DK141274B - Fremgangsmåde til isolering af blodkoagulationsfaktorerne. - Google Patents

Description

(11) FREMUE6GEL3ESSKRIFT 141274 DANMARK (Bi) intci.3 a 6i κ 35/1$ «(21) An*»enfngnr. 5245/74 (22) Indleveret den 18. jun. 1974 (23) Lebedeg 18. jun. Ί97-4- (44) Ansegningen fremlagt og β 1 ηΑΠ fremlaeggeleeeelcriftet offentliggjort den '^5. I8D. y DIREKTORATET FOR ^ PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begaretfra den

19· jun. 1975, 571491, US

(71) AKT IEBOLAGET KABI, Lindhagens gat an 155, S-104 25 Stockholm 50, SE.

(72) Opfinder: Lars-Olov Anderseon, Apoteksvaegen 45, S-741 00 Knivsta, SE: Håkan Gunnar Borg, Foellerstavaegen 16, S-l4l 44 Huddinge, SE: Elisabeth Charlotte Ehreriberg, FJugestagraend 19, S-124 46 Bandhagen 4, SE: Nanna Forsman, Solvaegen 9, S-175 61 Jaerfaella, SE: Gunnar Hanshoff, Tygel® vaegen 1, S-175 58 Jaerfaella, SE: Goeran Lindroos, Tavastgatan 40, S-117 24 Stockholm, SE: Maggie Miller-Andersson, Toppvaegen 45, S-175 40 Jaerfaellaj SE.

(74) Fuldmeegtig under sagens behandling:

Kontor for Industriel Eneret v. Svend Schønnlng.___ (64) Fremgangsmåde til isolering af blodkoagulationsfaktorerne.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af blodkoagulationsfaktorerne faktor I (fibrinogen), faktor VIII (antihaemofilifaktoren, forkortet AHF) og faktor IX (også kaldet B-faktoren) fra animalsk eller humant plasma.

Der er gennem årene udført omfattende arbejde for at klarlægge mekanismerne for blodets koagulering og for at isolere de komponenter der deltager deri. Den store interesse for blodets koagulering kan delvis forklares ved den rent videnskabelige interesse i systemet som sådant. Imidlertid er kendskabet til hvordan blodets koagulering findo1 sted og hvordan den kan påvirkes først og fremmest af yderste betydning fra et klinisk synspunkt.

Der foreligger stadig et antal uklare punkter med hensyn til me- 2 1Α127Λ kanismerne ved blodko agul er ingen, men der er almindelig enighed om at blodels koagulering kan beskrives som en proces hvor aktivering a£ en sporkomponent følges af påfølgende aktivering af et antal komponenter som til sidst resulterer i dannelse af en blodklump eller et koagel. En forholdsvis lille indledende virkning resulterer således i en betydelig og værdifuld sluteffekt.

Imidlertid er kun et ringe antal af de forskellige komponenter som deltager i blodet koaguleringssystem hidtil blevet isoleret i ren tilstand. Disse komponenter kaldes som regel koagulationsfaktorer, og der antages at findes tolv sådanne, der alle plejer at blive betegnet med de respektive romertal, dvs. faktor I, faktor II osv. i overensstemmelse med den nomenklatur der er fastslået af International Commission of Haemostasis and Thrombosis (Thromb. Diathes, Haemorrhag. Suppl. 13, 1964).

I forbindelse med blodkoaguleringsfaktorerne er der grund til også at nævne to andre systemer. Det ene af dem er det system af inhibitorer som regulerer blodets tendens til at koagulere og forhindre dannelsen af tromber (blodpropper). Dette system indeholder bl.a. antitrombin ill, faktor X -inhibitor og faktor XI -inhibitor. Det andet system er det som sørger for at eventuelt dannede blodpropper (tromber) opløses, og det benævnes som regel det fibrinolytiske system. Det indeholder plasmin og plasminogen som betydningsfulde komponenter.

Koagulationsfaktor I, dvs. fibrinogen, er (i) det strukturelle element som danner den gel der fremkommer ved koagulering af blod eller plasma, og (ii) et protein med molekylvægt på ca.

