DK141666B - Fremgangsmaade til samtidig udvinding af insulin og pancreatin fra svinepancreas - Google Patents

Description

^ p £ y OD FREMLÆeSELSISSIRIFT 1^+1666 DANMARK (81) ,nt 0,3 c 12 Μ 9/9Λ IVIMnfV a 61 K 37/26 «(21) An—gning nr. 5813/75 (22) Ind—tt dm 19· d©C . 1975 (23) Lnbedne 19· deC. 1975 (44) An—gning— fremlagt og frenriliJuuuuluuwKi'lftet offeridggjmt den 19·. ΐ9δθ

Dl REKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET 0®> Worftot begeøret fra den

20. dec. 1974, 2460334, DE

(71) HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, Bruenlngstrasse 45, 6230 Frankfurt/ '

Main 80, DE.

(72) Opfinder: Leonhard Haefner, Koenigsteliy'Taunue, Am Erdbeerstein 26, BE: Wilhelm Schramm, Kelkhelm/Taunus, Ameelweg 18, DE: Hane Kar gi, Schwalbach/Tstunus, Schwalbenstrasse 30, BE: Friedrich Kieser, Epp* gtein/Taunus, Staufenstrasse 8, DE.

(74) Fukln—gtig under ugana ball—dllngi

Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Go.

(64) Fremgangsmåde til samtidig udvinding af insulin og pancreatin fra svinepancreas.

Bugspytkirtler fra slagtedyr er interessante som farmaceutiske råstoffer i to henseender. De anvendes for det første som det eneste udgangsmateriale til udvinding af insulin, og for det andet indeholder de enzymer, der er værdifulde til terapeutisk anvendelse. Således er bugspytkirtler fra kreaturer vigtige for udvindingen af trypsin og chymotrypsin foruden insulin, mens der ud fra bugspytkirtler fra svin kan udvindes den terapeutisk værdifulde enzyroblanding pancreatin med lipolytiske, amylolytiske og proteolytiske virkninger.

På grund af denne bifunktionalitet er der, så længe stoffer fra bugspytkirtler er blevet anvendt i medicinen, farmacien og teknikken, blevet udført talrige forsøg på at udvinde begge 2 141666 systemer af virksomt stof fra et fælles udgangsmateriale. I vejen for en sådan dobbeltforarbejdning står imidlertid vanskeligheder, der ligger deri, at det til udvinding af insulin er nødvendigt at anvende ekstraktionsbetingelser, under hvilke enzymerne for størstedelens vedkommende inaktiveres irreversibelt. Til fuldstændig ekstraktion af insulinet foretrækkes der således sure betingelser, for det meste en pH-værdi under 4, i nærværelse af et organisk opløsningsmiddel, for det meste 50-80 volumenprocents ethanol. Amylaserne og lipaserne i pancreas er imidlertid ikke bestandige under disse betingelser og denatureres i vidt omfang.

Det proteolytiske system trypsin-chymotrypsin udviser en større bestandighed. Den supplerende udvinding af krystalliseret trypsin eller trypsin-chymotrypsin-blanding fra ekstraktionsremanenserne fra insulinfabrikationen er f.eks. kendt fra britisk patentskrift nr. 613.030, tysk patentskrift nr. 875.640, fransk patentskrift nr. 999.346, USA-patentskrift nr. 2.686.148 og 2.751.330 eller tysk patentskrift nr. 1,013.834.

Den samtidige udvinding af insulin og pancreatin er derimod mere problematisk. En økonomisk anvendelig fremgangsmåde er på grund af de ovenfor beskrevne vanskeligheder hidtil ikke blevet tilvejebragt. Således er der i tysk patentskrift nr. 745.284 beskrevet en fremgangsmåde, ved hvilken ekstraktionen af insulinet gennemføres ved en pH-værdi i det basiske område for at beskytte enzymerne mest muligt. Fra tysk patentskrift nr. 874.062 og 875.856 kendes den enzymskånende, sure insulinekstraktion. En-. zymerne skades imidlertid også ved disse fremgangsmåder så meget, at der under økonomiske betingelser ikke kan fremstilles et produkt, der opfylder de nutidige krav.

Foruden de absolutte pH-værdiområder, i hvilke der arbejdes, er en af hovedårsagerne til den betydelige enzyminaktivering åbenbart anvendelsen af uorganiske eller organiske syrer til indstilling af pH-værdien. Ved fremgangsmåden ifølge tysk fremlæggelsesskrift nr. 2.146.275 tages også hensyn til denne erkendelse. Her beskrives udvindingen af insulin foruden pancreatin fra frysetørrede bugspytkirtler. Fra de affedtede, lyophiliserede kirtler ekstraheres insulinet med et vandigt-organisk Opløsningsmiddel, fortrinsvis 60-80%'s ethanol, efter tilsætning af neutralsalte, såsom natriumchlorid, uden direkte syretilsætning. Ekstraktionen af insulin fra friske eller dybfrosne bugspytkirtler efter tilsætning af salte, såsom natriumchlorid eller ammoniumchlorid, er 3 141666 kendt fra USA-patentskrift nr. 2.779*706.

