DK142033B - Biologisk aktive proteiner, især enzymer, bundet til et polykondensationsprodukt, samt fremgangsmåde til fremstilling deraf. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1^2033 C 12 N 11/00 DANMARK od int.ci.3 c 07 o 7/00 UMmVIMniS. C 08 G 12/08 §(21) Ansøgning nr. 1520/75 (22) Indleveret den 9· aPr* 1975 (23) Løbedag 29. jan. 1974 (44) Ansøgningen fremlagt og 1 1 1 Qfin fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 1'·

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

22. feb. 1975, 2605/75, CH

(71) L. GIVAUDAN & CIE SOCIETE ANONYME, CH-1214 Vernier-Geneve, CH.

(72) Opfinder: Regula Boeniger, Hirzerenstrasse, Greifensee, CK: Victor Krasnobajew, 50 Langwattstråsse, Zollikerberg, CH.

(74) Fuldmægtig under sagene behandling:

Plougmann & Vingtoft Patentbureau.

(64) Biologisk aktive proteiner, isser enzymer, bundet til et polykon* densationsprodukt, samt fremgangsmåde til fremstilling deraf.

Det er kendt at binde proteiner, især enzymer, til faste bærestoffer og derved fremstille uopløselige produkter med fordelagtige egenskaber. De bundne, uopløseliggjorte eller biologisk aktive proteiner kan så f.eks. håndteres lettere end i deres oprindelige opløselige form. Til bærestoffer bundne enzymer kan, på grund af deres lette genvinding, anvendes flere gange ved stationære fremgangsmåder eller, særlig fordelagtigt, i kontinuerligt arbejdende fremgangsmåder.

Således kendes f.eks. fremstillingen af en kondensationsharpiks med stor bindingskapacitet for proteiner ved omsætning af 1,3-phe-nylendiamin og formaldehyd samt diazotering af reaktionsproduktet.

2 142033 I OSA patentskrift nr. 3.706.633 er beskrevet en fremgangsmåde til fiksering eller uopløseliggørelse af proteiner. Der gås her ud fra dialdehydstivelse, som i første trin omsættes til et kondensationsprodukt med en polyamin. Derefter følger et reaktionstrin, der udføres ved hjælp af natriumborhydrid, og endelig diazotering af kondensationsproduktet og fiksering af proteinet. I USA patentskrift nr. 3.821.083, som svarer til dansk patentskrift nr. 133.010t er det også anført, at der til fremstilling af bærestoffer for proteiner som udgangsmateriale anvendes polymere med aldehydgrupper. F.eks. omdannes polyacrolein til acetalen, denne fikseres på en inert bærer, og endelig genfremstilles de frie aldehydgrupper ved sur hydrolyse af acetalen. På den således forberedte bærer kan proteinet derefter anbringes.

Biologisk aktive proteiner, især enzymer, bundet til det i det følgende beskrevne organiske bæremateriale udmærker sig i forhold til de kendte ved, at de organiske bærematerialer er fremstillet ud fra lettere tilgængelige udgangsmaterialer og ved, at de er fremstillet på mindre kompliceret måde. De ved den i USA patentskrift nr.

3.706.633 beskrevne fremgangsmåde fikserede proteiner kan desuden ikke anvendes til søjlechromatografi, idet de ved denne fremgangsmåde fremstillede partikler (dvs. protein-bærestof-complexet eller det bærestof, hvortil proteinet er bundet) er amorfe og for fine.

De polykondensationsprodukter, som anvendes til binding af proteiner, især enzymer, ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har desuden meget større bindingsevne end de kendte stoffer.

