DK141533B - Polykondensationsprodukt til binding af proteiner eller enzymer. - Google Patents

Description

(w V Rft OD FREMLÆeeiLSESSKRIFT 141533 i«) Tillæg til patent nr. 138750 DANMARK ln, cl·3 c o® S 'Vål C 12 N 11/08 «(21) Ansøgning nr. 4463/74 (22) Indleveret dsn 21 . aug. 1974 (23) Løbedag 21. aug. 1974 (44) Ansøgningen fremfagt og fremlasggeteesskrtftet oHentlfggjort den 1 4. apr. 1 980

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

9. Jul. 1974, 9415/74, CH

(7i) L. GIVAUDAN & GIE SOCIETE ANONYME, CH-1214 Vernier, Geneve, CH.

(72) Opfinder: Regula Boeniger, Hirzerenstraeee, Greifensee, CH: Victor Krasnobajew, Langwattstrasse 50, Zollikerberg, CH.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Plougmann & Vingtoft Patentbureau.

(54) Polykondensatlonsprodukt til binding af proteiner eller enzymer.

Dansk patent nr. 138.750 angår et polykondensatlonsprodukt af en aromatisk diamin og et aliphatisk aldehyd til binding af proteiner eller enzymer, hvilket polykondensatlonsprodukt eventuelt er dia-zoteret, og hvilket produkt er ejendommeligt ved, at det er fremstillet ved omsætning af 1,3-phenylendiamin med glutardialdehyd i et molforhold fra 1:1 til 1:10, eventuelt i nærværelse af et finkornet, fast, inert uorganisk bæremateriale for proteiner eller enzymer, som kan være en siliciumforbindelse eller et metaloxid, og det derved vundne produkt udmærker sig ved stor bindingskapacitet til proteiner.

Det har nu vist sig, at en række andre strukturelt beslægtede aminer kan omsættes med samme eller strukturelt lignende dialdehyder eller med acrolein på samme måde til kondensationsharpikser, som ligeledes 2 141533 på fremragende måde er egnet til samme formål, altså til binding af proteiner.

Opfindelsen bygger på denne erkendelse og angår et polykondensations-produkt til binding af proteiner eller enzymer, hvilket produkt eventuelt er diazoteret, og hvilket produkt er ejendommeligt ved, at det er fremstillet ved omsætning af 1 mol af en én- eller tokernet carbocyc-lisk aromatisk di- eller triamin, hvorhos de to kerner i den tokerne-de amin er bundet til hinanden med en direkte binding eller via ét broatom, med 1 - 10 mol af et aliphatisk dialdehyd med 2-5 carbon-atomer eller acrolein, eventuelt i nærværelse af et finkornet, fast, inert uorganisk bæremateriale for proteiner eller enzymer, med de undtagelser, at polykondensationsproduktet ikke er fremstillet ved omsætning af 1,4-phenylendiamin og et aliphatisk dialdehyd med 2-5 car-bonatomer, og at polykondensationsproduktet ikke er det i krav 1 i patent nr, 138.750 omhandlede.

Polykondensationsprodukter på basis af polyaminer såsom ethylendiamin, paraphenylendiamin, hexamethylendiamin, urinstof og sebacinsyredihydra-zid og dialdehyder er f.eks. beskrevet i fransk patentskrift nr. 1.052.578. De dér beskrevne produkter anvendes imidlertid i kunststofindustrien. At sådanne kondensationsprodukter skulle kunne anvendes til binding af proteiner eller enzymer fremgår ikke af det nævnte franske patentskrift og er ej heller nærliggende på baggrund heraf.

I USA patentskrift nr. 3.706.633 er beskrevet en fremgangsmåde til fiksering eller uopløseliggørelse af proteiner. Der gås her ud fra dialdehydstivelse, som i første trin' omsættes til et kondensationsprodukt med en polyamin. Derefter følger et reaktionstrin, der udføres ved hjælp af natriumborhydrid, og endelig diazotering af kondensationsproduktet og fiksering af proteinet. I USA patentskrift nr. 3.821.083, som svarer til dansk patentskrift nr. 133.010, er det også anført, at der til fremstilling af bærestoffer for proteiner som udgangsmateriale anvendes polymere med aldehydgrupper. F.eks. omdannes polyacrolein til acetalen, denne fikseres på en inert bærer, og endelig genfremstilles de frie aldehydgrupper ved sur hydrolyse af acetalen. På den således forberedte bærer kan proteinet derefter anbringes.

