JPS6153226A - 単純ヘルペスサブユニツトワクチンの精製方法 - Google Patents
単純ヘルペスサブユニツトワクチンの精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明り単純ヘルペスサブユニットワクチンの精製方法
に関する。さらに詳しくは、単純ヘルペスウィルス１型
および２型に共通に存在する糖蛋白である。？Ａおよび
ｇＢ （両者は分子ｈｔは異なるが、免疫学的には全く
同一である。以下ｐＡ−Ｂと略称する）？有効成分とす
る単純ヘルペスウィルスｌ型および２型の両１１ｕ［ｔ
の予防のための単純ヘルペスサブユニットワクチンの精
製方法全提供するものである。 ウィルスによる主な感染症の殆んどが、ワクチンによる
予防接種によってコントロールが可能となったが、ヘル
ペス匡ウィルスによる感染症の予防対策は、代された大
きな問題である。初感染の場合は一投に重篤な例が多く
、とくに成人における先進国においては単純ヘルペスウ
ィルス（以下Ｈ８Ｖと略称するｌに対する免疫抗体の保
有率が低下してきており、今後問題化するのは必至であ
る。すでに一方では、一種の性病として、あるいは新生
児ヘルペス感染症として［層化している国もある。 ＩＳＶには１型と２型の２種類があり、１型は人体の主
に口唇部に、２型は主に性器部に感染するとされている
。 我が国においても、ｌ型・２型のいずれもかなり浸潤し
ていることが知られており、今後、重要なウィルス感染
症として、防造対策に取り組む必要がある。 ウィルスによる感染症の予防には、通常ワクチンの投与
が最も効果的である。しかしながら、本ウィルス感染症
の場合、）ＩＳＶの性質として注目される発癌性と潜伏
感染の問題は、ワクチン開発の障害となっている。すな
わち、通常考えられる弱毒ウィルス株全作出して生ワク
チンとする方法や、ウィルスを不活剤の添加・加熱処理
等によって不活化しワクチンとする方法では、ＩＳＶの
場合は当該ＨＳＶの感染性が消失したかどう力１全確実
に証明することけ困難であり、万一感染性を有するＩＳ
Ｖが残存していた場合、人体に重大な障害が引き起こさ
れる可能性を考慮しなければならない。もしこのような
ワクチンを接種した後、Ｈ３”／による発症がすぐには
見られなくとも、潜伏感染全惹起している懸念全否定し
てしまう訳にはいかない。すなわち、単純ヘルペスワク
チンにおいては、安全性の証明がきわめて難しいのであ
る。又、別の見地からのべれば、単純ヘルペスのように
致死率の低い感染症では、とくに副反応？なくすために
、ワクチンは高度に精製されたものであることが望まし
い。従って一般的にとりあげられるような生ワクチンや
不活化ワクチンは実用には供し難い。 従来技術 以とのような背景に基づいて、接種されたワクチンに起
因するＨＳＶ感染の恐れのないワクチン全開発するため
に・種々の検討がなされつつある。その中で実用化可能
性の糸口を示唆するものとして、単純ヘルペスのサブユ
ニットワクチンに関する報告がいくつかなされている。 Ｈ８’＃ｌ子の表面部分であるウィルスエンベロープお
よびＨ８Ｖ全培養する際の感染培養細胞の細胞膜とには
、Ｈ３Ｖ特異糖蛋白が発現し、この糖蛋白に対する抗体
がＩＳＶによる感染症の防菌抗体になり得るのではない
かと、いろいろ考えられており、之とえはライ／ｌ／
ｘ ｘ ＞ ヘｏ −フ成分２・ワクチン材料トして用
いることが試みられている。 ５ｋｉｎｎｅｒら（Ｍｅｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、工ｍ
ｍｕｎｏＬｚｅｅ、 １１９〜１ａ２（１９７ｓ＋ ）
は、ＩＳＶ−１型感染幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−
２１１全超音波処理して細胞を破壌した後、Ｎ０ｎｉｄ
ｅｔＰ−４０（ＭＰ−４０： シｘ ル化学製＋ ？
ｘＶＡｒ％ 加ｉで可溶化処理し、次にホルマリン？加
えて７２時間・４°ａで不活化処理２行った後に、２０
ｗ／ｖ％蔗糖液全用いてクッション超遠心分離にかけ、
その７ラクシヨンの一部？ワクチン材料として用いるこ
と金試みた。 ＫｕｔｉｎｏｖｌＬら（Ａｒｃｈ、 Ｖｉｒｏｌ、、
６１．１４１〜１４７（１９７９１）は、Ｈ８７−１型
感染ヒ）胎児肺細胞全浮遊液にＮｏｎ１ｄｅｔ Ｐ−４
ＣＪｋ Ｏ，５■Ａ％加えて可溶化処理し、その溶解物
から細胞の核物質やウィルスのヌクレオカプシド全各々
遠心分離除去し、ｈｉ’＃＋ワクチン材料として供試し
た。 Ｚｗｅ ｅ ｒｉｎｋら〔工ｎｆｅａｔ、工ｍｍｕｎ、
、 ３ Ｌ ２６７〜２７５（１９８１１）は、ＩＳ
Ｖ−１型感染つサギ初代腎細胞ｆ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００’ｉｌＶ／Ｖ％含むトリス−ＫＤＴＡバッファー
で可溶化処理しを後、細胞の核物質全低速遠心により分
離し、さらに高分子物質を超遠心分離により除去したｈ
ｉ＃ｔレンズ豆レクチン結合セファロース４Ｂアフィ
ニティーカラムに通し、吸着戎分全α−メチルマンノシ
ドとグルコース全含ム溶離液で溶出し、ワクチン材料と
した。 Ｂｅｒｔｌａｎｄら〔米国特許第４，３１７，８１１号
（１９８２１）は、ＨＳＶ−１型感染二’７ トＩＪ胎
児繊維芽細胞全４モルの尿素全含有するリン酸バッファ
ーによる可溶化処理にかけ、連続超遠心分離により細胞
成分全分離し、ｂ清中のウィルス成分全超音波処理およ
び６０°Ｃ・３時間加熱処理して不活化した後、デオキ
シリボヌクレアーゼによる酵素処理でウィルスＤＮＡ
Ｔｈ 分解し、次にセファロース６Ｂ−ａｉ＜よるゲル
を濾過クロマトグラフィーにかけてデオキシリボヌクレ
アーゼを除去した地の全、ウィルスエンベロープ成分と
してワクチン材料に用いた。 さらに、別の試みとしてＫｌａｔｌｎら［Ａ ｒ ａ
ｈ。 Ｖｉｒｏｌ、 、 ６８．７３〜８０（１９８１１１）
は、ＨＳＶ−１型感染アフリカミドリザル腎細胞の培養
り清？蔗糖密度勾配連続超遠心分離にかけ、ウィルス粒
子全精製取得し、このウィルス浮遊液Ｋ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００ｋ ＩＶ／Ｖ％加えて可溶化処理してウィ
ルス粒子全破壊した後、蔗糖密度勾配超遠心分離により
ＨＳＶのヌクレオカプシド部分とウィルスエンベロープ
部分？分離し、後者全ワクチン材料とした。 Ｋｉｔｃｅｓら〔工ｎｆｅｃｔ、工ｍｍ１ｎ、 、 １
６．９５５〜９６０（１９７７１）は、ＨＳＶ−１型感
染ヒト咽頭がんと皮細胞？ホモジナイザーで破壊し、遠
心分離にかけ、ウィルス粒子浮遊液と清全ホルマリンで
不活化処理し、このウィルス粒子浮遊液にドデシル硫酸
ナトリウムおよびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム
塩ｔ１ｖＶ％加えて可溶化処理２行なった。次に塩化セ
シウム全層いた超遠心分離でヌクレオカプシド全除去し
たと清を集め、さらにデオキシリボヌクレアーゼで酵素
処理し、Ｈ３Ｖ由来の核酸２含まないウィルスエンベロ
ープ成分全得、これ全ワクチン材料に供試した。 ０ａｐｐｅｌら（Ａｒｃｈ、 Ｖｉｒｏｌ、 、 ６５
．１５〜２３（１９８０１）は、ＨＳＶ−１型感染ニア
） ＩＪ胎児繊維芽細胞全超音波処理および凍結・融
解のくり返し操作により破壊し、低速遠心分離および超
遠心分離によりウィルス粒子全粗精製し、さらに蔗糖密
度超遠心分離２２回くり返して精製ウィルス粒子全行、
これにＩ Ｖ／Ｖ％Ｎｏｎ１ｄｅｔ Ｐ−４０による可
溶化処理全角えた後、蔗糖液クッション超遠心分離にか
けウィルスエンベロープ成分ｔ−集め、ワクチン材料と
すること全試みた。 以とはいずれもＨＳＶ−１型についての報告であるが、
２３ＭについてはＨｌｌｌｅｍａｎら〔Ｔｈｅ Ｈｕｍ
ａｎ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓｅｓ 、 ５０３〜
５０９、ｂｙ Ｎａｈｍｉａｓ、Ａ、：ｆ、ｅｔａｌ
、Ｋ１５ｅｖｉｅｒ。 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 （１９８１１） ＬｆｉＨＳ Ｖ
