DK142995B - Fremgangsmaade til fremstilling af et glucoseisomerase-produkt ved dyrkning af en stamme af bacillus coagulans i et naeringsmedium - Google Patents

Description

Ygay (11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 142995 DANMARK (B1) ,nt C|3 012 N 9/92 §(21) An**enrnenr. 5155/76 (22) indleveret den 13. Jul. 1976 (24) Lebedag 15· Jul. 1976 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlaeggelsesskriftet offentliggjort den 9. raST. 1 9^1

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begar« fra den 22. Jul. 1975, 50693/75, GB (71) NOVO INDUSTRI A/s, Novo Alle, 2880 Bagsværd, DK.

(72) Opfinder: Ivan Verner Diers, Mosegård Park 85, 3500 Lille Værløse, DK.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling: (54) Fremgangsmåde til fremstilling af et glucoseisomerase-produkt ved dyrk= ning af en stamme af Bacillus coagulans i et næringsmedium.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et glucoseisomerase-produkt ved dyrkning af en stamme af Bacillus coagulans i et næringsmedium og udvinding af det dannede glucoseisomerase-produkt.

Sirup, der indeholder en blanding af glucose og fructose, anvendes i stort omfang i industrien på grund af deres søde smag og deres ringe krystallisationstendens. Sådanne sirupper fremstilles fortrinsvis udfra glucosesirupper under anvendelse af en glucoseisomerase, som katalyserer isomeriseringen af glucose til fructose. Det er viatigt for økomomien af denne fremgangsmåde, at enzymprisen er lav, og at der kun dannes ringe mængder af biprodukter, som skal fjernes før _ 2 - 142995 siruppen kan anvendes.

Man kan fremstille glucoseisomerase udfra et stort antal forskellige arter af mikroorganismer, og egenskaberne af glucoseisomeraserne varierer fra art til art.

Når man først har udvalgt sin mikroorganisme til fremstilling af glucoseisomerase, er det yderst vigtigt, at fremgangsmåden gennemføres på en sådan måde, at enzymprisen bliver så lav som mulig. Enzymprisen afhænger af adskillige faktorer, blandt andet prisen af råmaterialerne, prisen af gæringstanken, gæringstiden, energikravene, koncentrationen af enzymet i gæringsvæsken og enzymudbyttet.I denne forbindelse bør det bemærkes, at mange enzymer, som deltager i kataboliske reaktioner, f.eks. glucoseisomerase, vides at blive represseret af glucose og andre energirige forbindelser, hvorved udtrykket repression anvendes for at beskrive det fænomen, at visse betingelser represserereller undertrykker enzymdannelse. Med henblik på opnåelse af et bedre udbytte af glucoseisomerase kan man således anvende andre carbonkilder, f.eks. glycerol, eller man kan anvende glucosen eller de andre energirige forbindelser i koncentrationer, som er begrænsende for vækst· Carbonbegrænset vækst kan gennemføres på tre foretrukne måder. En carbon- og energikilde kan tilføres til en batch-kultur i den postlogaritmiske fase med en konstant hastighed, som begrænser vækst og eliminerer repression af enzymsyntesen, i det følgende kaldet en doseret bacth-gæring. En anden metode er en "fed batch" gæring (Pirt, S.J. (1974), J. appl. Chem. Biotechnol. 2£, 415). En "fed batch" gæring kan være en homogen batch-gæring, hvis vækst er begrænset ved koncentrationen af carbon- og energikilden, hvorved alle andre næringsmidler foreligger i overskud. Når den vækstbegrænsende carbon- og energikilde er udtømt, tilfører man kontinuerligt næringsmedium til batch-kulturen. Volumenvariationen og den diskontinuerlige fjernelse af gæringsvæske adskiller den "fed batch" gæring fra en chemostat-kultur. For det tredie kan carbonlimitering gennemføres i den klassiske chemostat (Monod, J., A. Rev. Microbil., 3^, 64 (1949)), hvilket er den mest effektive metode. En chemostat-kultur består af en fuldstændig blandet suspension af biomasse,hvortil der tilføres medium med en konstant hastighed (F), hvorved kulturen fjernes fra chemostaten med den samme hastighed; voluminet af kulturen (V) forbliver således konstant. I ligevægtstilstanden er forholdet F/V = D

- 3 - 142995 (fortyndningshastigheden)lig med den specifikke væksthastighed ja.