340.000. Koncentrationen deraf i plasma er ca. 2 mg/ml plasma. Under blodkoaguleringsprocessen dannes der et enzym, nemlig trombin, der hydrolytisk fraspalter to peptider fra fibrinogenet. Fraspalt-ningen af disse peptider fra fibrinogenet bevirker at dettes struktur ændres og efter ændringen begynder at aggregere eller polyme-risere. Denne aggregering eller polymerisering fører til dannelse af en gel, dvs. et koagel eller en blodprop.

Fibrinogen bruges klinisk til at standse visse typer blødning. Det er forholdsvis vanskeligt at fremstille fibrinogen til klinisk brug. Da fibrinogen er et forholdsvis følsomt molekyle, må fraktioneringsmetoder ved fremstilling deraf være meget skånsomme. Den største vanskelighed består i at opnå en kvalitet af fibrinogen med høj Icoagulerbarhed, der samtidig udviser god stabilitet i vandig opløsning.

3 141274

Koagulationsfaktor VIII, antihaemofilifaktoren (forkortet benævnt AHF) er et protein med en molekylvægt på’ca. 1 million.

Det er til stede i meget små mængder i blodplasma, idet den normale koncentration deraf er ca. 10 pg/ml plasma. En af' de mest kendte hereditære koagulationsdefekter er karakteriseret ved fravær af den biologisk aktive faktor VIII (AHF). Denne defekt er den klassiske hæmofili eller hæmofili A, også kaldet blødersygdom.

Kraftig hæmofili viser sig som stærkt forøget blødningstendens ved hvilken det mindste sår giver anledning til en livstruende blødning.

Denne sygdom viser sig i meget ung alder, og der kan optræde mange forskellige typer komplikationer. Det er meget almindeligt at patienterne får gentagne ledblødninger som fører til betændelser (i leddene) og i det lange løb til invaliditet. Dette bevirker at de fleste af de alvorligt angrebne hænrafili-patienter vil få alvorlige mobilitetsforstyrrelser selv i tyve års glideren hvis de ikke er blevet behandlet med præparater indeholdende AHF.

Den terapi som kan anvendes ved hæmofili, er transfusion af fuldt menneskeblod eller plasma eller endog forskellige koncentrater indeholdende AHF. De medicinske fordele ved at bruge sådanne koncentrater er indlysende. De AHF-koncentrater der for tiden er tilgængelige kan deles i to forskellige typer, nemlig for det første højkoncentrerede og for det andet lavkoncentrerede præparater. De præparater der hidtil har været mest anvendte er af den lavkoncentrerede type. Eksempler derpå er kryoprecipitater ifølge Pool (j. Pool, E. K. Hershgold og A. Pappenhagen i Nature 203 (1964) side 312) og Cohns fraktion 1-0 (beskrevet i M. Blombåck, Arkiv Kemi 12 (1958) side 387).

Begge disse lavkoncentrerede AHF-præparater indeholder betydelige mængder fibrinogen. Ulempen ved denne type præparat er at patienterne behøver indgift af forholdsvis store mængder vandig opløsning deraf ved infusion. I den senere tid er der blevet udviklet visse såkaldte højkoncentrerede AHF-præparater. Med disse kan en tilstrækkelig dosis AHF gives i vandig opløsning med et rumfang på 10-15 ml. Denne type AHF-koncentrat er væsentligt lettere at bruge end den tidligere, lavkoncentrerede type.

Klinisk synes de højkoncentrerede præparater at fungere godt, men der er også visse ulemper ved dem. Fra et isoleringsstandpunkt består en ulempe ved dem i at udbyttet af AHF-aktivi- 4 U1274 tet fra udgangsplasmaet er forholdsvis lavt. Desuden udnytter man ikke de andre proteiner, som forekommer i de fraktioner hvoraf AHF udvindes. Desuden fordrer disse metoder et udgangsmateriale af meget høj kvalitet, det betyder at blodplasmaet må være frisk eller frosset umiddelbart efter opsamlingen af blodet og den påfølgende centrifugering.

