DK144097B - Fremgangsmaade til udvinding af det antibiotiske stof thienamycin - Google Patents

Description

fw V P&

(19) DANMARK

H (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n> 144Q97B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 67^/78 (51) jnt.CI.3 C 12 P 17/18 (22) Indleveringsdag 15· fet>· 1978 C 07 D 487/04 (24) Løbedag 15- feb. 1978 (41) Aim. tilgængelig 2. sep. 1978 (44) Fremlagt 7· dec. 1981 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag “ (62) Stamansøgning nr. “

(30) Prioritet 1. mar. 1977, 773551*, US

(71) Ansøger MERCK & CO. INC., Rahway, US.

(72) Opfinder Rathin Datta, US: George Thomas Wildmsn, US, (74) Fuldmægtig ingeniørfirmaet Hofman-Bang Se Boutard.

————^^^^—^—111 .............. —...................

(54) Fremgangsmåde til udvinding af det antibiotiske stof thienaraycin.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af det antibiotiske stof thienamycin.

Thienamycin fås ved dyrkning af en mikroorganisme af arten Strep-tomyces cattleya i et egnet næringsmedium under kontrollered? be-tingelser.

^ Fra USA patentskrift nr. 3 950 357 er det kendt at isolere thiena- 3. mycin ved anvendelse af faste ionbytterharpikser.

t—

Thienamycin, der har formlen 3 2 144097 CH3-CH(0H)-- >—S-CH?-CHp-NHp

J

C00H

er en hydrofil amphoter forbindelse, som ikke kan extraheres fra vandige opløsninger ved hjælp af simple organiske opløsningsmidler.

En simpel extraktion med opløsningsmiddel, som er kendt fra isoleringen af penicillin og andre antibiotiske stoffer, kan derfor ikke benyttes i det foreliggende tilfælde.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at der kan benyttes i vand uopløselige flydende ionbyttere, som er opløst i egnede organiske opløsningsmidler, til at overføre thienamycinet ved en ionbytningsmekanismefra den vandige fase til det organiske opløsningsmiddel, efterfulgt af overførsel af renset thienamycin fra den flydende ionbytter/opløsnings-middel-blanding til en egnet vandig puffer, atter ved ionbytning. Anvendelsen af konventionelle centrifugal-extraktorer til ionbytnings-extraktionsprocessen har ført til en yderst hurtig blanding og faseseparering, hvorved man formindsker den tid, hvor thienamycinet er underkastet skadelige pH-værdier. Denne procedure giver forbedrede udbytter af thienamycin i forhold til anvendelsen af konventionelle faste ionbyttere.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del anførte.

En væsentlig rensning af det antibiotiske stof sker ved den flydende ionbytningsproces. Det antibiotiske stof med ovennævnte formel I kan også renses yderligere ved en afsaltning og chro-matografi på polymere adsorptionsmidler, såsom Amberlite XAD-1, 2 og 4, fortrinsvis XAD-2 (fremstillet af Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania), chromatografi på stærkt katio-niske eller anioniske ionbytterharpikser, såsom Dowex 50 x 2 (Na+-form) eller Dowex 1x2 (Cl"-form) (fremstillet af Dow Chemical Co., Midland, Michigan) og ved gelfiltrerings-chromatografi gennem polyacrylamid-geler.

3 144097

Hovedfordelen ved den flydende ionbytningsproces i forhold til den konventionelle faste ionbytningsproces er følgende: 1) større udbytte af thienamycin og 2) processen kan gennemføres helt kontinuerligt, hvilket medfører de for kontinuerlig drift karakteristiske fordele.

Thienamycin fremstilles som nævnt ved aerob gæring af egnede van-n dige næringsmidler under kontrollerede betingelser, idet der som mikroorganisme anvendes en stamme af Streptomyces cattleya, såsom mikroorganismen registreret under betegnelsen NRRL 8057. Gæringen udføres i de sædvanlige vandige medier, som benyttes i almindelighed til fremstilling af antibiotiske stoffer. Sådanne medier indeholder kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte, der kan assimileres af mikroorganismen.

Fremstillingen og karakteriseringen af thienamycin er beskrevet i beskrivelsen til USA patent nr. 5 950 357.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan benyttes flydende kat-ionbyttere og flydende anionbyttere.

