DK143907B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotikumet lysolipin dets komponenter l og x og acylderivater deraf - Google Patents

Description

(19) DANMARK

|j| (t2) FREMLÆGGELSESSKRIFT ud 11*390? B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2214/76 (51) IntCI.3 Q 12 P 17/18 (22) Indleveringsdag 19· maj 1976 C 07 0 49^/16 (24) Løbedag 1 9 · maj 1 97 6 (41) Aim. tilgængelig 21. nov. 1 97 6 (44) Fremlagt 26. okt. 1981 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 20. maj 1975, 6477/75, CH 5- apr. 1976, 4228/76, CH

(71) Ansøger CIBA-GEIGY AG, 4002 Basel, CH.

(72) Opfinder Hans Zaehner, LE; Hannelore Lrautz, LE: Walter Kel= ler, CH.

(74) Fuldmægtig Dansk Patent Kontor ApS.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikumet lysolipin, dets komponenter I og X og acyl= derivater deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af det hidtil ukendte antibiotikum lysolipin, dets komponenter I" og X med formlerne 0^0 OCH-j

o E C I B A I

^ Ho I OH 0 C pqH« .ΟΙΝΟ-, 0 9 4 1

ΐ |G ^H lysolipin I

^ C^O^'^N^0 J ch3 143907 0^0 OCH, H D I -3 CH.Os N 1 0 1 01 3 '•/VyVy

E C I B A I

ho VV^” 0 029Η26011Τ012 ch3o' 0

Qg lysolipin X

og acylderivater deraf.

Antibiotikumet lysolipin opstår ved dyrkning af stammen Strepto-myces violaceoniger (Vaksman et Curtis), Vaksman et Henrici Tu. 96, der opbevares under denne betegnelse i Institut fur Mikrobiologie ved Universitåt Tubingen (Tyskland). Stammen er deponeret under betegnelsen NRRL 8097 ved Northern Regional Lab., US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois.

Stammen S.violaceoniger Tli 96 danner yderligere et antibiotikum, ropalocidin, der er beskrevet i en afhandling af Dietmar Mahl "Ropalicidin ein antifungisch.es Antibiotikum aus Streptomyces violaceoniger", Stuttgart, 1971·

Stammen S. violaceoniger Tli 96 danri er et i begyndelsen hvidt, senere askegråt luftmycelium. Sporekæderne er monopodielt forgrenet og har form af snævre, regelmæssige skruer, der sjældent omfatter mere end tre vindinger. Sporerne er ellipsoide, ca. 0,9 nm brede og 1,2 nm lange og har en glat overflade. Ved vækst på peptohhol-digt næringssubstrat (pepton-jernagar) iagttoges end ikke efter flere dages inkubation nogen melanoid misfarvning. Stammen viser altså ingen kromogenitet, da den ikke formår at danne tyrosinase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at stammen Streptomyces violaceoniger Tu 96 (NRRL 8097) eller en lysolipin-dannende mutant deraf, hvis egenskaber ikke afviger væsentligt fra nævnte stammes, dyrkes aerobt i mindst 3 dage i en vandig næringsopløsning indeholdende en carbon- og nitrogenkilde samt uorga 143907 3 niske salte, hvorpå lysolipinet isoleres og, om ønsket, adskilles i dets komponenter og/eller, om ønsket, overføres i et acylderivat.

Mutanter, der danner antibiotikum, og som har væsentligt samme egenskaber som Streptomyces violaceoniger NRRL 8097, kan f.eks. vindes under indvirkning af ultraviolet- eller røntgenstråler eller af nitrogensennepsolier .

Som carbonkilder skal f.eks. nævnes: assimilerbare kulhydrater, f.eks. glucose, saccharose, lactose, mannitol, stivelse.og glycerol. Som nitrogenholdige næringsstoffer skal nævnes: aminosyrer, peptider og proteiner samt disses nedbrydningsprodukter, såsom pepton eller trypton, endvidere kødekstrakter, vandopløselige bestanddele af kornsorter, såsom majs og hvede, af destillationsrester fra alkoholfremstilling, af gær, bønner, især fra sojaplanten, af frø, f.eks. fra bomuldsplanten, men også ammoniumsalte og nitrater. Af andre uorganiske salte kan næringsopløsningen f.eks. indeholde chlorider, carbonater, sulfater, phosphater af alkali- eller jord-alkalimetaller, af magnesium, jern, zink og mangan.

Dyrkningen sker aerobt, f.eks. i hvilende overfladekultur eller fortrinsvis submerst under rystning eller omrøring med luft eller oxygen i rystekolber eller de kendte fermentere. Som temperatur egner sig en sådan mellem 18 og 40°C, fortrinsvis 27°C. En væsentlig antibiotisk virkning viser næringsopløsningen derved i almindelighed efter 3 til 7 dage. Fortrinsvis dyrker man i flere trin, d.v.s. man fremstiller først en eller flere forkulturer i flydende næringsmedium, hvilke så overpodes til det egentlige produktionsmedium, f.eks. i forholdet 1:20. Forkulturen får man f.eks. ved, at man overpoder et sporuleret mycelium, der er opnået ved ca.

14 dages vækst på et næringssubstrat, til et flydende medium og lader det vokse i 72 timer.

Antibiotikumet er indeholdt i kulturfiltratet. Isoleringen af antibiotikumet fra kulturfiltratet sker efter i og for sig kendte metoder under hensyntagen til antibiotikumets kemiske, fysiske og biologiske, især lipofile egenskaber. Til afprøvning af antibiotikavirkningen (d.v.s. antibiotikumets tilstedeværelse) egner sig som forsøgsorganisme særligt godt Bacillus subtilis.

