DK142512B - Proevestrimmel med en holdedel et indikatorlag og en afdaekning - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1^+2512 (®) \R&/ DANMARK ^ i"*· ci·3 o 01 n 31/22 UMINIVIMnix β 01 N 33/52 f(21) Ansøgning nr, 1045/72 (22) Indleveret den 7· mar. 1972 (24) Løbedag 7, mar. 1972 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlaggelsesskriftet offentliggjort den 10. HOV. 1 9θ0 DIREKTORATET FOR . . . .

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Pnontet begæret fra den 16. apr. 1971, 2118455, DE (71) BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., Mannheim-Waldhof, DE.

(72) Opfinder; Hans tange, Roentgen-Str. i4, Lamperthelm, DE: Walter Ritters® dorf, Kasseler-Btr. 6, Mannheim-Waldhof, DE; Hans-Georg Rey, Hers= felder-Str. 18, Mannheim-Waldhof, DE: Peter Rieckmann, 6TTegerwald= weg, 10, MannheimrWaldhof, DE.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Firmaet Chas. Hade._______ (54) Prøves trimmel med en holdedel, et Indikatorlag og en afdækning.

Opfindelsen angår en prøvestrimmel af den i indledningen til krav 1 nævnte art og beregnet til påvisning af stoffer indeholdt i legemsvæsker.

Reagenspapirer har allerede været anvendt i lang tid,· Den mest udbredte anvendelse har pH-indikatorpapirer. Dog er også andre reagenspapirer udbredt, f.eks. curcuma-papir til syrepåvisning, kalium= jo^id-stivelse-papir til påvisning af oxidationsmidler, blyacetat-papi;r til sulfiåpåvisnipg etc. I den nyere tid har prøvepapirer specielt indenfor sektoren af den kliniske kemi fundet en stadig større betydning. De tillader lægen en særlig hurtig og bekvem, halvkvantitativ bestemmelse af patologiske bestanddele (som f.eks. glukose, _ 2 - U2512 æggehvide o.s.v.) i legemsvæsker (urin, serum etc.). Da sådanne prøvepapirer yderligere i stadig større grad anvendes af lægfolk, har det vist sig nødvendigt at ændre de udelukkende af imprægneret filter-papir bestående simple prøvepapirer til en form, der er mere sikker ved brug, og ved hvilken forstyrrelser i påvisningen kan undgås.

En af de hyppigste fejlkilder er prøvepapirernes fejlreaktion fremkaldt ved berøring med hånden eller ved ydre indflydelser som f.eks. af fugtighed og autooxidation. For at udelukke berøringen af selve prøvepapirerne er man gået over til at anbringe prøvepapiret i form af en lille rektangel på en plaststrimmel, der tjener som håndtag. Dette giver tillige en besparelse af de ofte dyre reagenser. Til beskyttelse af de følsomme reagenser overfor indvirkning af luftfugtighed og oxygen etc. har man yderligere indesluttet prøveområderne i kunststoffolier, således at den undersøgte væske kun kan trænge ind over de ubeskyttede sideflader af prøveområdet, således som det fremgår af tysk offentliggørelsesskrift nr. 1.546.307. Denne fremgangsmåde giver ganske vist en god beskyttelse af prøvepapiret, men til gengæld må man dog medtage nogle tungtvejende ulemper, som det trods intensivt arbejde indtil nu ikke er lykkedes at fjerne. Prøvepapirerne i prøvestrimmelen ifølge det nævnte skrift er ganske vist på overraskende måde også ved korte - dyppetider hurtigt fuldstændigt gennem-trængt med væske. Det kan dog forekomme, at der mellem papir og plastfolie danner sig luftblærer, som i væsentlig grad kan vanskeliggøre bedømmelsen af den fremkomne farve. Fremdeles kan det undertiden ske, at der ved væskens indtrængning fra siden optræder forstyrrende kromatografi-effekter, som bevirker en uregelmæssig farvning af prøveområdet, der kun vanskeligt kan bedømmes. For, i det mindste delvis, at ophæve de nævnte mangler, har man forsøgt at forsyne plastfolierne med huller (jf. ovenfor nævnte skrift). Da man af tekniske grunde pr. prøvezone i det højeste kan udstanse 25 huller med en minimaldiameter på 0,5 mm i folierne, ser sådanne prøvestrimler ud som et groft raster, så at en entydig farveaflæsning ikke kan sikres. På den anden side har fine perforeringer af gennemstukne folier på grund af plastens koldtflydning tilbøjelighed til igen at lukke sig. Yderligere fører perforeringen til ujævnheder på folierne og dermed til forstyrrende reflektioner i overfladen.

