DK144679B - Fremgangsmaade til udvinding af intravenoeskompatible gammaglobuliner - Google Patents

Description

144679

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til udvinding af intravenøskompatible gammaglobulinerr fra et udfældet gammaglobulin-råbundfald fra blod, ved hvilken den antikomplementære gammaglobulinbestanddel i en vandig opløsning af råbundfaldet bindes til en vandopløselig polymer og udfældes, hvorefter det indtil da i opløsning forblivende, intravenøskompatible gammaglobulin udfældes.

Blod er en væske, som består af faste og flydende bestanddele.

Til de faste bestanddele hører røde og hvide blodlegemer såvel som blodpladerne. Plasmaet eller den flydende del af blodet indeholder ca. 90$ vand og lo$ faste stoffer. Til de i plasmaet opløste stoffer hører bl.a. gammaglobulin, som anvendes til behandling og prophylaxe af infektioner. Til isolering af gammaglobulin må alle andre i plasmaet tilstedeværende substanser fjernes i størst mulig udstrækning, for at der skal opnås et så vidt muligt rent gammaglobulin.

Til fældning og isolering af gammaglobulin fra blod anvender man navnlig en under betegnelsen "COHN-metode" kendt fremgangsmåde (COHN et al., J. Amer. Chem. Soc·, Vol. 68, 1946, pp. 459-475; Vol.

72, 195o, pp. 465-474). Denne fremgangsmåde går ud fra et af forskellige blodprøver blandet plasma. Den er i princippet en fraktioneret fældning under forskellige betingelser. X det første trin bliver ved t 3° C og en pH-værdi på 7»2 med en ethanoltilsætning på 8$ først hovedsagelig udskilt fibrinogen som første sediment. Den resterende væske fældes i et andet trin med ca. 19$ ethanol ved pH 5»6. Bundfaldet indeholder overvejende gammaglobulin. Til rensning af dette som COIIN-fraktion II-III betegnede bundfald opløses dette atter og 144679 2 fældes ved pH 5 med 8/o ethanol. Den resterende væske fældes derefter påny med 25/» ethanol ved pH 7*2, Det herved dannede bundfald består af mindst 9o0/0 gammaglobulin. Bundfaldet optages i en egnet bufferløsning og er efter sterilfiltrering klar til anvendelse på mennesker.

Det har vist sig, at gammaglobulinpræparater, som er udvundet på den ovenfor beskrevne måde eller på anden måde, i talrige tilfælde er antikomplementært virksomme, så at der ved intravenøs indgivelse opstår komplikationer på grund af legemsreaktioner.

Man har derfor allerede forsøgt at forøge intravenøskompatibiliteten af gammaglobuliner. Som eksempler skal nævnes følgende, fra litteraturen kendte fremgangsmåders 1. Behandling med egnede enzymer 2. Hydrolyse ved høj hydrogenionkoncentration (f.eks. ved pH 4,o) 3. Modificering med β-propiolacton.

Det har imidlertid vist sig, at de kendte fremgangsmåder modificerer gammaglobulinmolekyleme og ændrer dem således i deres kemiske struktur, at deres virksomhed formindskes og deres gennemsnitlige opholdstid i organismen forkortes.

Ved en anden kendt fremgangsmåde (GB patentskrift 1 372 953) går man ud fra et gammaglobulin-råbundfaid, der f.eks. er fremkommet ved cryoethanol-fraktionering ifølge COHN, og som indeholder både intravenøstkompatible og antikomplementære gammaglobulin-be s tand-dele. De antikomplementære bestanddele bindes i en vandig opløsning af råbundfaldet ved hjælp af et vandopløseligt salt eller en vandopløselig, lineær, trådformet, uladet polymer, hvorved de danner et uopløseligt kompleks, som bundfældes, f.eks. ved hjælp af polyethy-lenglycol. Da der imidlertid ved denne bundfældning ikke kan foretages en nøjagtig adskillelse mellem ønskede og uønskede bestanddele, er det til opnåelse af en fuldstændig bundfældning af de antikomplementære bestanddele nødvendigt at anvende fældningsmidlet i en sådan mængde, at der også bundfældes en vis mængde rene globuliner. Den kendte fremgangsmåde er derfor forholdsvis uøkonomisk.

Opfindelsen har til formål at tilvejebringe en fremgangsmåde af den indledningsvis angivne art, ved hvilken ulemperne ved de kendte fremgangsmåder afhjælpes, og som således bevirker en minimal ændring af gammaglobulinmolekylernes struktur og reducerer den antikomplementære virksomhed af præparatet i sammenligning med kendte præparater, og som giver et maksimalt udbytte af rent, intravenøskompatibelt gammaglobulin.