4 143907

Fra kulturfiltratet kan antibiotikumet ekstraheres med et med vand ikke-bl andbart lipofilt opløsningsmiddel, f.eks, ethyl acetat, carbonhydrider,' såsom cyclohexan, benzen, eller halogenerede carbon-hydrider, f.eks. methylenchlorid, chloroform, tetrachlormethan og tetrachlorethylen.

Til rensning af det efter afdampning af opløsningsmidlet opnåede råprodukt kan man f.eks. betjene sig af ekstraktion, fældning, fordeling mellem ikke-blandbare opløsningsmiddelfaser eller adsorption, fremfor alt kromatografi. En stor del af de mere lipofile ledsage-stoffer kan fjernes ved ekstraktion af råproduktet med petroleums-ether. Man kan også opløse råproduktet,f.eks. i methanol, og skille fra ledsagestoffer ved hjælp af adsorptionsmidler, såsom aktivt kul, kiselgel, magnesiumsilikat, aluminiumoxid eller blandinger deraf eller adsorptionsharpikser, f.eks. tværbundne dextraner, såsom "Sephadex" (fra fa. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala). F.eks. kan råproduktet renses ved gentagen søjlekromatografi under anvendelse af kiselgel, hensigtsmæssigt med små tilsætninger af aktivt kul. Antibiotikumet elueres fortrinsvis efter gradientmetoden med blandinger af chloroform eller tetrachlormethan og methanol, idet det procentuelle indhold af det stærkest polære opløsningsmiddel forøges trinvis.

Den ovennævnte fordeling mellem ikke-blandbare opløsningsmiddelfaser kan også foretages som modstrømsfordeling med et Craig-apparatur. Som opløsningsmiddelsystem tjener f.eks. en blanding af chloroform, cyclohexan, methanol og vand.

Til udvinding af de enkelte ensartede komponenter af antibiotikumet kan deres adskillelse og isolering f.eks. ske efter metoden med præparativ tyndtlagskromatografi under de for analytisk påvisning beskrevne betingelser. Mere fordelagtig er adskillelse ved hjælp af søjlekromatografi, hvorved der som adsorptionsmiddel f.eks, benyttes kiselgel med et indhold på 1-5% aktivt kul, og elueringen udføres fortrinsvis efter gradientmetoden med en blanding af chloroform og methanol. Forøgelsen af koncentrationen af det mindst polære opløsningsmiddel sker hensigtsmæssigt i mindre procentuelle trin, f.eks. 5-20% chloroform, eller man arbejder efter den kontinuerlige gradientelueringsmetode. Rensningsproceduren kan eventuelt gentages.

5 143907 I tyndtlagskromatogram på silicagelplader fra firmaet Merck (kisel-gel 60, F25^) viser komponenterne følgende Rf-værdier: i chloroform-methanol (9-1)ί X = 0,58; I w 0,81; i henzen-methanol (9:1): X= 0,26; I = 0,30; i chloroform-acetone (5=5) : X = 0,40; I = 0,53; i benzen-acetone (5:5): X = 0,47; I = 0,74-· For lysolipin I blev der ved rækkefortyndingsprøven fundet følgende minimale hæmnings-koncentrationer (MIC):

Mikroorganismer MIC i γ/ml

Lysolipin I

Il H—MMT· ' 1 t I . J i I- ·*·Ρ ' >— ™ —

Eubacteriales (gram-negative)

Achromobacter geminiani (27°) > 0,0025 < 0,005

Salmonella minnesota (37°) >0,5 <1

Salmonella typhimurium (37°) > 100

Proteus vulgaris (37°) > 0,001 < 0,0025

Eubacteriales (gram-positivs)

Arthrobacter aurescens (27°) > 0,001 < 0,0025

Arthrobacter crystallopoietes (27°) > 0,001 < 0,0025

Arthrobacter simplex (27°) > 0,001 < 0,0025

Bacillus brevis (37°) 5,1 0,025 < 0,05

Bacillus megaterium (37°) > 0,001 < 0,0025

Bacillus subtilis (37°) > 0,001 < 0,0025

Brevibacterium flavum (27°) > 0,001 < 0,0025

Clostridium pasteurianum (30°) > 0,001 < 0,0025

Chromobacterium violaceum (27°) >0,1 <0,5

Corynebacterium poinsettiae (27°) > 0,001 < 0,0025

Corynebacterium rathayi (27°) > 0,001 < 0,0025

Micrococcus luteus (27°) > 0,001 < 0,0025

Micrococcus roseus (27°) > 0,001 < 0,0025

Sarcina lutea (27°) > 0,001 < 0,0025

Staphylococcus aureus (37°) > 0,001 < 0,0025

Ps eudomonadale s

Pseudomonas fluorescens (27°) > 0,001 < 0,0025

Pseudomonas saccharophila (27°) > 0,001 < 0,0025

For lysolipin X ligger MIC med faktoren 10-50 højere.

6 143907

Komponent I af lysolipin har følgende kemiske og fysiske egenskaber: Det er et dybt gult krystallinsk stof, der er praktisk taget uopløseligt i vand og vandige syrer og baser; i lavalkanoler, såsom methanol, ethanol, n-propanol, samt i ether og petroleumsether, er det delvis opløseligt. I acetone, dimethylformamid, dimethyl-sulfoxid, ethylacetat, carbonhydrider, f.eks. eyclohexan, benzen og halogenerede carbonhydrider som ovenfor nævnt er det godt opløseligt.