Polykondensationsprodukterne ifølge opfindelsen udmærker sig i forhold til de kendte ved at være fremstillet ud fra billigere udgangsmaterialer og ved at være fremstillet på mindre kompliceret måde.

3 141533

De i USA patentskrift nr. 3.706.633 beskrevne partikler kan desuden ikke anvendes til søjlechromatografi, idet de er amorfe og for fine. Polykon-densationsprodukterne ifølge den foreliggende opfindelse har desuden meget større bindingsevne end de kendte stoffer.

Eksempler på carbocycliske aromatiske di- eller triaminer er f.eks. enkeltkernede forbindelser såsom phenylendiaminer, f.eks. p-phenylen-diamin, phenylentriamlner såsom 2,4,6-triaminophenol og 2,4,6-tri-aminotoluen, tokernede forbindelser såsom biphenyldiaminer, f.eks. benzidin, eller tokernede forbindelser, i hvilke de to kerner er forbundet via ét broatom, f.eks. diaminodiphenylmethaner.

Foruden aminogrupper kan de aromatiske kerner også have andre substi-tuenter, f.eks. lavere alkylgrupper såsom methyl og ethyl, lavere alkoxygrupper såsom methoxy og ethoxy, hydroxy-, halogen-, carboxy-, mercapto-, lavere alkylthio- eller sulfonylgrupper.

Endelig kan der ved fremstillingen af de omhandlede kondensationsprodukter også anvendes blandinger af forskellige siminer.

Eksempler på aliphatiske dialdehyder er glutardialdehyd, ravsyredi-aldehyd og glyoxal. Ifølge opfindelsen foretrækkes glutardialdehyd, da dette dialdehyd fører til produkter med høj bindingsevne.

Foretrukne aminokomponenter er benzidin og 2,4,6-triaminotoluen, da polykondensationsprodukter fremstillet hermed har særlig god bindingsevne. Ifølge opfindelsen foretrækkes derfor kondensationsprodukter, som er fremstillet ved, at der til benzidin sættes glutardialdehyd, eller som er fremstillet ved, at der til 2,4,6--triaminotoluen sættes glutardialdehyd.

Om de ved fremgangsmåden vundne produkter er egnede til binding af enzymer, kan fastslås eksperimentelt på let måde ved behandling af det vundne produkt med enzym, fortrinsvis amyloglucosidase, og måling af det bundne enzyms aktivitet. Produktet er velegnet, når denne aktivitet andrager mindst 50 - 100 enheder pr. g bærestof.

Til dette formål kan følgende forsøgsmetode benyttes: 4 141533 1 g af bærestoffet fyldes i en chromatografisøjle (1,5 x 15 cm).

En opløsning af 1 g amyloglucosidase (50 enheder/mg) i 100 ml 16 millimol acetatpuffer (pH-værdi 4,8) sættes på søjlen ved stuetemperatur og med en gennemstrømningshastighed på 20 ml/time. Det bundne enzym skal, som ovenfor anført, have en aktivitet på mindst 50 -100 enheder/g bærestof.

Aktiviteten måles efter Zulkoski's metode på grundlag af den af fra opløselig stivelse frigjorte glucose. Den frigjorte glucose bestemmes enzymatisk ved hjælp af glucoseoxidase/peroxidase-tests (Bergmeyer, Metho-den der enzymatischen Analyse, I, (1970) 416). 1 Enhed = den mængde enzym, som frigør ét /Umol glucose/minut ved en reaktionstemperatur på 60"C ved pH-værdi 4,8 fra opløselig stivelse.

På den anden side er egnetheden givet, når bærematerialet mindst binder 10 mg af et protein (f.eks. kvægserumalbumin) pr. g bærestof.

Den bundne proteinmængde kan bestemmes ved hydrolyse af det bærestofbundne protein med 6N HCl og påfølgende bestemmelse af mængden af frigjorte aminosyrer ved hjælp af en hvilken som helst gængs analysemetode for aminosyrer.

Som proteiner, der kan bindes til de omhandlede kondensationsprodukter, kan anføres polypeptider, antigener, antistoffer, proteininhibitorer eller især enzymer. Enzymerne kan være af vegetabilsk, animalsk eller mikrobiel oprindelse. Der kan anvendes hydrolaser (peptidaser, proteinaser, desaminaser, carbohydraser og esteraser), lyaser eller desmolaser (hydrolyaser, decarboxylaser og aldolaser), transferaser, isomeraser, oxidoreduktaser og ligaser. Eksempler på enzymer, ud fra hvilke der ifølge opfindelsen kan fremstilles uopløselige enzympræparater, er alkoholdehydrogenase, naringinase, hesperidinase, β-glucosidase, a-amylase, invertase, amyloglucosidase, urease, trypsin, ficin, papain, bromelin, subtilopeptidase, rennin, glucoseisomerase, glucoseoxidase, peroxidase, katalase, acylase og cytochrom.

