CH628322A5 - Verfahren zur gleichzeitigen gewinnung von insulin neben pankreatin aus schweinepankreas. - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung von Insulin und Pankreatin aus frischen oder tiefgefrorenen Schweinepankreata durch Extraktion der Drüsen mit Aceton, bei dem man zur Extraktion ein Reaktionsgemisch mit mindestens 40% Aceton verwendet und bei einem pH-Wert von 5 bis 7 extrahiert, nach Extraktion, gegebenenfalls nach weiterem Acetonzusatz, den Feststoff vom Extrakt trennt, den Extrakt in an sich bekannter Weise auf Insulin verarbeitet und den Feststoff nach dem Abtrennen aus dem Extraktionsgemisch durch Zugabe eines Puffers auf einen pH-Wert oberhalb von 5,6 stellt und in an sich bekannter Weise zu Pankreaktin verarbeitet. Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Extraktion zur Einstellung des pH-Wertes wasserlösliche Salze mit Kationen, die mit den sauren Begleitstoffen des Insulins unter den Extraktionsbedingungen undissoziierte Verbindungen bilden, verwendet.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren werden die Nachteile der bisher bekannten Arbeitsweisen vermieden. Uberraschenderweise wurde gefunden, dass die Extraktion von Insulin aus frischen oder durch Tiefkühlung konservierten Pankreata in überaus schonender Weise erfolgen kann, wenn man den zerkleinerten Drüsen, die vorteilhaft in einem Gemisch aus Wasser und Aceton suspendiert sind, die Lösung eines Salzes zusetzt, dessen Kationen in der Lage sind, mit Inhaltsstoffen der Drüsen so zu reagieren, dass Wasserstoffionen aus dem Reaktionsgemisch freigesetzt werden, die eine pH-Verschiebung verursachen. In erster Linie kommen für die Freisetzung der Wasserstoffionen Fettsäuren in Frage, die mit Metallionen undissoziierte Verbindungen bilden. Als Metallionen kommen insbesondere solche in Frage, die physiologisch unbedenklich sind, da es sich meist nicht vermeiden lässt, dass Reste dieser Salze im Pankreatin verbleiben.

Weniger in Betracht kommen dagegen solche Metallionen, insbesondere solche Schwermetallionen, die die Endprodukte in ihren Hormon- bzw. Fermentaktivitäten beeinträchtigen. Vorzugsweise verwendet man wasserlösliche Calciumsalze, jedoch können auch Magnesium-, Zink-, Aluminium-, Eisen-, Kobalt-, Nickel-, Zinn- und Mangan-Salze verwendet werden. Die erforderliche Menge des zuzusetzenden Salzes kann durch pH-Wert-Messung ermittelt werden. Calciumsalze, insbesondere Cal-ciumchlorid, werden bevorzugt verwendet, einmal wegen ihrer guten Löslichkeit, zum anderen wegen ihrer physiologischen Unbedenklichkeit. Ein vorteilhafter Nebeneffekt ist die bekannte enzymstabilisierende Eigenschaft der Calciumionen.

Beispielsweise lässt sich durch Zusatz von ca. 0,7 % Cal-ciumchlorid zu den in einem Aceton-Wasser-Gemisch suspen-

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dierten zerkleinerten Drüsen so eine Verschiebung des pH- tronlauge oder eine wässrige Lösung eines mit alkalischer Reak-

Wertes der Mischung nach pH 5-6, vorzugsweise 5,4—5,6 errei- tion hydrolysierenden Salzes wie z.B. Dinatriumhydrogenphos-chen ; Bedingungen, unter denen die empfindlichen Enzyme des phat. Die hier gegebenenfalls ausflockende Inertproteinfraktion Pankreas eine kaum nachweisbare Minderung erleiden. Dieser lässt sich durch Zentrifugieren abtrennen. Der klare Extrakt Effekt lässt sich gegebenenfalls durch Zusatz eines geeigneten 5 wird wieder sauer gestellt, im Vakuum vom Aceton befreit, entSalzes verstärken, wenn die chemische Reaktion dieses Salzes fettet, das Konzentrat mit Kochsalz gefällt und der erhaltene mit dem Calciumsalz eine Freisetzung von Wasserstoffionen be- Salzkuchen in an sich bekannter Weise auf Insulin weiterverar-wirkt. Geeignet hierfür sind saure Salze mehrbasischer Säuren, beitet.