−２型感染ニワトリ胎児繊維芽細胞ｆ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００で可溶化処理し、次にデオキシリボヌクレ
アーゼで酵素処理したもの全レクチンアフイニ゛ティク
ロマトグラフィーおよびセファロ−スゲ＃濾過処理によ
り、ウィルスエンベロープ部分？集め、これ全アルミニ
ウムゲル処理してサブユニットワクチンとした。 いずれの報告もワクチン材料としてウィルスエンベロー
プ部分全部分精製したものであり、免疫原性全高めるた
め水酸化アルミニウムゲル処理が行なわれている。そし
て、マウスなどの動物実験により、ウィルスエンベロー
プ部分の有効性が確かめられているが、これらのワクチ
ン材料の分取・精製工程は煩雑である丘に、精製度が不
充分であり、培養細胞成分の混入はさけられない。 前述したようにＨＳＶに対するワクチンは、いかなる副
作用全も避けるために、高度に精製されたものであるこ
とが要件である。これまでに報告されているワクチン標
品け、ソノ技術内容全検討すれば、感染細胞あるいけウ
ィルス粒子から抽出したものであっても、いずれも宿主
由来の蛋白全かなり含んでいることが思料される。すな
わちこれらの公知技術ニヨルワクチン標品は、とくにワ
クチンとしての安全性の面から人体用のＨ３Ｖサブユニ
ットワクチンとして受は入れ難い問題点Ｐ含んでいるこ
とが明らかである。 その後、Ｅｂａｒｌｆｌら〔Ｊ、 Ｖｉｒａｌ、 ３６
．６６５〜６７５（１９８０））けＨ３Ｖ感染ヒト咽頭
カンと皮！ａｍｔ１％デオキシコール酸および１％Ｔｗ
ｅｅｎ ４０による可溶化処理全行って、これ全数回の
分取用ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動及びドデシルＷｆ、ｆａナトリウムーヒドロ
キシアパタイトカラムクロマトグラフィーの組合せによ
り、サブユニットｔＡおよびｐＢＱ精製し、このｔＡｌ
ｌＢに対する抗血清を作製している。この抗血清は精製
Ｈ８Ｖ−１粒子に対し、中和活性全有している。この際
％ Ｅｂｅｒｌｅらは抗ｔＡ血清、抗ｐＢ血清がたがい
にｆＢ、ｆＡとも反応？生ずることから、１Ｐ１．ｆｊ
Ｂは同一でＩ／ｉないカ２非常に類似した抗原決定部位
？有し、ざらに構成蛋白成分は同一で糖質との結合の度
合が異っていると想定している。 発明の目的 ＨＳＶに対するサブユニットワクチンとして用いられる
ワクチン材料は、ＨＳＶ−１型および２型の両者に対し
てひとしく抗原性を有しているものであれば、もつとも
好ましく、この抗原性も単にこれらウィルスに対する中
和抗体の産生能のみでは不充分であって、完全に１（３
７感染全防御するにたるものでなくてはならない。また
すでに述べた様にワクチンとして製品化する場合には、
安全性と有効性がすぐれ、ワクチン製剤としての保存安
定性を充分に具備したものであることが肝要である。こ
れらの要Ｐ＃全勘案すれば、）ＩＳＶに対するワクチン
は、まずワクチン材料としては、成分的に特定しつる一
定の精製標品であることが望ましく、かつＨＳＶ−１型
および２型双方に対して効能全盲するワクチンであるこ
とか、実用とからも所望されるのである。 本発明は、このような見地からなされたものであって、
ＨＳＶのエンベロープＴｈ構＋ｆｆ１ｆるサブユニット
ポリペブタイドのうち、ＨＳＶ−１，ＨＳｖ−２に共通
のポリペブタイドであるｔＡ及びｇＢが完全にＨＳＶの
感染全防菌し、免疫効果音もつものであることを発見し
ｔことに基き、さらにこのｙＡ及びｆＢを高度に分離精
製する工業的手段全見出し、本発明？完成した。すなわ
ち、本発明は、単純ヘルペス１型、２型に対する安全、
有効かつ安定ナサブユニットワクチンの精製力Ｂ ＋
提供するものである。 発明の構成及び効果 ｖｈ ｉ ＨＳ Ｖ （以下Ｈ５Ｖ−１型および２型全
意味する）感染培養細胞等からＨＳＶに共通な糖蛋白で
ある。ｐＡ−Ｂ全有効成分とする単純ヘルペスユニット
ワクチンの精製方法について説明する。先ずＨ３Ｖ感染
培養細胞、もしくけその培養細胞から部分精製されたＨ
８ｖ粒子、あるいはＨ８Ｖ特異サブユニット糖蛋白含有
体全界面活性剤によって可溶化する。ここで得られたＨ
８Ｖ特異サブユニット糖蛋白溶解液全、界面活性剤の存
在下で単クローン抗体全リガンドとするアフィニティー
クロマトグラフィーにかける。かくして高度に精製され
た、ＨＳＶに共通な糖蛋白であるｐＡ−Ｂ全有効成分と
する単純ヘルペスサブユニットワクチンが精製される。 本発明において用いられるＨ８Ｖ特異サブユニット糖蛋
白含有体として嚇、Ｈ３Ｖ粒子のほか、公知の方法によ
りＨ８Ｖｆ感染せしめて培養した動物ｍ胞Ｔｔ用いるこ
とカｉできる。 すなわち、ＨＳＶに感染した細胞中には、ＨＳＶが増殖
し存在するほか、細胞膜ＥＫＨ８ｖ特異サブユニット糖
蛋白が発現しており、これらはいずれも本発明における
ワクチンの原材料となり得る。 また、遺伝子組み換え技術全利用したＨ３Ｖ１１Ａ−Ｂ
ｔ−産生する組み換え培養体？利用することもできる。 Ｈ８Ｖの宿主域は広く、自然宿主は人であるが、サル、
ウサギ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、発
育鶏卵などに感染増殖する。動物細胞としてはこのよう
にＨ８Ｖに感受性？有する動物由来のものが、広く使用
しつる。例えば、幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１
１、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏｌ、ヒト胎児
肝細胞（ＨＥＬ １％ヒト咽頭ガンＥ皮細胞（Ｈｏｐ−
２１％ウサギ初代腎細胞（ＰＲＫＩ、ニワ） ＩＪ胎児
繊維芽細胞など？挙げることができる。 ｙＡ −Ｈの取得にさいし、要すれば、出発材料の処理
法とし℃、Ｈ３Ｖ感染培養細胞の培養り清、あるいは培
養細胞全ホモジナイザー、や超音波処理等の適当な手段
で破砕して得られるＨ３Ｖ含有体から遠心分離などの方
法忙より細胞片などの粗大不溶物全除去し、Ｈ８Ｖ粒子
全取得精製した浮溶液全用いることもできる。 可溶化処理に用いられる界面活性剤は、ドデシル硫酸ナ
トリウム・デオキシコール酸ナトリウム等のアニオン系
界面活性剤あるいはＴｒｉｔｏｎ、 Ｎｏｎ１ｄｅｔ、
Ｔｗｅｅｎなどの非イオン系界面活性剤の中から選ば
れるが、好ましくは非イオン系界面活性剤の添加量は、
通常０．１〜１０ｖ／ｖ％であり、好ましくはｏ、ｓ
〜２．ＯＶ／Ｖ％である。 可溶化処理は、Ｈ８Ｖ粒子あるいはＨ３Ｖ特異サブユニ
ット糖蛋白含有体の浮遊液に所要量の界面活性剤？加え
て０°０Ｔ−２５°Ｃで、２４時間静置もしくは攪拌す
ることによって容易達成される。 この処理工程によって、可溶化抽出された糖蛋白は、界
面活性剤が存在しない条件下では再結合するので、アニ
オン界面活性剤または非イオン性界面活性剤の存在して
いる条件で、ポリサッカライド硫酸エステルゲル全用い
たアフイニテイクロマトグラフイー処理とゲル濾過全実
施する。あるいは、Ｈ８Ｖ糖蛋白＃Ａ −Ｂに対する単
クローン抗体全リガンドとするアフィニティークロマト
グラフィーにかけて、各種の糖蛋白の中から目的とする
？Ａ・Ｂ全分離取得することもできる。 本発明におけるポリサッカライド硫酸エステル全用いる
アフイニテイクロマトグラフイートハ、ヘパリンセファ
ロース（ファルマシア社製）、架橋デキストランゲルで
あるセファロース、セファデックス（ファルマシア社製
）やセルロースゲルであるセルロファインＧＯ−１５（
チッソ社製）等のポリサッカライドゲルを、たとえばピ
リジンの存在下クロルスルホン酸と反応させる等の方法
によって硫酸エステル化して得られるゲル全円いる。こ
のゲルは群特異性７フイニテイー全有し、Ｈ８Ｖ−１及
びＨ３Ｖ−２に共通の特異サブユニット９に、ｙＢに対
し吸着能全有し、βす１Ｔｆｉ 白’ｆＦ ’４ ｋ吸
着しない特質全方する。このアフィニティークロマトグ
ラフィーの方法はポリサッカライド硫酸エステル全充填
したカラムに、可溶性に用いたと同じ群の中から選ばれ
る界面活性剤２ｏ、ｏｓ〜２．０％好ましくけ０．１〜
０．５％程度含有させたｐＨ５〜８程度でイオン強度０
．００１〜１．０程度である適当な緩唾液（たとえば０
．１Ｍ食塩を含む０．０１ＭＩＪン酸緩箔液（ｐＨ７，
２１等）全通液して平衡化させる。続いて可溶化処理全
