CH638521A5 - Process for obtaining the antibiotic thienamycin - Google Patents

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CH638521A5
CH638521A5 CH204578A CH204578A CH638521A5 CH 638521 A5 CH638521 A5 CH 638521A5 CH 204578 A CH204578 A CH 204578A CH 204578 A CH204578 A CH 204578A CH 638521 A5 CH638521 A5 CH 638521A5
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liquid
antibiotic
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thienamycin
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CH204578A
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Rathin Datta
George Thomas Wildman
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Merck & Co Inc
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    • C07D477/02—Preparation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
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Description

Die Erfindung betrifft die Isolierung von Thienamycin aus 5 Fermentationsbrühen oder unreinen Lösungen, einer Substanz mit antibiotischer Wirksamkeit gegen gramnegative und grampositive Mikroorganismen; und dieses unter Verwendung flüssiger Ionenaustauschersysteme.
Das Antibiotikum Thienamycin erhält man durch Züch-io tung von Mikroorganismen-Stämmen von Streptomyces catt-laya in geeigneten wässrigen Nährmedien unter gesteuerten Bedingungen. Die Erfindung betrifft die Gewinnung des Antibiotikums in im wesentlichen reiner Form.
Das Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums Thiena-15 mycin wird in der US-PS 3 950 357 beschrieben. Dieses Verfahren arbeitet unter Anwendung fester Ionenaustauscherharze.
Darüberhinaus ist Thienamycin eine hydrophile, ampho-tere Verbindung, die nicht durch einfache organische 20 Lösungsmittel aus wässrigen Lösungen extrahiert werden kann. Daher kann die einfache Lösungsmittelextraktion, die sehr gut auf die Isolierung von Penicillin und anderen Antibiotika anwendbar ist, hier nicht gut eingesetzt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren arbeitet unter Anwen-
25 dung von in Wasser unlöslichen flüssigen Ionenaus-
tauschern, die in organischen Lösungsmitteln gelöst sind, um das Thienamycin durch den Ionenaustausch-Mechanismus aus der wässrigen Phase in das organische Lösungsmittel zu übertragen, worauf das gereinigte Thienamycin aus dem flüs-30 sigen Ionenaustauscher-Lösungsmittel-System in wässrige Puffer übertragen wird, wiederum durch den Mechanismus des Ionenaustauschs. Die Anwendung üblicher Zentrifugen-Extraktoren für das Ionenaustausch-Extraktionsverfahren führt zur äusserst raschen Vermischung und Phasentrennung, 35 wodurch die Zeit, während der sich das Thienamycin unter nachteiligen pH-Wert-Bedingungen befindet, auf ein Minimum herabgesetzt wird. Dies führt zu höheren Thiena-mycinausbeuten, als sie unter Anwendung von üblichen festen Ionenaustauschern erzielt werden.
40 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung der antibiotischen Verbindung Thienamycin mit der folgenden Strukturformel:
CH3-CH(OH)
S-CH2-CH2~NH2
COOH
aus Fermentationsbrühen, in denen das Antibiotikum hergestellt wird oder aus Lösungen, die teilweise gereinigtes Antibiotikum enthalten. Man erzielt dies durch Kontakt der Fermentationsbrühe, in der das Antibiotikum erzeugt wird oder einer Lösung von teilweise gereinigtem Antibiotikum mit flüssigem Ionenaustauscher, gelöst in einem organischen Lösungsmittel, zur Übertragung des Antibiotikums in das flüssige Ionenaustauschersystem (Vorwärtsextraktion) und anschliessenden Kontakt des flüssigen Ionenaustauschersystems, das das Antibiotikum enthält, mit einer wässrigen Pufferlösung, um die Übertragung des Antibiotikums in die wässrige Pufferphase zu bewirken (Rückextraktion).