Opfindelsen bygger på den erkendelse, at proteiner, især enzymer, bindes til polykondensationsproduktet af 1,3-phenylendiamin og glu-tardialdehyd i større mængder end til et kondensationsprodukt af 1,3--phenylendiamin og formaldehyd. Der fås på denne måde et væsentligt mere aktivt produkt. Opfindelsen angår derfor biologisk aktive proteiner, især enzymer, bundet til et polykondensationsprodukt af en aromatisk diamin og et aliphatisk dialdehyd, hvilket polykondensationsprodukt eventuelt er diazoteret, hvilke proteiner, især enzymer, bundet til et polykondensationsprodukt, er ejendommelige ved, at polykondensationsproduktet er fremstillet ved omsætning af 1 mol 1,3--phenylendiamin med 1-10 mol glutardialdehyd, eventuelt i nærværelse af et finkornet, fast indifferent uorganisk bæremateriale for proteiner, 142033 3 herunder enzymer, hvilket bæremateriale kan være en siliciumforbindelse eller et metaloxid, ligesom opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af biologisk aktive proteiner, især enzymer, bundet til et polykondensationsprodukt af en aromatisk diamin og et aliphatisk dialdehyd, hvilket polykondensationsprodukt eventuelt er diazoteret, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at proteiner, især enzymer, under anvendelse af søjlechromatografi bindes til et polykondensationsprodukt, der er fremstillet ved omsætning af 1 mol 1,3-phenylendiamin med 1-10 mol glutar-dialdehyd, eventuelt i nærværelse af et finkornet, fast indifferent uorganisk bæremateriale for proteiner, herunder enzymer, hvilket bæremateriale kan være en siliciumforbindelse eller et metaloxid, og hvilken polykondensation eventuelt er udført i et to-fasesystem.

Det anvendte kondensationsprodukt (PAG-harpiks) har i forhold til det allerede kendte, ovenfor anførte kondensationsprodukt af 1.3- phenylendiamin og formaldehyd en række meget fordelagtige egenskaber, som gør det særdeles velegnet som bærestof til binding af proteiner af forskelligste art og oprindelse: Der dannes større partikler, som er lettere filtrerbare, hurtigere sedimenterende og derfor i almindelighed lettere at håndtere; bindingskapaciteten for proteiner er væsentligt højere end for det kendte 1.3- phenylendiamin-formaldehyd-kondensationsprodukt, hvorved en større mængde protein/g bærestof end ved 1,3-phenylendiamin-form-aldehyd kan bindes til harpiksen - målt under samme betingelser mindst dobbelt så stor bindingskapacitet (bindingskapaciteten angives i mg protein (enzym)/g (ml) bærer (sediment). Målingen heraf foretages f.eks. ved anvendelse af de bundne enzymer til katalyse af biologiske reaktioner under standardiserede betingelser); kondensationsproduktet er allerede et aktiveret bærestof, som straks kan indsættes, og på grund af den høje aktivitet med hensyn til binding eller uopløseliggørelse af proteiner, respektive enzymer, kan bindingen af proteinet foretages på meget enkel måde. Endelig er produktet meget billigt.

De omhandlede bundne proteiner og de ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede bundne proteiner er derfor fordelagtige i forhold til proteiner bundet til det kendte 1,3-phenylendiamin-form- 4 142033 aldehyd-kondensationsprodukt ved, at proteinerne bindes til bærematerialet, phenylendiamin-glutardialdehyd, i en mængde, der er mindst dobbelt så stor.

Som proteiner, der kan bindes til kondensationsproduktet, kan anføres polypeptider, antigener, antistoffer, proteininhibitorer og især enzymer. Enzymerne kan være af vegetabilsk, animalsk eller mikrobiel oprindelse. Der kan anvendes hydrolaser (peptidaser, proteinaser, desaminaser, carbohydraser og esteraser), lyaser eller desmolaser (hydrolyaser, decarboxylaser og aldolaser), transferaser, isomeraser, oxidoreduktaser og ligaser. Eksempler på enzymer, ud fra hvilke der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan fremstilles uopløselige enzympræparater, er alkoholdehydrogenaser, naringinase, hesperidinase, β-glucosidase, α-amylase, invertase, amyloglucosidase, urease, trypsin, ficin, papain, bromelin og cytochrom.

Molforholdet mellem kondensationspartnerne 1,3-phenylendiamin og glutardialdehyd ligger mellem 1:1 og 1:10, fortrinsvis ved ca. 1:3.

Omsætningen kan udføres på kendt måde, f.eks. i vandig opløsning, fortrinsvis under tilsætning af en syre. Ved en særlig udførelsesform arbejdes der i nærværelse af et inert, finkornet, uorganisk, især silicatholdigt, bæremateriale for proteiner eller enzymer. Eksempler på sådanne bærematerialer er silicagel, diatoméjord, kiselgur, bentonit, wollastonit og porøst glas, men der kan også anvendes metaloxider såsom aluminiumoxid eller hydroxylapatit.