して得られたＨ８Ｖの特異サブユニットｇリペブタイド
溶ＩＮｉにＬ記ＪＪ＆ｉ液全加えて蛋白質濃度１００ｒ
ｒＬｔ／ｒｒＬ１以下に調整したサンプル全カラムに通
液し吸着操作２行なう。吸着終了後、前記界顛活性剤緩
衝液全通液サンプルの５〜１０倍量通液しカラム全洗浄
する。つぎに平衡化に用いたものよりイオン強度が高い
界面活性剤含有緩割液（たとえば０．６Ｍ食塩？含む０
．０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液に界面活性剤全顎えた液）
全通液し溶出操作全行なう。溶出液は７ラクシヨンに分
取しｇＡ１ｔＢ全含有するフラクション全集めて回収す
る。 回収した７ラクシヨンは次工程のゲル？濾過に用いる緩
術液如透析して、ゲル濾過用サンプルとして調製する。 ゲル濾過は前記ポリサッカライド硫酸エステルゲル全用
いたアフイニテイクロマトグラフイーにおいて用いる平
衡化緩唾液と同じく、界面活性側音０゜０５〜２．０％
好ましくけ０．１〜０．５％程度含有させたｐＨ５〜８
、イオン強度０Ｊ）０１〜１．０程度の緩唾液全用いて
行なうが、前記アフィニティークロマトグラフィーにお
いて用い友平衡化緩唾液と同一組成の緩唾液全用いれば
好都合である。 ゲル？Ｊ’ ｉｌ剤はセルロース、アガロース、架橋デ
キストランなどの高分子多糖類顆粒あるいは架橋ポリア
クリルアミドであり、商品としてはセフアリルＢ、セフ
ァデックス、セファロース（以しファルマシア社製）、
バイオゲルＰ（バイオラッド社製）、セルロファイン（
チッソ社製）などが例示されるが、分子ふるい作用全盲
する坦体であればこれらに限定されない。 ゲル濾過の結果、分子量が約１３０，０００、約９５，
０００．約ｓｏ、ｏｏｏその池の成分からなる両分が得
られるが、これらのうち分子量約９０．０００〜１００
，０００から成る成分？分画する。 このようにして得られた画分には、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミド電気泳動分析において、単ク
ローン抗体をリガンドとするアフイニテイクロマトグラ
フイーによって得られるｐＡ、ｐＢ成分とほぼ同一の品
質であり、抗ｙＡ−Ｂ単−クローン抗体感作ヒツジ赤血
球に対し凝集反応音生ずる。 この画分は適当な濃度になるように濃縮し、Ｔｗｅｅｎ
８０． Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−Ｚｏｏ 等の非イオン
界面活性剤のうち少くともその１種ｉ０．０１〜０．１
％、好ましくは０．０２〜０．０５％含有する中性付近
の生理的に等張な緩衝液に透析し、ワクチン原液となし
、ワクチン製剤化に供する。 本発明の方法により調製されたｙＡ−’Ｂは、ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で分析し
た結果においても、また免疫電気泳動分析全行なった所
見においても、不純物の存在がすべて否定された。 かくして精製されたワクチンはワクチン投与後の抗体産
生全高めるため、免疫アジュバントとしてたとえばアル
ミニウムゲル全力口えて製剤化してもよい。更に吸着し
たアルミニウムゲルｍｆｌＡ液にチメロサールなどの防
腐剤２ ｏ、ｏ ｏ ｓ〜０．ＩＷハ］程度添加してア
ルミニウムゲル添加ワクチンとしてもよく、また凍結乾
燥製剤としてもよい。 かくして精製復製剤されたワクチンは、力価の低下がな
く、きわめてその保存性がよく、使用時の溶解性が速や
かですぐれた単純ヘルペスサブユニットワクチンの製剤
カ得られる。 つぎに参考例および実施例全学げて本発明全具体的に説
明する。 参考例１ 単クローン抗体の調製：Ｈ８Ｖ−１型ＫＯ８株の感染Ｖ
ｅｒｏ細胞全細胞全感染後２ロｐＨ７．２〜７．４）で
４°０１時間可溶化処理し、１ ０ ０、０ ０ ０
Ｇで１時間超遠心後、Ｌ清全分取し、粗製糖蛋白画分？
得た。このＱ，１ｍｌ （蛋白量１ ０ ０ｒｎｇ／ｍ
Ｊ− １ ｆ Ｂａ１ｂ１０マウス（４退会♀）後肢掌
皮内に接種し免疫全行なった。免疫１ケ月後マウスのＮ
Ｙ摘出し、細切してＥａｇｌｅＭＥＮ培地全加えて免疫
牌細胞浮遊液全得た。 次に１×１０８個の免疫肺細胞と別に用意したｌＸ１０
７個のＰ３Ｕ１細胞全シャーレに入れポリエチレングリ
フール４，０００）用いて３７°０５分間融合し．ＨＡ
Ｔ培地でハイプリドーマを選択した（ Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｅｄ。 ｂｙ Ｋｅｎｎｅｔｔ ａｔ ａｌ， ２ｎｄ． Ｅｄ
． ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ３
６３〜４１９（１９８１ １ ］。 この中からさらに酵素抗体法？用いて１ＩＡ−Ｂに対す
る抗体産生ハイブリドーマ全選択し、こｆｉｉ ２，
６， ｔｏ， １４−テトラメチルペンタデカン（Ａｌ
ｄｒ．ｉｃｈ Ｏｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ｌで処理し
たＢ ａ ｌ ｂ １０雌マウス（４週令）の腹腔に移
植した。移植後７〜１４日目に腹水？採取しｇＡ・Ｂに
対する単クローン抗体（ ｔ 、Ｇｆｉｌ １ ０ｍｇ
／ｍＡ ）全量た。 参考例２ ■ Ｏ０Ｃ以下の温度にてピリジン２００ｍＬにクロル
スルホン酸１１ ？ｙＬＬ ｌ”滴下し一混合する。滴
下終了後混液を加熱し、６５〜７０°０に昇温する。こ
の中に架橋アガロースゲルであるセファロース０Ｌ−６
Ｂ（７アルマシア社［１のピリジン包含体３０ｍＪ−に
加え、６５〜７０°Ｃにて４時間反応させる。反応終了
後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液全顎えて中和する
。 ゲル全濾過分離し、０．０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝食塩液
で充分に洗浄して架橋アガロース硫酸エステル２３ ｍ
−’ ｋ得る０ ■ 前記のと同様にして調製したピリジン−クロルスル
ホン酸混液２１０？Ｎ−’の中に、エピクロルヒドリン
架橋デキストランであるセファテックスＧ−５０（７ア
ルマシア社１１１Ｊ１７．５ｇＴｔ加え、攪拌下６５〜
７０°σにて４時間保持する。反応終了後、冷却し、水
酸化す） ＩＪウム水溶液全加えて中和する。ゲルｒ
ｆ濾過分離し、０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝食塩液で充分に
洗浄して架橋デキストラン硫酸エステル全得る。 ■ 前記■と同様にして調製したピリジン−クロルスル
ホン酸混？＆ ２ ｔ ｏ ｔｒｄに、架橋セルロース
ゲルであるセルロファインＧＯＬ−２５
に関する。さらに詳しくは、単純ヘルペスウィルス１型
および２型に共通に存在する糖蛋白である。？Ａおよび
ｇＢ （両者は分子ｈｔは異なるが、免疫学的には全く
同一である。以下ｐＡ−Ｂと略称する）？有効成分とす
る単純ヘルペスウィルスｌ型および２型の両１１ｕ［ｔ
の予防のための単純ヘルペスサブユニットワクチンの精
製方法全提供するものである。 ウィルスによる主な感染症の殆んどが、ワクチンによる
予防接種によってコントロールが可能となったが、ヘル
ペス匡ウィルスによる感染症の予防対策は、代された大
きな問題である。初感染の場合は一投に重篤な例が多く
、とくに成人における先進国においては単純ヘルペスウ
ィルス（以下Ｈ８Ｖと略称するｌに対する免疫抗体の保
有率が低下してきており、今後問題化するのは必至であ
る。すでに一方では、一種の性病として、あるいは新生
児ヘルペス感染症として［層化している国もある。 ＩＳＶには１型と２型の２種類があり、１型は人体の主
に口唇部に、２型は主に性器部に感染するとされている
。 我が国においても、ｌ型・２型のいずれもかなり浸潤し
ていることが知られており、今後、重要なウィルス感染
症として、防造対策に取り組む必要がある。 ウィルスによる感染症の予防には、通常ワクチンの投与
が最も効果的である。しかしながら、本ウィルス感染症
の場合、）ＩＳＶの性質として注目される発癌性と潜伏
感染の問題は、ワクチン開発の障害となっている。すな
わち、通常考えられる弱毒ウィルス株全作出して生ワク
