JPH04228072A - リポペプチドデアシラーゼ - Google Patents
リポペプチドデアシラーゼInfo
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- JPH04228072A JPH04228072A JP3132622A JP13262291A JPH04228072A JP H04228072 A JPH04228072 A JP H04228072A JP 3132622 A JP3132622 A JP 3132622A JP 13262291 A JP13262291 A JP 13262291A JP H04228072 A JPH04228072 A JP H04228072A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本発明は、酵素技術に関するものである。
具体的には、本発明は、微生物、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎ
ｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓによって産生される、抗真菌
性代謝物質、エキノカンジンＢ（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄ
ｉｎＢ， ＥＣＢ）、アクレアシン（ａｃｕｌｅａｃｉ
ｎ）、およびＥＣＢの類似体の脂質親和性アシル側鎖を
脱アシル化するリポペプチドデアシラーゼの精製に関す
るものである。
ｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓによって産生される、抗真菌
性代謝物質、エキノカンジンＢ（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄ
ｉｎＢ， ＥＣＢ）、アクレアシン（ａｃｕｌｅａｃｉ
ｎ）、およびＥＣＢの類似体の脂質親和性アシル側鎖を
脱アシル化するリポペプチドデアシラーゼの精製に関す
るものである。
【０００２】エキノカンジンＢおよびアクレアシンは、
それぞれリノレオイルおよびパルミトイル側鎖を有する
既知の環状ヘキサペプチドである。ボエック等（Ｂｏｅ
ｃｋ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．），１９８８．Ｊ．Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４１，１０８５−１０
９２；ボエック等（Ｂｏｅｃｋ，Ｌ．Ｄ．， ｅｔａｌ
．），１９８９．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ
），４２，３８２−３８８；およびキムラ等（Ｋｉｍｕ
ｒａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．），１９８７．Ａｇｒｉ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，１６１７−１６２３は、Ａ
ｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ および
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 種の全細胞によるＥＣＢの
リノレオイル基の脱アシル化を報告している。タケシマ
等（Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｈ．， ｅｔ ａｌ．），１
９８９．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，６０６−６１０
は、アクレアシンを脱アシル化する、Ａ．ｕｔａｈｅ
ｎｓｉｓ由来のデアシラーゼの精製および部分的特性化
を報告している。
それぞれリノレオイルおよびパルミトイル側鎖を有する
既知の環状ヘキサペプチドである。ボエック等（Ｂｏｅ
ｃｋ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．），１９８８．Ｊ．Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４１，１０８５−１０
９２；ボエック等（Ｂｏｅｃｋ，Ｌ．Ｄ．， ｅｔａｌ
．），１９８９．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ
），４２，３８２−３８８；およびキムラ等（Ｋｉｍｕ
ｒａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．），１９８７．Ａｇｒｉ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，１６１７−１６２３は、Ａ
ｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ および
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 種の全細胞によるＥＣＢの
リノレオイル基の脱アシル化を報告している。タケシマ
等（Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｈ．， ｅｔ ａｌ．），１
９８９．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，６０６−６１０