Der anvendes fortrinsvis silicagel, f.eks. med en partikelstørrelse på 0,05 - 0,2 mm (70 - 325 mesh). Ved tilstedeværelse af et sådant bæremateriale opnås en homogen partikeldannelse ved kondensationen, hvilket igen medfører bedre sedimentation. Kondensationen i nærværelse af et bæremateriale udføres hensigtsmæssigt på den måde, at partiklerne først bringes i berøring med én af de to komponenter, hvorefter den anden komponent tilsættes under samtidig eller påfølgende let syrning.

Kondensationen kan foretages i homogen fase eller fortrinsvis i et to-fasesystem under tilsætning af en syre, fortrinsvis saltsyre, under kraftig omrøring eller omrystning. Anvendelsen af et to-fase- 5 142033 system befordrer dannelsen af sfæriske, i udstrakt grad homogene, let filtrerbare og godt sedimenterende partikler, som er særlig velegnede som bærestoffer.

Som anden fase kan anvendes inerte, med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmidler, f.eks. dichlormethan, chloroform, carbon-tetrachlorid, benzen, toluen, ethylacetat, dioxan og carbondisulfid. Det foretrækkes især at anvende chloroform som organisk opløsningsmiddel .

Ved den beskrevne fremgangsmåde fås et allerede meget aktivt bærestof, som dog ved direkte diazotering kan aktiveres yderligere.

Diazoteringen kan udføres på i og for sig kendt måde ved behandling af kondensationsproduktet med nitrit og syre.

Til bindingen af proteinerne til bærestoffet behandles dette med en vandig, fortrinsvis en pufret, opløsning af proteinet (1 - 50 mg/ml) ved en temperatur på ca. 0 - 30°C, fortrinsvis mellem 4°C og stuetemperatur, og behandlingen kan foretages under omrøring eller rystning. Bindingen af proteinet sker sandsynligvis ved kemisk binding, f.eks. til diazogrupperne i det behandlede bærestof. På grund af den høje aktivitet hos bærestoffet kan bindingen af proteiner også fordelagtigt foregå ved en simpel filtrering af proteinopløsningen gennem et lag af bærestoffet, fortrinsvis gennem en med basrer fyldt søjle, som det f.eks. er sædvanligt ved søjlechromatografi. Således kan man f.eks. lade kulturfiltrater af mikroorganismer, som indeholder proteiner eller enzymer, løbe direkte over en bærestofsøjle, hvorhos proteinerne eller enzymerne bindes selektivt. Der eftervaskes også med pufferopløsning og 1M KCl-opløsning til fjernelse af ikke-bundne proteiner.

De på bærestofferne bundne proteiner er i almindelighed meget stabile, og der nås med enzymer meget høje specifikke aktiviteter (enhed/g). Der kan bæres mindst fra 1:3 til 1:10 vægtdele protein/-bærer. Aktivitetsangivelsen for det bundne enzym angives som det antal enzymenheder, der er bundet på hvert gram bærestof. Denne enhed er igen den enzymmasngde, der pr. minut omsætter 1 mikrogram substrat, hvorhos denne omsætning måles under standardiserede betingelser. Høj specifik aktivitet betyder derfor, at det ved an- 6 142033 vendelse af små mængder enzympræparat er muligt at få høj katalytisk aktivitet.

De omhandlde bærerbundne proteiner, især enzymerne, kan anvendes på i og for sig kendt måde, f.eks. til analytiske eller præparative formål eller i levnedsmiddelteknologien, f.eks. ved dannelse af aromastoffer (jfr. f.eks. Scientific American 224 (No. 3) 26 - 33 (1971), Angew. Chemie 8£, (8) 319 - 368 (1972), Chemiker Zeitung 96, (11), 595 - 602 (1972), C & EN, (15.2.71), 86 - 87).

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler 1 - 8, i hvilke mængdeangivelserne af det vundne eller det anvendte bærestof er beregnet på tørvægt, og fremstillingen af bærestoffet beskrives i eksempel A - F:

Eksempel A.