Under anvendelse af denne teknik fandt f.eks. Smith og Dean (J. Gen. Microbiology 72, 37-47 (1972))et forøget udbytte af beta-galacto-sidase i chemostat-kulturer af Klebsiella aerogenes, hvis vækst blev begrænset af lactose (carbon- og energikilde).

Under gæringen af glucoseisomerase undgår man normalt enhver vækst-begrænsning hidrørende fra oxygen. Således tilfører man normalt en tilstrækkelig mængde luft til mediet, eller gæringen udføres med andre vækstbegrænsende faktorer, f.eks. en vækstbegrænsning hidrørende fra et næringsmiddel. En vækstbegrænsning hidrørende fra oxygen er også uønsket, fordi kulstofkilder i overskud vil repres-sere enzymproduktion.

Da mætningskoncentrationen af oxygen i gæringsmedier er meget lille, . konstruerer man derfor konventionelle fermentatorer beregnet til gæring af glucoseisomerase på en sådan måde, at de tilvejebringer en høj overføringshastighed af oxygen fra gasfasen til den flydende fase. Konventionelle fermentatorer til gæring af glucoseisomerase er således konstrueret med omrørere, der er beregnet til en høj omdrejningshastighed og/eller et effektivt fordelingsorgan til luftindtaget og/eller luftindtag med en høj kapacitet af luft, som blæses ind i fermentoren pr. tidsenhed og/eller en fermentor med et stort forhold mellem højde og bredde.

Koncentrationen af oxygen måles ved hjælp af en polarografisk eller galvanisk målemetode. Følsomheden af disse metoder er ret lille; oxygenkonventrationer under 1,5 mm Hg kan kun vanskeligt bestemmes i stordrift.

På grund af de ovenfor angivne fænomener kan oxygenkoncentrationen i gæringsmediet være meget lav, men alligevel vækstbegrænsende, på grund af den høje overføringshastighed af oxygen fra gasfasen til den flydende fase.

Ifølge opfindelsen har det vist sig, at man kan opnå en endog større forøgelse af udbyttet af glucoseisomerase, hvis gæringen gennemføres med en tilførsel af oxygen, som er begrænsende for vækst, hvis man anvender visse mikroorganismer af arten Bacillus coagulans og hvis V :. - 4 - 142995 man gennemfører gæringen under visse, nærmere specificerede driftsbetingelser.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et glucose-isomerase-produkt ved dyrkning af en stamme af Bacillus coagulans i et næringsmedium og udvinding af det dannede glucoseisomerase-produkt er ejendommelig ved det, der er angivet i den kendetegnende del af krav 1.

Ifølge opfindelsen opnår man således et meget højt udbytte af glucoseisomerase; yderligere reduceres energibehovet, fordi man tilfører en mindre mængde oxygen; som resultat heraf reduceres den totale pris af den glucoseisomerase, som fremstilles ved fremgangsmåden i-følge opfindelsen.

Opfindelsen er således begrænset til anvendelsen af en stamme af arten Bacillus coagulans, som er fakultativt aerob. Ved at tilføre oxygenet i en mængde, som er begrænsende for vækst, etablerer man en tilstand, under hvilken de fakultativt aerobe bakterier vokser delvist anaerobt , delvist aerobt. Det antages, at denne særlige tilstand på en eller anden måde står i forbindelse med den kendsgerning, at der opnås usædvanligt høje udbytter af glucoseisomerase. Mikroorganismen kan være enhver fakultativ aerob stamme af Bacillus coagulans. Visse atypiske stammer af Bacillus coagulans, hvortil der senere vil blive henvist, er de foretrukne mikroorganismer ifølge opfindelsen.

Ifølge opfindelsen gennemføres gæringen således også med en tilførsel af oxygen, som er begrænsende for vækst. Vægten af den cellemasse, som tilvejebringes ved den aerobe metabolisme, er mange gange større end vægten af den cellemasse, som tilvejebringes ved den anaerobe eller fermentative metabolisme. Man vil derfor forvente, at den aerobe metabolisme burde være den foretrukne, men ifølge opfindelsen har det overraskende vist sig, at de meget høje udbytter af glucoseisomerase kun kan opnås, hvis fremgangsmåden involverer både aerob og anaerob metabolisme.