Lysolipin I, krystalliseret af acetone-ether, smelter ved 260-262°C under sønderdeling, [a]p° = -50,2° (chloroform). Ved tyndtlagskro-matografi på silicagel i systemet chloroform-methanol (l9*.l) er Ef = 0,6.

Elementæranalyse giver følgende værdier:

Analyse for: c29H24ciN0n (597,95):

Beregnet: C 58,25 H 4,05 Cl 5,93 Ϊ 2,34 OCH^ 15,57%

Bundet: C 58,36 H 4,22 Cl 6,03 Ή 2,48 0CH3 15,43% C 58,30 H 4,27 N 2,38 (OCHy bestemmelse ifølge Zeisel).

Molekylvægt ved damptrykosmometri i ethylacetat: fundet 536. Mikrotitrering med 0,1 S tetr arnethyl ammoniumhydroxid i methylcello-solve-vand (8:2): fundet 9,72, ækvivalent vægt 545·

Titrering med 0,1 N HC1: intet trin (N-atomet følgelig ikke basisk).

Big. 1 viser IR-spektret for lysolipin I i KBr, fig. 2 ITV-spektret i ethanol (96%'s), fig. 3 viser NMR-spektret i CDCl^ (100 MHz); ved udbytning med D20 forsvinder kun de to signaler i offset-området samt det brede signal ved ca. 2,7 ppm, fig. 4 viser ^C-NMR-spektret i CDCl^ og lidt dimethylsulfoxid med fuldstændig støjdekobling og fig. 5 ^C-NMR-spektret, off-resonans.

Tabel 1 gengiver en sammenstilling af maximaerne fra fig. 4.

Tabel 2 viser massespektret for lysolipin I.

Til NMR-spektret (fig.3) skal der gøres følgende bemærkninger: 1.) Spinkobling.

Indstråling ved 4,43: dubletten ved 5,02 ppm bliver til en singlet.

7 143907

Indstråling ved 5»02 ppm: dubletterne ved 4,4-3 og 4,68 ppm bliver samtidigt til singletter.

Signalet ved 5,02 ppm svarer i integral til 2 protoner og kan opfattes som overlejring af en dublet og en bred multiplet. Dubletten står i vekselvirkning med den ved 4,43 ppm, multipletten med dubletten ved 4,68 ppm.

2.) De eksakte koblingskonstanter blev udmålt i et fire gange udstrakt spektrum og gav: 4,43 (d): 3,0 Hz., 4,68 (d): 4,1 Hz., 5,02 (d): 3,0 Hz., 5,40 (d): 5,7 Hz., 5,62 (d): 5,7 Hz. De sidste to signaler danner sammen et AB-spektrum, ligeså de to dubletter ved 7,36 og 7,90 ppm (J^ = 8 Hz., o-stillede hydrogenatomer ved en aromatisk ring).

To af de tre hydroxylgrupper i lysolipin I kan let acyleres. Ved længere tids acylering (2 uger ved stuetemperatur) får man tri-Q-acetyl-lysolipin I, der blev krystalliseret af acetone-vand; bleggule krystalprismer med smp. 2l6-224°C.

Fig. 6 viser NMR-spektret i CDCl^ (100 MHz). Den anvendte stofprøve indeholder endnu ethylacetat. Dette forårsager følgende signaler: tripletten ved 1,2 ppm; en delvis af OCH^-signaler overdækket kvartet ved ca. 3,5 ppm og en del af signalet ved ca. 2,35 ppm.

Tabel 3 gengiver massespektret for tri-O-acetyl-lysolipin I.

Når acyleringen kun gennemføres som sædvanligt natten over, får man en blanding af to produkter, der ikke har kunnet adskilles ved krystallisation, øjensynlig et mono- og et diacetat.

Monoacylateme af lysolipin I, især monoacetatet, kan fås ved kortvarig, f.eks. 2-4 timer, acylering.

Adskillelse af monoacetatet, diacetatet og triacetatet dannet ved acetylering af forskellig varighed af lysolipin kan gennemføres ved andre standardrensningsfremgangsmåder, såsom ved kromatografi, f.eks. på silicagel eller aluminiumoxid, eller ved adsorption på harpikser, såsom tværbundne dextraner, f.eks, "Sephadex"-, især "Sephadex® LH-20"- eller "Amberlite® XAD”-harpikaer, eller ved 8 143907 fordeling mellem ikke-blandbare opløsningsmidler.

Ved anvendelse af andre acyleringsmidler, såsom de af andre carboxylsyrer, f.eks. lavaliphatiske carboxylsyrer med 1-7 C-atomer, afledte, kan de tilsvarende monoacyl-, diacyl- og triacylderivater dannes på analog måde, og disse kan adskilles på lignende måde som beskrevet for acetaterne.

Ved røntgenspektrometri blev der for komponent I af lysolipin bestemt følgende strukturformel O^O OCH^ ΗΟγγίοΗΟΞ 0

CH^O i U

OH,

O

Lysolipin X blev isoleret som et farveløst amorft pulver. Det danner lysolipin I ved opvarmning eller ved bestråling med UV-lys, især ved tilstedeværelse af katalytiske mængder syre. Det kan imidlertid også omdannes til lysolipin I ved behandling i et egnet opløsningsmiddel, f.eks. chloroform eller methanol, med en syre, f.eks. en carboxylsyre, såsom en lavere aliphatisk carboxylsyre, ' f.eks. myre- eller eddikesyre, eller en uorganisk syre, såsom saltsyre eller svovlsyre. Det er ustabilt i uren tilstand. Ved opbevaring i luften uden beskyttelse mod lys, især ved stuetemperatur eller ved højere temperatur, omdannes det gradvis til lysolipin I. Det var muligt at opnå en delvis adskillelse af lysolipin X og I ved Craig-fordeling i systemet carbontetrachlorid/ chloroform/methanol/vand (3,42:2,28:4:1). Det således fremkomne, næsten farveløse amorfe pulver, d.v.s. lysolipin X, kan krystalliseres fra methanol. Ved opvarmning undergår krystallerne modifikation ved 200°C, og de smelter ved 260°C.