Til en opløsning af 5,0 g (0,05 mol) 1,3-phenylendiamin i 50 ml vand og 10 ml koncentreret saltsyre sættes under kraftig omrøring 50 g (0,125 mol)glutardialdehyd (25%'s vandig opløsning). Ved begyndende størkning af reaktionsblandingen tilsættes 300 ml vand. Der omrøres i yderligere 1 time ved stuetemperatur, hvorefter der afsuges over en Buchner-tragt under reduceret tryk. De fine polymerpartikler vaskes med 0,1N NaOH-opløsning og vand, og opbevares i 0,01N NaOH-opløsning. Udbytte: 13,8 g.

Eksempel B.

Til en opløsning af 5 g (0,05 mol) 1,3-phenylendiamin i 300 ml chloroform sættes under kraftig omrøring først 50 g (0,5 mol) glutar-dialdehyd og efter yderligere 5 minutters forløb 20 ml 7N saltsyreopløsning. Reaktionsblandingen størkner straks. Der tilsættes 100 ml vand og rystes i 5 minutter, til den igen er flydende. Efter frasugning af reaktionsblandingen over en Buchner-tragt vaskes polymerpartiklerne med 0,1N NaOH-opløsning. Resterende chloroform fjernes ved vask med acetone. Udbytte: 14 g. De således vundne bærepartikler er sfæriske, homogene og godt filtrerbare; de opbevares i vand eller i fortyndet natriumhydroxidopløsning.

Eksempel C.

7 142033

Til en opløsning af 2,0 g (0,02 mol) 1,3-phenylendiamin i 50 ml benzen sættes under omrøring 30 g silicagel. Efter 10 minutters omrøring ved stuetemperatur frafiltreres silicagelen over en Buchner-tragt og suges tør. Ved silicagel endnu vedhængende benzen forstyrrer ikke den videre reaktion. De med 1,3-phenylendiamin imprægnerede silicagelpartikler sættes derefter hurtigt under kraftig omrøring til en blanding af 50 g(0,125 mol)glutardialdehyd (25%'s opløsning i vand), 10 ml koncentreret saltsyre og 340 ml vand.

Der indtræder straks polymerisation. Den orangerøde polymer røres i 1 time ved stuetemperatur, frafiltreres over en Blichner-tragt under reduceret tryk og vaskes med vand til neutral reaktion. Det således vundne bærestof opbevares derefter i en svagt alkalisk opløsning (0,01N NaOH)-opløsning.

Eksempel D.

Til 50 g(0,125 mol)glutardialdehyd (25%'s vandig opløsning) sættes under kraftig omrøring 30 g silicagel. Massen sættes derefter til en opløsning af 5 g (0,05 mol) 1,3-phenylendiamin i 300 ml chloroform under kraftig omrystning. Efter tilsætning af 10 ml 7N saltsyreopløsning og 100 ml vand rystes der i yderligere 10 minutter.

Reaktionsproduktet oparbejdes som beskrevet i eksempel B. Der fås homogene, sfæriske partikler, som hurtigt sedimenterer og udmærket kan filtreres.

Eksempel E.

På analog måde som beskrevet i eksempel C og D fremstilles bæremateriale, hvor der i stedet for silicagel anvendes diatoméjord.

Eksempel F.

En suspension af 1 g af det som beskrevet i eksemplerne A - E vund- 8 142033 ne kondensationsprodukt i 30 ml vand syrnes med 1,15 ml koncentreret saltsyre ved 0°C. Til den iskolde suspension sættes dråbevis og under omrøring IN natriumnitritopløsning. Efter endt omsætning fra-filtreres det sort-violetfarvede bæremateriale og vaskes med koldt vand og en pufferopløsning (pH-værdi 4-8,5 alt efter pH-værdien i proteinopløsningen, som derefter skal fikseres).

Eksempel 1.

