkeit und     Adsorp-          tionseigenschaften    der beiden Verbindungen  abtrennen.

   So wird zum Beispiel     Erythro-          mycin    B auf     Cellulose    stärker als     Erythro-    i           mycin        adsorbiert.    Deshalb erscheint bei     Ad-          sorption    einer Mischung von     Erythromyein          und        Erythromycin    B aus deren gemeinsamer  Lösung auf einer Säule aus     Cellulose    und Aus  waschung dieser Säule mit einem geeigneten  Lösungsmittel das,     Erythromyein    bereits im,  ersten Waschwasser,

   während     Erythromycin     B auf der Säule bleibt und erst bei längerem  Auswaschen gewonnen wird. Man kann die  beiden Verbindungen auch durch selektive  Extraktionsverfahren in einer Gegenstrom  anlage trennen.-    <I>Beispiel<B>1</B></I>  Eine Sporen enthaltende Kultur von       Streptomyees        erythreus,    Stamm     NRRL   <B>2338,</B>  wird hergestellt, indem man den Organismus       auf    einem     Agar-Schrägnährboden    folgender  Zusammensetzung Achtet:

           Dextrin   <B>15 g</B>       Trypton   <B>5 g</B>       Agar    20<B>g</B>       Betain        0,5   <B>g</B>  Gelöste     Mineralmischung*    2     ems     Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter         *Diese    Mineralmischung enthält folgende  Bestandteile:

           K2HP04        100,0   <B><I>g</I></B>       NaC1        100,0   <B>g</B>       M9S04        100,0   <B><I>g</I></B>       FeS04'7        H20    2,0<B>g</B>       ZnS04-7    11,0     1,0-   <B><I>g</I></B>       CUS04.5    H20<B>0,5 g</B>       MnC12'4    H,0     0,5   <B>g</B>       C0C12   <B>* 6</B>     H20   <B>0,1 g</B>       CaC12    40,0<B>g</B>  Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter.

      Der     Schrägnährboden    wird<B>10</B> Tage lang  bei<B>330 C</B> bebrütet. Man gewinnt die Sporen  in Form einer     wässrigen    Suspension, indem  man den     Schrägnährboden    mit einer kleinen  Menge sterilen destillierten Wassers bedeckt  und die Sporen vorsichtig von der Oberfläche  des Nährbodens abschabt.

      Etwa<B>1</B>     cm,%    der auf diese Weise erhaltenen       Sporensuspension    verwendet man zur Imp  fung des folgenden sterilisierten Nährmediums  unter sterilen Bedingungen:         Caseinhydrolysat   <B>1 g</B>         < N-Z-Amin   <B>A ,</B> von     Sbeffield          Farms    erhalten)        Blacksträp -Melasse    2<B>g</B>       K21-I-PO4        0,15   <B>g</B>  Wasser<B>100</B>     CM3       Das geimpfte Nährmedium -wird etwa<B>72</B>  Stunden lang bei etwa     2811   <B>C</B> bebrütet, bis  gute vegetative Entwicklung zu beobachten  ist.

   Etwa<B>5</B>     ems    des die vegetative Form des  Organismus enthaltenden Nährmediums be  nutzt man zur Impfung eines<B>250</B>     em3    lassen  den     Erlenmeyerkolbens,    der etwa<B>75</B>     em3    eines  sterilisierten     Gärmediums    folgender Zusam  mensetzung enthält:

      Rohrzucker 45<B>g</B>  Sojabohnenmehl 20<B>g</B>  Aus kondensierter     Melasse-          schlempe    gewonnene     lös-          liehe    Stoffe 2<B>g</B>       Natriumchlorid   <B>5 g</B>       Caleiumearbonat    2<B>g</B>       Cobal.tochloridhexahydrat        0,

  001   <B>g</B>  Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter    Der Kolben mit dem geimpften Nähr  medium wird in einen auf etwa<B>280 0</B> gehal  tenen Brutraum gestellt und sechs Tage lang  auf einer sich drehenden     Schüttelvorriehtung     mit einem     Schüttelhub    von etwa<B>5</B> cm und  einer Geschwindigkeit von 240 Umdrehungen  in der Minute geschüttelt. Von Zeit zu Zeit  werden Proben     des    Nährmediums auf die Ge  samtmenge der darin enthaltenen     autibioti-          sehen    Wirkstoffe untersucht. Erreicht deren  Menge einen Wert von etwa<B>250-300</B>     j/eins     der Brühe, so filtriert man diese zur Entfer  nung des     Mycels.     