9 1439Φ7

Forbindelsen har den specifikke drejning [a= -349° -1 (c = 1,19 i CHCl^). Det således fremstillede rene produkt er stabilt under fravær af lys og syre. Ved tyndtlagskromatografering på silicagel i systemet chloroform:methanol (39:1) fås Rf-værdien = 0,22 (Rf-værdi for lysolipin I = 0,39)· Fig. 7 viser NMR-spektret (100 MHz) for lysolipin X i CDCl^. Signalerne ved 0,9 og 1,3 ppm må sansynligvis tilskrives en fedtagtig forurening. Størsteparten af signalerne i området fra 3 til 8 ppm har imidlertid stor lighed med signalerne for lysolipin I og viser det nære slægtskab mellem de to forbindelser.

Fig. 8 viser UV-spektret for lysolipin X i chloroform.

Massespektret for lysolipin X viser signaler m/e ved 597 (M^ -H^O, 1C1), 567, 565, 536, 519» 504, 328 og 233). På basis af disse data, ^C-NMR-spektret (anført i tabel IV) og røntgenspektrometri er der fastlagt følgende strukturformel for lysolipin X

tt O^O OCHo

E C I B A I HO

"-/VVH 0 O °29Η2601Η012 CH30 i 0 ch3 Røntgenspektrometri har også vist, at lysolipin X i krystallinsk tilstand også indeholder et halvt mol vand pr. mol stof med ovenstående formel.

IR-spektret for lysolipin X er anført i tabel V.

Når lysolipin X acyleres, f.eks. acetyleres, i et kort tidsrum på nogle få timer, f.eks. 2-4 timer, ved stuetemperatur, dannes et lysolipin X-monoacylat, især et monoacetat. En egnet fremgangsmåde til fremstilling af lysolipin X-monoacetat er f.eks. beskre- 10 U3907 vet i det efterfølgende eksempel 6. På analog måde kan der fremstilles monoacylderivater af andre lavere aliphatiske carboxylsyrer, f.eks. sådanne med 1-7 carbonatomer.

Ved acylering i længere tid af lysolipin X, f.eks. i ca. 12 timer, kan der fås en blanding af diacylater og monoacylater, f.eks. diacetater og monoacetater, eller esterene af de andre ovenfor anførte syrer. De kan isoleres hver for sig ved de ovenfor beskrevne rensningsfremgangsmåder for estere af lysolipin I. Ved gennemgribende acylering, f.eks. i et tidsrum på 3-5 dage, kan triaeylateme, f.eks. triacetatet, fremstilles.

Foruden antibakteriel virkning mod bakterier har lysolipin, såvel i form af den ved fermenteringen fremkomne blanding af de to komponenter, lysolipin I og lysolipin X, og i fom af de enkelte komponenter og derivater deraf også virkning mod gæragtige svampe, såsom Candida albicans, Candida lipolytica og Saccharomyces cerevisiae. De er virksomme såvel mod voksende som hvilende mikrobielle celler som mod deres sfæroplaster. Deres virkning beror sandsynligvis på en hæmning af cellevægsyntesen. Virkningen ophæves delvis ved hjælp af et overskud af lipider, f.eks. sphingolipider, phosphoglycerider og bakteriecellevæglipider.

Lysolipin og dets derivater kan anvendes alene eller i kombination med andre cellevægsyntesehaanmende antibiotika, såsom penicilliner, cephalosporiner og cycloserin, til bekæmpelse af infektioner, der fremkaldes af bakterier, såsom de nævnte, og som desinfektionsmidler. Med nogle antibiotika, f.eks. penicilliner, blev der iagttaget en synergistisk virkning.

Til fremstilling af farmaceutiske præparater kan antibiotikumet blandes med et til topisk, enteral eller parenteral applikation egnet uorganisk eller organisk bæremateriale. Som sådant kommer sådanne stoffer i betragtning, der ikke reagerer med forbindelsen, såsom gelatine, lactose, stivelse, magnesiumstearat, planteolier, benzylalkohaler eller andre lægemiddelbærere. De farmaceutiske præparater kan f.eks. foreligge som tabletter, dragées, pulvere, suppositorier eller i flydende form som opløsninger, suspensioner, emulsioner, cremer eller salver. Eventuelt er de steriliseret og/ n 143907 eller indeholder hjælpestoffer, såsom konserveringsmidler, stabiliserings-, befugtnings- eller emulgeringsmidler. De kan også indeholde andre terapeutisk værdifulde stoffer. Også desinfektionsmidlerne kan på kendt måde blandes med egnede bærestoffer.

Opfindelsen beskrives nærmere i de følgende eksempler.