wenn die entsprechenden Calciumsalze, die hierbei gebildet Der nach der Abtrennung des insulinhaltigen Extraktes an-

werden, schwach oder gar nicht unter den vorherrschenden Be- io fallende Feststoff bildet das Ausgangsmaterial für Pankreatin, dingungen dissoziieren. Beispielsweise eignen sich hierfür Na- Zur Schonung der Fermentaktivitäten wird er unverzüglich triumdihydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat. durch Zugabe der Lösung eines Puffersalzes oder eines Puffer-

Zusätze von anderen Neutralsalzen wie Natriumchlorid salzgemisches auf einen pH-Wert oberhalb 5,6, vorzugsweise oder Ammoniumchlorid und ähnliche, wie sie für die Extraktion zwischen 6 und 7 gebracht und dann in an sich bekannter Weise von Insulin unter anderen Bedingungen gelegentlich verwendet 15 zu Pankreatin verarbeitet.

werden, stören diese Reaktion nicht und können gegebenenfalls Beispiel 1

zugesetzt werden. 50 kg tiefgefrorene Schweinepankreas werden mit einem

Beispielsweise lässt sich das erfindungsgemässe Verfahren Fleischwolf zerkleinert und in einer vorgelegten Mischung aus foigendermassen durchführen: Die frischen oder durch Tiefküh- 1201 Aceton und 501 Wasser bei 15 °C suspendiert. Durch lung konservierten Schweinepankreata werden zerkleinert und 20 Zugabe von wässriger Calciumchloridlösung (100 g Calciumin einem Gemisch aus beispielsweise 24 Vol.-% Wasser und 76 chlorid in 150 ml Wasser) wird der pH-Wert auf 5,6 eingestellt. Vol.-% Aceton, dem gegebenenfalls die erwähnten Neutralsal- Man rührt 30 Minuten bei 15 °C, versetzt mit 451 Aceton und ze sowie die vorstehend erwähnten Salze mehrbasischer Säuren trennt dann den Feststoff durch Zentrifugation ab. Die Klarpha-zugesetzt worden sind, suspendiert. Für die Extraktion und die se enthält das Insulin, der Feststoff wird zu Pankreatin verar-nachfolgende Abtrennung der unlöslichen Drüsenbestandteile 25 beitet.

ist es vorteilhaft, die Acetonkonzentration in der flüssigen Phase Der Feststoff wird mit 401 wässriger Na2HP04-Lösung an-zwischen 40 und 80 VoI.-% zu halten, um einerseits die Lösung geteigt, die so viel Phosphat enthält, dass sich ein pH-Wert von des Insulins aus dem Drüsengewebe zu ermöglichen und um 6,0 bis 6,5 einstellt, und durch Vakuumdestillation bei 25 °C andererseits die Aktivierung der Zymogene durch autolytische Produkttemperatur auf einen Acetongehalt 15 0 gebracht. Der Vorgänge in der Ansatzmischung zu verhindern. 30 dickflüssige Destillationsrückstand wird nun je nach Drüsen-

Das Volumen der Extraktionsfiüssigkeit wird nach prakti- qualität bis zu 3 Stunden bei 25 °C gehalten, danach mit 2501 sehen Erwägungen festgelegt, die in der ausreichenden Lösung Aceton verrührt und auf 30 °C angeheizt.