0,23 g af det som beskrevet i eksempel B vundne bæremateriale diazo-teres på den i eksempel F beskrevne måde og fyldes i en chromatogra-fisøjle (1,5 x 15 cm). En opløsning af 1 g amyloglucosidase (107 enheder/mg) i 100 ml 16 millimol acetatpuffer (pH-værdi 4,8) hældes ved stuetemperatur og med en gennemstrømningshastighed på 20 ml/time over søjlen. Det fikserede enzym opviser en aktivitet på 14.300 enheder/g bæremateriaie.

Eksempel 2.

En suspension af 1 g diazoteret bæremateriale (fremstillet som beskrevet i eksempel c eller D) i 20 millimol phosphatpuffer (pH-vær-di 5,2) hældes på en chromatografisøjle (1,5 x 15 cm). En opløsning af 500 mg invertase (150 enheder/mg) i 50 ml 20 millimol phosphatpuffer (pH-værdi 5,2) hældes ved stuetemperatur og med en gennemstrømningshastighed på 20 ml/time over søjlen. Søjlen vaskes med 50 ml 20 millimol phosphatpuffer (pH-værdi 5,2) og 50 ml IN kaliumchloridopløsning. Bundet enzymmængde: 349 mg. Det bundne enzyms aktivitet: 4.280 enheder/g bærer. Aktiviteten af det bundne enzym er 8,5% sammenlignet med det opløselige enzyms aktivitet. Vægtforholdet mellem enzym og bærestof er ca. 1:3. Et ud fra 20 g diazoteret bæremateriale og 10 g invertase, på analog måde fremstillet invertasepræparat har en aktivitet på 17,6% sammenlignet med det opløste enzyms aktivitet, idet enzympræparatets aktivitet er større, jo større den anvendte mængde af materialet er. [Der kan eksperimentelt arbejdes bedre med større mængder.]

Eksempel 3.

9 142033 1 g diazoteret bæremateriale (fremstillet som beskrevet i eksempel C eller D) i 0,1M phosphatpuffer (pH-værdi 7,0) fyldes i en chro-matografisøjle (1,5 x 15 cm). En opløsning af 600 ml ficin i 60 ml af en opløsning af 0,1M phosphatpuffer, 7 millimol mercaptoethanol og 1 millimol EDTA (pH-værdi 7,0) hældes ved stuetemperatur og med en gennemstrømningshastighed på 20 ml/time over søjlen. Der eftervaskes med 50 ml af den samme pufferopløsning og 50 ml 1M kaliumchloridopløsning. Bundet enzym: 459 mg. Den med casein som substrat bestemte aktivitet af det bundne enzym andrager 15% af det opløselige enzyms aktivitet.

Eksempel 4.

Gennem en søjle med 2 g diazoteret, ifølge eksempel C eller D fremstillet bæremateriale, hældes en opløsning af 4 g naringinase i 100 ml 0,05M citratpuffer (pH-værdi 6,5) ved stuetemperatur med en gennemstrømningshastighed på 20 ml/time. Den bærerbundne naringinase viser en aktivitet på 32% i sammenligning med det opløselige enzyms aktivitet.

Eksempel 5.

2 g diazoteret, som beskrevet i eksempel C eller D fremstillet bæremateriale rystes i 1 time ved 4°C med en opløsning af 600 mg naringinase i 50 ml 0,05M citratpuffer (pH-værdi 6,5). Aktiviteten af den bundne naringinase andrager 50% sammenlignet med det opløselige enzyms aktivitet.

Eksempel 6.

På samme måde som beskrevet i eksempel 5 bindes 40 mg hesperidinase i 50 ml 0,05M citratpuffer (pH-værdi 6,5) til bærematerialet. Det bundne enzyms aktivitet andrager 27% af det opløselige enzyms aktivitet.

Claims (1)

1. Biologisk aktive proteiner, især enzymer, bundet til et poly-kondensationsprodukt af en aromatisk diamin og et aliphatisk dialdehyd, hvilket polykondensationsprodukt eventuelt er diazoteret, kendetegnet ved, at polykondensationsproduktet er fremstillet ved omsætning af 1 mol 1,3-phenylendiamin med 1-10 mol glutardialdehyd, eventuelt i nærværelse af et finkornet, fast inert uorganisk bæremateriale for proteiner, herunder enzymer, hvilket bæremateriale kan være en siliciumforbindelse eller et metaloxid.