Bei den flüssigen Ionenaustauscherverfahren erfolgt eine wesentliche Reinigung des Antibiotikums. Das Antibiotikum der Formel I kann auch weiter gereinigt werden durch ein Entsalzen und Chromatographie an polymeren Adsorben-
tien wie «Amberlite» XAD-1,2 und 4, vorzugsweise XAD-2 (hergestellt von der Rohm und Haas Co., Philadelphia, Penn-55 sylvania), Chromatographie an starken Kationen- oder Anionenaustauscherharzen wie «Dowex» 50 x 2 (Na+
Cyclus) oder «Dowex» 1x2 (Cl© Cyclus) (hergestellt von der Dow Chemical Co., Midland, Michigan) und durch Gel-permeations-Chromatographie durch Polyacrylamid-Gels. 60 Die wesentlichsten Vorteile des flüssigen Ionenaustauscherverfahrens im Hinblick auf das feste Ionenaustauscherverfahren sind: 1. eine höhere Thienamycin-Ausbeute und 2. kann das Verfahren in einer wirklich kontinuierlichen Weise durchgeführt werden, wodurch sich die wirtschaft-65 liehen Vorteile des kontinuierlichen Arbeitens ergeben.
Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen beschrieben:
Thienamycin wird während der äroben Fermentation von
geeigneten wässrigen Nährmedien unter gesteuerten Bedingungen durch einen Stamm von Streptomyces cattleya produziert, der zur Erzeugung dieser Verbindung geeignet ist, wie Streptomyces cattleya NRRL 8057*. Wässrige Medien, wie die zur Herstellung anderer Antibiotika verwendeten, sind zur Herstellung von Thienamycin geeignet. Derartige Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, die durch den Mikroorganismus assimilierbar sind.
Die Herstellung und Charakterisierung des Antibiotikums Thienamycin sind in der US-PS 3 950 357, deren Lehre von der vorliegenden Beschreibung umfasst werden soll, beschrieben.
Das erfindungsgemässe Verfahren basiert auf flüssigen Ionenaustauschern und einem organischen Lösungsmittel. Insbesondere sind die Ionenaustauscher flüssige Kationenaustauscher und flüssige Anionenaustauscher.
Die flüssigen Kationenaustauscher, die man erfindungsge-mäss verwendet, sind vorzugsweise stark kationischer Art, wie Dinonylnaphthalin-sulfonsäure (DNNS) in den Wasserstoff*, Natrium- oder anderen Cyclen. Der hier verwendete Ausdruck «Cyclus» bezieht sich auf die spezielle Salzform des flüssigen Ionenaustauscherrestes. Andere stark kationische flüssige Ionenaustauscher, die verwendet werden können, sind Didodecylnaphthalin-sulfonsäure und ihre Salze. Schwächer kationische flüssige Ionenaustauscher wie Di-(2-äthylhexyl)-phosphorsäure können ebenfalls verwendet werden, doch sind die stark kationischen Ionenaustauscher bevorzugt.
Man verwendet den Kationenaustauscher in Kombination mit einem organischen Lösungsmittel als Extraktionssystem. Der Ausdruck «organisches Lösungsmittel» soll ein organisches Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch bedeuten. Beim organischen Lösungsmittel soll es sich um eines mit einer mässig hohen dielektrischen Konstante handeln.
Der Ausdruck «mässig hohe dielektrische Konstante» soll eine dielektrische Konstante von etwa vier bis etwa vierundzwanzig bedeuten. Beispiele für derartige organische Lösungsmittel mit mässig hohen dielektrischen Konstanten sind gerad- und verzweigt-kettige Alkohole mit vier bis zehn Kohlenstoffatomen, gerad- und verzweigt-kettige Ketone mit vier bis acht Kohlenstoffatomen und gerad- und verzweigt-kettige Ester, mit vier bis zehn Kohlenstoffatomen.