Molforholdet mellem kondensationspartnerne polyamin og aldehyd liggerf som ovenfor anført, mellem 1:1 og 1:10, fortrinsvis ved ca. 1:3.

Omsætningen kan udføres på i og for sig kendt måde, f.eks. i vandig opløsning, fortrinsvis under tilsætning af en syre. Ved en særlig 5 141533 udførelsesform arbejdes der i nærværelse af et inert, finkornet, uorganisk, især silicatholdigt, hjælpemiddel. Eksempler på sådanne hjælpemidler er silicagel, pimpsten, diatoméjord (kisel-gur), bentonit, wollastonit og porøst glas, men der kan også anvendes metaloxider såsom aluminiumoxid eller hydroxylapatit. Der anvendes fortrinsvis silicagel, f.eks. med en partikelstørrelse på 0,05 - 0,2 mm (70 - 325 mesh). Ved tilstedeværelse af sådanne bærematerialer kan der opnås en homogen partikeldannelse véd kondensationen, hvilket igen medfører bedre sedimentation. Bedre, dvs. hurtig, separation muliggør en hurtig og mere ren fraskillelse af det bundne bærestof. Kondensationen i nærværelse af et bæremateriale udføres hensigtsmæssigt på den måde, at partiklerne først bringes i berøring med en af de to komponenter, hvorefter den anden tilsættes under samtidig eller påfølgende let syrning.

Kondensationen kan foretages i homogen fase eller fortrinsvis i et 2-fasesystem under tilsætning af en syre, fortrinsvis saltsyre, under kraftig omrøring eller omrystning. Anvendelsen af et 2-fasesystem befordrer dannelsen af sfæriske, i udstrakt grad homogene, let fil-trerbare og godt sedimenterende partikler, som er særlig velegnede som bærestoffer.

Som anden fase kan anvendes inerte, med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmidler, f.eks. dichlormethan, chloroform, carbontetrachlorid, benzen, toluen, ethylacetat, dioxan eller carbondisulfid. Det foretrækkes især som organisk opløsningsmiddel at anvende chloroform.^

Der kan dog også anvendes acetone.

Ifølge opfindelsen fås et allerede meget aktivt bærestof, som dog ved diazotering kan aktiveres yderligere. Diazoteringen kan udføres på i og for sig kendt måde ved behandling af kondensationsproduktet med nitrit og syre.

Til fiksering (kemisk binding) af proteinet til bærestoffet behandles sidstnævnte med en vandig, fortrinsvis pufret, opløsning af proteinet (1 - 50 mg/ml) ved en temperatur på ca. 0 - ca. 30°C, fortrinsvis mellem 4°C og stuetemperatur, og behandlingen kan foretages ved omrøring eller rystning. På grund af den høje aktivitet hos det om- 6 141533 handlede bærestof kan bindingen af proteinerne fordelagtigt også udføres ved simpel filtrering af proteinopløsningen gennem et bærestoflag, fortrinsvis en med bærestof fyldt søjle, som det f.eks. er sædvanligt ved søjlechromatografi. Således kan man f.eks. lade kulturfiltrater af mikroorganismer, som indeholder proteiner eller enzymer, løbe direkte over en bærestofsøjle, hvorhos proteinerne eller enzymerne bindes selektivt. Det er hensigtsmæssigt at efter-vaske med pufferopløsning og 1M kaliumchloridopløsning for at fjerne ikke-bundne proteiner.

De på de omhandlede bærestoffer bundne proteiner er i almindelighed meget stabile, og med enzymer fås der meget høje specifikke aktiviteter (enhed/g). Der kan opnås forhold på fra 1:3 til 1:10 vægtdele protein/bærestof.

De omhandlede bærestofbundne proteiner, især enzymerne, kan anvendes på i og for sig kendt måde, f.eks. til analytiske eller præparative formål eller i levnedsmiddelteknologien, f.eks. til fremstilling af glucose ud fra stivelse (jfr. f.eks. Scientific American 224, (nr. 3) 26 - 33 (1971), Angew. Chemie 84, (8) 319 - 268 (1972),

Chemiker Zeitung 96, (11), 595 - 602 (1972), C & EN, (15.2.71), 86 -87) .

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler, i hvilke mængdeangivelserne af det vundne eller anvendte bærestof er beregnet på tørvægt:

Eksempel 1.