Et videre forsøg på at løse de foreliggende problemer bestod i at lade et større mellemrum mellem papir og kunststoffolie frit (jf.

3 142512 tysk offentliggørelsesskrift nr. 1.940.964. Dette fører til forstærkede udvaskeeffekter, frem for alt ved længere tids neddypning eller ved undersøgelser i strømmende væsker, navnlig i urinstrålen. Desuden er fremstillingen af prøvestrimler ifølge sidstnævnte skrift forholdsvis kompliceret og denned kostbar.

På overraskende måde er det nu lykkedes at fremstille prøvestrimler, som i forhold til teknikkens stade giver betydelige fremskridt, da de ikke mere er behæftet med de kendte ulemper og desuden opviser en række yderligere fordele.

Det blev fundet, at man får særlig holdbare, ikke udblødende, berøringssikre og hurtigt reagerende prøvestrimler til påvisning af indholdsstoffer i legemsvæsker, når man i det mindste dækker et med en holdedel forbundet indikatorlag, som indeholder påvisningsreagenserne, med et finmasket net.

Opfindelsen angår derfor en prøvestrimmel af den indledningsvis omtalte art og ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 anførte. Herved sikrer man en god beskyttelse af indikatorlaget ved hjælp af netværket, hvis trådtykkelse og -tæthed samtidig er således, at man får den nødvendige fysiske styrke og den tilstrækkelige transparens til sikring af en entydig aflæsning, idet den anførte udformning sikrer en yderst hurtig indtrængning af prøvevæsken i indikatorlaget.

Det finmaskede netværk beskytter de underliggende indikatorlag på overraskende måde mod berøring med hånden og mod ydre indflydelser, selv om hulfladen, d.v.s. den ikke af kæde- og skudtråde dækkede flade, kan beløbe sig til 50# og mere af netværkets totale overflade.

Da den væske, der skal undersøges, ikke blot trænger ind over sidefladerne på indikatorlaget, men overvejende gennem netværkets masker, kan forstyrrende kromatografivirkninger ikke optræde mere. Af denne grund er det nu også muligt og fordelagtigt at lægge netværket meget tæt op imod indikatorlaget.

Man måtte vente, at anvendelsen af et net som afdækning af indikatorlaget på grund af utilstrækkelig tildækning ville føre til en ikke mere acceptabel stigning af udvaskningsvirkningerne, navnlig ved prøver i urinstrålen. På forbavsende måde viste det sig dog, at det modsatte var tilfældet, og at nettet modvirker denne forstyrrelse så 4 142512 stærkt, at prøvestrimmelen ifølge opfindelsen heller ikke ved stærk befugtning såsom ved lang tids neddypning i urin eller ved befugt-ning i urinstrålen bliver udvasket. Det er ligeledes overraskende, at aflæseligheden af selv meget svage farveændringer ikke på nogen måde svækkes af nettet. Netværket forårsager tværtimod en for øjet behagelig og godt udnyttelig egalisering af de frembragte farvetoner, hvorved netværkets struktur ikke bliver synlig. En yderligere fordel ved prøvestrimlerne ifølge opfindelsen er den yderst hurtige befugtning af indikatorlaget, som fører til forsinkelsesfrie aflæselige farvereaktioner. Prøvestrimmelen ifølge opfindelsen er således for første gang i stand til uafhængigt af neddypningstiden at levere reproducerbare analyseresultater. Dette betyder en væsentlig stigning i sikkerheden ved anvendelsen af prøvestrimler.

