DK143201B - Fremgangsmaade til fremstilling af virusstammer som stimulerer en vaertsorganismes naturlige afvaergemekanismer uden derved samtidig at virke antigent - Google Patents

Description

14320 1 o

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af virusstammer, som stimulerer en værtsorganismes naturlige afværgemekanismer uden derved samtidig at virke antigent.

5 Ved "antigen virkning" skal her og i det følgende forstås evnen til udløsning af en immunologisk krydsreaktion med udgangsvirus.

Det er kendt, at de naturlige, primære afværgemekanismer mod virusinfektioner hovedsagelig udløses via 10 produktion af interferon. Det kan dog ikke udelukkes, at desuden andre, hidtil ukendte faktorer spiller en rolle.

Interferoner er proteiner, som hos hvirveldyr fremkalder en uspecifik og ikke immunologisk afværgereaktion mod virusinfektioner. Når f.eks. virus når ind i 15 organismen på et varmblodet dyr, er det først og fremmest celler af det såkaldte "reticuloendotheliale system", der i løbet af nogle timer producerer store mængder interferon og frembringer et højt interferonspejl i kredsløbet.

Dette "cirkulerende interferon" fordeles hurtigt i legem-20 et og forebygger endvidere udbredelse af virusinfektionen, f.eks. en sekundærinfektion.

Det er allerede kendt, at interferondannelsen i en organisme kan stimuleres såvel med aktive som med inaktive virus, dvs. virus, der ikke mere kan formere sig, 25 jf. G. Bodo: "Naturwissenschaften" 58 (1971) 425-429, J.L. Le Clero og J. Cogniaux: "Le Clerc, Acta Virol" 9 (1965) 18-24, S. Hermodsson: "Acta path, microbiol. scand." 62 (1964), 224-238 og M. Harris: "Science" 170 (1970), 1068-1070.

30 Ulempen ved den terapeutiske anvendelse af disse metoder består i den samtidige induktion af virusspecifikke antistoffer i værtsorganismen. Derved vanskeliggøres eller hindres en gentagen anvendelse af sådanne virus til stimulering af uspecifikke afværgemekanismer 35 på grund af risiko for allergi og anafylaktisk chok med bestemte tidsintervaller.

Λ 0 143201 2

Der findes endnu et antal yderligere, helt forskellige mikroorganismer og stoffer, som kan fremkalde interferondannelse i organismen. Som eksempler herpå skal nævnes bakterier, endotoxiner, phytohæmaglutininer, na-5 turlige og syntetiske ribonucleinsyrer som f.eks. poly-inosin-polycytidylsyre (poly I:C) samt visse syntetiske polymere med anionkarakter som f.eks. polyvinylsulfat, polyacryl- og polymethacrylsyre samt pyrancopolymere, jf. Y.K.S. Murthy og H.P. Anders: "Angew. Chem. internat." 10 9. udgave (1970) 480-488. Disse stoffer har alle den tungtvejende ulempe, at de er for toksiske, idet de f.eks. ikke er fysiologisk nedbrydelige (syntetiske polymere) eller har andre stærke bivirkninger (poly I:C), således at de er klinisk uanvendelige, jf. Y.K.S. Murthy og H.P.

15 Anders: "Angew. Chem. internat.", 9. udgave (1970), 480--488, "Nature" 223 (1969), 715-718.

Fra beskrivelsen til dansk patent nr. 119.724 kendes en fremgangsmåde til fremstilling af en antigenfri vaccine, hvor man dyrker immunologisk kompetente 20 celler eller fortrinsvis cellefri systemer af immunologisk kompetente celler med et antigen i 2-60 minutter ved ca. 37°C, isolerer den dannede informatoriske ribonuclein-syré på kendt måde, f.eks. med phenol, og steriliserer og eventuelt tilsætter et bærestof. Ved denne kendte 25 fremgangsmåde tilsigtes det på kortest mulig tid at få immunkompetente celler til at danne antistoffer for at afkorte den relativ lange tid det tager for et legeme selv at danne antistoffer.

Det har nu vist sig, at værtsorganismens påvise-30 lige specifikke immunrespons på en virusstamme kan forsvinde med fuldstændig bibeholdelse af en uspecifik afværgemekanisme, når en tilsvarende virusstamme svækkes ved gennemgang af et tilstrækkeligt stort antal vævskulturer på cellekulturer, hvori den pågældende virus kan 35 formeres, på i og for sig kendt måde, f.eks. ved den i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.033.946 beskrevne metode .

É __.....