Til en opløsning eller suspension af 5 g af polyaminen i 200 ml chloroform sættes under kraftig omrøring først 20 g aldehyd (80 ml af en 25%'s opløsning i vand) og efter yderligere 5 minutters forløb portionsvis 20 ml 7N saltsyreopløsning. Reaktionsblandingen størkner.

Der tilsættes 300 ml vand og rystes i 5 minutter, til den igen bliver flydende. De polymere småkorn lades henstå under lejligheds omrøring i 1 time. Efter frasugning af reaktionsblandingen over en Buchner--tragt vaskes polymerpartiklerne tre gange med 200 ml acetone og 7 141533 derefter med O,IN NaOH-opløsning. Resterende chloroform fjernes ved vask med acetone. De således vundne bærestofpartikler er sfæriske, homogene og godt filtrerbare; de opbevares i vand eller fortyndet natriumhydroxidopløsning. De kan, eventuelt efter diazotering, anvendes til enzymbinding.

Eksempel A.

1 g bærestof fyldes i en chromatografisøjle (1,5 x 15 cm) og vaskes med den til efterfølgende enzymbinding anvendte pufferopløsning.

Den puf rede enzymopløsning (1 - 100 mg protein/ml puffer) hældes med en gennemstrømningshastighed på 20 ml/time gennem søjlen.

Koblingskapaciteten er udtømt, når der i eluatet kan påvises protein, hvilket f.eks. kan konstateres ved måling af absorptionen ved 280 nm. Det ikke bundne enzym fjernes ved vask af søjlen med 1M KCl-opløsning og pufferopløsningen. Derefter foretages aktivitetsbestemmelse af en alikvot af materialet med det pågældende substrat under de givne reaktionsbetingelser. Efter aktivitetsbestemmelse vaskes en alikvot af enzympræparatet med vand og tørres, og det tørrede materiale undersøges. På denne måde kan antal enheder enzymaktivitet/g bærestof bestemmes. 1 nedenstående tabel I er opstillet de ifølge eksempel 1 fremstillede kondensationsprodukter og de dertil svarende, ifølge eksempel A bestemte aktiviteter.

8 141533

<D

U

ffi

A

S1 OOOOOOOgOO § O O

1¾ ssssssssss sss

I I I I 1 I 1 1 1 1 III

-¾¾ SSSSSS^10^^ minin 'O?'» .......... ...

,ggm Ο ΟΟϋ ϋϋυυυϋ ϋϋϋ

I I

0) -H

I «I ^ mi® o S ® A (1) Ό S 1

d ,¾ O’ O

§ O -s

n^H 3 <D

M “ Φ Η M

,0¾ tn tf

+i 9 <u -"O

Q) P £ ^ , 3 λ λ λ λ λ Q Ο Ο Ο Ο Ο Ο

lun® nooooåoomo OOO

Ή Ο ^“'“’•^„„lOCMPOLn m οο 'Χ) ιϋΗ .. αοοο-^Γ'-Ο®^^ >1^· Η ^ •Ρ g +> 0) (Π Q) -p'-'-p -Η ·Η > ε >

• ·Η WH

Η 4-> Ν -Ρ Ο

Ai fi ,Μ -Ρ Η c 0) Π5 μ <ΰ A HJ Bi

'd’dtJ'd'd'O'O'O'O'O

Λ A A A A A -¾ -C A A A

t ί ίί ίίί 2 s fi •s 55555¾¾¾¾¾ ΐ I 3 2 S S S 51 S S « S S S i • £ * 3333S33333 >,8 8 τ3 ΟΟΟΟΟΟ^ΟΟΟ Oco^ S a fi 3 (d o i ir A **-* -*-* S A Η t>

O 0) 3 C

•H Pi ε in <u -μ h c -Η 'i 'i ^ S 3§3 ti C £ £ C C 3 s -S S 5 3 -i c ® ® ® ε ε ε cu gxiooofo *5 »S *§ 5 § 5

>§ § 3, -P 3 tn P

§ 5 c fi o fi h 5 5 Λ 5 5 5

w C! .p4 »r4 jJ rrt H o o - C ti C

W § g g O O o SSHmhhh h (d (d fi fi i se M ti. sL ti.

>ι -Η -P -Η -P 'tf „ 6 g " " f*

d βρρεει522 SH m m S

ύ ,S^^55 85qq5|IA.AA

t ^ * ti ? ? g N J j N fi ΐ ΐ ΐ η ,.,.......10)--(1)6-^7