Flere netagtige væv kan benyttes,men det foretrækkes, at netværket består af et kunststofvæv med en trådtykkelse på 20-100 μ og en fri hulflade på 40-60?6, da et væv med disse begrænsninger udgør det bedst mulige kompromis mellem netværkets permeabilitet over for væske og lys og den nødvendige beskyttelse af reagensstofferne over for blandt andet berøring. Netværket kan også være en tynd ikke-vævet materialebane, hvor man principielt opnår det samme som netop anført, og hvor man derudover, takket være materialets ringe tykkelse, bidrager til prøvestrimmelens gode forarbejdning og behandling.

For at sikre, at netværket sidder godt fast, foretrækkes det, at de udover indikatorlaget ragende zoner af netværket er forbundet med holdedelen ved et hæftelag.

Forskellige udførelseseksempler for opfindelsen er belyst i den følgende beskrivelse i forbindelse med tegningen, hvor fig. 1 viser et forstørret tværsnit af den nederste del af en prøve-strimmel ifølge opfindelsen, fig. 2 et forstørret billede af den nederste del af en prøvestrimmel ifølge opfindelsen, fig. 5 og 5 prøvestrimler, som hver har et indikatorlag, og fig. 4 og 6 prøvestrimler, hver med to indikatorlag.

I fig. 1-6 er der på en holdedel 2, som fortrinsvis består af et stift kunststoffolie, anbragt et hæftelag 3, som tildækker overfla- 5 1425 12 den af holdedelen 2 helt eller delvis. Et indikatorlag 4 befinder sig ved den nederste ende af holdedelen 2 og er énsidigt forbundet med denne eller med hæftelaget 3.

Et netværk 1 er dimensioneret større end indikatorlaget 4 og dækker en ikke mod holdedelen liggende overflade 6 af indikatorlaget 4, idet en ud over indikatorlaget 4 ragende zone 8 af netværket 1 ved hjælp af hæftelaget 3 er fast forbundet med holdedelen eller bæreren 2. Netværket 1 skal umiddelbart ligge an mod indikatorlaget 4, så at mellemrummet holdes så lille som muligt.

Som bæremateriale kommer fortrinsvis kunststoffer som f.eks. poly-styrol, polyvinylchlorid, polyester eller polyamid i betragtning.

Det er dog også muligt at imprægnere sugedygtige materialer som f.eks. træ, papir eller pap med vandskyende midler, eller at overtrække dem med en vandfast film, idet der som hydrofoberingsmiddel kan anvendes silicone eller hårde fedtstoffer, og som filmdanner f.eks. nitrocellulose eller celluloseacetat. Metalfolier eller glas kan også benyttes som bæremateriale. Bærematerialerne kan være farveløse og transparente. Med fordel vælger man dog uigennemsigtige materialer, som også kan indfarves passende til forhøjelse af farvekontrasterne.

Hæftelaget 3 består eksempelvis af varmtforseglingslag (polyethylen), smelteklæbere eller hærdnende koldtklæbere. I og for sig egner sig ethvert lag, som binder netværket 1 fast til bæreren ved fremstillingen af prøvestrimlerne, når det efter fremstillingen hærdner fuldstændigt enten termisk, kemisk eller ved en tørringsproces med tilstrækkelig hastighed. Hærdningen af hæftelaget 3 er nødvendig, da netværket 1 i zonen 8 i mange tilfælde fuldstændigt indlejres i hæftelaget 3. Herved træder hæftelaget ud igennem porerne og dækker netværket 1 på den fritliggende overflade.

Indikatorlaget består af en sugedygtig bærer, f.eks. filtrerpapir eller en plasthinde, der er imprægneret med reagenser og eventuelt med hjælpestoffer som f.eks. en stødpude eller et befugtningsmiddel. Indikatorlaget påføres normalt i form af bånd på bærefolien. Det er dog også muligt at blande reagenserne med neutrale faste stoffer, eventuelt med et bindemiddel og et opløsningsmiddel, og at overtrække bæreren med den således fremkomne pasta og derpå tørre den. Som faste stoffer kommer eksempelvis cellulose eller gips i betragtning. Desuden kan indikatorlaget bestå af en vandfast folie.