Beispiele für diese Alkohole sind n-Butanol, Isobutanol, Pentanol, Isopentanol, Hexanol, Heptanol und dergleichen. Beispiele für diese Ketone sind Methyläthylketon, Methyliso-butylketon und dergleichen. Beispiel für diese Ester sind Äthylacetat, Butylacetat und dergleichen.
Verwendet man ein Lösungsmittelgemisch, so kann ein Lösungsmittel mit einer hohen dielektrischen Konstante mit einem Lösungsmittel mit einer niedrigen dielektrischen Konstante vereint werden, um ein Lösungsmittelgemisch mit der gewünschten dielektrischen Konstante zu erzielen.
Der Ausdruck «hohe dielektrische Konstante» soll ein Lösungsmittel mit einer dielektrischen Konstante von etwa fünfundzwanzig bis etwa einhundert bezeichnen. Der Ausdruck «niedrige dielektrische Konstante» soll unter vier bedeuten. Es kann auch ein Gemisch von Lösungsmitteln mit mässig hohen dielektrischen Konstanten verwendet werden.
Der Kationenaustauscher wird gewöhnlich in einer Lösungsmittel-Lösung verwendet, in der der Kationenaustauscher 2 bis 15 Vol.-% beträgt. Die flüssige Kationenaustauscherlösung wird dann mit einem wässrigen Puffer auf einen pH-Wert von 1 bis 4 eingestellt.
•"Hinterlegt bei Northern Utilization Research and Development Branch des U.S. Department of Agriculture, Peoria, III.
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Die flüssigen Anionenaustauscher sind gewöhnlich Salze von stark anionischen Materialien, wie quaternäre Ammonium-Verbindungen. Der flüssige Anionenaustauscher kann ein Salz von Tricaprylylmethylammonium sein, wie das Acetat, Sulfat, Propionat, Phosphat, Chlorid und dergleichen oder kann er in der Hydroxyl-Form vorliegen. Andere Arten von flüssigen Anionenaustauschern, die verwendet werden können, sind in Wasser unlösliche primäre, sekundäre und tertiäre Amine.
Der flüssige Anionenaustauscher ist auch wirksamer, wenn er mit einem Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch verwendet wird, das eine mässig hohe dielektrische Konstante aufweist.
Die vorstehend beschriebenen Lösungsmittel und Lösungsmittelgemische, die mit dem Kationenaustauscher verwendet werden können, können auch mit dem Anionenaustauscher verwendet werden.
Der Anionenaustauscher wird gewöhnlich in einer Lösungsmittel-Lösung verwendet, in der der Anionenaustauscher etwa 5 bis 30 Vol.-% ausmacht.
Das Verfahren zur Isolierung von Thienamycin führt man zweckmässig durch, durch Kontakt der angesäuerten (H-Bereich von 2,5-4,5) Thienamycin enthaltenden Brühe oder Lösung mit dem flüssigen Kationenaustauschersystem. Nach der Trennung der beiden flüssigen Phasen wird die organische Phase, die nunmehr das Thienamycin enthält, mit einem wässrigen anorganischen Puffer, wie Natriumbicar-bonat, Ammoniumhydroxid, Natriumphosphat oder Kaliumphosphat und dergleichen oder wässrigen Pyridin rückextrahiert und das Thienamycin geht in die wässrige Phase über. Die wässrige Phase wird anschliessend von der organischen Phase abgetrennt.
Die letztgenannte Thienamycin enthaltende wässrige Phase wird alkalisch gemacht (H-Bereich von 8,0-11,0) und anschliessend in innigen Kontakt mit dem flüssigen Anio-nenaustauschersystem gebracht. Nach dem Trennen der beiden flüssigen Phasen wird die organische Phase, die jetzt das Thienamycin enthält, rückextrahiert mit einem wässrigen Puffer wie Natriumacetat, Kaliumacetat, Kaliumchlorid, Chlorwasserstoff oder Natriumeitrat und dergleichen und das Thienamycin geht in die wässrige Phase über, die anschliessend von der organischen Phase abgetrennt wird.
