DK143317B - Fremgangsmaade til udvinding af et antigen fra bordetella pertusses - Google Patents

Description

i 143317 o

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af et antigen fra Bordetella pertussis.

De traditionelle Pertussis-podestoffer til aktiv immunisering imod kighoste indeholder for det meste dræbte 5 kim fra Bordetella pertussis. Det er kendt, at Pertussis- kimene ved vaccination hyppigt forårsager lokale smerter og betændelser på vaccinationsstedet, men også feber og i sjældne tilfælde desuden neurologiske komplikationer som den frygtede encephalitis.

10 Det er derfor allerede blevet forsøgt, at erstatte den kimholdige vaccine med en ekstraktvaccine for at opnå en bedre forenelighed. Den flere gange beskrevne fremstilling af ekstrakter fra Pertussiskim ved hjælp af saltopløsninger fører ganske vist til en opløsning af en lille del af antigen-15 komplekset, men udbytterne er relativt lave, og ekstrakterne består ligesom kimene af adskillige komponenter, som til dels er toksiske og ikke fører til nogen forbedring af vaccinens forenelighed ved vaccination.

En yderligere rensning af saltekstrakterne er 20 stærkt begrænset på grund af det antigene materiales poly-dispersitet. Ved de sædvanlige biokemiske rensningsmetoder opnås i det væsentligste en fordeling af den antigenaktivitet i flere fraktioner, uden at den specifikke aktivitet derved kan forhøjes væsentligt.

25 Til forbedring af udbytterne er det også allerede blevet forsøgt at åbne Pertussiskimene med f. eks. ultralyd og underkaste det herefter isolerede cellevægsmateriale en ekstraktion med natrium- eller kaliumchlorid (jvf. tysk fremlæggelsesskrift nr. 1.617.605) eller et alkalimetalsalt 30 af desoxycholsyre (jvf. USA-patentskrift nr. 3.395.219).

Bortset fra det forøgede apparative forbrug er disse fremgangsmåder ligeledes utilfredsstillende, fordi problemet med at opnå en højere renhed af antigenet dermed ikke kunne løses.

35 Det er her værd at nævne, at Pertussiskimenes så kaldte histaminsensibiliserende faktor kan udvindes ved behandling med en vandig kogsaltopløsning, som indeholder 4 mol urinstof. Alligevel har det ikke været muligt at fjerne

O

2 1433 17 urinstoffet uden aktivitetstab med hensyn til histaminsensibiliseringen. Det kan diskuteres, om den histaminsensibiliserende aktivitet helt eller delvis svarer til antigenet.

5 Ved siden af henvisninger til at det drejer sig om forskellige komponenter, har Y. Sato i Symp. Series Immunobiol. Standard., Vol 13, s. 214-220, beskrevet, at behandlingen af et 22 S-Pertussisantigen med urinstof fører til en ødelæggelse af dets aktivitet.

10 Formålet med den foreliggende opfindelse er at udvinde et antigenkompleks i opløst form fra Pertussiskim med større udbytter og eventuelt i højere renhed end tidligere og at anvende det rensede antigen som en væsentlig virksom del i Pertussisvacciner.

15 Det har overraskende vist sig, at dette kan opnås ved en fremgangsmåde, hvorved den ovennævnte åbning af Per-tussiskimene undlades, og disse direkte behandles med opløsninger indeholdende denaturerende midler, kimene fraskilles, og det opløste materiale enten straks eller efter yderligere 20 rensning i et denatureret miljø udfældes, eventuelt på et vanduopløseligt adsorptionsmiddel, ved fraskillelse af denatureringsmidlet .

Opfindelsen angår følgelig en fremgangsmåde til udvinding af et antigen fra Bordetella pertussis, hvilken 25 fremgangsmåde er ejendommelig ved, at kim fra Bordetella pertussis blandes med en vandig opløsning af et denatureringsmiddel i form af urinstof, guanidin eller deres vandopløselige salte og et neutralt salt, den ovenstående væske skilles fra kimremanensen, hvorpå denatureringsmidlet skilles fra 30 den vandige suspension af antigenet.

Ifølge en fordelagtig udførelsesform for opfindelsen tilsættes der et vanduopløseligt adsorptionsmiddel før fra-skillelsen af denatureringsmidlet. Herved bindes antigenet til absorptionsmidlet ved udfældningen, og en aktivitetsfor-35 mindskelse som følge af aggregation undgås.