Alle de hidtil beskrevne fremgangsmåder har betydelige ulemper, dels fordi insulinudbyttet er for ringe, og dels fordi enzymerne i vidt omfang inaktiveres, eller der skal indskydes teknologisk omfattende og dermed dyre procestrin, såsom frysetørring.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til samtidig udvinding af insulin og pancreatin fra friske eller dybfrosne svinebugspyt-kirtler ved ekstraktion af kirtlerne i nærværelse af acetone, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der til ekstraktionen anvendes et vandigt ekstraktionsmiddel indeholdende mindst 40 vol.-% acetone, og hvori der er opløst et første opløseligt salt, hvis kation er en ugiftig flervalent metalion, fortrinsvis en calciumion, som reagerer med insulinets sure ledsagestoffer til dannelse af udissocierede forbindelser under frigørelse af hydrogenioner derfra til tilvejebringelse af en pH-værdi på 5-7 i pankreas-ekstrak-tionsmiddelblandingen, ekstrakten skilles fra det tilbageværende faste stof efter ekstraktionen, hvorefter pH-værdien af det fremkomne faste stof omgående indstilles til over 5,6 ved at forene det med en puffer, hvorved den således fremkomne ekstrakt er et insulin-holdigt materiale, fra hvilket insulin isoleres på i og for sig kendt måde, og det således fremkomne faste stof er et pancreatin-holdigt materiale, fra hvilket pancreatin isoleres på i og for sig kendt måde.

Ved den her omhandlede fremgangsmåde undgås ulemperne ved de hidtil kendte arbejdsmåder. Det har overraskende vist sig, at ekstraktionen af insulin fra friske bugspytkirtler eller fra bugspytkirtler, der er konserveret ved dybfrysning, kan foregå på en overordentlig skånsom måde, når der til de findelte kirtler, der er suspenderet i en blanding af vand og acetone, sættes en opløsning af et salt, hvis kationer er i stand til at reagere med stofferne i kirtler på en sådan måde, at der fra reaktionsblandingen frigøres hydrogenioner, der medfører en pH-værdifor-skydning. Til frigørelse af hydrogenioner kan der først og fremmest være tale om fedtsyrer, der danner udissocierede forbindelser med metalioner. På tale som metalioner koanmer sådanne, der er fysiologisk acceptable, da det for det meste ikke kan undgås, at rester af disse salte forbliver i pancreatinet.

Metalioner, der derimod ikke kommer i betragtning, er sådanne metalioner, især sådanne tungmetalioner, der 4 141666 nedsætter slutprodukternes hormon- eller enzymvirkning. Der anvendes fortrinsvis vandopløselige calciumsalte, men der kan også anvendes magnesium-, zink-, aluminium-, jern-, cobalt-, nikkel-, tin- og mangansalte. Den nødvendige mængde af saltet, der skal tilsættes, bestemmes ved pH-værdimåling. Der anvendes fortrinsvis calciumsalte, især calciumchlorid, for det første på grund af deres gode opløselighed, og for det andet fordi de er fysiologisk acceptable. En fordelagtig bivirkning er den kendte, enzymstabiliserende virkning af calciumionerne.

F.eks. kan der ved tilsætning af ca. 0,7% calciumchlorid til de findelte kirtler, der er suspenderet i en acetone-vand--blanding, således opnås en forskydning af blandingens pH-værdi mod en pH-værdi på 5-6, fortrinsvis 5,4-5,6. Under disse betingelser undergår de følsomme enzymer i pancreas en forringelse, der så lille, at den næppe kan påvises. Denne virkning kan eventuelt forstærkes ved tilsætning af et egnet salt, hvis den kemiske reaktion af dette salt med calciumsaltet bevirker en frigørelse af hydrogenioner. Egnet hertil er sure salte af flerbasiske syrer, hvis de tilsvarende calciumsalte, der dannes herved, kun i ringe omfang eller slet ikke dissocieres under de fremherskende betingelser. F.eks. er natriumdihydrogenphosphat eller dinatrium-hydrogenphosphat egnet hertil.

Tilsætninger af andre, neutrale salte, såsom natriumchlo-rid eller ammoniumchlorid og lignende, der undertiden anvendes til ekstraktion af insulin under andre betingelser, forstyrrer ikke disse reaktioner og kan eventuelt tilsættes.