Tilsætningen til gæringsmediet af en kilde af carbon og energi, som represserer glucoseisomerase-syntesen og som let konverteres anaerobt - 5 - U2985 til ikke represserende nedbrydningsprodukter, i et ringe overskud, er således ifølge opfindelsen også nødvendig for at opnå de høje udbytter af glucoseisomerase. Carbon- og energikilden kan være enhver carbon- og energikilde af den angivne art, hovedsageligt kulhydrater, herunder hydrolyseret stivelse, især hexoser og pentoser. Blandt hexoserne foretrækker man især glucose og fructose. Blandt pentoserne foretrækker man især xylose og ribose.

Alle andre næringsmidler tilsættes til dyrkningsmediet i til-' strækkelige mængder.

Glucoseisomerase-produktet udvindes på konventionel måde.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et glucoseisomerase-produkt omfatter anvendelsen af en Bacillus coagulans stamme udvalgt blandt NRRL 5649 - 5666.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et glucoseisomerase-produkt omfatter anvendelsen af en kontinuerlig gæring.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et glucoseisomerase-produkt omfatter den separate tilsætning af carbon- og energikilden.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et glucoseisomerase-produkt omfatter en kontinuerlig gæring, hvor fortyndningsfaktoren har en værdi imellem D.05 og 0.20.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelser} til fremstilling af et glucoseisomerase-produkt omfatter anvendelsen af en doseret batch-gæring, hvor carbon- og energikilden tilsættes separat.

_ 6 _ 142995

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et glucoseisomerase-produkt omfatter anvendelsen af glucose, hydrolyseret stivelse eller xylose som carbon- og energikilde.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemføres både diskontinuerligt, som en "fed batch" gæring eller som en doseret batch-gæring, og kontinuerligt, og i alle tilfælde opnås der høje udbytter. Den kontinuerlige fremgangsmåde kan gennemføres i henhold til et pH-statisk princip, hvor carbon- og energikilden tilsættes separat, når pH overskrider den ønskede værdi. Ved den kontinuerlige proces bør fortyndnings-hastigheden være ret lav, fortrinsvis svarende til det optimale enzymudbytte .

Det medium, hvori gæringen gennemføres, er konventionelt, med undtagelse af de ovenfor angivne begrænsninger for sammensætningen deraf. Carbon- og energikilden er tilstede i et ringe overskud, og alle de andre næringsmidler i mediet, nemlig N, P, S og Mg, tilsættes i tilstrækkelige mængder, og opfindelsen angår ikke andre forhold i forbindelse med disse andre næringsmidler. Næringsmediet er således et konventionelt medium, som indeholder mineralske salte, og som kan beriges med en organisk nitrogenkilde, såsom gærekstrakt, majsstøbevand eller lignende, idet mediet tillige indeholder en carbon- og energikilde, som kan være en af de tidligere angivne kilder, f.eks. glucose.

Alle næringsmidler foreligger således i overskud, idet den begrænsende faktor er oxygenet.

Da tilførslen af oxygen til gæringsbeholderen er vækstbegrænsende, indstilles oxygenmængden på en sådan måde, at partialtrykket af opløst opløst oxygen i mediet i gæringstanken næsten er lig 0. Denne tilstand kan etableres ved tilførsel af en luftstrøm til gæringstanken og reduktion af omdrejningshastigheden af omrøreren, indtil partialtrykket af opløst oxygen synker til den angivne værdi. Denne tilstand kan også etableres ved indstilling af hastigheden af den tilførte luft, når omrøreren roterer med konstant hastighed, eller ved at fortynde luften med varierende mængder af indifferent gas, f.eks. Nj. 1 det følgende skal opfindelsen illustreres ved nogle eksempler.

- 7 - 142935 I alle eksemplerne anvender man den samme mikroorganisme. Denne mikroorganisme er en konstitutiv og asporogen mutant, som hidrører fra den atypiske Bacillus coagulans NRRL 5650. Mutationen gennemføres som beskrevet på side 10, eks. 4 af beskrivelse af 10. januar 1974 til dansk patentansøgning nr. 124/74, "Isolering af mutant-bakterier, der er i stand til at producere glucoseiso-meriserende aktivitet i xylosefri medier".