des Wirkstoffes und in der günstigen technischen Handhabbar- Feststoff und Klarphase werden durch Zentrifugation ge-

keit der Suspension begründet sind. Von besonderem Vorteil ist trennt. Der Feststoff wird nochmals bei 25 °C mit 1501 Aceton, eine Verfahrensweise, bei der der Feststoffgehalt der Suspen- 35 das 101 Wasser enthält, extrahiert, durch Zentrifugation abge-sion etwa zwischen 10 und 20% liegt. Diesem Gemisch wird trennt und zur Erhaltung der Fermentaktivitäten im Vakuum dann zweckmässigerweise erst jetzt das Calciumsalz, am besten bei 25-30 °C getrocknet.

in Form einer wässrigen Lösung, zugesetzt. Die auf den ge- Ausbeute: 9 kg Pankreatin wünschten pH-Wert der zwischen 5 und 7, bevorzugt aber zwi- Der aus der Zentrifugation erhaltene Insulin-Extrakt wird sehen pH 5,4 und 5,6 liegt, gebrachte Suspension wird gerührt. 40 im Vakuum bis zur Acetonfreiheit eingedampft. Das dabei aus-Die ausreichende Extraktionszeit liegt, sofern man in den übli- fallende Fett wird abgetrennt. Aus dem wässrigen Destillations-chen Rührgefässen arbeitet, etwa zwischen 0,5 -1,5 Stunden. rückstand wird das gelöste Insulin in an sich bekannter Weise Danach werden die Feststoffe, bevorzugt durch Zentrifugieren, isoliert.

abgetrennt. Der Feststoff kann auch nach dem erfindungsge- Ausbeute: 3 g Insulin mit 251.E./mg = 75 000 I.E. Insulin mässen Verfahren mehrfach extrahiert werden, die Zahl der «

Extraktionen sollte jedoch im Interesse einer guten Qualität des Beispiel 2

Pankreatins möglichst gering gehalten werden. Die zur Insulinextraktion verwendete Mischung besteht aus

Die geklärten Extrakte werden gegebenenfalls vereinigt und 1201 Aceton und 501 Wasser, in denen 1 kg Ammoniumchlorid durch Zusatz von alkalischen Lösungen auf einen pH-Wert zwi- und 0,5 kg prim. Natriumhydrogenphosphat gelöst sind.

sehen 7 und 8, bevorzugt zwischen 7,3-7,7 eingestellt. Hierfür so Sonstige Ansatzmengen und -bedingungen und Ausbeuten verwendet man vorteilhaft schwaches Ammoniakwasser, Na- wie unter Beispiel 1.

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Claims (3)

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1. Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung von Insulin neben Pankreatin aus frischen oder tiefgefrorenen Schweinepan-kreata durch Extraktion der Drüsen mit Aceton, bei dem man zur Extraktion ein Reaktionsgemisch mit mindestens 40 % Ace- 5 ton verwendet und bei einem pH-Wert von 5 bis 7 extrahiert, den Feststoff nach der Extraktion vom Extrakt abtrennt, den Extrakt zu Insulin aufarbeitet, und den Feststoff nach dem Abtrennen aus dem Extraktionsgemisch durch Zugabe eines Puffers auf einen pH-Wert oberhalb 5,6 einstellt und zu Pankreatin 10 verarbeitet, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Extraktion zur Einstellung des pH-Wertes wasserlösliche Salze mit Kationen, die mit den sauren Begleitstoffen des Insulins unter den Extraktionsbedingungen undissoziierte Verbindungen bilden, verwendet. 15

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass man dem Extraktionsgemisch zusätzlich lösliche saure Salze mehrbasischer Säuren zusetzt, deren Anionen mit den Kationen der wasserlöslichen Salze zusätzlich zu den sauren Begleitstoffen unter den Extraktionsbedingungen undissoziierte Salze 20 bilden.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass man die Extraktion des Insulins bei einem Acetongehalt von 50 bis 60% im Extraktionsgemisch und die Abtrennung der Feststoffe aus dem Extrakt bei einem Acetongehalt von 60 bis 25 70% durchführt.