Netværket 1 kan bestå af regelmæssigt udbredte tråde i form af et væv 142512 6 med kæde- og skudtråde eller i form af et virke. Det er også muligt at anvende tyndt filtnetværk eller ikke-vævede stofbaner, hvor tråd-strukturen er uregelmæssig, når disse udviser den nødvendige stabilitet. Man foretrækker kunststofvæv af monofile eller spundne tråde, som kan bestå af cellulose (bomuld, cellstof, hamp, sisal), æggehvide (uld, silke) og plaststoffer som f.eks. polyamid, polyester, poly= ethylen, ^polypropylen, polyvinylchorid, polyacrylnitril såvel som af de forskellige blandingspolymerisater. I bestemte tilfælde kan der også anvendes fine metaltrådsvæv. Tykkelsen af de anvendte taver udgør 5-200 μ, fortrinsvis 20-100 μ, idet den frie hulflade udgør 30-80%, fortrinsvis h0-60%. Indenfor de angivne grænser kan netværket varieres afhængig af indikatorlagets farvereaktion. Normalt anvendes et farveløst materiale til netværket. Med farvede net får man blandingsfarver med indikatorlagets farver, hvilket under tiden bidrager til en forøgelse af kontrasterne.

Forbindelsen mellem nettet 1 og hæftelaget 3 kan alt efter arten af det anvendte materiale ske enten ved tryk eller varme eller begge dele, henholdsvis under anvendelse af højfrekvens eller ultralyd. Ifald bæreren 2 består af plaststoffer, der kan blødgøres, som f.eks. poly= vinylchlorid,kan denne selv tjene som hæftelaget 3. Forbindelsen med nettet sker da ved umiddelbar sammensvejsning eller ved tryk efter kvældning af overfladen med et egnet opløsningsmiddel, f.eks. methylenchlorid. Netværket 1 kan dog f.eks. ved partiel forsegling også alene forbindes med indikatorlaget 4.

Prøvestrimlerne ifølge opfindelsen fremstilles fortrinsvis ved, at man termisk sammenforsegler brede bånd af den med hæftelaget 3 forsynede bærefolie sammen med smalle bånd af reagenspapir, der anvendes som indikatorlaget 3, og noget bredere bånd af netværket 1 langs med de der udover ragende flader 8 og skærer det fremkomne prøvestrimmelbånd på tværs i prøvestrimler af den ønskede bredde. Alt efter anvendelsesformålet af prøvestrimlerne til enkelt- eller flergangsprøver kan også flere indikatorlag 4 anbringes i parallelle bånd på bærefolien 2. Fig. 4 og 6 beskriver sådanne udførelsesformer af dobbeltprøve-strimler. De ved overskæring af de ovennævnte prøvestrimmelbånd fremkomne snitflader 7 af indikatorlaget behøver ikke at være dækket af netværk 1, da den fritliggende flade 7 er relativt lille. I en særlig udførelsesform,se fig. 5,er der under indikatorlaget 4 lagt en sugedygtig bærer 9, som ikke indeholder reagenser. Denne forholdsregel øger 7 142512 i mange tilfælde indikatorlagets følsomhed og beskytter dette mod indvirkningen fra hæftelaget. I fig. 3 og 4 er hæftelaget 3 anbragt i form af smalle striber på bæreren. Man undgår således den i mange tilfælde uønskede berøring af reagenserne med substanser fra hæftelaget. I tilfælde af at bærefolien er dækket helt eller overvejende med hæftelaget 3, kan dette anvendes til yderligere at fiksere en eventuelt med henvisninger eller sammenligningsfarver påtrykt dækfolie 5 (sammenlign fig. 5) på bæreren 2.