Eine weitere Reinigung des Antibiotikums kann man erzielen durch Entsalzen und Chromatographie an poly-meren Adsorbens-Harzen, wie «Amberlite» XAD-1,2 und 4, vorzugsweise XAD-2, Chromatographie bei neutralem pH-Wert an starken Kationenaustauscher- oder Anionenaus-tauscherharzen, wie «Dowex» 50 x 2 (Na+ Cyclus) oder «Dowex» 1 x 2 (Cl© Cyclus) und durch Gelpermeations-Chromatographie unter Anwendung von Polyacrylamidgels.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auf Fermentationsbrühen oder -lösungen mit einem weiten Bereich von Antibiotika-Konzentrationen angewendet werden. Im allgemeinen ist das Verfahren um so wirksamer, je höher die Antibiotikakonzentration ist. Beispielsweise kann die Antibiotikakonzentration im Bereich von 2 mg pro Liter bis etwa 10 000 mg pro Liter betragen. Jedoch soll dies keine Lösungen oder Brühen ausschliessen, die unter Bildung höherer Konzentrationen des Antibiotikums Thienamycin hergestellt wurden.
Eine derartige Verfahrensweise umfasst beispielsweise die Extraktion von Thienamycin mit einem stark sauren flüssigen Kationsaustauschersystem bei saurem pH-Wert von 2,5-4,5 (Vorwärtsextraktion), das Trennen der Phasen und den anschliessenden Kontakt der organischen Phase mit einem wässrigen Rückextraktionsmittel, das Trennen der Phasen und den anschliessenden Kontakt der letzteren wässrigen Phase mit einem stark basischen flüssigen Anionenaus-
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tauschersystem bei alkalischem pH-Wert von 8,0-11,0 (Vorwärtsextraktion), die Phasentrennung und den anschliessenden Kontakt der organischen Phase mit einem weiteren Rückextraktionsmittel und die anschliessende Trennung der Phasen. Die so erhaltene letztgenannte wässrige Lösung kann weiter durch folgende Arbeitsweisen gereinigt werden: Entsalzen und Chromatographie an einem polymeren Absorbens, Chromatographie an einem Anionenaustauscherharz vom Polystyrol-quaternäres-Ammonium-Typ oder Chromatographie an einem Kationenaustauscherharz, mit einem Puffer oder Wasser; die Gelfiltration und Chromatographie an einem adsorbierenden Harz.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann so durchgeführt werden, dass einer der flüssigen Ionenaustauscher verwendet wird, ohne dass der andere verwendet wird. So kann man den flüssigen Anionenaustauscher verwenden unter Ausschluss des flüssigen Kationenaustauschers oder man kann den flüssigen Kationenaustauscher verwenden unter Ausschluss des flüssigen Anionenaustauschers.
Werden jedoch beide Ionenaustauscher nacheinander angewendet, so ist die Reihenfolge, in der die flüssigen Ionenaustauscher verwendet werden, nicht kritisch. So kann man folgend auf den flüssigen Kationenaustauscher den flüssigen Anionenaustauscher verwenden, oder den flüssigen Anionenaustauscher gefolgt von dem flüssigen Kationenaustauscher.
Das erfindungsgemäss verwendete Extraktorsystem kann jedes der auf dem Gebiet der Trennung von Flüssigkeiten mit verschiedenen Dichten bekannte System sein. Für den Fachmann versteht es sich, dass verschiedene Zentrifugen verschiedener Grössen und Formen auf optimale Ergebnisse eingestellt werden können.