0 143201 3

Konsekvensen deraf er, at en således attenueret virusstamme ved indgift hverken fremkalder de for den pågældende virus karakteristiske kliniske symptomer i en værtsorganisme, eller reagerer med et immunrespons ved 5 dannelse af specifikke, påviselige antistoffer. Den uspecifikke stimulering af en afværgemekanisme, f.eks. i form af interferoninduktion, bibeholdes derimod. Desuden er sådanne attenuerede virus godt forenelige og udviser ikke de i forbindelse med de ovennævnte stoffer beskrevne 10 toksicitetssymptomer.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde, som er ejendommelig ved, at en virusstamme valgt blandt in-fektiøs pustuløs vulvovaginitis IPV-virusstamme, Aujeszky/ Pseudorabiesvirusstamme S/T og influenzavirus A 1-stam-15 me FM 1 ved i og for sig kendte metoder gennemgår vævskulturpassager, indtil der ved i og for sig kendte testmetoder ikke påvises noget virusspecifikt immunrespons over for udgangsvirus, men kun en uspecifik interferoninduktion.

Det har overraskende vist sig, at de ved frem-20 gangsmåden ifølge opfindelsen ved tilstrækkelig yderligere passage attenuerede virusstammer ikke mere udviser den hyppigt iagttagne immunologiske krydsreaktion med udgangsvirus, dvs. ikke udviser "antigen virkning" som defineret ovenfor, men kun den ønskede uspecifikke inter-25 feroninduktion. Derved undgås de ved anvendelse af utilstrækkeligt attenuerede virusstammer optrædende kliniske symptomer. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udgør således en berigelse af farmacien.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen attenuer-30 ede virusstammer kan anvendes til profylakse og behandling af virusinfektioner såvel i human- som i veterinærmedicinen .

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede virusopløsninger kan formuleres efter gængse me-35 toder og administreres som f.eks. opløsning, sirup, emulsion, suspension, spray, salve, pasta, creme, lotion, aerosol og tabletter.

O

4 U3201

Præparaterne fremstilles på i og for sig kendt måde, f.eks. ved fortynding af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen attenuerede virus med egnede opløsningsmidler og/eller indifferente, ikke-toksiske, faste, halv-5 faste eller flydende bærerstoffer, eventuelt under anvendelse af emulgerings- og/eller dispergerings-, sprøjteeller drivmidler og under anvendelse af egnede stabilisatorer.

Som eksempler på sådanne opløsningsmidler, bærer-10 stoffer, emulgerings- eller dispergeringsmidler skal her nævnes: vand, ikke-toksiske, organiske opløsningsmidler eller fortyndingsmidler såsom paraffiner (f.eks. jordoliefraktion-er), planteolier (f.eks. jordnødde/sesamolie), alkoholer 15 (f.eks. ethylalkohol eller glycerol) og glycoler (f.eks. propylenglycol eller polyethylenglycol), faste bærerstoffer som f.eks. naturlige stenmel (f.eks. høj-dispers kiselsyre, silicater), sukker (f.eks. rør-, mælke-og druesukker), emulgeringsmidler såsom ikke-ionogene og 20 anioniske emulgatorer (f.eks. polyoxyethylen-fedtsyre- ester, polyoxyethylenfedtalkoholether, alkylsulfonater og arylsulfonater), dispergeringsmidler (f.eks. lignin, sulfitaffaldslud, methylcellulose, stivelse og polyvinyl-pyrrolidon) og glittemidler (f.eks. magnesiumstearat, 25 talkum, stearinsyre og natriumlaurylsulfat).

Som stabilisatorer kan nævnes: aminosyrer, sukker, proteiner, polysaccharider og polyalkylenglycoler. Disse stabilisatorer kan anvendes såvel i vandig opløsning som i lyofiliseret tilstand.

30 De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen attenuer ede vira eller de deraf fremstillede lægemidler kan anvendes på gængs måde, f.eks. oralt, intramuskulært, subkutant eller lokalt, især på alle slimhinder hos mennesker og dyr.

35 Ved anvendelse i humanmedicinen indgives der in tramuskulært 0,1-5 ml, fortrinsvis 0,5-2 ml, og ved ind- 14320 -,

O

5 gift i sprayform 0,5-5 ml, fortrinsvis 1-2 ml, af en opløsning, der indeholder 300-800, fortrinsvis 400-500 CCA--enheder pr. ml.

Ved anvendelse af de her omhandlede virusstammer 2 på det veterinærmedicinske område afhænger doseringsområdet af de individer, der skal vaccineres, samt indgi ftsme to den.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i de efterfølgende eksempler. Det bemærkes, at den anven-dte vaccine indeholder ialt 10^ - 10® KiD^**^ -enheder pr. ml, fortrinsvis 10®-107 KiD,. g-enheder pr. ml.