På tegningen viser: fig. 1 IR-spektrum for lysolipin I i KBr, fig. 2 UV-spektrum for lysolipin I i finsprit, fig. 5 NMR-spektrum for lysolipin I i CDC1Z, 13 2 fig. 4- "O-MR-spektrum for lysolipin I med fuldstændig støjde- kobling, fig. 5 ^C-HMR-spektrum for lysolipin I, off-resonans, fig. 6 UMR-spektrum for tri-O-acetyllysolipin I, fig. 7 KMR-spektrum for lysolipin X, ikke helt ren og fig. 8 UV-spektrum for lysolipin X i GECly

Tabellerne viser: tabel 1 massespektrum for lysolipin I, tabel 2 1^C-NMR-spektrum for lysolipin I, tabel 5 massespektrum for tri-O-acetyllysolipin I, tabel 4 ^C-MtR-spektrum for lysolipin X og tabel 5 IR-spektrum for lysolipin X.

Eksempel 1.

En lyoampul med 5 ml sporesuspension af S.violaceoniger TU % op-slæmmes med 5 ml 0,2 M phosphatpuffer pH 7. 3 Erlenmeyerkolber med 1 chikane (indbugtning, "baffle") hver med 100 ml næringsopløsning, der pr. liter ledningsvand indeholder 4 g gærekstrakt, 10 g maltekstrakt og 4- g glucose og hvis pH før sterilisation er indstillet med 1 N natriumhydroxidopløsning på 7?3> podes hver med 2 ml af Streptomyces-suspensionen og inkuberes i 24- timer på en roterende rystemaskine med 250 o/min. ved 27°C. 25 ml af den således vundne kultur podes i hver af 6 2-liter Erlenmeyerkolber med 4- chikaner og 500 ml af ovennævnte næringsopløsning. Kolberne inkuberes derpå ved 27°C på en roterende rystemaskine med 120 o/min. i 4-8 timer.

12 143907 0,75 liter af kulturen fra 2 liter-kolberne overføres til en 50-liter fermenter, der indeholder 30 liter af ovennævnte næringsopløsning og inkuberes i 24 timer ved 27°C. Derpå overføres 15 liter af kulturen til en fermenter med 300 liter af ovennævnte næringsopløsning. Denne fermenter har et totalvolumen på 500 liter og har en 6-bladet turbineomrører og 4 chikaner (prelplader, "baffles")· Dyrkningsbetingelserne i fermenteren er: tryk 0,5 ato, rørehastig-hed 450 o/min., temperatur 27°C, luftgennemgang 1 liter V/V/min. Betingelserne svarer til en i sulfitopløsning målt oxygenabsorptionsrate på 150 M O^/l/h. Den optimale dannelse af antibiotikumet lysolipin sker efter ca. 100 timers inkubation. Kulturopløsningen har så en pH-værdi på 7,5· Ben viser ved agradiffusionsprøven med Bacillus subtilis en hæmningszone på 14-15 mm under anvendelse af Whatmann A filterrondeller med en diameter på 6 mm.

Eksempel 2 600 liter af den ifølge eksempel 1 opnåede kulturopløsning filtreres under tilsætning af 2% filterhjælpemiddel "Dicalite" (diatoméjord). 560 liter kulturfiltrat indstilles med natriumhydroxid-opløsning på pH 9,0 og ekstraheres på en kontinuerlig ekstraktor to gange med chloroform i forholdet 2:1. Det inaktive vandige raffinat bortkastes. 600 liter chloroformfase koncentreres i vakuum. Der fås 290 g tør remanens. Denne digereres med 2 liter pe-troleumsether. Den inaktive petroleumsetherekstrakt bortkastes, og den uopløselige del tørres i vakuum. Der bliver en gulbrun, halvfast remanens tilbage (46 g).

Eksempel 3 2,8 g af det ifølge eksempel 2 opnåede råprodukt kromatograferes på en søj'le af Sephadex®' LH-20 (alkyleret tværbundet dextran), længde 73 cm, diameter 3 cm, med chloroform-methanol (1:1) med en hastighed på 20 ml pr. time. Der opfanges fraktioner på 5 ml. Det relative indhold i fraktionerne af lysolipin I bestemmes fotometrisk ved 360 nm; det i fraktionerne 40-47 bestemte indhold af lysolipin I antages vilkårligt som 1. Der fremkommer følgende fordeling: 13 H3»07

Fraktion mg tør remanens relat.indhold af

lysolipin I

1-27 40 under 0,05 28-29 30 0,46 30-39 524 0,58 40-4? 618 1 48-55 234 0,29 56-80 233 under 0,1 ' — ' 1 I I I ' ' ' ' 1 · ' .......... I f 1 I'·' ^

Fraktionerne 40-47 giver af acetone-ether 416 mg dybt gule krystaller af lysolipin I, smp. 260-262°C (sønderdeling). Yderligene kemiske, fysiske og biologiske egenskaber er anført i beskrivelsens almindelige del.

Af moderluden fra krystallisationen og af nabofraktionerne kan der ved fornyet kromatografi på Sephadex® IB-20 vindes yderligere 360 mg krystaller.

Eksempel 4.

300 mg lysolipin I fremstillet ifølge eksempel 3 henstilles med 10 ml pyridin og 10 ml eddikesyreanhydrid i 2 uger ved stuetemperatur; derpå inddampes opløsningen i vakuum. Remanensen kromato-graferes på 30 g kiselgel med chloroform-ethylacetat (4:1). De første 150 ml eluat indeholder 48 mg uensartet materiale. De efterfølgende 210 ml giver 220 mg bleggult olieagtigt materiale, der i tyndtlagskromatogram (kiselgel, ethylacetat som flydemiddel, farvning med ioddamp) viser en hovedplet med Rf 0,33 og to svage forureninger. Fed langsom krystallisation af acetone-vand dannes der bleggule krystalprismer med et uskarpt smp. ved 216-224°C. 3ttr-spektrum i CDCl^ (100 MHz), se fig. 6. Prøven indeholder endnu noget ethylacetat (fra kromatografien), der kan iagttages på MR-spektret. Af. massespektret (se tabel 3) ses det, at der foreligger et triacetat.