Eksempler på flydende kationbyttere er de stærkt kationiske typer, såsom dinonylnaphthalensulfonsyre (DNNS) på hydrogen-, natrium- eller anden form. Udtrykket "form" refererer til den særlige saltform af den flydende ionbytter. Som eksempel på en anden stærk ionisk flydende Ionbytter kan nævnes dodecylnaphthalen-sulfonsyre og salte deraf. Svagere kationiske flydende ionbyttere, såsom di-(2-ethylhexyl)phosphorsyre, kan også anvendes, men de stærkt kationiske ionbyttere foretrækkes,

Kationbytteme anvendes i kombination med et organisk opløsningsmiddel eller en blanding af sådanne som extraktionsmiddel. Det organiske opløsningsmiddel bør have en moderat høj dielektricitetskonstant, såsom mellem 4 og 24. Typiske eksempler på sådanne organiske opløsningsmidler med en moderat høj dielektricitetskonstant er lige eller forgrenede alkoholer med 4-10 carbonatomer, lige eller forgrenede ketoner med 4-8 carbonatomer og lige eller forgrenede estere med 4-10 carbonatomer.

Typiske eksempler på de nævnte alkoholer er n-butanol, iso- 4 146097 butanol, pentanol, isopentanol, hexanol og heptanol. Typiske eksempler på ketonerne er methylethylketon og methylisobutyl-keton. Eksempler på egnede estere er ethylacetat og butyl-acetat.

Når der anvendes en blanding af opløsningsmidler, kan et opløsningsmiddel med en høj dielektricitetskonstant kombineres med et opløsningsmiddel med en lav dielektricitetskonstant for at opnå en blanding med den ønskede dielektricitetskonstant. Med udtrykket "høj dielektricitetskonstant" menes et opløsningsmiddel med en dielektricitetskonstant mellem 24 og 100. Med udtrykket"lav dielektricitetskonstant" menes mindre end 4.

Der kan dog også benyttes en blanding af opløsningsmidler med moderat høje dielektricitetskonstanter.

Kationbytteren anvendes sædvanligvis i en koncentration på 2 til 15 volumenpct. i opløsningsmidlet. Den flydende kation-bytteropløsning indstilles derefter på en pH-værdi mellem 1 og 4 med en egnet vandig puffer.

De flydende anionbyttere er sædvanligvis salte af stærkt anion-iske materialer, såsom kvaternære ammoniumforbindelser. Den flydende anionbytter kan være et salt af tricaprylylrnethylammonium, såsom acetat, sulfat, propionat, phosphat eller chlorid, eller kan have hydroxyl-form. Andre typer af flydende anionbyttere, som kan anvendes, er i vand uopløselige primære, sekundære og tertiære aminer.

Den flydende anionbytter anvendes også med et opløsningsmiddel eller en blanding af sådanne med moderat høj dielektricitetskonstant .

De ovenfor beskrevne opløsningsmidler og blandinger heraf, som kan anvendes med kationbytteren, kan også benyttes til anion-bytteren.

Anionbytteren anvendes sædvanligvis i en koncentration på 5 til 50 volumenpct. i opløsningen.

Den omhandlede fremgangsmåde kan anvendes i forbindelse med 5 144097 gæringsvæsker eller opløsninger med vidt forskellige koncentrationer af det antibiotiske stof. I almindelighed vil processen være mest effektiv ved de høje koncentrationer. F.eks. kan koncentrationen af det antibiotiske stof ligge mellem 2 mg pr. liter og 10 000 mg pr. liter. Det er dog ikke meningen dermed at udelukke opløsninger eller gæringsvæsker, der er fremstillet med et indhold af højere koncentrationer af det antibiotiske stof thienamycin.

Ifølge en udførelsesform kan thienamycinet extraheres med en stærkt sur flydende kationbytter ved surt pH, nemlig fra 2,5 til 4,5 (fremad-extraktion), adskillelse af faserne og derefter behandling af den organiske fase med et vandigt tilbage-extraktionsmiddel, adskillelse af faserne efterfulgt af behandling af sidstnævnte vandige fase med en stærkt basisk flydende anionbytter-blanding ved alkalisk pH-værdi, nemlig fra 8,0 til 11,0 (fremad-extraktion), adskillelse af faserae og efterfølgende behandling af den organiske fase med endnu et vandigt tilbage-extraktionsmiddel og derefter adskillelse af faserne. Den således opnåede sidstnævnte opløsning kan renses yderligere ved følgende proces: afsaltning og chromato- grafi på et polymert adsorptionsmiddel, chromatografi på en anionbytterharpiks af typen polystyren-kvaternær ammonium eller chromatografi på en anionbytterharpiks med en puffer eller vand, gelfiltrering og chromatografi på en adsorberende harpiks.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udføres ved anvendelse af enhver af de flydende ionbyttere uden anvendelse af de andre. Således kan man anvende den flydende anionbytter til ude·” lukkelse af den flydende kationbytter, eller den flydende kationbytter kan anvendes til udelukkelse af den flydende anionbytter.