Koagulationsfaktor IX kendes også under betegnelsen B-faktor fordi én type blødersyge, nemlig hæmofili B, bevirkes af arvelig mangel på koagulationsfaktor IX. Hæmofili B viser sig ved stærkt forøget blødningstendens ved trauma og kirurgiske indgreb.

I alvorlige tilfælde kan der indtræde store subkutane og intramus-kulære hæmatomer. Ledblødninger med sekundære leddeformationer førende til invaliditet er også en forholdsvis almindelig ledsage-tilstand i forbindelse med hæmofili B. Den behandling som kan gives består af forskellige former for substitutionsterapi, dvs. transfusion af blod, plasma eller et af de faktor IX-koncentrater, der nu er tilgængelige.

Behandlingen kan være enten profylaktisk og gives over en lang periode, bl.a. for at forhindre udvikling af de foran nævnte ledbeskadigelser, eller den kan gives i forbindelse med kirurgiske operationer, tandudtrækninger og andre situationer, hvor risikoen for olødning er stor. De for tiden tilgængelige behandlingsmetoder har mange ulemper. Transfusion af blod eller plasma medfører risiko for overføring af hepatitis og i nogen grad for at bevirke immunisering. Med de koncentrater af faktor IX, der nu er tilgængelige, er der en indlysende risiko for overførelse af leverbetændelse (hepatitis).

Det er den foreliggende opfindelses formål at gøre det muligt at eliminere de foran nævnte ulemper og tilvejebringe en metode til isolering af koagulationsfaktorerne I, VIII og IX fra en og samme portion blodplasma.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør tilvejebringelse af (i) et fibrinogent produkt indeholdende 80-90% fibrinogen, (ii) et koaguleringsfaktor VIII (AHF) produkt med større renhed end et hvilket som helst kommercielt tilgængeligt AHF-pro-dulct og (ϊϋ) det reneste koagulationsfalctor b (faktor IX) produkt som endnu har foreligget.

Herved er der opnået de vigtige fordele at man i ud- 5 14127* talt grad har kunnet nedsætte den mængde væske indeholdende en hvilken som helst af disse tre koagulationsfaktorer, som skal gives til en patient, hvilket ikke alene er omkostningsbesparende, men også nedsætter ulemperne for patienten. Fx er det AHP-produkt, som fremstilles ud fra frisk plasma ved fremgangsmåden ifølge eksemplet, tilgængeligt i en koncentration på 30 AHF-enheder/ ml. Dette tillader indgift af en i høj grad effektiv dosis simpelthen som en almindelig injektion ved hjælp af en håndsprøjte, således at man ikke længere behøver en langvarig kontinuerlig infusion fra en ophængt infueiorasflasina*

Fremgangsmåden beror på at man adsorberer faktorerne fra et vandigt væskesystem til et adsorptionsmiddel som er et sul-fateret eller sulfonatgruppeholdigt tværbundet gelmatrice-dannende kulhydrat. Koagulationsfaktorerne bindes således på gelen og renses på den måde, hvorpå de elueres derfra.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i patentkravets kendetegnende del angivne.

Den mest almindelige fremgangsmåde til fremstilling af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte geler består i at man fremkalder tværbindingsprocessen ved hjælp af cyanogenbromid ved alkalisk pH-værdi.

Et eksempel tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel a) Fremstilling af tværbundet dextransulfat-agarosegel under anven-delse af "Sepharose" 4B-agarose._ 35 g cyanogenbromid opløstes i 500 ml vand hvorefter der tilsattes 30 g dextransulfat. Der tilsattes ca. 1000 ml "Sepharose" (et i Danmark Indregistreret varemærke for en perleformig agarose-gel der fremstilles ved at man lader en 4%s vandig opløsning af agarose gelere i perleform) 4B gel og 300 ml vand, og det hele sammenblandedes godt. Man lod blandingen henstå under omrøring og pH-vær-dien deraf holdtes konstant på 11 i syv minutter ved tilsætning af lud. Derefter standsedes tilsætningen af lud og man lod pH-værdien falde langsomt af sig selv. Omrøringen fortsattes i 48 timer og herefter vaskedes gelen. Den tværbundne dextransulfat-"Sepharose" 4B-gel var da klar til brug.