Behandlingen af Pertussiskimene med den nævnte vandige opløsning, som bevirker en ekstraktion af kimene, 3 143317

O

sker på nemmeste måde ved henstand af de i opløsningen mest muligt homogent suspenderede kim. Ved denne foranstaltning må der imidlertid regnes med de længste ekstraktionstider. Allerede en langsom bevægelse af kimene, der kan 5 opnås ved simpel omrøring, forbedrer ekstraktionens virkningsgrad. Apparater, som kendes til homogeniseringsformål, kan med fordel anvendes til forhøjelse af udbytterne og til forkortelse af tiden. Alt efter det anvendte bevægelsesmiddel udgør ekstraktionstiden 0,5-48 timer. I gennemsnit må der 10 regnes med en ekstraktionsvarighed på 18 timer.

Ekstraktionstemperaturen udgør hensigtsmæssigt 1-40°C. Temperaturer under stuetemperatur, f. eks. i området mellem 1 og 10°C, foretrækkes.

Blandingen holdes under ekstraktionstiden ved en 15 pH-værdi på mellem 6 og 10, fortrinsvis ved en pH-værdi på 8. Såfremt denne pH-værdi ikke indstilles af sig selv, kan den opnås ved tilsætning af egnede pufferopløsninger.

Adskillelsen af ekstrakt og kimremanens sker hensigtsmæssigt ved centrifugering. Også filtreringsapparater, 20 som formår at tilbageholde mikroorganismer, er egnede til udvinding af den cellefrie ekstrakt.

Det har overraskende vist sig, at antigenet i en opløsning, som indeholder denatureringsmidler, fremviser et relativt ensartet opbygget stofs egenskaber. Dets 25 yderligere rensning kan derfor fordelagtigt gennemføres i nærværelse af denatureringsmidlet. En egnet foranstaltning hertil er f. eks. gelkromatografi, ved hvilken der kan opnås en adskillelse af toksiske komponenter fra antigenet, når udviklingen foretages med en puffer indeholdende denaturerings-2Q midler. Som medium til gelkromatografien egner sig især: med epichlorhydrin tværbundet dextran, i handelen som "Sepha-dex" 'S/ fra firmaet Pharmacia, Uppsala, eller copolymere af acrylamid og methylenbisacrylamid, i handelen som "Bio-Gel P" ®, fra firmaet Bio-Rad Laboratories, Richmond, U.S.A.

35 Som pufferstoffer indenfor rammerne af den her om handlede fremgangsmåde kommer de ved biokemiske arbejder, til stabilisering af opløsningens pH-værdi, anvendte kemiske forbindelser på tale, fortrinsvis de, som er beskrevet i Hand- 143317 4

O

book of Biochemistry, Cleveland (Ohio), 2nd Edition, side J 238, f. eks. tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. Det har vist sig hensigtsmæssigt at sætte små mængder, 1-20 mmol af såkaldte chelat- eller kompleksdannere, f. eks. ethylendiamin-5 tetraacetat (EDTA) til de anvendte pufferopløsninger.

I det tilfælde hvor der anvendes et adsorptionsmiddel, retter valget deraf sig i det væsentligste efter det ønskede anvendeisformål for antigenet. Til en Pertussisvaccines foretrukne anvendelsesområder foretrækkes som adsorberende mid-20 del et i vaccinefremstillingen prøvet immunologisk tilsætningsstof. Dette kan være af uorganisk oprindelse, såsom calcium-phosphat eller aluminiumoxid, fortrinsvis anvendes AlPO^, og/ eller γ-ΑΙΟ(ΟΗ) i en slutkoncentration (faststofkoncentration i.det færdige produkt) på 0,05% til 0,4% (vægt/vol.). Imidler-25 tid kommer også organiske polymere, især polyanioniske tilsætningsstoffer, på tale, som i de foreliggende denatureringsmidlers opløsninger er uopløselige, f. eks. derivater af polyacrylsyren. Er en indgivelse til mennesker og dyr ikke påtænkt, kan et hvilket som helst adsorberende middel, anvendt 2Q til adsorption af proteiner, sættes til opløsningen af antigenet.