EKSEMPEL 1

I alle forsøg i dette eksempel anvendte man 1 liter BIOFLO C30 fermentor fra New Brunswick Sci. Inst., New Brunswick, N.J., USA

3 med en brugbar volumenkapacitet på 300-350 cm .

Rotationshastigheden af omrøreren blev varieret fra 250 til 500 omdrejninger pr. minut.

pH blev indstillet på 7.0 - 0.2 ved hjælp af 1 N NaOH.

Temperaturen blev holdt på 50°C - 0.2°C.

Spændingen af opløst 02 (CQ2 L) blev holdt på en værdi, som praktisk talt var lig nul, når C>2 var den vækstbegrænsende faktor, og i alle sammenligningsforsøgene (som vil blive beskrevet senere) blev oxygentensionen holdt på en værdi, der var højere end 20 mm Hg. Fortynd-ningshastigheden D var næsten den samme i alle forsøg. Mediet havde følgende sammensætnina: __ Mediets sanmentsætning_^__

Mediets _Begrænsende faktor__ bestanddele ~ ' ““ 02 C N P Mq (NH4)2S04 1 275 1 275 1 O ' ΣΓ5 2.5 “ k2hpo4 1.0 1.0 1.0 0.021 1.0

NaH2PO42H20 1.0 1.0 1.0 0.021 1.0

NaCl 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

MgS047H20 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

FeCl26H20 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02

MnS04H20 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02

Zn SO. 0.0025 0.0025 0.0025 0.0025 0.0025 _4______ -8- 142995

CaCiL, 0.0075 0.0075 0.0075 0.0075 0.0075 __tø______

Thiamin, HCl 0.001 0.001 0,001 0.001 0.001

Glucose 8 8 8 8 8 EDTft, 0.083 0.083 0.083 0.083 0.083

Pluronic H-61 0.083 0.083 0.083 0.083 0.083

Distilleret vand adll ad 11 ad 11 adll ad 11

Bakterietørvægten (X) blev bestemt på følgende måde. En 5 ml prøve blev centrifugeret i 10 minutter med 5000 omdrejninger pr. minut umiddelbart efter prøveudtagningen. Cellerne blev vasket en gang i iskold fosfatstødpude (0.05% w/v), pH 6.5, og centrifugeret på samme måde som før. Bundfaldet blev tørret til konstant vægt ved 100°C. Forholdet mellem OD^j-q °9 x viste sig at afvige mindre en 10% fra 0.35 mg celle-tørvægt pr. OD45Q enhed.

Analysen af glucoseisomerase blev gennemført på følgende måde. Prøven blev fortyndet i maleatstødpude (0.25 M maleinsyre, o. 10 M Mg 30^.7^0, 0.475 M NaOH og 1.0% w/v KC1; pH 6.5) og blev derpå behandlet med lysozym med henblik på total.frigørelse af enzymet fra cellerne. Til en prøve på 1 ml tilsatte man 0.1 ml af en opløsning af æggehvide-lysozym (Sigma Chemicals), svarende til 44.000 enheder. Efter lysozym-behandling i en time tilsatte man glucosesubstrat (1 ml 0.278 M glucose og 0.001 M 0X12-6^0), og isomeriseringen blev gennemført i 20 minutter ved 65°C. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 10 ml 0.1 M perchlosyre. 0.5 ml af isomeratet blev anvendt til farvereaktionen med cystein-carbazol-svovlsyre. Først tilsatte man 0.1 ml frisk fremstillet 1-cysteinium-chlorid (2.2% w/v). Derpå tilsattes 3 ml af en blanding af 1 ml carbazol-op løsning (0.4% w/v i ethanol) og svolvsyre (80% w/v i vand). Den violette farve blev målt ved 560 nm efter fremkaldelse i 30 minutter ved30°C. Løbende blindprøver af både substrat og af prøve var absolut nødvendige. En enhed glucoseisomerase er defineret som den mængde enzym, der katalyserer dannelsen af 1 yjmol fructose pr. minut under de angivne reaktionsbetingelser.

Organismen blev kultiveret kontinuerligt med en tilført mængde af ilt, som er vækstbegrænsende. Af sammenligningsgrunde gennemførte man lignende kontinuerlige gæringer med tilførte mængder af C, N, Mg og P, som hver for sig var vækstbegrænsende.