6 ί41274 b) Fremstilling af heparin-"Sepharose"-gel.

Heparin-"Sepharose"-gel fremstilledes ved at 100 ml vandig heparinopløsning indeholdende 5>000 ehheder/ml blandedes med 200 ml "Sepharose" 4B-gel efterfulgt af tilsætning af 4 g cyano-genbromid. pH reguleredes til 11 og holdtes på denne værdi i syv minutter, hvorefter man tillod pH-værdien at falde. Gelen henstod natten over under omrøring, vaskedes den næste dag og var så parat til brug.

c) Isolering af faktor 1, VIXX og IX fra samme udgang-*^^*-at·-tale

Dextransulfat-"Sepharose"—gel fremstilledes som under a) ovenfor, men med den forskel at målestokken øgedes til 10 liter gel.

Der fremstilledes heparin-"Sepharose"-gel som under b) ovenfor, men således at målestokken forøgedes til at give 1 liter gel.

30 kg frosset plasma optøedes, hvorefter der skete udfældning af Cohns (metode 6) fraktion I med 8% ætanol og centrifugering i en Sharpies centrifuge. Den ovenstående væske opsamledes og brugtes til fremstilling af faktor IX som beskrevet senere i nærværende eksempel. Udfældningen af fraktion I blev skåret i stykker og opløst i 9,6 liter 0,02 M citratpuffer pH 6,8. Til opløsningen sattes der 180 ml 2%s AltOH^-gel og blandingen omrør-tes i 30 minutter hvorefter gelen fjernes ved centrifugering. Til opløsningen sattes der derpå 10 liter dextransulfat-"Sepharose"-gel og blandingen omrørtes i 30 minutter. Gelen fraskiltes på et filter og det i opløsningen tilstedeværende AHF-aktive materiale udfældedes ved tilsætning af natriumcitrat ved pH 7,1.

Det udfældede materiale indeholdt 0,7 AHF-enheder/mg protein og det kunne opløses til dannelse af en opløsning indeholdende 30 AHF-enheder/ml. Udbyttet som beregnet fra AHF-indholdet i plasmaet var 34%. Fibrinogenet (faktor i) kunne vindes ved eluering af dextransulfat-"Sepharose"-gelen med 2 M NaCl.

Det vundne fibrinogen var 89% rent og udbyttet var 84%.

Faktor IX fremstilledes ud fra den ovenstående væske efter udfældning af Cohns fraktion I. Til denne opløsning (32 liter) sattes der 5 liter kvældet DEAE-"Sephadex"-gel ("Sephadex" er et i Danmark indregistreret varemærke for tværbundet dextran; DEAE står for diætylaminoætyl). Blandingen omrørtes i en time efterfulgt af fraskillelse af gelen ved dekantering. Efter vask eluere-des DEAE-"Sephadex"-gelen med 0,05 M fosfat, 1M NaCl, pH 7,0 puf- 141274 7 fer. Den vundne proteinfraktion dialyseredes mod0,03M citrat, 0,06M NaCl, pH 7,6 puffer. Til opløsningen sattes der derefter 1 liter heparin-"Sepharose"-gel under omrøring. Gelen pakkedes i en kolonne og desorberedes på følgende m&de:

Til en kolonne med et rumfang på 200 .ml pakket med den tværbundne heparin-"Sepharose"-gel og ekvlllbreret med 0,02 M tris-(hydroxymetylaminometan), 0,01 M citrat, 0,15 M NaCl-puffer (pH 8,4) førtes der 40 ml humant blodplasma. Ved eluering af denne tværbundne gel med samme puffer vaskedes den ikke-adsor-berede hoveddel af plasmaet lige igennem kolonnen. Adsorbatet på kolonnen elueredes derefter ved gradienteluering med 0,05 M citratpuffer (pH 5,0) under kontinuerlig øgning af ionstyrken ved tilsætning af 2 M NaCl.