は、アクレアシンを脱アシル化する、Ａ．ｕｔａｈｅ
ｎｓｉｓ由来のデアシラーゼの精製および部分的特性化
を報告している。
【０００３】天然の抗真菌物質の構造的修飾によって、
シロファンギンおよびダプトマイシンのような有用な治
療薬が得られた。デボノ等（Ｄｅｂｏｎｏ，Ｍ．， ｅ
ｔ ａｌ．），１９８９．Ｊ．Ａｎｔｉａｂｉｏｔ．（
Ｔｏｋｙｏ），４２，３８９−３９７； デボノ等（Ｄ
ｅｂｏｎｏ，Ｍ．， ｅｔａｌ．），１９８８．Ａｎｎ
．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５４４，１５２−１６７
；ゴルディー等（Ｇｏｒｄｅｅ，Ｒ．Ｓ． ｅｔ ａｌ
．），１９８８．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
５４４，２９４−３０９；およびボエック（Ｂｏｅｃｋ
，Ｌ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．），１９８８．Ｊ．Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４１，１０８５−１０９
２。例えばＥＣＢは、Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓの全細胞
で脱アシル化されて脂質親和性のアシル側鎖が切断され
、ＥＣＢの環状ヘキサペプチド核を与える。化学的方法
によって核を再アシル化すると、改善された抗真菌特性
を有するシロファンギンのようなアシルＥＣＢ化合物が
得られる。
シロファンギンおよびダプトマイシンのような有用な治
療薬が得られた。デボノ等（Ｄｅｂｏｎｏ，Ｍ．， ｅ
ｔ ａｌ．），１９８９．Ｊ．Ａｎｔｉａｂｉｏｔ．（
Ｔｏｋｙｏ），４２，３８９−３９７； デボノ等（Ｄ
ｅｂｏｎｏ，Ｍ．， ｅｔａｌ．），１９８８．Ａｎｎ
．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５４４，１５２−１６７
；ゴルディー等（Ｇｏｒｄｅｅ，Ｒ．Ｓ． ｅｔ ａｌ
．），１９８８．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
５４４，２９４−３０９；およびボエック（Ｂｏｅｃｋ
，Ｌ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．），１９８８．Ｊ．Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４１，１０８５−１０９
２。例えばＥＣＢは、Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓの全細胞
で脱アシル化されて脂質親和性のアシル側鎖が切断され
、ＥＣＢの環状ヘキサペプチド核を与える。化学的方法
によって核を再アシル化すると、改善された抗真菌特性
を有するシロファンギンのようなアシルＥＣＢ化合物が
得られる。
【０００４】全身の真菌感染症の治療のための改善され
た抗真菌薬が必要とされているので、これらの製造方法
は重要である。このような化合物を製造するための酵素
的方法は通常、化学的方法よりシンプルかつ経済的な方
法なので、これらの方法はとりわけ望ましい。従って、
このような変換に有用な酵素を入手し得ることは、非常
に望ましい。
た抗真菌薬が必要とされているので、これらの製造方法
は重要である。このような化合物を製造するための酵素
的方法は通常、化学的方法よりシンプルかつ経済的な方
法なので、これらの方法はとりわけ望ましい。従って、
このような変換に有用な酵素を入手し得ることは、非常
に望ましい。
【０００５】Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎ
ｓｉｓ デアシラーゼは、精製された形で提供される。 この酵素は、ＥＣＢのリノレオイル基およびアクレアシ
ンのパルミトイル基の切断を触媒する。この酵素は、ｐ
Ｈ６．０および６０℃で最も活性な、６３ＫＤおよび１
８ＫＤのサブユニットを含有しているヘテロダイマーで
ある。この酵素は、細胞に関連しており、コファクター
、金属イオンキレートまたはスルフヒドリル試薬に影響
されない。
ｓｉｓ デアシラーゼは、精製された形で提供される。 この酵素は、ＥＣＢのリノレオイル基およびアクレアシ
ンのパルミトイル基の切断を触媒する。この酵素は、ｐ
Ｈ６．０および６０℃で最も活性な、６３ＫＤおよび１
８ＫＤのサブユニットを含有しているヘテロダイマーで
ある。この酵素は、細胞に関連しており、コファクター
、金属イオンキレートまたはスルフヒドリル試薬に影響
されない。
【０００６】この酵素は、環状ヘキサペプチド核の製造
方法およびＡ２１９７８Ｃ抗生物質の環状ペプチド核の
製造方法において有用である。
方法およびＡ２１９７８Ｃ抗生物質の環状ペプチド核の
製造方法において有用である。
【０００７】本発明はまた、疎水性相互作用、陽イオン
交換、染色−リガンドクロマトグラフィーおよびゲル濾
過からなる、デアシラーゼ酵素をほぼ均一まで精製する
ための方法を提供するものである。
交換、染色−リガンドクロマトグラフィーおよびゲル濾
過からなる、デアシラーゼ酵素をほぼ均一まで精製する
ための方法を提供するものである。
【０００８】本発明によって提供されるＡｃｔｉｎｏｐ
ｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓのデアシラーゼを、本