Til intramuskulær indgift på kvæg har det vist sig hensigtsmæssigt at anvende 0,5-10 ml, fortrinsvis 1-5 ml vaccine med ovennævnte koncentration. Ved indgift i spray-15 form anvendes 1-15 ml, fortrinsvis 2-6 ml.

Til intramuskulær indgift på svin har det vist sig hensigtsmæssigt at anvende 0,5-10 ml, fortrinsvis 1,5-5 ml af en vaccine med ovennævnte koncentration. Ved indgift i sprayform anvendes til svin 1,5-10 ml, for-20 trinsvis 2-5 ml.

Eksempel 1

Den i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.033.946 beskrevne, ved attenuering via 200 vævskulturpassager

Muu j gennemgår endnu 150 vævskulturpassager på den deri beskrevne måde.

Ved påføring på dyrenes luftvejs- og genitalslimhinder opstår der ingen kliniske symptomer. Det er ikke muligt ved nogen af de almindeligt anvendte metoder, efter 30 det gængse tidsrum på 4 uger efter podningen med udgangs- chicken celleagglutinationsenhed yv)

KiD = kulturinfektiøs dosis 35 xxx) -j.pv _ infektiøs pustuløs vulvovaqinitis = Exanthema coitale vesiculosum bovis = blæreudslæt hos kvæget.

143201 x)

O

6 virus at påvise reagerende antistoffer i serum. Der XX) > kan dog påvises interferondannelse , som har bevirket, at dyrene var beskyttet før infektionen med virulent virus.

5

Eksempel 2 I 4 besætninger - 1 inseminationsstation og 3 op-drætningsbrug - lider dyrene dels af hoste, dels af u-specifikke genitalinfektioner, påviseligt ikke af viral 10 oprindelse. Efter vaccination med den i eksempel 1 beskrevne, interferoninducerende virusstamme helbredes de angrebne dyr fuldstændigt i løbet af nogle få uger. Humoral t immunrespons mod udgangsvirus udebliver.

15 Eksempel 3

Den ved 300 passager svækkede AUJESZKY/Pseudora-biesvirusstamme S/T podes dels intranasalt, dels intra-muskulært på svinebestande, som lider af uspecifik enzo-otisk pneumoni i luftvejene. Efter 3 uger er sygdomssymp-20 tomerne - i modsætning til kontroldyr - forsvundne, og det specifikke immunrespons mod udgangsvirus udebliver.

Eksempel 4 2i- Influenzavirus A 1 - stamme FM 1 adapteres på primære abenyrecellekulturer og gennemgår 350 vævskulturpassager.

Med således attenuerede virusopløsninger vaccineres 20 forsøgspersoner i alderen 30-40 år, hvis serum-antistoftiter mod A 1 - FM 1 er <1:32, hver især med X) 'Antistoffer kan påvises ved de gængse metoder såsom serumneutralisationstest, dobbeltdiffusionsmetode eller immunelektroforese.

XX) 35 Interferon kan påvises ved gængse metoder såsom plaque-reduktionsmetoden, reduktion af virus-hæmag-glutinintiteren eller ved kvantitativ hæmadsorptions-metode.

7

O

143201 500 CCA-enheder pr. ml. Indgiften foretages hos 10 personer subkutant og hos 10 personer intranasalt.

4 dage efter vaccinationen foretages den eksperimentelle behandling af de vaccinerede personer samt 10 5 kontrolpersoner af samme aldersgruppe med serumantistof-titer <1:32 ved intranasal indsprøjtning af 500 CCA-enheder pr. ml af en patogen A 1 - FM 1 - virusopløsning.

På tegningen viser fig. 1 størrelsen af serum-antistoftiteren (ordinater) hos de 20 forskellige for-10 søgspersoner før vaccinationen.

Fig. 2 viser de samme titere 14 dage efter den aktive virusbehandling.

De vaccinerede personer er beskyttet mod infektionen, medens 9 af de 10 kontrolpersoner udviser in-15 fluenzasymptomer.

Fig. 3 viser de 10 kontrolpersoners serumantistof titer før den aktive behandling.

Fig. 4 viser serumantistoftiteren 14 dage efter den aktive virusbehandling. Kun hos kontrolperson nr.

20 6 konstateres ingen influenzasymptomer.

I serum hos de vaccinerede personer konstateres ingen stigning af den virusspecifikke antistoftiter (fig. 2). Antistoftiteren mod A 1 - FM 1 i rekonvalescentserum ligger mellem 1:32 og 1:128 (fig. 4).