Uår acetylering som sædvanlig kun gennemføres natten over, får man en blanding af to produkter, der ikke kunne skilles ved krystallisation, åbenbart et diacetat.

14 143907

Eksempel 5 1,5 g af det ifølge eksempel 2 opnåede råprodukt underkastes en Craigfordeling over 190 trin i opløsningsmiddelsystemet tetrachlor-methan (3,42 liter)-chloroform (2,28 liter)-metlianol (4 liter)-vand (1 liter). De stærkt gult farvede fraktioner 26-54 indeholder fremfor alt lysolipin I. Der isoleres ved, at man fortynder fraktionerne med det dobbelte volumen vand, skiller den organiske fase fra, udryster den vandige fase tre gange med methylenchlorid, forener de organiske faser, tørrer med natriumsulfat og inddamper i vakuum. Man får 258 mg tyndtlagskromatografisk ensartet lysolipin I, der renses yderligere ved kromatografi på Sephadex® LH-20 og omkrystallisation som ovenfor beskrevet.

Fraktionerne 76-100 giver ved analog oparbejdning et næsten farveløst amorft pulver (393 mg), lysolipin X. MR- og UV-spektrum se fig. 7 og 8. Ved tyndtlagskromatografi på kiselgel i chloroform-methanol (39:1) er Rf = 0,22 (mod 0,39 for lysolipin i). På tyndt-lagspladen bliver den i begyndelsen meget blege, næppe erkendelige plet af lysolipin X dybt gul ved henstand i luften, hurtigere ved opvarmning. Ved eluering af pletten og fornyet tyndtlagskromatografi viser det sig, at lysolipin X er gået over til lysolipin I.

En prøve af lysolipin X kromatograferes med methanol på Sephadex LH-20. En i begyndelsen blegt gul zone bliver stadig mere intensiv gul ved fremadskridende kromatografering. De gule eluatfraktioner viser sig ved tyndtlagskromatografien at være identiske med lysolipin I.

Et i begyndelsen næsten farveløst præparat af lysolipin X opbevares i flere måneder i køleskab. Det antager i løbet af denne tid en intensiv gul farve. Ved en Craigfordeling (se ovenfor) fås af præparatet endnu ringe mængder lysolipin X. Hovedmængden kan identificeres som lysolipin I.

15 1439Ό7

Tabel 1

Lysolipin I.

^C-NMR-spektrum (25,2 MHz), Opløsningsmiddel: CDCl^ + noget DMSO.

Nr, δ (ppm) m Nr, δ (ppm) m 1 181,26 s 15 117,77 s 2 168,26 s 16 116,15 d " 3 158,60 s 17 111,24 s 4 151,26 s 18 110,37 s 5 149,65 5 19 108,54 s 6 144,95 s 20 92,63 d 7 143,17 s 21 90,95 t 8 140,53 S 22 78,87 d 9 138,86 s 23 75,31 d 10 134,06 s 24 67,70 d 11 133,09 S 25 61,55 q 0CH5 12 127,91 s 26 58,42 q 00^ 13 125,48 d 27 57,67 q 0CH? 14 120,62 ? 28 35,55 q 6: Kemisk forskydning i forhold til tetramethylsilan som intern standard, m: Opspaltning i "off-resonans"-spektrum. Af de 29 C-atomer er 28% erkendelige som selvstændige signaler.

Tabel 2

Lysolipin I.

Gule krystaller, Cg^Hg^ClNOn Massespektrum, Di = 140°C.