_ 9 - U2995

Man undersøgte cellemassen og enzymproduktionen i relation til gæringsbetingelserne, og især undersøgtes resultaterne i forbindelse med de gæringer, hvor O2 og C var vækstbegrænsende.

Resultaterne af disse forsøg er sammenstillet i den følgende tabel.

Tabel 1 fortyndnings- begrænsen- udbytte af celle- enzynwdbytte, Produktivitet, hastighed D, de faktor masse, mg bakte- glucoseiscme- glucoseisomera-hr~ rietørvægt/mg raseenhed/mg seenhed/tng glucose bakterietør- glucose .timer vægt 0.12 O 0.17 0.98 2.00 x 10_2 0.12 C 0.29 0.38 1.16 x 10"2 0.13 N 0.09 0.06 0.07 x ΙΟ-2 0.11 P 0.09 0.17 0.17 x 10~2 0.10 Mg 0.175 0.11 0.19 x 10~2

Det fremgår af den ovenfor angivne tabel, at de betingelser, hvor O2 er vækstbegrænsende, frembringer langt det bedste enzymudbytte og den højeste produktivitet.

EKSEMPEL 2 I dette eksempel anvendtes en fermentor som den i eksempel.1 beskrevne i forbindelse med "fed batch" gæring. Hastigheden af omrøreren var 350 omdrejninger pr. minut under hele forsøget, og voluminet varierede fra 150 ml til 350 mis. pH blev indstillet på 7.0 - 0.2 med 1 N NaOH. Temperaturen blev indstillet på 50°C - 0.2°C.

Sammensætningen af mediet var følgende: - 10 - 142995 (NH4)2S04 3 g per 1

Difco gærekstrakt 10 g per 1 K2HP04 1 g per 1

MgS04.7H20 0.5 g per 1

Vandværksvand ad 11

Efter sterilisation ved 130°C i 50 minutter tilsatte man 10 g glucose aseptisk til mediet.

Gæringsmetode og “resultater:

Fermentoren podedes på basis af en frisk gæringsvæske-kultur (0.5 ml i 150 ml af mediet). Efter en kort ventefase påbegyndtes batch-væksten3 og 17 timer senere tilførte man medium med en konstant hastighed af 27.6 ml/time; 8 timer senere var fermentorens volumen fyldt op, og forsøget afsluttedes. 1 denne periode, i hvilken man tilførte medium, udviste oxygentensicnen en målt værdi på nul. Udbyttet af biomasse og enzym blev bestemt som i eksempel 1.

Resultater T

udbytte af biomasse 3.56 g pr. 1 udbytte af enzym 4.1 glucoseisomerase enheder pr. ml.

EKSEMPEL 3 I dette eksempel anvendtes en Biotec fermentor FL 110 fra Biotec, Bromma, Sverige med et operativt volumen på 10 1. Luft blev i fin fordeling indført i fermentorens bund med en konstant hastighed af 10 1/min, omdréjningshastigheden af omrøreren blev holdt på en værdi af 620 omdrejninger pr. minut, og temperaturen på 50°C. Beholderen blev podet med en skråagar, som havde stået natten over. Mediet bestod af:

Majsstøbevand (50% tørvægt) 30 g pr. 1 K2HP04 1.5 g pr. 1 (NH4)2S04 5 g pr. 1

Glucose 2 g pr. 1

MgS04.7H20 0.1 g pr. 1 - 11 - U2995

Pluronic H-61 0.3 g pr 1

Neutraliseret til pH 6.8 med 30% natriumhydroxid Ledningsvand til 1 1, steriliseret ved 121°C i 105 minutter.

13 timer efter podningen afsluttedes batch-væksten, hvor pH begyndte at vokse; den målte værdi af oxygentensionen i mediet var nu nul. Da pH nåede værdien 6.5, tilførte man 40% glucose-opløsning via pH-meter/titratoren og en peristaltisk pumpe; på denne måde blev pH holdt konstant 1 de næste 8 timer, og glucose blev tilført med en konstant hastighed af 2.1 g/1 x time; ved slutningen af dette tidsrum forøgedes oxygentensionen fra en målt værdi på nul til en målt værdi der var højere end nul, og væksten standsede. Cellerne blev høstet, og biomasse- og enzymudbytte blev bestemt som før angivet.

Resultater: udbytte af biomasse 4.2 g pr. 1 udbytte af enzym 8.8 glucoseisomerase enheder/ml.