Die Pankreata der Schlachttiere sind als pharmazeutische 30 Rohstoffe zweifach interessant. Sie dienen einmal als alleiniges Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Insulin, zum anderen enthalten sie für die therapeutische Anwendung wertvolle Enzyme. So sind Rinderpankreata für die Gewinnung von Trypsin und Chymotrypsin neben Insulin wichtig, während aus Schwei- 35 nepankreata das therapeutisch wertvolle Enzymgemisch Pankreatin mit lipolytischen, amylolytischen und proteolytischen Aktivitäten gewonnen werden kann.

Aufgrund dieser Bifunktionalität hat es, seit pankreatische Inhaltsstoffe in Medizin, Pharmazie und Technik verwendet 40 werden, nicht an Versuchen gefehlt, aus einem gemeinsamen Ausgangsmaterial beide Wirkstoffsysteme zu gewinnen. Solcher Doppelverarbeitung stellen sich jedoch Schwierigkeiten entgegen, die darin liegen, dass für die Gewinnung von Insulin Extraktionsbedingungen erforderlich sind, unter denen die Enzy- 45 me grösstenteils irreversibel inaktiviert werden. So bevorzugt man zur vollständigen Extraktion des Insulins saure Bedingungen - meist unter pH 4 - in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels - meist 50-80 Vol.-% Äthanol. Die Amylasen und Lipasen des Pankreas sind jedoch unter diesen Bedingungen so nicht beständig und werden weitgehend denaturiert.

Eine grössere Beständigkeit zeigt das proteolytische System Trypsin-Chymotrypsin. Die zusätzliche Gewinnung von kristallisiertem Trypsin bzw. Trypsin-Chymotrypsin-Gemisch aus dem Extraktionsrückständen der Insulin-Fabrikation ist z.B. aus dem 55 Britischen Patent 613 030, dem DBP 875 640, dem Französischen Patent 999 346, den US-Patenten 2 686 148 und 2 751 330 oder dem DBP 1 013 834 bekannt.

Die gleichzeitige Gewinnung von Insulin und Pankreatin gestaltet sich demgegenüber problematischer. Ein wirtschaftlich 60 brauchbares Verfahren hat sich wegen der oben geschilderten Schwierigkeiten bisher nicht durchgesetzt. So ist in der Deutschen Patentschrift 745 284 ein Verfahren beschrieben, bei dem zum grösstmöglichen Schutz der Enzyme die Extraktion des Insulins bei alkalischem pH-Wert vorgenommen wurde. Aus den 65 Deutschen Patentschriften 874 062 und 875 856 ist die fermentschonende saure Insulinextraktion bekannt. Die Enzyme wurden jedoch auch nach diesen Verfahren so weit geschädigt,

dass kein den heutigen Ansprüchen genügendes Produkt unter wirtschaftlichen Bedingungen erhalten werden kann. Neben den absoluten pH-Bereichen, in denen gearbeitet wurde, ist offenbar eine der Hauptursachen für die erhebliche Fermentin-aktivierung die Verwendung von anorganischen bzw. organischen Säuren für die Einstellung des pH-Wertes. Dieser Erkenntnis trägt auch das Verfahren der DAS 2 146 275 Rechnung. Hier wird die Gewinnung von Insulin neben Pankreatin aus gefriergetrocknetem Pankreatin beschrieben. Aus den entfetteten lyophilisierten Drüsen wird mit wässrig-organischem Lösemittel — bevorzugt ist 60-80 % Äthanol - nach Zusatz von Neutralsalzen wie Natriumchlorid ohne direkten Säurezusatz das Insulin extrahiert. Die Extraktion von Insulin aus frischen oder tiefgekühlten Pankreata nach Zusatz von Salzen wie Natriumchlorid oder Ammoniumchlorid ist aus der US-PS 2 779 706 bekannt.

Alle bisher beschriebenen Verfahren haben erhebliche Nachteile, teils dadurch, dass die Insulinausbeute zu gering ist, teils dadurch, dass die Enzyme weitgehend inaktiviert werden oder dass technologisch aufwendig und damit teuere Verfahrensschritte wie die Gefriertrocknung dazwischengeschaltet sind.