チンとする方法や、ウィルスを不活剤の添加・加熱処理
等によって不活化しワクチンとする方法では、ＩＳＶの
場合は当該ＨＳＶの感染性が消失したかどう力１全確実
に証明することけ困難であり、万一感染性を有するＩＳ
Ｖが残存していた場合、人体に重大な障害が引き起こさ
れる可能性を考慮しなければならない。もしこのような
ワクチンを接種した後、Ｈ３”／による発症がすぐには
見られなくとも、潜伏感染全惹起している懸念全否定し
てしまう訳にはいかない。すなわち、単純ヘルペスワク
チンにおいては、安全性の証明がきわめて難しいのであ
る。又、別の見地からのべれば、単純ヘルペスのように
致死率の低い感染症では、とくに副反応？なくすために
、ワクチンは高度に精製されたものであることが望まし
い。従って一般的にとりあげられるような生ワクチンや
不活化ワクチンは実用には供し難い。 従来技術 以とのような背景に基づいて、接種されたワクチンに起
因するＨＳＶ感染の恐れのないワクチン全開発するため
に・種々の検討がなされつつある。その中で実用化可能
性の糸口を示唆するものとして、単純ヘルペスのサブユ
ニットワクチンに関する報告がいくつかなされている。 Ｈ８’＃ｌ子の表面部分であるウィルスエンベロープお
よびＨ８Ｖ全培養する際の感染培養細胞の細胞膜とには
、Ｈ３Ｖ特異糖蛋白が発現し、この糖蛋白に対する抗体
がＩＳＶによる感染症の防菌抗体になり得るのではない
かと、いろいろ考えられており、之とえはライ／ｌ／
ｘ ｘ ＞ ヘｏ −フ成分２・ワクチン材料トして用
いることが試みられている。 ５ｋｉｎｎｅｒら（Ｍｅｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、工ｍ
ｍｕｎｏＬｚｅｅ、 １１９〜１ａ２（１９７ｓ＋ ）
は、ＩＳＶ−１型感染幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−
２１１全超音波処理して細胞を破壌した後、Ｎ０ｎｉｄ
ｅｔＰ−４０（ＭＰ−４０： シｘ ル化学製＋ ？
ｘＶＡｒ％ 加ｉで可溶化処理し、次にホルマリン？加
えて７２時間・４°ａで不活化処理２行った後に、２０
ｗ／ｖ％蔗糖液全用いてクッション超遠心分離にかけ、
その７ラクシヨンの一部？ワクチン材料として用いるこ
と金試みた。 ＫｕｔｉｎｏｖｌＬら（Ａｒｃｈ、 Ｖｉｒｏｌ、、
６１．１４１〜１４７（１９７９１）は、Ｈ８７−１型
感染ヒ）胎児肺細胞全浮遊液にＮｏｎ１ｄｅｔ Ｐ−４
ＣＪｋ Ｏ，５■Ａ％加えて可溶化処理し、その溶解物
から細胞の核物質やウィルスのヌクレオカプシド全各々
遠心分離除去し、ｈｉ’＃＋ワクチン材料として供試し
た。 Ｚｗｅ ｅ ｒｉｎｋら〔工ｎｆｅａｔ、工ｍｍｕｎ、
、 ３ Ｌ ２６７〜２７５（１９８１１）は、ＩＳ
Ｖ−１型感染つサギ初代腎細胞ｆ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００’ｉｌＶ／Ｖ％含むトリス−ＫＤＴＡバッファー
で可溶化処理しを後、細胞の核物質全低速遠心により分
離し、さらに高分子物質を超遠心分離により除去したｈ
ｉ＃ｔレンズ豆レクチン結合セファロース４Ｂアフィ
ニティーカラムに通し、吸着戎分全α−メチルマンノシ
ドとグルコース全含ム溶離液で溶出し、ワクチン材料と
した。 Ｂｅｒｔｌａｎｄら〔米国特許第４，３１７，８１１号
（１９８２１）は、ＨＳＶ−１型感染二’７ トＩＪ胎
児繊維芽細胞全４モルの尿素全含有するリン酸バッファ
ーによる可溶化処理にかけ、連続超遠心分離により細胞
成分全分離し、ｂ清中のウィルス成分全超音波処理およ
び６０°Ｃ・３時間加熱処理して不活化した後、デオキ
シリボヌクレアーゼによる酵素処理でウィルスＤＮＡ
Ｔｈ 分解し、次にセファロース６Ｂ−ａｉ＜よるゲル
を濾過クロマトグラフィーにかけてデオキシリボヌクレ
アーゼを除去した地の全、ウィルスエンベロープ成分と
してワクチン材料に用いた。 さらに、別の試みとしてＫｌａｔｌｎら［Ａ ｒ ａ
ｈ。 Ｖｉｒｏｌ、 、 ６８．７３〜８０（１９８１１１）
は、ＨＳＶ−１型感染アフリカミドリザル腎細胞の培養
り清？蔗糖密度勾配連続超遠心分離にかけ、ウィルス粒
子全精製取得し、このウィルス浮遊液Ｋ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００ｋ ＩＶ／Ｖ％加えて可溶化処理してウィ
ルス粒子全破壊した後、蔗糖密度勾配超遠心分離により
ＨＳＶのヌクレオカプシド部分とウィルスエンベロープ
部分？分離し、後者全ワクチン材料とした。 Ｋｉｔｃｅｓら〔工ｎｆｅｃｔ、工ｍｍ１ｎ、 、 １
６．９５５〜９６０（１９７７１）は、ＨＳＶ−１型感
染ヒト咽頭がんと皮細胞？ホモジナイザーで破壊し、遠
心分離にかけ、ウィルス粒子浮遊液と清全ホルマリンで
不活化処理し、このウィルス粒子浮遊液にドデシル硫酸
ナトリウムおよびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム
塩ｔ１ｖＶ％加えて可溶化処理２行なった。次に塩化セ
シウム全層いた超遠心分離でヌクレオカプシド全除去し
たと清を集め、さらにデオキシリボヌクレアーゼで酵素
処理し、Ｈ３Ｖ由来の核酸２含まないウィルスエンベロ
ープ成分全得、これ全ワクチン材料に供試した。 ０ａｐｐｅｌら（Ａｒｃｈ、 Ｖｉｒｏｌ、 、 ６５
．１５〜２３（１９８０１）は、ＨＳＶ−１型感染ニア
） ＩＪ胎児繊維芽細胞全超音波処理および凍結・融
解のくり返し操作により破壊し、低速遠心分離および超
遠心分離によりウィルス粒子全粗精製し、さらに蔗糖密
度超遠心分離２２回くり返して精製ウィルス粒子全行、
これにＩ Ｖ／Ｖ％Ｎｏｎ１ｄｅｔ Ｐ−４０による可
溶化処理全角えた後、蔗糖液クッション超遠心分離にか
けウィルスエンベロープ成分ｔ−集め、ワクチン材料と
すること全試みた。 以とはいずれもＨＳＶ−１型についての報告であるが、
２３ＭについてはＨｌｌｌｅｍａｎら〔Ｔｈｅ Ｈｕｍ
ａｎ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓｅｓ 、 ５０３〜
５０９、ｂｙ Ｎａｈｍｉａｓ、Ａ、：ｆ、ｅｔａｌ
、Ｋ１５ｅｖｉｅｒ。 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 （１９８１１） ＬｆｉＨＳ Ｖ
−２型感染ニワトリ胎児繊維芽細胞ｆ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００で可溶化処理し、次にデオキシリボヌクレ
アーゼで酵素処理したもの全レクチンアフイニ゛ティク
ロマトグラフィーおよびセファロ−スゲ＃濾過処理によ
り、ウィルスエンベロープ部分？集め、これ全アルミニ
ウムゲル処理してサブユニットワクチンとした。 いずれの報告もワクチン材料としてウィルスエンベロー
プ部分全部分精製したものであり、免疫原性全高めるた
め水酸化アルミニウムゲル処理が行なわれている。そし
て、マウスなどの動物実験により、ウィルスエンベロー
プ部分の有効性が確かめられているが、これらのワクチ
ン材料の分取・精製工程は煩雑である丘に、精製度が不
充分であり、培養細胞成分の混入はさけられない。 前述したようにＨＳＶに対するワクチンは、いかなる副
作用全も避けるために、高度に精製されたものであるこ
とが要件である。これまでに報告されているワクチン標
品け、ソノ技術内容全検討すれば、感染細胞あるいけウ
ィルス粒子から抽出したものであっても、いずれも宿主
由来の蛋白全かなり含んでいることが思料される。すな
わちこれらの公知技術ニヨルワクチン標品は、とくにワ
クチンとしての安全性の面から人体用のＨ３Ｖサブユニ
ットワクチンとして受は入れ難い問題点Ｐ含んでいるこ
とが明らかである。 その後、Ｅｂａｒｌｆｌら〔Ｊ、 Ｖｉｒａｌ、 ３６
．６６５〜６７５（１９８０））けＨ３Ｖ感染ヒト咽頭
カンと皮！ａｍｔ１％デオキシコール酸および１％Ｔｗ
ｅｅｎ ４０による可溶化処理全行って、これ全数回の
分取用ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動及びドデシルＷｆ、ｆａナトリウムーヒドロ
キシアパタイトカラムクロマトグラフィーの組合せによ