3 144679

Ifølge opfindelsen opnås dette ved, at der som vandopløselig polymer til binding af den antikomplementære gammaglobuliribestand-del anvendes hydroxyethylstivelse (HES) med en molekylvægt på looo - 900.000 og i en koncentration på 1 - 30 vægt-$ i opløsningen, der har en pH-værdi på 3,^ - 8,0. Et optimalt resultat opnås ifølge opfindelsen ved anvendelse af HES i den vandige opløsning i en mængde på 8-10 vægt-$. PH-værdien holdes hensigtsmæssigt ved 6,5-6,9.

Efter opløsning af gammaglobulinråbundfaldet i den bufrede HES-opløsning tilsættes til den sidstnævnte blanding polyet-hylenglycol (PEG) indtil en koncentration på 10$. Efter tilsætning af PEG sker en udfældning af de substanser, som er bundet til HES, og som indeholder de antikomplementære bestanddele af gammaglobulinråbundfaldet· De udfældede uønskede bestanddele fjernes ved centrifugering. Den resterende væske blandes i en fraktioneret fældning ved pH 7,2 med yderligere 20$ PEG. Efter tilsætningen udfældes de ønskede bestanddele af gammaglobulin-rå-bundfaldet og kan udvindes ved centrifugering. Det fremkomne bundfald bringes i en fysiologisk natriumchloridopløsning på en koncentration af 5»2$ æggehvidestof.

I det følgende forklares de enkelte fremgangsmådetrin endnu engang på grundlag af et udførelseseksempel.

Fraskillelse af gammaglobulinet.

Man går ud fra en samlet plasma, til hvilken der tilsættes 8$ ethanol til udfældning ved en pH-værdi på 7,2 ved * 3° C, Derved udskilles fraktion I. Til den resterende væske tilsættes derefter ved •4· 5°c og en pH-værdi på 5»8 19$ ethanol. Derved udskilles fraktion II-III, som består af gammaglobuliner. Bundfaldet opløses atter og fældes påny ved pH 5 med 8$ ethanol. Den resterende væske fældes derefter påny med 25$ ethanol ved pH 7»2. Det herved dannede bundfald (fraktionll) består af mindst 9o$ gammaglobulin.

Formindskelse af den antikomplementære virksomhed.

Gammaglobulinbundfaldet opløses påny i en buffret vandig opløsning ved pH 6,7 i en koncentration på ca. 6$, hvorhos der til den vandige opløsning er tilsat ca. lo$ hydroxyethylstivelse med en molekylvægt på ca. 400.000, målt på grundlag af viskositetsmålinger. Denne tilsætning muliggør en adskillelse mellem antikomplementære bestanddele og intravenøskompatible gammaglobuliner.

4 144679

Overføring til en fysiologisk kogsaltopløsning.

Efter tilsætning af 10$ polyethylenglykol med en molekylvægt på ca. 4000, hvorved de antikomplementære bestanddele bundfældes, centrifugeres blandingen. Deh resterende væske blandes med 20$ p o ly ethyl engly ko 1, også med en molekylvægt på ca. 4000, hvorved også de intravenøskompatible bestanddele bundfældes. Det således udvundne bundfald fracentrifugeres og bringes i en fysiologisk kogsaltopiø.sning til en koncentration på 5,2$ æggehvidestof og sterilfiltreres derefter. Opløsningen er herefter klar til terapeutisk brug.

På tegningen viser fig. 1 strukturformlen for hydroxyethylstivelse (HES), fig. 2 immun-elektrophorese-diagrammer (iEP) af forskellige gammaglobuliner henholdsvis af normalsera, som er fremstillet efter kendte henholdsvis den ny fremgangsmåde, hvorhos den øvre halvdel af diagrammet i hvert af tilfældene viser IEP-diagram-mer for normal-blodsera, medens den nedre halvdel af diagrammerne viser følgende substansers a) standard-gammaglobulin, b) proteolytisk modificeret gammaglobulin, c) betapropiolacton-modificeret gammaglobulin, d) gammaglobulin fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Ved alle prøverne ifølge diagrammerne a) til c) drejer det sig dm et i handelen værende modificeret præparat. Disse prøver viser foruden gammaglobulinlinjen (langstrakt seglfornet linje i højre side af diagrammet) også yderligere æggehvidestofbestanddele af det menneskelige blod. Gammaglobulinlinjerne er ved prøverne a) og b) vist uskarpt på grund af den kemiske modificering. Prøven c) viser en i forhold til gammaglobulinlinjen i sammenligningsserummet forandret position.

I modsætning hertil viser sig klart, at prøven d) består praktisk talt udelukkende af rent gammaglobulin, da spektrets seglformede linje tydeligt er indeholdt i normalserummet.

Af diagrammerne kan ses, at det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udvundne gammaglobulin er praktisk taget loo$ rent og fuldstændig svarer til gammaglobulinet i det oprindelige blodserum.

Det sidstnævnte betyder, at molekylerne ikke er modificeret eller kemisk forandret.