Der vandtes en fraktion med faktor IX-aktivitet som efter dialyse og frysetørring underkastedes gelfiltrering på "Sephadex" G-200. Der vandtes herved et præparat af faktor IX som indeholdt 52 enheder/mg protein. Det samlede udbytte fra plasma var 47%.

Som kilde til blodkoaguleringsfaktoreme I, VIII og IX kan der anvendes et hvilket som helst animalsk blodplasma indeholdende disse blodkoaguleringsfaktorer; den kan stamme fra et menneske eller et hvilket som helst dyr,fx fra okse eller et andet pattedyr eller andet dyr som har disse koaguleringsfaktorer i plasmaet.

Det dextransulfat som bruges i eksemplet er i den form som det er leveret af fabrikanten (Pharmacia Fine Chemicals) , dvs. faktisk natriumdextransulfat. Det omtales almindeligvis slet .og ret dextransulfat, ikke blot af leverandøren og fabrikanten og litteratur stammende fra dem, men også i anden litteratur. Det leveres som natriumsalt fordi det har længere lagringsstabilitet i den form. Det kan bruges i forbindelse med den foreliggende opfindelse i begge former, så betegnelsen Mdextransulfat” anvendes i nærværende beskrivelse både om den fri form og om natriumsaltformen.

"Sepharose" 4B leveres ikke som tørre perler, i eksemplet· brugtes "Sepharose" i den form hvor den leveres, nemlig som en viskost flydende, men ikke fritstremmende form.

141274 8 I betegnelsen "tværbundet dextransulfat-epiklorhydrin-agarose" betyder delen "epiklorhydrin-agarose” at agarosen for sig omsattes særskilt med epiklorhydrin. Betegnelsen «tværbundet" i det længste af de to citerede udtryk betyder altså at der er tværbinding ved en særskilt tværbindingsreaktion mellem dextran-sulfatet og den epiklorhydrinbehandlede agarose.

Man kan bruge epiklorhydrin som tværbindingsmiddel i et reaktionsmedium som indeholder dextransulfat og agarose (fx "Sepharose" 4B) for at fremkalde tværbinding mellem to polysak-karidstoffer som bruges til fremstilling af en tværbundet vand-uopløselig gelmatrice til fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Tværbundet benzidin-2,2-disulfonsyre-agarose kan ved fremgangsmåden erstattes med den tilsvarende mængde tværbundet benz-idin-2,2-disulfonsyre-dextran ved udskiftning af agarose med den tilsvarende mængde dextran ved fremstillingen.

Den puffer der anvendes i eksemplet som opløsningsmiddel for det som udgangsmateriale anvendte blodplasma eller et hvilket som helst adsorbat eller precipitat kan erstattes med en hvilken som helst anden vandig pufferopløsning som er forenelig med udgangs-blodplasmaet, adsorbatet eller precipitatet og som giver den i kravet angivne pH-værdi til opløsning af det specifikke blodprodukt, adsorbat eller precipitat.

Den ikke-adsorberede del af udgangsmaterialeopløsningen kan i almindelighed udvaskes fra adsorptionsblandingen eller kolonnen med et enkelt rumfang af udgangspufferopløsningen af samme størrelse som det rumfang gel der bruges i blandingen eller kolonnen.

X eksemplet er fremgangsmåden belyst ved anvendelse af tværbundet dextransulfat-agarose, men i stedet kan anvendes et i vand uopløseligt adsorberende gelmatriceadsorptionsmiddel i form af tværbundet dextransulfat-dextran, tværbundet dextransulfat-epiklorhydrin-agarose, dextransulfat-epiklorhydrin-tværbundet agarose, tværbundet kondroitinsulfat-tværbundet heparin-agarose, tværbundet heparin, tværbundet benzidin-2,2-disulfonsyre-agarose eller tværbundet benzidin-2,2-disulfonsyre-dextran.