り、サブユニットｔＡおよびｐＢＱ精製し、このｔＡｌ
ｌＢに対する抗血清を作製している。この抗血清は精製
Ｈ８Ｖ−１粒子に対し、中和活性全有している。この際
％ Ｅｂｅｒｌｅらは抗ｔＡ血清、抗ｐＢ血清がたがい
にｆＢ、ｆＡとも反応？生ずることから、１Ｐ１．ｆｊ
Ｂは同一でＩ／ｉないカ２非常に類似した抗原決定部位
？有し、ざらに構成蛋白成分は同一で糖質との結合の度
合が異っていると想定している。 発明の目的 ＨＳＶに対するサブユニットワクチンとして用いられる
ワクチン材料は、ＨＳＶ−１型および２型の両者に対し
てひとしく抗原性を有しているものであれば、もつとも
好ましく、この抗原性も単にこれらウィルスに対する中
和抗体の産生能のみでは不充分であって、完全に１（３
７感染全防御するにたるものでなくてはならない。また
すでに述べた様にワクチンとして製品化する場合には、
安全性と有効性がすぐれ、ワクチン製剤としての保存安
定性を充分に具備したものであることが肝要である。こ
れらの要Ｐ＃全勘案すれば、）ＩＳＶに対するワクチン
は、まずワクチン材料としては、成分的に特定しつる一
定の精製標品であることが望ましく、かつＨＳＶ−１型
および２型双方に対して効能全盲するワクチンであるこ
とか、実用とからも所望されるのである。 本発明は、このような見地からなされたものであって、
ＨＳＶのエンベロープＴｈ構＋ｆｆ１ｆるサブユニット
ポリペブタイドのうち、ＨＳＶ−１，ＨＳｖ−２に共通
のポリペブタイドであるｔＡ及びｇＢが完全にＨＳＶの
感染全防菌し、免疫効果音もつものであることを発見し
ｔことに基き、さらにこのｙＡ及びｆＢを高度に分離精
製する工業的手段全見出し、本発明？完成した。すなわ
ち、本発明は、単純ヘルペス１型、２型に対する安全、
有効かつ安定ナサブユニットワクチンの精製力Ｂ ＋
提供するものである。 発明の構成及び効果 ｖｈ ｉ ＨＳ Ｖ （以下Ｈ５Ｖ−１型および２型全
意味する）感染培養細胞等からＨＳＶに共通な糖蛋白で
ある。ｐＡ−Ｂ全有効成分とする単純ヘルペスユニット
ワクチンの精製方法について説明する。先ずＨ３Ｖ感染
培養細胞、もしくけその培養細胞から部分精製されたＨ
８ｖ粒子、あるいはＨ８Ｖ特異サブユニット糖蛋白含有
体全界面活性剤によって可溶化する。ここで得られたＨ
８Ｖ特異サブユニット糖蛋白溶解液全、界面活性剤の存
在下で単クローン抗体全リガンドとするアフィニティー
クロマトグラフィーにかける。かくして高度に精製され
た、ＨＳＶに共通な糖蛋白であるｐＡ−Ｂ全有効成分と
する単純ヘルペスサブユニットワクチンが精製される。 本発明において用いられるＨ８Ｖ特異サブユニット糖蛋
白含有体として嚇、Ｈ３Ｖ粒子のほか、公知の方法によ
りＨ８Ｖｆ感染せしめて培養した動物ｍ胞Ｔｔ用いるこ
とカｉできる。 すなわち、ＨＳＶに感染した細胞中には、ＨＳＶが増殖
し存在するほか、細胞膜ＥＫＨ８ｖ特異サブユニット糖
蛋白が発現しており、これらはいずれも本発明における
ワクチンの原材料となり得る。 また、遺伝子組み換え技術全利用したＨ３Ｖ１１Ａ−Ｂ
ｔ−産生する組み換え培養体？利用することもできる。 Ｈ８Ｖの宿主域は広く、自然宿主は人であるが、サル、
ウサギ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、発
育鶏卵などに感染増殖する。動物細胞としてはこのよう
にＨ８Ｖに感受性？有する動物由来のものが、広く使用
しつる。例えば、幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１
１、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏｌ、ヒト胎児
肝細胞（ＨＥＬ １％ヒト咽頭ガンＥ皮細胞（Ｈｏｐ−
２１％ウサギ初代腎細胞（ＰＲＫＩ、ニワ） ＩＪ胎児
繊維芽細胞など？挙げることができる。 ｙＡ −Ｈの取得にさいし、要すれば、出発材料の処理
法とし℃、Ｈ３Ｖ感染培養細胞の培養り清、あるいは培
養細胞全ホモジナイザー、や超音波処理等の適当な手段
で破砕して得られるＨ３Ｖ含有体から遠心分離などの方
法忙より細胞片などの粗大不溶物全除去し、Ｈ８Ｖ粒子
全取得精製した浮溶液全用いることもできる。 可溶化処理に用いられる界面活性剤は、ドデシル硫酸ナ
トリウム・デオキシコール酸ナトリウム等のアニオン系
界面活性剤あるいはＴｒｉｔｏｎ、 Ｎｏｎ１ｄｅｔ、
Ｔｗｅｅｎなどの非イオン系界面活性剤の中から選ば
れるが、好ましくは非イオン系界面活性剤の添加量は、
通常０．１〜１０ｖ／ｖ％であり、好ましくはｏ、ｓ
〜２．ＯＶ／Ｖ％である。 可溶化処理は、Ｈ８Ｖ粒子あるいはＨ３Ｖ特異サブユニ
ット糖蛋白含有体の浮遊液に所要量の界面活性剤？加え
て０°０Ｔ−２５°Ｃで、２４時間静置もしくは攪拌す
ることによって容易達成される。 この処理工程によって、可溶化抽出された糖蛋白は、界
面活性剤が存在しない条件下では再結合するので、アニ
オン界面活性剤または非イオン性界面活性剤の存在して
いる条件で、ポリサッカライド硫酸エステルゲル全用い
たアフイニテイクロマトグラフイー処理とゲル濾過全実
施する。あるいは、Ｈ８Ｖ糖蛋白＃Ａ −Ｂに対する単
クローン抗体全リガンドとするアフィニティークロマト
グラフィーにかけて、各種の糖蛋白の中から目的とする
？Ａ・Ｂ全分離取得することもできる。 本発明におけるポリサッカライド硫酸エステル全用いる
アフイニテイクロマトグラフイートハ、ヘパリンセファ
ロース（ファルマシア社製）、架橋デキストランゲルで
あるセファロース、セファデックス（ファルマシア社製
）やセルロースゲルであるセルロファインＧＯ−１５（
チッソ社製）等のポリサッカライドゲルを、たとえばピ
リジンの存在下クロルスルホン酸と反応させる等の方法
によって硫酸エステル化して得られるゲル全円いる。こ
のゲルは群特異性７フイニテイー全有し、Ｈ８Ｖ−１及
びＨ３Ｖ−２に共通の特異サブユニット９に、ｙＢに対
し吸着能全有し、βす１Ｔｆｉ 白’ｆＦ ’４ ｋ吸
着しない特質全方する。このアフィニティークロマトグ
ラフィーの方法はポリサッカライド硫酸エステル全充填
したカラムに、可溶性に用いたと同じ群の中から選ばれ
る界面活性剤２ｏ、ｏｓ〜２．０％好ましくけ０．１〜
０．５％程度含有させたｐＨ５〜８程度でイオン強度０
．００１〜１．０程度である適当な緩唾液（たとえば０
．１Ｍ食塩を含む０．０１ＭＩＪン酸緩箔液（ｐＨ７，
２１等）全通液して平衡化させる。続いて可溶化処理全
して得られたＨ８Ｖの特異サブユニットｇリペブタイド
溶ＩＮｉにＬ記ＪＪ＆ｉ液全加えて蛋白質濃度１００ｒ
ｒＬｔ／ｒｒＬ１以下に調整したサンプル全カラムに通
液し吸着操作２行なう。吸着終了後、前記界顛活性剤緩
衝液全通液サンプルの５〜１０倍量通液しカラム全洗浄
する。つぎに平衡化に用いたものよりイオン強度が高い
界面活性剤含有緩割液（たとえば０．６Ｍ食塩？含む０
．０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液に界面活性剤全顎えた液）
全通液し溶出操作全行なう。溶出液は７ラクシヨンに分
取しｇＡ１ｔＢ全含有するフラクション全集めて回収す
る。 回収した７ラクシヨンは次工程のゲル？濾過に用いる緩
術液如透析して、ゲル濾過用サンプルとして調製する。 ゲル濾過は前記ポリサッカライド硫酸エステルゲル全用
いたアフイニテイクロマトグラフイーにおいて用いる平
衡化緩唾液と同じく、界面活性側音０゜０５〜２．０％
好ましくけ０．１〜０．５％程度含有させたｐＨ５〜８
、イオン強度０Ｊ）０１〜１．０程度の緩唾液全用いて
行なうが、前記アフィニティークロマトグラフィーにお
いて用い友平衡化緩唾液と同一組成の緩唾液全用いれば
好都合である。 ゲル？Ｊ’ ｉｌ剤はセルロース、アガロース、架橋デ
キストランなどの高分子多糖類顆粒あるいは架橋ポリア
クリルアミドであり、商品としてはセフアリルＢ、セフ
ァデックス、セファロース（以しファルマシア社製）、
バイオゲルＰ（バイオラッド社製）、セルロファイン（
チッソ社製）などが例示されるが、分子ふるい作用全盲
する坦体であればこれらに限定されない。 ゲル濾過の結果、分子量が約１３０，０００、約９５，
０００．約ｓｏ、ｏｏｏその池の成分からなる両分が得
られるが、これらのうち分子量約９０．０００〜１００