F.eks. kan den her omhandlede fremgangsmåde gennemføres på følgende måde: De friske eller ved dybfrysning konserverede svinebugspytkirtler findeles og suspenderes i en blanding af f.eks. 24 volumenprocent vand og 76 volumenprocent acetone, til hvilken der er sat de nævnte, neutrale salte samt eventuelt de ovenfor nævnte salte af flerbasiske syrer. Ved ekstraktionen og den efterfølgende fraskillelse af de uopløselige kirtelbestanddele er det fordelagtigt at holde acetonekoncentrationen i den flydende fase på mellem 40 og 80 volumenprocent for på den ene side at gøre det muligt at opløse insulinet fra kirtelvævet og på den anden side for at forhindre aktivering af zymogener på grund af auto-lytiske processer i udgangsblandingen.

141666 5

Ekstraktionsvæskens volumen fastlægges ved praktiske overvejelser, der er begrundet i en tilstrækkelig opløsning af det virksomme stof og en gunstig teknisk håndtering af suspensionen. Særlig fordelagtig er en fremgangsmådevariant, ved hvilken suspensionens indhold af fast stof ligger mellem ca. 10 og 20%. Til denne blanding sættes der hensigtsmæssigt først calciumsaltet, bedst i form af en vandig opløsning. Derefter omrøres suspensionen, der er indstillet til den ønskede pH-værdi, der er fordelagtigt ligger mellem 5 og 7, dog fortrinsvis mellem 5,4 og 5,6. Den tilstrækkelige ekstraktionstid er, hvis der arbejdes i sædvanlige rørebeholdere, ca. 0,5-1,5 timer. Derefter fraskilles de faste stoffer, fortrinsvis ved centrifugering. Ved den her omhandlede fremgangsmåde kan det faste stof også ekstraheres flere gange, men antallet af ekstraktioner bør med henblik på en god kvalitet af pancreatinet holdes så lavt som muligt.

De klarede ekstrakter forenes eventuelt og indstilles ved tilsætning af basiske opløsninger til en pH-værdi mellem 7 og 8, fortrinsvis mellem 7,3 og 7,7. Hertil anvendes der fordelagtigt svagt ammoniakvand, natriumhydroxidopløsning eller en vandig opløsning af et salt, der hydrolyserer med basisk reaktion, f.eks. dinatriumhydrogenphosphat. Den inerte proteinfraktion, der eventuelt udflokker herved, kan fraskilles ved centrifugering. Den klare ekstrakt indstilles igen til sur reaktion, befries i vakuum for acetone og affedtes, koncentratet fældes med kogsalt, og den fremkomne saltkage videreforarbejdes til insulin på i og for sig kendt måde.

Det faste stof, der fremkommer ved fraskillelsen af den insulinholdige ekstrakt, er pancreatin-udgangsmaterialet. For at skåne enzymaktiviteten indstilles det omgående til en pH-værdi mellem 6 og 7 ved tilsætning af en opløsning af puffersalt eller en puffersaltblanding og videreforarbejdes derefter på i og for sig kendt måde til pancreatin.

Eksempel 1.

50 kg dybfrossen svinepancreas findeles i en kødmaskine og suspenderes i en blanding af 120 liter acetone og 50 liter vand ved 15°C. Ved tilsætning af vandig calciumchloridopløsning (100 g calciumchlorid i 150 ml vand) indstilles pH-værdien til 141666 6 5,6» Der omrøres i 30 minutter ved 15°C og tilsættes 45 liter acetone, hvorefter det faste stof fraskilles ved centrifugering.

Den klare fase indeholder insulinet, og det faste stof forarbejdes til pancreatin.

Det faste stof sammenæltes med 40 liter vandig dinatrium-hydrogenphosphatopløsning, der indeholder så meget phosphat, at der indstilles en pH-værdi på 6,0-6,5, og ved vakuumdestillation ved en produkttemperatur på 25°C indstilles der et acetoneindhold på 15%. Den tyktflydende destillationsremanens holdes nu afhængigt af kirtelkvaliteten i indtil 3 timer ved 25°C, hvorefter den sammenrøres med 250 liter acetone og opvarmes til 30°C.

Det faste stof og den klare fase adskilles ved centrifugering. Det faste stof ekstraheres yderligere ved 25°C med 150 liter acetone, der indeholder 10 liter vand, fraskilles ved centrifugering og tørres i vakuum ved 25-30°C for at bevare enzymaktiviteten .

Udbytte: 9 kg pancreatin.

Insulinekstrakten, der fås ved centrifugeringen, inddampes i vakuum, til den er fri for acetone. Fedtet, der udfælder derved, fraskilles. Fra den vandige destillationsremanens isoleres det opløste insulin på i og for sig kendt måde.

Udbytte: 3 g insulin med 25 I.E./mg = 75 000 I.E. insulin

Eksempel 2,

Blandingen, der anvendes til insulinekstraktion, består af 120 liter acetone og 50 liter vand, hvori der er opløst 1 kg ammoniumchlorid og 0,5 kg primært natriumhydrogenphosphat.

De øvrige mængder, betingelser, herunder tilsætning af calciumchloridopløsning, og udbytter er de samme som i eksempel 1.