Beispiel 1
Ein Rohr mit einer lyophilisierten Kultur, die einen Thienamycin produzierenden Streptomyces cattleya enthält, wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem 250-ml-Erlen-meyer-Kolben mit Prall- bzw. Trennwänden, der 50 ml eines sterilen Mediums B der folgenden Zusammensetzung enthält, suspendiert:
Medium B
autolysierte Hefe vom Typ pH 10 g/1
Dextrose 10 g/1
MgS04-7H20 50 mg/1
KH2PO4 0,182 g/1
Na2HP04 0,19 g/1
pH-Wert 6,5 vor dem Sterilisieren.
Der inoculierte Kolben wird bei 28°C während 24 Stunden lang auf einem Rotationsschüttler mit 150 U/min geschüttelt. 3 10 ml-Anteile der 24 Stunden lang im Medium B behandelten Brühe werden aseptisch entnommen. Jeder Anteil von 10 ml wird sofort mit 500 ml Medium B, enthalten in drei 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit Prall- bzw. Trennwänden vermischt. Diese drei Kolben werden 24 Stunden lang bei 28°C auf einem Rotationsschüttler von 150 U/min geschüttelt.
1500 ml der in den mit Prallwänden versehenen 2-1-Erlen-meyer-Kolben enthaltenen 24stündigen Medium-B-Brühen wurden unmittelbar zur Animpfung eines 756-1-Fermentier-gefässes aus rostfreiem Stahl verwendet, dass 4671 Medium E der folgenden Zusammensetzung enthielt:
Medium E
Glycerin 10 g/1
Pharmamedia 5 g/1
CaCL-ÓHiO 0,01 g/1
«Distillers Solubles»
(lösliche Schlempenanteile) 10 g/1 CaCC>3 3 g/1 Polyglykol 2000 2,5 g/1
pH-Wert 7,3 vor dem Sterilisieren.
Dieser Behälter wird unter Anwendung einer Rührgeschwindigkeit von 130 Upm und eines Luftstroms von 2831/min während 48 Stunden bei 28°C betrieben. Die Fermentation wird in Abständen von 24 Stunden überwacht und in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Alter pH-Wert
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6,8
24
6,8
48
6,5
4541 der vorstehenden 48-stündigen Kulturbrühe aus dem 756-1-Fermentiergefäss aus rostfreiem Stahl werden unmittelbar zur Animpfung eines Fermentiergefässes von 56701 aus rostfreiem Stahl verwendet, das 40821 Medium G der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium G
Maisquellflüssigkeit 15 g/1
Glycerin 10 g/1
«Pharmamedia» 5 g/1
COCI2.6H2O 0,01 g/1
CaCCb 3 g/1
Polyglykol 2000 2,5 g/1
pH-Wert 7,3 vordem Sterilisieren.
Dieser Behälter wird unter Anwendung einer Rührgeschwindigkeit von 0,0154 Upm/1 und eines Luftstroms von 0,33981/1 während 96 bis 100 Stunden bei 25°C betrieben. Der pH-Wert des Ansatzes wird auf 6,0 bis 7,0 gestellt.
Die 40821 Fermentationsbrühe werden unter Anwendung einer Filterpresse von 76,2 cm und einer Filtrationshilfe-Beimischung bis zu einem Ausmass von 4% Gew./Vol. filtriert. Anschliessend wird zu dem Filtrat eine Menge von 12 g des Natriumsalzes von (Äthylendinitril)-tetraessigsäure gefügt. Das Filtrat wird auf 6°C gekühlt.