，０００から成る成分？分画する。 このようにして得られた画分には、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミド電気泳動分析において、単ク
ローン抗体をリガンドとするアフイニテイクロマトグラ
フイーによって得られるｐＡ、ｐＢ成分とほぼ同一の品
質であり、抗ｙＡ−Ｂ単−クローン抗体感作ヒツジ赤血
球に対し凝集反応音生ずる。 この画分は適当な濃度になるように濃縮し、Ｔｗｅｅｎ
８０． Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−Ｚｏｏ 等の非イオン
界面活性剤のうち少くともその１種ｉ０．０１〜０．１
％、好ましくは０．０２〜０．０５％含有する中性付近
の生理的に等張な緩衝液に透析し、ワクチン原液となし
、ワクチン製剤化に供する。 本発明の方法により調製されたｙＡ−’Ｂは、ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で分析し
た結果においても、また免疫電気泳動分析全行なった所
見においても、不純物の存在がすべて否定された。 かくして精製されたワクチンはワクチン投与後の抗体産
生全高めるため、免疫アジュバントとしてたとえばアル
ミニウムゲル全力口えて製剤化してもよい。更に吸着し
たアルミニウムゲルｍｆｌＡ液にチメロサールなどの防
腐剤２ ｏ、ｏ ｏ ｓ〜０．ＩＷハ］程度添加してア
ルミニウムゲル添加ワクチンとしてもよく、また凍結乾
燥製剤としてもよい。 かくして精製復製剤されたワクチンは、力価の低下がな
く、きわめてその保存性がよく、使用時の溶解性が速や
かですぐれた単純ヘルペスサブユニットワクチンの製剤
カ得られる。 つぎに参考例および実施例全学げて本発明全具体的に説
明する。 参考例１ 単クローン抗体の調製：Ｈ８Ｖ−１型ＫＯ８株の感染Ｖ
ｅｒｏ細胞全細胞全感染後２ロｐＨ７．２〜７．４）で
４°０１時間可溶化処理し、１ ０ ０、０ ０ ０
Ｇで１時間超遠心後、Ｌ清全分取し、粗製糖蛋白画分？
得た。このＱ，１ｍｌ （蛋白量１ ０ ０ｒｎｇ／ｍ
Ｊ− １ ｆ Ｂａ１ｂ１０マウス（４退会♀）後肢掌
皮内に接種し免疫全行なった。免疫１ケ月後マウスのＮ
Ｙ摘出し、細切してＥａｇｌｅＭＥＮ培地全加えて免疫
牌細胞浮遊液全得た。 次に１×１０８個の免疫肺細胞と別に用意したｌＸ１０
７個のＰ３Ｕ１細胞全シャーレに入れポリエチレングリ
フール４，０００）用いて３７°０５分間融合し．ＨＡ
Ｔ培地でハイプリドーマを選択した（ Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｅｄ。 ｂｙ Ｋｅｎｎｅｔｔ ａｔ ａｌ， ２ｎｄ． Ｅｄ
． ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ３
６３〜４１９（１９８１ １ ］。 この中からさらに酵素抗体法？用いて１ＩＡ−Ｂに対す
る抗体産生ハイブリドーマ全選択し、こｆｉｉ ２，
６， ｔｏ， １４−テトラメチルペンタデカン（Ａｌ
ｄｒ．ｉｃｈ Ｏｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ｌで処理し
たＢ ａ ｌ ｂ １０雌マウス（４週令）の腹腔に移
植した。移植後７〜１４日目に腹水？採取しｇＡ・Ｂに
対する単クローン抗体（ ｔ 、Ｇｆｉｌ １ ０ｍｇ
／ｍＡ ）全量た。 参考例２ ■ Ｏ０Ｃ以下の温度にてピリジン２００ｍＬにクロル
スルホン酸１１ ？ｙＬＬ ｌ”滴下し一混合する。滴
下終了後混液を加熱し、６５〜７０°０に昇温する。こ
の中に架橋アガロースゲルであるセファロース０Ｌ−６
Ｂ（７アルマシア社［１のピリジン包含体３０ｍＪ−に
加え、６５〜７０°Ｃにて４時間反応させる。反応終了
後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液全顎えて中和する
。 ゲル全濾過分離し、０．０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝食塩液
で充分に洗浄して架橋アガロース硫酸エステル２３ ｍ
−’ ｋ得る０ ■ 前記のと同様にして調製したピリジン−クロルスル
ホン酸混液２１０？Ｎ−’の中に、エピクロルヒドリン
架橋デキストランであるセファテックスＧ−５０（７ア
ルマシア社１１１Ｊ１７．５ｇＴｔ加え、攪拌下６５〜
７０°σにて４時間保持する。反応終了後、冷却し、水
酸化す） ＩＪウム水溶液全加えて中和する。ゲルｒ
ｆ濾過分離し、０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝食塩液で充分に
洗浄して架橋デキストラン硫酸エステル全得る。 ■ 前記■と同様にして調製したピリジン−クロルスル
ホン酸混？＆ ２ ｔ ｏ ｔｒｄに、架橋セルロース
ゲルであるセルロファインＧＯＬ−２５
【チッソ社製】
乾燥物７・５を全加え・６５〜７０°０にて４時間反応
させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液
全顎えて中和する。ゲルを濾過分離し、０．０１ＭＩＪ
ン酸媛衝食塩液で充分に洗浄して架橋セルロース硫酸エ
ステル７．２ｔを得・る。 実施例 参考例２で得られたセルロース’ｆ！Ｌｍエステルゲル
２００ｙａｆ ｆ充填したカラムに０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１ｏｏ ｆ ０．１％含有するＭ／１００リン
ｍ緩衝生理食塩水（ｐＨ７，２）ｉ６００ｍｆ通液して
平衡化せしめる。このカラムにさきに得られたＥ清（蛋
白濃度約１００−△”１Ｔｈ１００ｒｒＬ１通液する。 通液終了後、平衡化緩唾液を６００ ｍｊ！通液してカ
ラム全洗浄する。つぎにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００Ｔｅ
Ｏ，１％およびＮａ０１ｉ ０．６Ｍ含むＭ／１００リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，２１を通液し溶出させる。溶出液
はフラクション分取し、前述参考例１で得られた抗ＰＡ
’ Ｂマウス単りローン抗Ｃ４１ｉＴＴいた。？Ａ−
Ｂマウス単クローン抗体感作ヒツジ赤血球によるｒ −
Ｐ ＨＡ法によりｙＡ−Ｈの存在？確認し、ｙＡ −Ｂ
ｆ含むフラクション全集める。得られた７ラクシヨン
は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ｆ Ｏ，Ｌ含むＭ／１０
０リン酸緩術生理食塩水（ｐＨ７，２１に透析した後、
ミニコン（ｍｉｎｉｃｏｎｌ Ｂ −Ｌ ５ （アミコ
ン社製）？用いて濃縮し、ゲル濾過用サンプル４７ＦＬ
Ｊｌを得る。 セルロファインＧＯ−７００（チッソ社製）全売ｊ眞し
たカラム（１５ｍｍφ×ｌ Ｏ００？ＦＬ７ＦＬ Ｈ＋
に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００Ｋ？含むＭ／１０
０ Ｐ ａ ５（ｐＨ７，２１全通液し平衡化させたも
のに、ゲル濾過用サンプル１ｍｌ ｙ２通液しｓ Ｏ，
１％ Ｔｒｉｔｏｎｘ−ｔｏｏ全含むＭ／１００ Ｐ
Ｂ’Ｓ （ＰＨ７，２１を用いてゲルＩ濾過する。各７
ラクシヨンに抗１ｋ・Ｂマウスモノクロナル抗体ヒツジ
赤血球にょるｒ−ＰＨＡによって２１−Ｈの存在全確認
してｙＡ−Ｈの存在するフラクション全分取した。 このフラクション全サンプリングし、ＳＤＳ電気泳動分
析にかけたところ、前述の参考例１で得られた精製、ｐ
Ａ−Ｂワクチン原液と同一の泳動パターン２示した。 なお前記ｇＡ−Ｈの存在する７ラクシヨンは分子量約９
５，０００であった。このゲル濾過操作Ｔｈ段部のゲル
濾過サンプルについてＩＨａＬ、ｙＡ−Ｂの存在する７
ラクシヨンをプールし、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
Ｚｏｏ含有Ｍ／１００ＦＢＳに透析した後、単純ヘルペ
スサブユニットワクチン原液とした。 得られたワクチン原液に００５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−Ｚ