Hvis begge flydende ionbyttere anvendes i rækkefølge, er det ikke kritisk, hvilken af ionbytterne man anvender. Man kan således anvende den flydende kationbytter efterfulgt af den flydende anionbytter, eller den flydende anionbytter kan anvendes efterfulgt af den flydende kationbytter.

6 144097

Til extraktion kan anvendes et vilkårligt i og for sig kendt apparatur. Således kan der benyttes centrifuger af forskellige typer og størrelser.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil i det efterfølgende illustreres nærmere ved hjælp af et eksempel.

EKSEMPEL

Et rør af lyofiliseret kultur indeholdende en thienamycin-producerende stamme af Streptomyces cattleya åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i en 250 ml luftet konisk kolbe indeholdende 50 ml sterilt medium B med følgende sammensætning:

Medium B

Autolyseret gær af type pH 10 g/l

Glucose 10 g/l

Mg.S047H20 50 mg/l KH2P04 0,182 g/l

Na2HP04 0,19 g/l pH 6,5 før sterilisation

Den podede kolbe rystes ved 28°C og 150 omdr./min i et roterende rysteapparat i 24 timer. Tre 10 ml portioner af Medium B fjernes aseptisk efter 24 timers dyrkning. Hver 10 ml portioner blandes straks med 500 ml medium B i tre 2 liters luftede koniske kolber. Disse podekolber rystes ved 28°C i et roterende rysteapparat ved 150 omdr./min. i 24 timer.

I5OO ml af Medium B gæres i 24 timer og indholdet i de koniske 2 liters kolber anvendes straks til podning af et 756 liters gæringsapparat af rustfrit stål indeholdende 467 liter Medium E med følgende sammensætning: 7 144097

Medium E

Glycerol 10 g/l

Pharmamedia 5 g/l

CaCl2-6H20 0,01 g/l

Destilleret opløsning 10 g/l

CaC03 3 g/l

Polyglycol 2000 2,5 g/l pH 7,3 før sterilisation

Denne tank drives ved 28°C med en rystehastighed på 130 omdr./min. og en luftstrøm på 283 liter pr. minut i 48 timer. pH-værdien af gæringsvæsken styres med 24 timers interval i overensstemmelse med følgende tabel:

Alder pH

0 6,8 24 6,8 48 6,5 454 liter af ovennævnte 48 timer gamle gæringsvæske i den 756 liters rustfrie stålbeholder anvendes straks til podning af en 5670 liters gæringsbeholder af rustfrit stål indeholdende 4082 liter Medium G med følgende sammensætning:

Medium G

Majsstøbevæske 15 g/l

Glycerol 10 g/l

Pharmamedia 5 g/l

CaCl2 · 6H20 0,01 g/l

CaC03 3 g/l

Polyglycol 2000 2,5 g/l pH 7,3 før sterilisation

Denne tank drives ved 25°C og en omdrejningshastighed på 0,0154 omdr./liter og en luftstrøm på 0,34 liter/liter i i 96 til 100 timer. Gæringsvæskens pH-værdi indstilles på 6,0 til 7,0.

8 144097

De 4082 liter gæringsvæske filtreres ved en 75 cm filterpresse, idet der tilsættes et filtreringshjælpemiddel i en mængde på 4% w/v. Til filtratet sættes 12 g (ethylendinitril)-tetraeddike-syre, natriumsalt. Filtratet afkøles til 6°C.

