DK144179B - Fremgangsmaade til udvinding af streptokokstofskifteprodukter - Google Patents

Description

(19) DANMARK ( w) ± \r&/

(12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od mi79B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 21 /75 (51) IntCI.3 C 12 N 9/22 (22) Indleveringsdag 1 6· εβρ· 1975 C 12 Ν 9/48 (24) Løbedag 16. sep. 1975 C 12 Ν 9/70 (41) Aim. tilgængelig 17· mar. 1977 C 12 Ν 9/88 (44) Fremlagt 4. jan. 1982 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -(30) Prioritet - (71) Ansøger VEB ARZNEIMITTELWERK DRESDEN* 8l 22 Radebeul* DD.

(72) Opfinder Dieter Gerlach, DD: Werner Koehler* DD: Gerhard

Baerwald* DD: Peter Boyde* DD.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Giersing & Stellinger.

(54) Fremgangsmåde til udvinding af streptokok-stofskifteprodukter.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til udvinding af streptokok-stof skif teprodukter med en høj renhedsgrad.

Streptokokker er grampositive kædeformigt voksende kuglebakterier, der fysiologisk regnes til mælkesyrebakterierne. Når de dyrkes i flydende næringssubstrater, danner de en række interessante ex-tracellulære stofskifteprodukter. De mest kendte er streptolysin 0, hyaluronatlyase, desoxiribonuklease (streptodornase) og streptokinase, ω Alt efter de anvendte stammers, næringssubstratets og kulturbetingel- CT) sernes beskaffenhed (pH-værdi, temperatur, glucoseniveau) dannes der ^ forskellige mængder af disse proteiner. I serologiske undersøgelser -i" anvendes streptolysin 0 (antistreptolysinreaktion = ASR), hyaluronat- lyase (antihyaluronidasereaktion) og streptodornase (antistreptodor- *

Q

2 U4179 nasereaktion) til diagnosticering af streptokoksygdommeo Til klinisk brug har streptokinase og streptodornase, enten alene eller kombineret, vist sig at være velegnede.

De hidtil kendte rensningsforskrifter gælder for det meste kun for et enkelt streptokolcprotein. Man behøver til isolering fra kulturfiltratet større mængder tilsætningsmaterialer, som f.eks, ethanol, methanol eller ammoniumsulfat. Også brugen af absorptionsmidler, såsom celit, er omstændelig, skønt der herved opnås betydelige fremskridt. Det er blevet foreslået at udføre fældningen af streptokinase på CM-cellulose, hvilket medfører et nyt princip, nemlig en ionbytter, der fungerer som krystalliseringscentrum.

Opfindelsen har til opgave at tilvejebringe en fremgangsmåde til udvinding af streptokokstofskifteprodukter, hvori der angives metoder til samtidig isolering af flest mulige stofskifteprodukter mider betingelser, der udelukker en infektion. Samtidig skal rensningen være enkel.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, at man indstiller en fermenteret streptokokkultur på pH 3,5, hvorefter man eluerer de isolerede dræbte streptokokker med 0,1 M phosphatpuffer ved pH 8 og derpå indrører højdisperst sili-ciumdioxid i eluatet ved pH 6-7 og udfælder hyaluronatlyasen fra den fra adsorbatet adskilte opløsning ved hjælp af ammoniumsulfat, fracentrifugerer den, dialyserer den mod 0,02 phosphatpuffer og udvinder den i ren form på DEAE-agarose, samt eluerer de på det højdisperse siliciumdioxid adsorberede stofskifteprodukter, især streptolysin 0, streptokinase og streptodornase med vand ved en pH-værdi på 9,5 -10,5, fortrinsvis 10,0, og udvinder produkterne, især ren streptokinase og streptodornase, ved fraktionerede fældningstrin og gelchrom-atografi på DEAE-agarose.

Når den udvoksede streptokokkultur indstilles på pH 3,5 og røres 1 time ved stuetemperatur eller fermentationstemperatur, dræbes alle streptokokker. De proteiner (streptolysin U, hyaluronatlyase, streptodornase og streptokinase), der er adsorberet på de døde streptokokker, centrifugeres fra sammen med kokoerne. De enkelte produkter elueres med 0,1 M phosphatpuffer ved pH 8 og skilles fra de døde kokker. Koncentreringen af stofskifteproduxterne på dette trin kræver overraskende nok ingen hjælpestoffer, bortset fra den anvendte syre. Den biologiske del af fremgangsmåden, der ikke er genstand for opfindelsen, skal ikke omtales nærmere. Til fremstilling af den ferraenta- 3 144179 tionsopløsning, der indeholder de førnævnte streptoxokstofskifteprodukter, anvendes stammen Streptokokkus equisimilis og eventuelt den i DE-patentskrift 136 620 beskrevne fremgangsmåde.

De isolerede stofskifteprodukter, der er elueret fra streptokokkerne, renses nu simultant som ovenfor omtalt. Det sidste rensningsskridt består altid i chromatografi på en nyudviklet ionbytter, der består af tværbundet agarose, hvorpå diethy1 aminoethyl-grupper er blevet fixeret på kendt vis. Med denne ionbytter, der kan autoklaveres og regenereres på søjlen, chromatograferer man altid principielt på den samme måde, idet der anvendes en lineær gradient mellem 0,02 H phosphatpuffer (pH B,0) og 0,02 M phosphatpuffer med 0,4 M NaCl (pH 7,6). Ionbytteren regenereres, idet søjlen (2,5 x 25 cm) vaskes mod 1 1 0,5 N NaOH, sterilt H£0 og steril phosphatpuffer (0,02 M pH 8,O). Også tilsætningen af chloroform (4 ml pr. 1 puffer) har vist sig at være godt som konserveringsmiddel.