Fjernelsen af denatureringsmidlet sker hensigtsmæssigt ved dialyse. Da antigenet i det fysiologiske miljø ikke kan træde gennem dialysemembranen, udfældes det even-25 tuelt på et adsorberende middel, ved denatureringsmidlets tiltagende udtræden gennem membranen.

Såfremt der ønskes et sterilt præparat, kan oparbejdningen fra ekstrationen til det færdige, eventuelt absorberede materiale ske under sterile betingelser. Som al-2Q ternativ foretages en kimfrifiltrering før fjernelsen af denatureringsmidlet og eventuelt før tilsætningen af det absorberende middel. Den yderligere oparbejdning må derpå ske under sterile betingelser.

Denatureringsmidlerne anvendes fortrinsvis i koncen- trationer på 2-6 mol/liter, især på 4-6 mol/liter, beregnet Jo på den samlede opløsning, da der herved opnås de bedste resultater ved ekstraktionen.

O

5 143317

Af neutralsalte foretrækkes de vandopløselige alka-limetalhalogenider, såsom NaCl el}.er KC1, og det i en koncentration på 0,5-3 mol/liter, fortrinsvis på 1 mpl/liter, beregnet på den samlede opløsning. Denatureringsmidler og neutralsalte 5 har ved ekstraktionen af antigenet en synergistisk virkning.

Som udgangsmateriale til den her omhandlede fremgangsmåde anvendes Bordetella pertussiskim. De formeres på kendt måde f.eks. ved dyrkning i Cohen-Wheeler-næringsopløsning ved ca. 35°C under omrøring, og udvindes ved syreudfældning, ved 1Q udfældning med organiske opløsningsmidler eller ved centrifugering. Til formeringen af kimene gås der således frem, at Bordetella pertussis-fermenteringskulturen underkastes en sur fældning ved en pH-værdi på 3-5, fortrinsvis ved en pH-værdi på 4. Til syrefældningen er alle mineralsyrer egnede, for-trins vis 1 N saltsyre, endvidere organiske syrer , f. eks. eddikesyre. Kim, som er skilt fra kulturmediet ved centrifugering, egner sig ligeså godt som ved hjælp af acetone eller syre udfældet kim. Kimene anvendes fortrinsvis i vandig su- 9 9 spension. Koncentrationen kan udgøre 50 * 10 - 1000 ' 10 , 9 9 2Q fortrinsvis 100 10 - 400' 10 per ml.

Virkningen af Pertussisvacciner undersøges ved dyreforsøg ifølge en af Kendrick, 1947, angiven fremgangsmåde (P.L. Kendrick, G, Eldering, M.K. Dixon og J. Misner, Amer.

J. Publ. Health 37 803 (1947) og Fed. Reg. 33 Nr. 118, 8818, 25 paragraf 73.404 (1968)).

Herved immuniseres 18 mus i tre fortyndingstrin med Pertussisantigenet, og den belastningsdygtige immunitet undersøges efter 13 dage ved en intracerebral infektion med 200 LD[.q levende kim fra Bordetella pertussis. Som standard- 2Q præparat medføres altid en vaccine med kendt beskyttelsesværdi. Den i dette forsøg fundne beskyttelsesværdi er en målestok for vaccinens beskyttende virkning i mennesker (jvf. hertil Medical Res. Council Brit. Med. J. Nr. 5128, 994 (1959)).

55 Ved ekstraktion af Pertussis-kimsuspensioner med en kimtæthed på 100 * lO^kim per ml, alt efter de ved den her beskrevne fremgangsmåde anvendte betingelser, fremkom vær- 143317 6

O

dier fra 25 til 75 IE/ml, En vaccine med mindst 8 IE/ml anerkendes alment som en virksom vaccine.

Toksiciteten bestemmes efter retningslinierne fra U.S. Department of Health, Education and Welfare.

5 lo mus får 0,5 ml af den 1:2 fortyndede Pertussis- vaccine, der skal undersøges. Ifølge kravene fra National Institutes of Health (NIH) i Federal Reg. 33^, Nr. 188, 8818, (1968), paragraf 73,403, kræves der vægtstigninger fra 3 g/ 7 dage. Ved et ved den her omhandlede fremgangsmåde frem-stillet Pertussisantigen udgør dyrenes gennemsnitlige vægtstigning efter 72 timer 1-3 g og efter 7 dage 5-6 g. Det indeholder følgelig ingen toksiske andele af Pertussiskimene og har en god forenelighed.