Prøvestrimlerne ifølge opfindelsen tjener frem for alt til undersøgelse af legemsvæsker, i særdeleshed af urin. De kan dog ved passende modificering af påvisningsreagenserne også anvendes i al almindelighed. Det er klart, at uklare væsker som f.eks. blod eller stærkt sedimentholdig urin eventuelt må centrifugeres eller filtreres før undersøgelsen. Da prøvestrimlerne befugtes meget hurtigt og let, er det endog muligt at analysere viskose væsker,som f.eks. serum eller sekreter fra slimhinder som f.eks. spyt,uden tidsspilde.

Med de følgende eksempler skal opfindelsen forklares nærmere.

Eksempel 1 pH-Prøvestri.mmel

Filtrerpapir (Schleicher og Schtlll nr. 2316) imprægneres med følgende opløsning, tørres i varmluftstrøm og skæres i 6 mm brede bånd.

Methylrødt 0,08 g

Bromthymolblåt 1,00 g

Methanol ad 1000 ml

Disse bånd bliver indforseglet ved hjælp af varme valser mellem et 60 mm bredt bånd af smeltevoksovertrukket polyesterfolie og et 12 mm o bredt bånd af en ikke-vævet materialebane af polyester (15 g/m ), således at midten af prøvepapiret kommer til at ligge 6 mm fra den nederste rand på polyesterbåndet og under midten af båndet af den ikke-vævede materialebane, idet varmevalseme ved stedet for prøvepapiret har en udsparing. Lægges der under pH-prøvepapiret et lige så bredt bånd af almindeligt filtrerpapir, kan man undlade udsparingen på varmevalseme.

8 142512

Det færdigt or segle de "bånd "bliver så skåret på tværs i 6 mm "brede strimler.

Dypper man disse prøvestrimler i opløsninger med pH 5-8, så får man, alt efter pH, farver fra gult til "blåt, som strækker sig jævnt over hele prøveområdet.

Bliver pH-prøvepapiret indforseglet på sædvanlig måde mellem poly= ethylenovertrukne polyesterfolier, kan der ved kromatografieffekter og luftblærer under ugunstige betingelser optræde forstyrrelser.

Eksempel 2 Æggehvide-prøve s trimler filtrerpapir (Schleicher und Schtlll nr. 2316) imprægneres med følgende opløsnirger efter hinanden, tørres og skæres i 6 mm brede strimler.

Uatriumcitrat 130,6 g

Citronsyre 46,6 g

Dauroylsarkosin 0,8 g

Yand 500,0 g

Methanol ad 1000 ml

II

Magniumsulfat 59,4 g

Te trabrompheno1= phthale ine thyl= ester 0,5 g

Methanol ad 1000 ml

Som beskrevet i eksempel 1 indforsegles prøvepapiret mellem poly= esterfolie og en tilsvarende ikke-vævet materialebane * og skæres på tværs.

Dyppes de således fremkomne prøvestrimler i æggehvideholdig urin,-får man regelmæssige grønne til blå farvninger i prøve 9 142512 området. Holder man prøvestrimlerne indtil 5 sekunder i urinstrålen, får man den samme farvning som ved kort neddypning i den pågældende urin. Særlig giver æggehvidefri urin i begge tilfælde en negativ reaktion kendetegnet ved en svag gulfarvning. Sædvanlige på- eller indforseglede prøvestrimler kan derimod ved udvaskningseffekter angive falsk positiv reaktion.

Eksempel 3

Kombinerede æggehvide pH-prøvestrimler pH- og æggehvide-prøvepapirer fremstilledes som beskrevet i eksemplerne 1 og 2 og blev således indforseglet, at de kom til at ligge på den samme prøvestrimmel ved siden af hinanden i en afstand af ca. 3 mm. Dypper man disse prøvestrimler i egnede undersøgelsesopløsnin-får man de samme farvninger, som man får med de tilsvarende enkeltprøvestrimler. Disse farvninger ændrer sig heller ikke ved længere tid.

Bliver prøvepapirerne kun forseglet ved siden af hinanden, så farves kort efter neddypningen den side af æggehvide-prøveområdet, som er modsat pH-prøveområdet, dybere grønt, medens den tilsvarende side af pH-området får en mere til den sure pH svarende farvning. Dette hidrører fra diffusionen af den sure stødpude fra æggehvide- til pH-prøven gennem den forbindende væskefilm.