  Etwa     11/9    Liter der     filtrierten    Kulturbrühe  werden mit Natronlauge auf einen pH-Wert  von<B>9,5</B> gebracht lind mit<B>0,75</B> Liter Amyl-           aeetat    ausgezogen. Der     Ainylacetatextrakt,    in  dem praktisch alle in der     ursprünglielien    Gär  brühe vorhandenen     autibiotischen    Wirkstoffe  enthalten sind, wird     duteli        Vakuumeindamp-          fung    auf ein Volumen von etwa<B>10</B> eins ein  geengt.

   Der konzentrierten     Amylacetatlösung     setzt man<B>0,5 g</B> gereinigte     Cellulosefasern    zu  und trocknet die     Misehung    über Nacht im     Va-          ku-Lun.    Die trockene, feinpulverige     Cellulose,     auf der alle antibiotischen Wirkstoffe der  Brühe absorbiert sind, wird auf die Oberseite  einer etwa<B>3,2</B> X<B>38</B> cm messenden     ehromato-          graphischen        Adsorptionssäule    gelegt,

   die etwa  <B>161 g</B> trockene gereinigte     Celluloselasern    (im  Handel -unter     derMarkenbezeichnung         Solka -          Flocken    zu haben) enthält. Es wird mit     0,1-          prozentiger,        -wässriger,    mit     Methylisobutyl-          keton    gesättigter     Ammoniumhydroxydlösung          ehromatographiert.    Das     Eluat    wird in Frak  tionen gesammelt,

   die auf ihre antibiotische  Wirksamkeit gegen<B>S.</B>     aureus    als     Prüforga-          nismus    untersucht werden. Die Anwesenheit  von     Erythroinyein        und/oder        Erythromycin,    B  wird unter Verwendung des gleichen     Lösungs-          mittelsystems    wie oben durch     ehromatogra-          phisc'he    Analyse mit Filterpapier bestimmt.

    Dabei zeigt sich,     dass    die ersten 120     em3    der       Auswaschflüssigkeit    nur     Erythromycin,    die  zweiten 120 eins jedoch eine Mischung aus       Erythromycin    und     Erythromycin    B enthal  ten. Die folgenden aktiven     Eluatfraktionen     enthalten nur     Erythromycin    B; diese werden  vereinigt und mit Chloroform ausgezogen.

   Der       Chloroformauszug    wird im Vakuum zur  Trockne eingedampft, und der nur aus     Ery-          throinycin    B bestehende Rückstand wird mit       Hexan    gewaschen und in<B>25</B>     ein3    Äther auf  genommen. Die ätherische Lösung wird fil  triert und im Vakuum zur Trockne einge  dampft. Den Rückstand löst man in einer  möglichst kleinen Menge warmen Acetons und       lässt    abkühlen, wobei sich Kristalle des     Ery-          thromycins    B abscheiden.

   Dieses kristalline  Antibiotikum enthält (ebenso wie das     Ery-          thromycin)    eine bestimmte Menge gebundenes  Lösungsmittel. Entfernt man dieses Lösungs  mittel, so hat dies den Verlust der kristallinen  Eigenschaften des Antibiotikums zur Folge.