m/e % m/e % m/e % 601 0,2 524 0,3 475 0,25 600 1,0 523 0,2 474 0,20 599 3,2 522 0,15 473 0,3 598 2,7 521 0,3 597 8,0 520 0,35 471 0,1 596 0,2 519 0,35 470 0,1 518 0,35 469 0,2 16 143007 579 og 468 0,6 581: spor, 507 0,3 467 0,4 langt under 506 0,7 466 1,5 0,1% 505 0,7 465 0,2 504 1,4 464 0,4 570 0,3 503 0,2 463 0,5 569 1,2 502 0,2 462 0,4 568 1,3 461 0,25 567 4,0 497 0,2 566 1,0 496 0,6 450 0,1 565 2,2 495 0,4 449 0,15 494 1,2 448 0,2 552 0,2 493 0,3 447 0,2 551 0,1 492 0,2 446 0,2 550 0,15 491 0,15 445 0,3 549 0,2 490 0,2 489 0,3 441 0,1 539 0,7 488 0,3 440 0,4 538 2,5 W 0,2 439 0,3 537 2,7 486 0,2 438 1,1 536 6,5 437 0,1 535 2,2 478 0,15 436 0,3 534 0,3 477 0,2 435 0,2 533 0,4 476 0,25 434 0,25 433 0,2 225 0,2 147 0,6 432 0,1 224 0,2 146 0,25 431 0,1 223 0,35 145 1,2 430 0,1 144 0,3 219 0,2 143 0,7 423 0,1 218 0,2 142 0,3 422 0,2 217 0,5 141 0,j6 421 0,2 216 0,2 140 0,2 420 0,4 215 0,35 139 0,35 419 0,2 214 0,1 138 0,3 418 0,25 213 0,3 137 0,35 417 0,35 212 0,25 136 0,5 211 0,3 135 1,2 4X0 0,05 210 0,5 134 0,2 409 0,1 133 0,4 408 0,2 X9X 0,2 132 0,6 407 0,25 190 0,3 131 4,5 406 0,3 189 0,6 I30 0,5 405 0,3 188 0,3 129 1,6 404 0,2 187 1,0 128 1,2 403 0,1 186 0,2 127 0,6 402 0,2 185 0,4 126 0,3 125 0,4 380 0,1 178 0,2 124 0,35 379 0,2 177 0,35 123 0,6 378 0,3 176 ' 1,0 122 0,5 377 0,1 175 0,5 121 0,6 120 0,4 af 376-226 151 0,4 119 _ 0,8 ingen klart fra 150 2,7 118 0,7 baggrunden 14-9 3,5 117 3,9 fremtrædende 148 0,8 116 0,8 peaks, ingen peak over 0,1% 115 2,2 83 3,7 51 0,8 114 0,3 82 0,9 50 1,2 113 0,4 ' 81 1,5 112 0,5 80 0,3 46 0,3 111 0,4 79 1,3 45 4,8 110 0,9 78 0,7 44 3,3 109 0,7 77 1,9 43 ^45_ 108 0,4 76 0,5 42 2,6 107 1,0 75 0,6 41 6,1 106 0,7 74 6,3 40 0,5 105 2,5 73 2,1 39 2,3 104 0,4 72 0,3 38 0,6 103 0,8 71 1,7 37 0,5 102 0,4 70 1,6 36 0,8 101 O, 69 3,5 100 0,2 68 0,9 33 2,3 99 0,5 67 1,4 52 89 l8 143907 98 0,8 66 0,3 31 100 97 1,5 65 0,9 30 15 96 0,8 64 0,3 29 67 95 1,6 63 0,4 28 5,7 94 0,6 62 0,15 27 2,6 93 1,2 61 0,5 26 0,8 92 0,6 60 1,8 91 3,4- 59 4-,8 19 0,7 90 0,2 58 8,5 18 6,0 89 0,5 57 3,2 17 1,5 88 0,2 56 1,5 16 0,3 87 0,9 55 5,5 15 26 86 0,2 54 0,5 14 2,2 85 1,2 53 1,0 Aflæsning på det første 84 1,2 52 0,5 spor: 1% = 27 mm

Tabel 3

Tri-O-Acetyl-lysolipin I.

Massespektrum. Di = 120°.

m/e I (%) m/e I (%) m/e I (%) 685 2 577 7 507 3 684 8 576 2 506 4 683 24 505 6,2 682 21 568 1 504 6,7 681 58 567 1,3 503 3,3 566 2,5 502 1,6 653 0,8 565 2 652 1,2 564 1,7 497 2,5 651 3,0 563 0,9 496 9 650 2,5 562 1,3 495 11 649 5,5 494 23 551 1,2 493 16 643 5 550 1,7 492 5,4 642 20 549 4,0 491 3,7 641 40 548 2,5 490 3,3 640 37 547 1,7 489 3,7 639 100 546 3,7 488 6,3 487 4 19 U3907 612 5 537 2,5 486 6 611 16 536 3,3 610 17 535 6,7 479 1,2 609 50 534 5,7 478 5,0 608 15 526 5,7 477 3,3 607 27 525 4,6 476 3,7 524 10,2 475 4,0 600 metastab,ion 523 6,2 474 2,5 581 metastab.ion 522 1,7 473 2,0 521 2,5 472 1,2 581 5,5 520 4,6 471 1,7 580 15 519 5,4 470 1,7 579 17 518 7,1 469 1,2 578 40 468 3,3 467 1,7 45 12 466 4,0 44 5 465 3,7 43 48 464 5,1 42 13 463 6,0 41 7 462 10 461 8 32 33 460 2,5 31 43 30 12

Fra 460 til 85 29 39 ingen signifi- 28 10 kante peaks 18 8 85 3,3 17 2 84 2,0 16 1,2 83 4,4 15 15 82 1,7 14 5 81 2,0 74 12 73 1,7 72 1,2 71 5,4 70 3,0 69 9,5 20 U3907 61 2,5 60 6,3 57 7,5 56 2,5 55 5,4

Eksempel 6 0,240 g lysolipin X fremstillet ifølge eksempel 5 sættes til en opløsning af 2,48 g tetra-(n-butyl)-ammoniumfluorid-trihydrat, som er tørret i 48 timer i højvakuum, i 30 ml methylenchlorid. En opløsning af 1,88 ml eddikesyreanhydrid i 10 ml methylenchlorid tilsættes derpå dråbevis i løbet af 15 minutter. Efter endt tilsætning kan der kun påvises spor af udgangsmaterialet ved tyndtlagskroma-tografering. Efter en reaktionstid på 2 timer ved stuetemperatur hældes reaktionsblandingen i isvand, og reaktionsproduktet ekstrahe-res 3 gange med chloroform. Den gule remanens, som fås ved fordamp-ning, kromatograferes på 100 g "Sephadex LH-20". Lysolipin X-mono-acetat fås ved eluering med methanol som et beigefarvet stof. En lille mængde gule krystaller elueres fra andre fraktioner, og disse er identiske med lysolipin I-monoacetat, når det sammenlignes med en autentisk prøve fremstillet på samme måde som ovenfor ud fra lysolipin I.