Die filtrierte Brühe wird bei etwa 5°C kontinuierlich mit 2,5 n-Schwefelsäure vermischt, um den pH-Wert der Brühe auf 3 zu bringen, wobei man einem Leitungsmischer verwendet. Die angesäuerte Brühe vom pH-Wert 3 wird anschliessend mit einer Geschwindigkeit von 2.271/min in einen Zentrifugenextraktor eingespeist und mit kalter (etwa 5°C) 10%iger Vol/Vol Dinonylnaphthalin-sulfonsäure (DNNS) (zunächst im Natrium-Cyclus) vom pH-Wert 2 in n-Butanollösung in Kontakt gebracht, die in den Extraktor mit einer Geschwindigkeit von 1141/min eingespeist wird. In dem Extraktor werden die beiden Lösungen innig vermischt und die Kationenaustauschreaktion erfolgt zwischen Na+-H+-Ionen des DNNS-Restes und der Ammonium-Kation-Form des Thienamycins, was zur Übertragung des Thiena-mycins aus der wässrigen Phase in die Lösungsmittelphase führt. Die beiden Phasen werden anschliessend durch eine Podbielniak Modell D-36-Vorrichtung, die bei 200 Upm mit einer Zentrifugalkraft bis zu 2000 g in dem Extraktor arbeitet,
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wirksam getrennt. Die Thienamycin enthaltende Lösungsmittelphase, der angereicherte DNNS/Lösungsmittelstrom,
wird anschliessend mit einer Geschwindigkeit von 1141/min in einen zweiten Extraktor gepumpt, wo er mit einem wässrigen Puffer, 6% Vol/Vol Pyridin enthaltend 5 g/1 zweibasisches Na-Phosphat, zur Rückextraktion in Kontakt gebracht wird. Das Rückextraktionsmittel wird mit einer Geschwindigkeit von 1141/min in den zur Rückextraktion verwendeten Extraktor eingespeist.
Etwa 98% des Thienamycins werden aus der Brühe in die DNNS/n-Butanolphase in dem ersten Extraktor extrahiert und etwa 95% des Thienamycins werden aus der DNNS/n-Butanolphase unter Anwendung des zweiten Extraktors in den wässrigen Puffer extrahiert. So beträgt die Thienamycin-Gesamtausbeute etwa 93% aus der Brühe in den wässrigen Puffer über das Flüssigkeits-Kationenaustauschverfahren.
Das wässrige Rückextraktionsmittel von dem flüssigen Kationenaustauschverfahren wird nun mit 2,5 n-Natriumhy-droxid vermischt, um den pH-Wert auf 11 zu bringen, wobei man einen Leitungsmischer verwendet. Dieser wässrige Strom von etwa 5°C und vom pH-Wert 11 wird mit einer Geschwindigkeit von 1141/min in einen dritten Extraktor beschickt, wo er in innigen Kontakt gebracht wird mit einem flüssigen Anionenaustauscher, 30% Vol/Vol «Aliquat 336», Tricaprylyl-methyl-ammoniumacetat (Acetat-Cyclus) in n-ButanoI, der mit einer Geschwindigkeit von 1141/min eingespeist wird. Die Anionenaustauschreaktion erfolgt zwischen dem negativen Acetation des «Aliquat 336»-Rests und der Carboxylat-Anionform vom Thienamycin, was zu einer Übertragung des Thienamycins aus der wässrigen Phase in die Lösungsmittelphase führt. Die beiden Phasen werden anschliessend durch die in dem Extraktor angewendeten Zentrifugalkräfte wirksam getrennt. Die das Thienamycin enthaltende Lösungsmittelphase, der angereicherte « Ali-quat»/Lösungsmittelstrom, wird anschliessend in einen vierten Extraktor gepumpt, wo er mit einem wässrigen Puffer, 0,40 m-Kaliumacetat (pH-Wert 5,0) in Kontakt gebracht wird und erneut wird über Anionenaustauschreak-tionen das Thienamycin übertragen, diesmal von der Lösungsmittelphase in die wässrige Pufferphase. Die verbrauchte Lösungsmittelphase, die das «Aliquat 336» enthält, s wird anschliessend kontinuierlich zum Acetat-Cyclus regeneriert, wobei man sich üblicher Flüssigkeits-Extraktionsko-lonnen bedient.
Durch diese beschriebene Arbeitsweise werden etwa 80 bis 85% des Thienamycins aus dem beschickten wässrigen Strom io über das FIüssigkeits-Anionenaustauschverfahren in den Rückextraktions-Puffer übertragen.