De her omhandlede Pertussis-vacciner, der skal 15 fremstilles, egner sig til parenteral og oral indgivelse.

Til opløsningen eller suspensionen af antigenet kan der sættes antimikrobielle konserveringsmidler, såsom natrium-timerfonat. Til fremstilling af en polyvalent vaccine kan Pertussisantigenet blandes med andre antigener og/eller 2q toxoider på sædvanlig måde.

Den her omhandlede opfindelse udgør et væsentligt fremskridt ved fremstillingen af Pertussisantigenet eller Pertussisvacciner. Fremgangsmåden er enkel. Den opnåede beskyttelsesaktivitet af det adsorberende ekstrakt-anti-25 gen er overraskende høj, i betragtning af tidligere fra litteraturen kendte data. Det høje udbytte i ekstrakten tydeliggøres også ved at kim, som er blevet underkastet en 6 molurinstof ekstraktion, havde mistet 80% eller mere af deres antigenaktivitet. Ved saltekstraherede kim fremkommer efter 2Q fraskillelse af ekstrakten imidlertid kun et tab på 10-20% af antigenaktiviteten. Fordi antigen-ekstrakten i et denaturerende miljø ikke fremviser nogen væsentlig polydisper-sitet, er en fraskillelse af toksiske komponenter mulig.

Derefter kan der forventes en betydelig stigning i anti-25 genets forenelighed ved dets anvendelse hos mennesker, især børn.

Fremgangsmåden forklares i de følgende eksempler.

143317 7 q Eksempel 1

Til 40 liter af en Pertussis-kimsuspension med 9 100 * 10 kim/ml sættes 6 liter 1 mol tris(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-puffer med en pH-værdi på 8,0 og indeholdende 5 50 mmol EDTA. Efter sammenblandingen tilsættes 14,4 kg urin stof og 3,48 kg NaCl, rumfanget indstilles med vand til et rumfang på 60 liter og suspensionen omrøres natten over med en magnetomrører. Efter at kimene er blevet fjernet ved centrifugering (Sharpless-gennemløbscentrifuge) tilsættes 3 li-ter af en 2%'s suspension af AlPO^ i blanding med en suspension af 1% Al(OH)2. Urinstoffet fjernes derpå ved dialyse mod sterilt 0,15 mol NaCl i et Hollow-Fiber-apparat fra fa. Ami- con. Efter adsorbatets udfældning indstilles det samlede volumen med en isotonisk kogsaltopløsning til 40 liter. Et , _ således fremstillet immunogen udviste i beskvttelsesforsøget 15 efter Kendrick 25 IE/ml.

En ekstrakt fremstillet ud fra det samme udgangsmateriale ved behandling af kimene med 0,5 mol NaCl udviste i beskyttelsesforsøget kun 4,5 IE/ml.

20 Toksiciteten målt hos mus: 3. dag + 3,2 g; 7. dag + 5,8 g.

Eksempel 2

Ved en ekstraktionsfremgangsmåde efter eksempel 1, imidler- 25 9 tid gående ud fra 200 * 10 kim/ml og en vandig opløsning på 6 mol guanidin-hydrochlorid + 1 mol NaCl, måltes ekstraktens beskyttelsesværdi til 76 IE/ml.

Toksiciteten målt hos mus: 3. dag +1,0 g; 7. dag + 5,2 g.

30

Eksempel 3

Ekstrakten udvundet ifølge eksempel 1, imidlertid med 9,6 kg urinstof i stedet for 14,4 kg, koncentreres på et ultrafilter 35 til 2 liter og påføres en søjle af "Sephadex" ® G-150, ækvilibreret med ekstraktionspufferen (indeholdende 4 mol 143317 8

O

urinstof). Den koncentrerede ekstrakt viste før kromatografien i et til 80 ’ 10y kim/ml ækvivalent volumen, 8,25 IE/ml, svarende til 130 IE/mg protein. Materialet, svarende til søjlens tilbageholdelsesvolumen, samles til en molekylvægt 5 på ca. 90.000, og urinstoffet fjernes ved dialyse mod 0,15 mol kogsaltopløsning. Den efter kromatografien udvundne fraktion koncentreredes til et volumen ækvivalent med en kim- 9 tæthed på 360 * 10 kim/ml og viste i beskyttelsesforsøget 84,3 IE/ml, svarende til 525 IE/mg protein.