Den foreliggende fremgangsmådes fordele består i, at der ikke behøves nogen tilsætningsstoffer til isoleringen, og at streptokokkerne er dræbt, hvorfor der ikke består nogen fare for infektion. Ydermere kan alle vigtige stofskifteprodukter isoleres simultant på denne enkle måde og på samme måde renses på den samme ionbytter.

Fremgangsmåden forklares nærmere med det følgende udførelses-eksempel .

Eksempel 5 1 30h streptokokkultur (streptokokker gruppe C), der ved pH 7,2 og 28° C giver titere på 128 HU/ml streptolysin 0 100 TE/ml hyaluronat-lyase (0,24 U/ml efter definitionen ifølge Gerlach og Kohier) og 4200

Christensenenheder/ml streptokinase, indstilles mod koncentreret saltsyre på pH 3,5 og omrøres 1 time. Der centrifugeres og den flydende del kastes bort. De dræbte streptokokker vaskes to gange med 250 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH 8,0). Herved elueres så at sige alle stof-skifteprodukter kvantitativt. Denne opløsning omrøres i 2 timer ved stuetemperatur med højdisperst siliciumdioxid. Streptolysin 0, strep-todomase og streptokinase adsorberes, medens hyaluronatlyasen forbliver i opløsning. Denne kan efter fældning med 300 g ammoniumsulfat renses yderligere på følgende måde. Man lader precipitatet stå natten over og fracentrifugerer det, hvorefter det opløses i 10 ml vand og klarcentrifugeres. Derpå dialyserer man phosphatfrit mod 0,02 M phosphatpuff er (pH 8) og påfører produktet på en 2,5 x 25 cm søjle af 4 144179 tværbundet agarose, til hvilken er bundet diethylaminoethylgrupper. Denne såkaldte DEAE-agarose-Q. tilberedes i forvejen ved at vaske søjlen med 1 1 0,5 N NaOH, H20 og at ækvilibrere med 0,02 M phosphat-puffer med pH 8,0. Der elueres med en lineær gradient, der består af 1 1 0,02 M phosphatpuffer (pH 8,0) og 1 1 0,02 M phosphatpuffer med 0,4 M NaCl-tilsætning (pH 7)6). Man eluerer så ved 0,05 M NaCl hyalu-ronatlyasen. De til siliciumdioxidet bundne komponenter, såsom streptolysin, streptodornase eller streptokinase, kan påny isoleres med vand, hvis pH-værdi er indstillet til 9>5-10,5, fortrinsvis 10,0, ved omrøring i 20 minutter. 450 ml af den. klart centrifugerede opløsning (eluatet) bringes på pH 3»5 og udfældes ved tilsætning af 10 vægt-$ NaCl (45 g NaCl). Efter 30 minutter centrifugeres fra og opløses i 100 ml vand under tilsætning af IN NaOH (dråbevis). Den uopløselige rest kastes bort. Til denne opløsning tilsættes nu 10 ml 0,5 m opløsning af Νβ2ΗΡ0^ og pH-værdien indstilles på 6,9. Under omrøring, og idet pH-værdien holdes konstant ved tilsætning af 1 N NaOH, udfældes der ved dråbevis tilsætning af 1 M CaC^-opløsning (5,0 ml). Der røres i 15 minutter og efter yderligere 45 minutter centrifugeres. Calciumphosphatbundfaldet vaskes med 50 ml 0,02 M phosphatpuffer (pH 8,0). Af dette bundfald er genvindingen af det bundne streptolysin ifølge E.J. Pentz og G. Shigemura (j. Bacteriol. 69. 210 (1955)) mulig. l40 ml blandet opløsning indstilles nu under omrøring med 38 ml mættet ammoniumsulfatopløsning på 21,3$ ammoniumsulfatmætning. Efter 15 minutters omrøring lader man det stå i 45 minutter og centrifugerer derefter. Bundfaldet vaskes med 22$ mættet ammoniumsulfatopløsning (50 mi) og kastes bort. Centrifugatet og vaskevandet blandes, hvorved man får 175 ml. Af denne opløsning kan strep-tokinasen ved udfældning ved pH 7,0 og 45$ ammoniumsulfat skilles fra ' størstedelen af streptodornasen. Til dette formål kontrollerer man pH-værdien og tilsætter yderligere 77 ml mættet ammoniumsulfatopløs-ning. Efter 15 minutters omrøring og 45 minutters aflejring centrifugeres der. Bundfaldet vaskes en gang med 50 ml 50$ mættet ammoniumsulfatopløsning og oploses derefter i 20 ml vand. Denne opløsning dialyserer man mod 0,02 M phosphatpuffer med pH 8,0 og benytter derefter en søjle, der er præpareret på samme måde som ovenfor. Også elu-eringen foregår på samme måde. Man får derved ca. 50$ af udgangsmængden af streptokinase. Af don flydende del fra streptokinaseudfældnin-gen, der indeholder 60$ af streptodomasen, kan denne nemt isoleres, idet den udfældes ved tilsætning af 20 g fast ammoniumsulfat pr. 100 ml opløsning (pr. 235 ml 47 g). Efter 30 minutters omrøring og 60 minutters aflejring centrifugeres.