Dies führt zu einer wesentlichen Reinigung des Thienamycins. Die Reinheit bezieht sich auf das Verhältnis des Thiena-mycin-Titers zum Titer der gesamten gelösten Feststoffe. Im Beispiel wurde die Reinheit dreissigfach angehoben.
Falls gewünscht, stellt man den pH-Wert des das Thienamycin enthaltenden Extrakts aus dem Flüssigkeitsanionen-austauschverfahren auf 7 bis 7,2 ein und konzentriert auf ein 20 Volumen von 75,71, das anschliessend auf eine Säule von 3791 «Amberlite» XAD-2 in einer Geschwindigkeit von 9,461/min aufgebracht wird. Das Harz wird mit entionisiertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 18,91/min eluiert und man gewinnt 5681 einer angereicherten Fraktion, 2s konzentriert sie auf 2,51 und trägt diese auf 401 eines
«Dowex» 50 x 2 (Na+-Cyclus) Harzes in einer Geschwindigkeit von 600 ml/min auf. Das Harz wird anschliessend mit 600 ml/min entionisiertem Wasser eluiert und man gewinnt 64,41 einer angereicherten Fraktion, die man auf0,2271 kon-30 zentriert und auf ein 30-1-Bett von «Bio-Gel» P2 (Korngrösse 0,074 bis 0,037 mm), das vorher mit 0,1 m 2,6-Lutidin-acetat-Puffer vom pH-Wert 7,0 equilibriert wurde, aufgetragen. Das Gel wird mit dem gleichen Puffer entwickelt. Die angereicherte Fraktion wird auf 0,1891 konzentriert und auf 41 35 «Amberlite» XAD-2-Harz aufgetragen. Das angereicherte Eluat wird konzentriert und das Konzentrat gefriergetrocknet unter Bildung von etwa 90% reinem Thienamycin.
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Claims (8)

638521 PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Gewinnung des Antibiotikums Thiena-mycin aus Fermentationsbrühen oder -lösungen, die dieses Antibiotikum enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man die Brühen oder Lösungen mit in Wasser unlöslichem, flüssigem Ionenaustauscher, gelöst in einem organischen Lösungsmittel, zur Übertragung des Antibiotikums in das flüssige Ionenaustauschersystem durch Vorwärtsextraktion in Kontakt bringt und anschliessend das flüssige Ionenaustauschersystem, das das Antibiotikum enthält, mit einem wässrigen Puffer zur Bewirkung der Übertragung des Antibiotikums in die wässrige Pufferphase durch Rückextraktion in Kontakt bringt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Ionenaustauscher, ausgewählt aus der Gruppe von a) flüssigen Kationenaustauschern, b) flüssigen Anionenaus-tauschern, c) flüssigen Kationenaustauschern, gefolgt von flüssigen Anionenaustauschern und d) flüssigen Anionenaus-tauschern, gefolgt von flüssigen Kationenaustauschern, verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als flüssiges Kationenaustauschersystem Dinonyl-naphthalinsulfonsäure oder ihre Salze einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als flüssigen Anionenaustauscher ein Salz einsetzt, das man auswählt aus der Gruppe von Tricaprylyl-methyl-ammonium-acetat, Tricaprylyl-methyl-ammonium-pro-pionat, Tricaprylyl-methyl-ammonium-phosphat und Trica-prylyl-methyl-ammonium-sulfat.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man mit den flüssigen Ionenaustauschern ein Lösungsmittel verwendet, das eine mässig hohe dielektrische Konstante aufweist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Lösungsmittel aus Alkoholen mit vier bis zehn Kohlenstoffatomen wählt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Lösungsmittel aus Ketonen mit vier bis acht Kohlenstoffatomen wählt.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Lösungsmittel aus Estern mit vier bis zehn Kohlenstoffatomen wählt.
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