      <B>. -</B><I>Beispiel<B>-0</B></I>  Man stellt ein sterilisiertes Nährmedium  her, das folgende Bestandteile enthält:    Dextrose     15   <B>g</B>  Sojabohnenmehl     15   <B>g</B>       Maisieststoffe,        ( cornsteep        solids )   <B>5,0 g</B>       Caleiumearbonat    2,0<B>g</B>       Natriumehlorid   <B>5,0 g</B>  Wasser zur Auffüllung auf<B>1</B> Liter    Das Nährmedium wird mit einer     Sporen-          suspension    geimpft, die man herstellt, indem  man     Streptomyces        erythreus,    Stamm     NRRL     <B>2338,

  </B> nach dem in Beispiel<B>1</B> beschriebenen  Verfahren auf einem     Agar-Schrägnälirboden     züchtet und die Sporen zusammen mit einer  kleinen Menge sterilen destillierten Wassers  abschabt. Das in einer     2-Liter-Flasche        befind-          liehe    geimpfte     Nährinedium    wird etwa<B>26</B>  Stunden lang bei etwa 280<B>C</B> unter Schütteln  der Flasche in einer sieh hin und her bewe  genden Schüttelvorrichtung mit einem Aus  schlag von<B>5</B>     ein    und einer Geschwindigkeit  von 114 vollständigen Ausschlägen in der     Mi-          nutA    bebrütet.

   Das erhaltene vegetative     Mycel     wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit  Wasser gewaschen und in etwa<B>1</B> Liter ste  rilem destilliertem Wasser erneut suspendiert.  Der auf diese Weise hergestellte Impfstoff  wird zur Impfung eines 40 Liter fassenden       Gürgefässes    verwendet, das etwa 20 Liter einer  sterilisierten Gärbrühe von folgender Zusam  mensetzung enthält:

           Glykokoll   <B>150 g</B>  Rohrzucker<B>1370<I>g</I></B>       dl-a-Alanin   <B>17,8<I>g</I></B>  Primäres     Natriumphosphat   <B>100 g</B>       Natriunichlorid        100   <B>g</B>       Magnesiumsulfat        10   <B>g</B>       Ferrosullat-heptahydrat    0,4<B><I>g</I></B>       Zinksuliat-heptahydrat    0,2<B>g</B>       Magnesiumchlorid-tetrahydrat   <B>0,032 g</B>       Cobaltochlorid-hexahydrat    0,2<B>g</B>  Wasser zur Auffüllung auf 20 Liter    Die Mischung aus anorganischen Salzen,

         Glykokoll    und     dl-a-Alanin    -wird zusammen  sterilisiert und der     pH-Wert    der Brühe nach           aer    Sterilisation auf etwa<B>7,5</B> eingestellt. Der  Rohrzucker wird getrennt sterilisiert und der  sterilisierten Brühe aseptisch zugesetzt.  



  Nach Abkühlung der sterilisierten Brühe  setzt man den nach dem oben beschriebenen  Verfahren vegetativ hergestellten Impfstoff  aseptisch zu. Der Organismus wird in der  Brühe etwa vier Tage lang bei einer Tem  peratur von etwa<B>280 C</B> gezüchtet. Während  der Wachstumszeit wird die Brühe gerührt und  sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von  etwa<B>0,5</B> Raumteilen auf<B>1</B> Raumteil Brühe  in der Minute hindurchgeblasen.

   Mikrobiolo  gische Versuche mit<B>S.</B>     aureus    als Versuchs  organismus zeigen,     dass    der Gesamtgehalt an  antibiotischen     Wirkstoffen    in der Brühe zu  letzt etwa<B>250</B>     y/ems    beträgt, wovon etwa  <B>50</B> % aus     Erythromycin    B bestehen, wie sich  durch     Papierehromatographie    und     Bioauto-          gramm    beweisen     lässt.    Die Brühe wird zur  Entfernung des     Mycels        filtriert,

      und aus dem  klaren Filtrat     lässt    sieh nunmehr     Erythromy-          ein    B gewinnen.  



  11/2 Liter der so erhaltenen filtrierten       Erythromyein    und     Eryth        r*omycin    B enthalten  den Nährbrühe werden mit     wässriger    Natron  lauge auf einen     pH7Wert    von<B>9,5</B> eingestellt  und mit etwa<B>0,75</B> Liter     Amylacetat    ausgezo  gen. Der     Amylacetat-Extrakt    wird im Va  kuum zur Trockne eingedampft. Der     Ver-          dampfungsrückstand    wird in etwa<B>250</B>     ems     Chloroform aufgenommen, filtriert und im  Vakuum zur Trockne eingedampft.