Eksempel 4

Urobilinogen-prøvestrimler

Filtrerpapir (Schleicher og SchU.ll nr. 2312) imprægneredes med en opløsning af følgende sammensætning, tørredes og blev skåret i 6 mm brede bånd.

4-Cyclohexylaminobenzaldehyd 1,0 g Oxalsyre 200,0 g

Methanol ad 1000 ml

Prøvepapirbåndet blev indforseglet som beskrevet i eksempel 1 mellem bånd af polyethylenovertrukket polyesterfolie og nylonvæv (60^ trådtykkelse, 45$ fri hulflade) og skåret på tværs.

10 142512

Bliver disse pcøvestrimler dyppet i urobilinogenholdig urin, opstår der en fuldstændig regelmæssig rød farvning af prøveområdet, som tillader en reproducerbar halvkvantitativ bestemmelse af urobilinogenet.

Bliver prøvepapiret indforseglet mellem to polyethylenovertrukne polyesterfolier og kun i kort tid neddyppet, har man blot på de åbne rande af prøveområdet røde striber, medens midten forbliver hvid.

Eksempel 5

Glucose-prøvestrimler

Filtrerpapir (Schleicher og Schtill nr. 23 SI) blev vædet med følgende imprægneringsopløsning, tørret og skåret i 6 mm brede bånd.

o-Tolidin 4,00 g

Peroxidase 0,12 g

Grlueoseoxidase 13,00 g

Tartrazin 0,90 g

Ethanol (44$ig) ad 1000 ml På et polyvihylchloridbånd af 60 mm’s bredde blev der ved den neder-ste rand og i 10 mm’s afstand derfra påført 3 mm brede striber af et i luften hærdnende cyanacrylat-klæbemiddel fra to dyser. Eort derefter blev prøvepapiret lagt imellem striberne og et 12 mm bredt bånd af polyestervæv (50^ tråd tykke Ise, 45$ fri overflade) klæbet derover. Efter udhærdningen af klæbemidlet blev hele båndet skåret på tværs i 6 mm brede strimler.

Dypper man disse prøvestrimler i en glucoseholdig opløsning, f.eks. urin, så erholder man alt efter glucoseindholdet en regelmæssig, mere eller mindre grøn farvning af prøveområdet.

Dypper man på sædvanlig måde mellem to polyethylenovertrukne poly= esterfolier indforseglede prøvestrimler i urin, så danner der sig en luftblære med en stærkt grøn farveplet, der fremkaldes af den stærkere luftoxidation i dette område.

11 U2512

Eksempel 6

Hydrogenperoxid-prøvestrimler

En blanding af følgende sammensætning hLev påstrøget med en lagtykkelse af 350μ et polyvinylidenchloridbehandlet papir og tørret.

Polyvinylpropionat - dispersion 45,0 g

Phosphatpuffer 0,4 m (pH 5,5) 45,0 ml

Natriumalginat 0,5 g

Natriumlaurylsulfat 0,6 g o-Tolidin 0,2 g

Peroxidase 0,02 g

Methanol 6,0 g 6 mm Brede bånd af dette med reagensfilmen forsynede papir blev, som beskrevet i eksempel 5, overklæbet med et nylonvæv (60ju. trådtykkelse, 45$ fri huloverflade).

Dypper man prøvestrimmelen af denne art i en hydrogenperoxidindehol-dende opløsning, får man regelmæssige blå farvninger i afhængighed af hydrogenperoxidkoncentrationen.

Bliver derimod det kun med reagensfilmen forsynede papir dyppet i kort tid i væsken og straks igen udtaget, så erholder man uregelmæssige reaktioner, da væsken ikke fordeler sig regelmæssigt på filmoverfladen.

Eksempel 7

Nitrit-prøvestrimler

Filtrerpapir (Schleicher og Schtlll nr. 2316) imprægneredes med en opløsning af følgende sammensætning, tørredes og blev skåret i 6 mm brede bånd.