ｏｏ含有Ｍ／Ｚｏｏ Ｐ Ｂｓ ２加えて蛋白濃度５０
μシーとなるように調製し、除菌濾過後、１ ｍｌ ス
つ容器に小分けした単純ヘルペスサブユニットワクチン
精剤１５ｏ本Ｔｈ得た。
乾燥物７・５を全加え・６５〜７０°０にて４時間反応
させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液
全顎えて中和する。ゲルを濾過分離し、０．０１ＭＩＪ
ン酸媛衝食塩液で充分に洗浄して架橋セルロース硫酸エ
ステル７．２ｔを得・る。 実施例 参考例２で得られたセルロース’ｆ！Ｌｍエステルゲル
２００ｙａｆ ｆ充填したカラムに０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１ｏｏ ｆ ０．１％含有するＭ／１００リン
ｍ緩衝生理食塩水（ｐＨ７，２）ｉ６００ｍｆ通液して
平衡化せしめる。このカラムにさきに得られたＥ清（蛋
白濃度約１００−△”１Ｔｈ１００ｒｒＬ１通液する。 通液終了後、平衡化緩唾液を６００ ｍｊ！通液してカ
ラム全洗浄する。つぎにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００Ｔｅ
Ｏ，１％およびＮａ０１ｉ ０．６Ｍ含むＭ／１００リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，２１を通液し溶出させる。溶出液
はフラクション分取し、前述参考例１で得られた抗ＰＡ
’ Ｂマウス単りローン抗Ｃ４１ｉＴＴいた。？Ａ−
Ｂマウス単クローン抗体感作ヒツジ赤血球によるｒ −
Ｐ ＨＡ法によりｙＡ−Ｈの存在？確認し、ｙＡ −Ｂ
ｆ含むフラクション全集める。得られた７ラクシヨン
は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ｆ Ｏ，Ｌ含むＭ／１０
０リン酸緩術生理食塩水（ｐＨ７，２１に透析した後、
ミニコン（ｍｉｎｉｃｏｎｌ Ｂ −Ｌ ５ （アミコ
ン社製）？用いて濃縮し、ゲル濾過用サンプル４７ＦＬ
Ｊｌを得る。 セルロファインＧＯ−７００（チッソ社製）全売ｊ眞し
たカラム（１５ｍｍφ×ｌ Ｏ００？ＦＬ７ＦＬ Ｈ＋
に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００Ｋ？含むＭ／１０
０ Ｐ ａ ５（ｐＨ７，２１全通液し平衡化させたも
のに、ゲル濾過用サンプル１ｍｌ ｙ２通液しｓ Ｏ，
１％ Ｔｒｉｔｏｎｘ−ｔｏｏ全含むＭ／１００ Ｐ
Ｂ’Ｓ （ＰＨ７，２１を用いてゲルＩ濾過する。各７
ラクシヨンに抗１ｋ・Ｂマウスモノクロナル抗体ヒツジ
赤血球にょるｒ−ＰＨＡによって２１−Ｈの存在全確認
してｙＡ−Ｈの存在するフラクション全分取した。 このフラクション全サンプリングし、ＳＤＳ電気泳動分
析にかけたところ、前述の参考例１で得られた精製、ｐ
Ａ−Ｂワクチン原液と同一の泳動パターン２示した。 なお前記ｇＡ−Ｈの存在する７ラクシヨンは分子量約９
５，０００であった。このゲル濾過操作Ｔｈ段部のゲル
濾過サンプルについてＩＨａＬ、ｙＡ−Ｂの存在する７
ラクシヨンをプールし、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
Ｚｏｏ含有Ｍ／１００ＦＢＳに透析した後、単純ヘルペ
スサブユニットワクチン原液とした。 得られたワクチン原液に００５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−Ｚ
ｏｏ含有Ｍ／Ｚｏｏ Ｐ Ｂｓ ２加えて蛋白濃度５０
μシーとなるように調製し、除菌濾過後、１ ｍｌ ス
つ容器に小分けした単純ヘルペスサブユニットワクチン
精剤１５ｏ本Ｔｈ得た。
Claims (5)
- （１）ＨＳＶ感染培養細胞から得られるＨＳＶの特異サ
ブユニツトポリペプタイド溶解液を、ポリサツカライド
硫酸エステルを用いたアフイニテイクロマトグラフイー
処理およびゲル濾過操作を経て精製する単純ヘルペスサ
ブユニツトワクチンの精製方法。 - （２）ＨＳＶの特異サブユニツトポリペプタイド溶解液
を、界面活性剤の存在下アフイニテイクロマトグラフイ
ー処理に供する前記第（１）項記載のワクチンの精製方
法。 - （３）単純ヘルペスサブユニツトワクチンが、分子量９
０，０００〜１００，０００のポリペプタイドであるサ
ブユニツトｇＡおよびｇＢからなる前記第（１）項記載
のワクチンの精製方法。 - （４）サブユニツトｇＡおよびｇＢがＨＳＶの１型およ
び２型に共通なポリペプタイドである、前記第（１）項
又は第（３）項記載のワクチンの精製方法。 - （５）ポリサツカライド硫酸エステルが架橋ポリサツカ
ライド又はセルロースの硫酸エステルである前記第（１
）項記載のワクチンの精製方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59177194A JPS6153226A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | 単純ヘルペスサブユニツトワクチンの精製方法 |
| KR1019850006051A KR920009735B1 (ko) | 1984-08-24 | 1985-08-22 | 단순 헤르페스 바이러스 서브유니트 왁진의 제조방법 |
| EP85110643A EP0173268B1 (en) | 1984-08-24 | 1985-08-23 | A method for the preparation of a herpes simplex virus subunit vaccine |
| AT85110643T ATE54415T1 (de) | 1984-08-24 | 1985-08-23 | Verfahren zur herstellung eines impfstoffs einer herpes-simplex-virusuntereinheit. |
| US06/768,720 US4724146A (en) | 1984-08-24 | 1985-08-23 | Method for preparation herpes simplex virus subunit vaccine |
| CA000489367A CA1251401A (en) | 1984-08-24 | 1985-08-23 | Method for preparation of herpes simplex virus subunit vaccine |
| DE8585110643T DE3578617D1 (de) | 1984-08-24 | 1985-08-23 | Verfahren zur herstellung eines impfstoffs einer herpes-simplex-virusuntereinheit. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59177194A JPS6153226A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | 単純ヘルペスサブユニツトワクチンの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6153226A true JPS6153226A (ja) | 1986-03-17 |
| JPH0463863B2 JPH0463863B2 (ja) | 1992-10-13 |
Family
ID=16026819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59177194A Granted JPS6153226A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | 単純ヘルペスサブユニツトワクチンの精製方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0173268B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6153226A (ja) |
| KR (1) | KR920009735B1 (ja) |