   Nun wird  ein     Lösungsmittelsystem    hergestellt, indem  man 20 Teile     Methylisobutylketon,    20 Teile  einer<B>0,1</B> molekularen     Phosphatpufferlösung     mit einem     pu-Wert    von<B>6,5</B> und<B>1</B> Teil Ace  ton miteinander mischt.     Lässt    man diese  Mischung stehen, so bildet sieh ein     Zwei-          schichtensystem,    das man in eine ganz aus  Glas bestehende, 200     cm.3    fassende     60röhrige          Craig-Gegenstroin-Extraktionsanlage    gibt.

   Der       Verdampfungsrüekstand    des     Chloroformex-          traktes    wird in<B>10</B>     em3    der obern Phase gelöst  und in die erste Röhre der Extraktionsanlage  gegeben. Nun wird in üblicher Weise im Ge  genstrom extrahiert. Die Fraktionen werden  wieder     papierehromatographisch        und    mikro-    biologisch unter Verwendung von<B>S.</B>     aure-Lis     als Versuchsorganismus analysiert. Dabei zeigt  sieh,     dass    die Fraktionen     Nr.        27-40    nur     Ery-          t,hromycin    B enthalten.

   Diese Fraktionen wer  den vereinigt und im Vakuum bis auf<B>130</B>     ems     eingedampft. Diese Rückstandslösung wird  auf<B>10</B> %     Natriumehloridgehalt    aufgefüllt, mit  verdünnter Natronlauge auf den     pH-Wert   <B>9,8</B>  eingestellt und zweimal mit<B>je 75</B>     em3    Chloro  form ausgezogen. Die vereinigten     Chloroform-          extrakte    werden über wasserfreiem Natrium  sulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne  eingedampft.

   Den     Verdampfungsrückstand     löst man bei 470<B>C</B> in möglichst wenig Aceton  auf,     lässt    langsam abkühlen und gewinnt kri  stallines     Erythromycin    B aus der Lösung.  



  Das     auf    diese Weise gewonnene     Erythro-          mycin    B schmolz bei<B>190</B> bis<B>1910 C</B> auf der       Kofler-Heizbank.    Die Elementaranalyse einer  drei Stunden lang bei     6011   <B>C</B> im Vakuum über       Phosphorpentoxyd    getrockneten Probe ergab       folgende        Werte:        61,541/o        C;        9,45%        H;

            2,0%        N        und        (als        Differenzwert)        28,01        1/o        0.     



       Die        elektrometrische        Titration        in        66%iger          wässriger        Dimethyliormamidlös-Luig    zeigte die  Anwesenheit einer     titrierbaren    Gruppe mit  einem     PK'a    von<B>8,5</B> an.  



  Das nach den     Titrationsdaten    ermittelte       Molekulargewicht    beträgt etwa<B>736.</B>  



  Das     UV-Absorptionsspektrum    des in abso  lutem Methanol gelösten     Erythromycins    B  zeigte ein Maximum bei<B>286</B>     mu,    ein Minimum  bei<B>259</B>     niu    und     E"",   <B>= 59.</B>  



  Eine     mikrobiologisehe    Prüfung mit<B>S.</B>     au-          reus    als Versuchsorganismus zeigt,     dass    ein       Milligramin        Erythromyein    B die. gleiche anti  biotische Wirksamkeit wie etwa<B>750 y</B>     Ery-          thromycin    hat.  



  Das     Infrar-ot-Absorptionsspektrum    einer       60/Gi,gen    Lösung von     Erythromycin    B in  Chloroform, auf     Gewichts-Volumen-Grund-          lage,    hat zwischen 2,4 und 12 u folgende un  terscheidbare Absorptionsmaxima:<B>2,50;</B> 3,34;  <B>5,80;</B> 6,84; 7,24;<B>7,50;</B> 8,04; 8,54;<B>8,98;</B> 9,14;  9,48;<B>9,86;</B> 10,24;<B>10,56; 10,96;</B> 11,22; 11,54  und 11,94. In     Fig.   <B>1</B> der Zeichnung wird diese       Infrarot-Absorptionskurve    durch die ausgezo  gene Linie dargestellt.