Eksempel 7 0,70 g lysolipin X fremstillet ifølge eksempel 5 opløses i 35 ml af én blanding af chloroform og methanol (1:1) , og der tilsættes 0,1 ml myresyre. Den svagt gule opløsning tilbagesvales i 30 minutter ved en badtemperatur på 105°C. Efter dette tidspunkt kan der ikke påvises noget udgangsmateriale ved tyndtlagskromatografi. Chloroformet fordampes fra den brunrøde reaktionsopløsning på en rotationsfordamper, og det fremkomne methanolkoncentrat henstilles i et køleskab natten over, hvorved lysolipin I udkrystalliserer i form af gyldne små nåle. Ved filtrering og tørring fås 0,57 g krystaller.

Ved inddampning af moderluden fås 0,115 g halvkrystallinsk stof, som består af urent lysolipin I. Den første rene fraktion omkrystalliseres atter fra ca. 15 ml methanol og tørres i 48 timer ved 35°C i højvakuum. Det fremkomne produkt smelter ved 260-262°C.

2i U3M7

Eksempel 8.

100 ml af en sporesuspension af Streptomyces violaceoniger NEEL 8097 (TU 96) i en 0,2 M phosphatpufferopløsning med pH-værdi 7,0

C

indeholdende 10 sporer/ml inoculeres direkte i en 500 1 fermen-teringsheholder indeholdende 500 1 næringssubstrat indeholdende 4- g gærekstrakt, 10 g maltekstrakt og 4- g glucose pr. liter ledningsvand. Substratet indstilles på pH-værdien 7»3 med 1 N na-triumhydroxidopløsning inden steriliseringen. Fermenteringsbeholderen er forsynet med en 6-bladet turbineomrører med en diameter på 230 mm og har ingen indbugtninger. Dyrkningsbetingelserne i fermenteringsbeholderen er følgende: tryk 0,5 bar, omrøringshastighed 350 omdrejninger pr. minut, temperatur 27°C og luftgennemgang 1 liter/V/V/minut. Optimal dannelse af antibiotikummet lysoli-pin sker efter en fermenteringstid på 120-144 timer. Dyrkningsvæsken har på dette tidspunkt en pH-værdi på 7,8. Ved en agardiffusionsprøve med Bacillus subtilis på et syntetisk agarsubstrat fremkalder den ufortyndede og fuldstændige dyrkningsvæske en hæmningszone med en diameter på 14—15 π21 under anvendelse af Whatmann A filterskiver med en diameter på 6 mm.

Lysolipin isoleres fra dyrkningsvæsken i form af dets to komponenter lysolipin I og Lysolipin X under anvendelse af den i eksem-' pel 2 og 5 beskrevne fremgangsmåde.

Tabel 4-.

Lysolipin X

^0 NMR-spektrum (25,2 MHz.).Opløsningsmiddel CDCl^ + en lille mængde DMSO:

Spektret indeholder 2 carbonylsignaler foruden 16 signaler fra aromatiske C-atomer og 11 signaler fra aliphatiske C-atomer.

Signaler er angivet i ppm i forhold til trimethylsilan. Deres antal er anført i parentes.

a) carbonyl-toppe 1) 175,86 (s) 2) 167,86 (s) 143907 22 b) signaler fra C-atomer af aromatisk karakter 3) 159,11 (s) 4) 151,56 (s) 5) 149,07 (s) 6) 145,1 (s) 7) 143,30 (s) 8) 140,02 (s) 9) 139,2 (s) 10) 132,5 (s) 11) 126,5 (d) 12) 124,1 (s) 13) 123,0 (s) 14) 120,5 (d) 15) 119,2 (s) 16) 117,0 (d) 17) 115,6 (s) 18) 109,9 (s) c) signaler fra 0-atomer af aliphatisk karakter 19) 92,25 (d) 20) 90,28 (d) 21) 79,02 (d) 22) 72,7 (d) 23) 72,35 (s) 24) 67,3 (d) 25) 65,03 (d) 26) 61,83 (q) 27) 58,37 (q) 28) 57,54 (q) 29) 36,21 (q)

Tabel 5·

Lysolipin X IR-spektrum: a) absorptionsbånd for en opløsning i methylenchlorid 2,71 (w) 6,37 On) 11,31 (m) 2,85 (w) 6,74 (m) 3,39 (w) 7,33 (ms) 6,08 (s) 8,97 (m) 6,16 (s) 9,13 On) 6,26 (m) 9,43 (s)

Claims (1)

143907 23 b) absorptionsbånd, for en suspension i nuøol 2,88 (m) 6,39 (s) 9,14 (m) 11,32 (ms) 3,02 (m) 6,97 (s) 9,56 (s) 12,79 (ms) 3,67 (w) 8,00 (s) 9,80 (m) 6,12 (ms, skul- 8,57 (m) 9,98 (s) 6,21 (s) dei9 8,91 (m) 10,23 (m) 6,28 (s) 9,00 (m) 10,61 (m) Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikumet lysolipin, dets komponenter I og X med formlerne oAo 0CH, HD I 5 ch3°^>X0vVc1 E C I B A I άΥτ H0' A X 0H 0 '' V|H C29H24C1W011 Lysolipin I CH, 5 οΆ OCH, E C I B A I f I oh· I hoyVoh°h 0 G > i . CqqHqC-CINO^ yj ch50''\nao 29 26 12 I Lysolipin X ch3 og acylderivater deraf, kendetegnet ved, at stammen Streptomyces violaceoniger Tu 96 (NRRL 8097) eller en lysolipin-dannende mutant deraf, hvis egenskaber ikke afviger væsentligt fra nævnte stammes, dyrkes aerobt i mindst 3 dage i en vandig næringsopløsning indeholdende en carbon- og nitrogenkilde