| AT (1) | ATE54415T1 (ja) |
| CA (1) | CA1251401A (ja) |
| DE (1) | DE3578617D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004532830A (ja) * | 2001-02-23 | 2004-10-28 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 新規なワクチン |
| JP2004536785A (ja) * | 2001-02-23 | 2004-12-09 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 新規なワクチン |
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| US5244792A (en) * | 1984-04-06 | 1993-09-14 | Chiron Corporation | Expression of recombinant glyoprotein B from herpes simplex virus |
| US5612041A (en) * | 1984-07-17 | 1997-03-18 | Chiron Corporation | Recombinant herpes simplex gD vaccine |
| US5151267A (en) * | 1988-07-15 | 1992-09-29 | University Of Saskatchewan | Bovine herpesvirus type 1 polypeptides and vaccines |
| US5585264A (en) * | 1988-07-15 | 1996-12-17 | University Of Saskatchewan | Nucleotide sequences encoding recombinant bovine herpesvirus type-1 GI, GIII and GIV polypeptides |
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| US7784938B2 (en) | 2007-05-09 | 2010-08-31 | Dolby Laboratories Licensing Corporation | Method and system for shaped glasses and viewing 3D images |
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| TWI539230B (zh) | 2007-05-09 | 2016-06-21 | 杜比實驗室特許公司 | 三維影像之投影與觀看系統（一） |
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| US10809543B2 (en) | 2017-01-23 | 2020-10-20 | Dolby Laboratories Licensing Corporation | Glasses for spectral and 3D imaging |
| CN111896731B (zh) * | 2020-06-24 | 2023-06-09 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种化学发光免疫分析用清洗液 |
Family Cites Families (8)
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| SE420977B (sv) * | 1976-03-18 | 1981-11-16 | Kabi Ab | Forfarande for rening och isolering av hepatitvirus for vaccinframstellning |
| FI66020C (fi) * | 1977-09-19 | 1984-08-10 | Merck & Co Inc | Foerfarande foer framstaellning av antigeniska immunogeniska subunits av hsv-1 och hsv-2 |
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| US4317811A (en) * | 1980-09-11 | 1982-03-02 | Merck & Co., Inc. | Herpes simplex type 1 subunit vaccine |
| US4762708A (en) * | 1982-02-18 | 1988-08-09 | University Patents, Inc. | Materials and methods for herpes simplex virus vaccination |
| DE3228501A1 (de) * | 1982-07-30 | 1984-02-02 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur herstellung eines herpes-antigens, dazu geeignetes mittel sowie verfahren zu seiner herstellung und die verwendung dieses antigens |
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- 1984-08-24 JP JP59177194A patent/JPS6153226A/ja active Granted
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1985
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- 1985-08-23 AT AT85110643T patent/ATE54415T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-23 US US06/768,720 patent/US4724146A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-23 EP EP85110643A patent/EP0173268B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-23 CA CA000489367A patent/CA1251401A/en not_active Expired
- 1985-08-23 DE DE8585110643T patent/DE3578617D1/de not_active Expired - Lifetime
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Also Published As
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| DE3578617D1 (de) | 1990-08-16 |
| KR870001837A (ko) | 1987-03-28 |
| EP0173268A3 (en) | 1986-05-28 |
| KR920009735B1 (ko) | 1992-10-22 |
| JPH0463863B2 (ja) | 1992-10-13 |
| EP0173268A2 (en) | 1986-03-05 |
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| US4724146A (en) | 1988-02-09 |
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