        Stellt.     man    gleichzeitig     Chromatogramme     von     Erythrömycin    B und     Erythromycin    un  ter Verwendung von     ammoniakalischem,    mit       Methylisobutylketon    gesättigtem destilliertem  Wasser als     Entwieklungs-Lösungsmittel    auf  Filterpapierstreifen her, so ist das Verhältnis  der     Geseliwindigkeiten,    mit denen sich die bei  den Antibiotika bewegen, folgendes:

    
EMI0008.0009     
         Erythromycin    B ist in saurer Lösung viel  beständiger als     Erythromycin.    Wenn man       wässrige    Lösungen mit<B>je</B> etwa<B>38</B> Einheiten       Erythronlycin    B -Lind     Erythromycin    im     ein2     auf verschiedene-     p]I-Werte    einstellt und<B>j</B>     edes-          mal    eine Stunde lang bei etwa<B>250</B>     C    stellen       lässt,

          zeigendie        Lösmigen    von     Erythromycin    B  eine viel grössere Beständigkeit gegenüber  Säuren.  



  Die     Säureanlagerungssalze    von     Erythro-          mycin    B lassen sich herstellen, indem man eine       wässrige    Lösung der     Erythromycin-B-Base    mit  einer äquivalenten Menge einer Säure behan  delt und die Lösung im Vakuum zur Trockne  eindampft.     Man    kann auch die Lösung der       Erythromycin-B-Base    in einem organischen  Lösungsmittel mit einer Säure oder deren Lö  sung behandeln; das     Erythromycinsalz    fällt  dann direkt aus der Lösung aus.

   Bei der Her  stellung von     Säureanlagerungssalzen    starker  Säuren ist darauf zu achten,     dass    nicht     wÄh-          rend    der Anlagerung der Säure an das     Anti-          biotik-Lun    örtlich zu hohe Konzentrationen der  Säure auftreten, da sieh ein Teil des     Erythro-          mycins    B zersetzen kann, wenn der pH-Wert  geraume Zeit unter etwa 2 sinkt.

   Geeignete       Erythromycin-B-Salze    sind das Hydrochlorid,         SuHat,        Citrat,        Mandelat,        Succinat,        Oleat,          Palmitat,        Myristat,        Stearat,        Oxalat,        Thio-          cyanat    und     G,1-ticoheptonat.    Weitere ähnliche  Salze lassen sich nach den     obenerwähnten     Verfahren leicht herstellen. Für therapeu  tische Zwecke sollten die verhältnismässig un  giftigen Salze ausgewählt werden.

   Das     Hydro-          chlorid    des     Erythromyeins    B zum Beispiel  wird hergestellt, indem man eine Lösung von       Erythromycin    B in     Äthanol    mit einer äqui  valenten Menge     wässriger    Salzsäure behandelt  und die Lösung unter     Abscheidung    des festen  Salzes im Vakuum zur Trockne- eindampft.  Das Salz wird durch     Umkristallisation    aus  einer Mischung von     Äthanol    und Aceton ge  reinigt.  



  Das     Erythromycin    B und seine Salze sind  wirksame Antibiotika, die unter Berücksichti  gung des erhöhten     Molekulargewichtes    der  Salze etwa dieselbe breite antibakterielle Wirk  samkeit -wie     Erythromycin    besitzen.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCI-I Verfahren zur Herstellung von Erythro- mycin B, dadurch gek ennzeiehnet, dass man einen Erythromycin B erzeugenden Stamm von Streptomyces erythreus in einem assimi- lierbare Kohlenhydrate, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthaltenden Nähr medium züchtet, dann das Mycel aus dein die Kultur enthaltenden Medium entfernt,

   die ge samten 'antibiotischen Wirkstoffe aus dein Medium isoliert und schliesslich das Erythro- mycin B vom mitentstandenen Erythromyein abtrennt. UNTERANSPRUCH Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als<B>S.</B> erythreus- Stamm <B>S.</B> erythreus NRRL <B>2338</B> verwendet.