Den filtrerede væske ved 5°C blandes kontinuerligt med 2,5 normal svovlsyre til opnåelse af en pH-værdi på 3» idet der anvendes en indbygget blander. Den på en pH-værdi på 3 indstillede væske føres derefter med en tilførselshastighed på 228 liter pr. minut til en centrifugal-extraktør, hvor den behandles med kold (ca. 5°C) 10% v/v dinonylnaphthalensulfonsyre (DrøS) (primært på natriumform) ved en pH-værdi på 2 i n-butanol-opløsning, som er tilført extraktøren med en hastighed på 114 liter pr. minut. I extraktøren blandes de to opløsninger grundigt, og kationbytteren reagerer mellem Na+- og H+-ionerne af DMS-delen og ammoniumkation-formen af thienamycin, således at thienamycinet overføres fra den vandige fase til opløsningsmiddelfasen. De to faser bliver derefter effektivt separeret med en Podbielniak-model D-36, som drives ved 200 omdr./min. til udvikling af en centrifugal kraft op til 2000 G i extrak-toren. Den thienamycin-holdige opløsningsmiddelfase, den berigede DIMS/opløsningsmiddel-strøm, pumpes derefter med en hastighed på 114 liter pr. minut til en anden extraktør, hvor den behandles med en vandig puffer, 6% v/v pyridin indeholdende 5 g/l dibasisk natriumphosphat, til tilbage-extraktion, Tilbageextraktionen arbejder med en fødehastighed på 114 liter pr. minut til extraktoren.

Ca. 98% af thienamycinet extraheres fra væsken i DNNS/n-butanol-fasen i den første extraktør, og ca. 95% af thienamycinet extraheres fra DMS/n-butanol-fasen til den vandige puffer under anvendelse af den anden extraktør. Således er det totale thiena-mycin-udbytte ca. 93% fra væsken til den vandige puffer via den flydende kationbytterproces.

Det vandige tilbage-extrakt fra den flydende kationbytterproces blandes derefter med 2,5 normal natriumhydroxid til indstilling af en pH-værdi på 11 ved hjælp af en indbygget blander. Denne vandige strøm, ca. 5°C og pH=ll, fødes med en hastighed på 30 liter pr. minut til en tredje extraktør, hvor den behandles 9 144097 intimt med en flydende ionbytter 30% v/v "Aliquat 336", tri-caprylylmethylammoniumacetat (acetat-form), i n-butanol, som tilføres med 114 liter pr. minut. Anionbytterreaktionen sker mellem den negative acetation i "Aliquat 336"-delen og carboxylat-anion-formen af thienamycin til opnåelse af en overførsel af thienamycin fra den vandige fase til opløsningsmiddelfasen. De to faser adskilles derefter effektivt ved hjælp af de i extrak-tøren virkende centrifugalkræfter. Thienamycinet indeholdende opløsningsmiddelfasen, den rige aliquat/opløsningsmiddelstrøm, pumpes derefter til en fjerde extraktør, hvor den behandles med en vandig puffer, 0,40 molær kaliumacetat (pH=5,0) og igen, via anionbytterreaktioner, overføres thienamycinet, denne gang fra opløsningsmiddelfasen til den vandige pufferfase. Den forbrugte opløsningsmiddelfase, indeholdende "Aliquat 336" regenereres derefter kontinuerligt til acetat-cyclus under anvendelse af konventionelle kolonner til flydende extraktion.

Ved den beskrevne procedure overføres ca. 80 til 85% af thiena-r mycinet fra den vandige fødestrøm til tilbage-extraktions-pufferen via den flydende anionbytterproces.

Der sker en væsentlig rensning af thienamycinet. Renheden refererer til forholdet af thienamycin-titer til titer for totalt opløste faste stoffer. I eksemplet blev renheden forøget med en faktor på 30.

Om ønsket bliver den thienamycin-holdige extrakt fra den flydende anionbytterproces indstillet på en pH-værdi på 7-7,2 og koncentreret til et rumfang på 76 liter, som derefter påføres en 378 liter kolonne med Amberlite XAD-2 med en hastighed på 9,5 l/min. Harpiksen elueres med afioniseret vand med 19 l/min., og en fraktion på 570 liter opsamles og inddampes til 2,5 liter, som derefter påføres 40 liter Dowex 50 x 2 (Na+-form) harpiks med en hastighed på 600 ml/min.

Harpiksen elueres derefter ved 600 ml/min. med afioniseret vand, og en fraktion på 64 liter opsamles og inddampes til 0,23 liter. Dette koncentrat påføres et 30 liter lag af Bio-Gel P-2 (200-400 mesh), som forud er indstillet på ligevægt med 0,1M 2,6-lutidinacetat-puffer ved pH=7,0. Gelen udvikles derefter med samme puffer. Den berigede fraktion ind-