明細書では簡便のために、ＥＣＢデアシラーゼと呼ぶ。 その全てが実質上細胞に関連しているこの酵素は、その
精製された状態で、以下の物理的、触媒的、および速度
論的特性を有している。
ｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓのデアシラーゼを、本
明細書では簡便のために、ＥＣＢデアシラーゼと呼ぶ。 その全てが実質上細胞に関連しているこの酵素は、その
精製された状態で、以下の物理的、触媒的、および速度
論的特性を有している。
【０００９】ＥＣＢデアシラーゼは、６３ＫＤおよび１
８ＫＤのサブユニットを含有している８１キロダルトン
（ＫＤ）のヘテロダイマーである。この大きい方および
小さい方のサブユニットのアミノ末端配列は、それぞれ
以下の通りである。Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔ
ｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅ
ｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−（Ｔｒｐ）−Ｇｌｎ−−−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−（Ａｒｇ）−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ。Ｈｉｓ−Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−（Ｐｒｏ）−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ。上の配列において、
括弧中のアミノ酸残基は不確かな指定を示し、“−−−
”は、この残基がまだ確認されていないことを示す。
８ＫＤのサブユニットを含有している８１キロダルトン
（ＫＤ）のヘテロダイマーである。この大きい方および
小さい方のサブユニットのアミノ末端配列は、それぞれ
以下の通りである。Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔ
ｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅ
ｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−（Ｔｒｐ）−Ｇｌｎ−−−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−（Ａｒｇ）−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ。Ｈｉｓ−Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−（Ｐｒｏ）−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ。上の配列において、
括弧中のアミノ酸残基は不確かな指定を示し、“−−−
”は、この残基がまだ確認されていないことを示す。
【００１０】精製酵素のアミノ酸組成を、以下の表１に
示す。この組成は、ドツラフおよびイェー（Ｄｏｔｚｌ
ａｆ，Ｊ．Ｅ． ａｎｄ Ｙｅｈ，Ｗ−Ｋ，１９８７，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，１６１１−１６１８
）によって記載された方法により決定された。
示す。この組成は、ドツラフおよびイェー（Ｄｏｔｚｌ
ａｆ，Ｊ．Ｅ． ａｎｄ Ｙｅｈ，Ｗ−Ｋ，１９８７，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，１６１１−１６１８
）によって記載された方法により決定された。
【００１１】
【表１】Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓ デアシラーゼのアミ
ノ酸組成ａ：加水分解のゼロ時間まで外挿することによ
って決定した。 ｂ：システイン酸によって決定した。 ｃ：チオグリコール酸の存在下で加水分解することによ
って決定した。
ノ酸組成ａ：加水分解のゼロ時間まで外挿することによ
って決定した。 ｂ：システイン酸によって決定した。 ｃ：チオグリコール酸の存在下で加水分解することによ
って決定した。
【００１２】ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ） Ａｃ
Ａ ４４でゲル濾過することによって評価した時、ＥＣ
Ｂデアシラーゼの分子量は、４６，０００であった。前
記のサブユニットの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て決定された。ゲル濾過で決定された分子量は、酵素の
異常なゲル溶出挙動に起因するかもしれない著しい過小
評価である。ゲルにおける酵素のこの異常な溶出挙動は
、高分子の疎水性が通常高いことに起因する膜結合蛋白
に特有の性質である。
Ａ ４４でゲル濾過することによって評価した時、ＥＣ
Ｂデアシラーゼの分子量は、４６，０００であった。前
記のサブユニットの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て決定された。ゲル濾過で決定された分子量は、酵素の
異常なゲル溶出挙動に起因するかもしれない著しい過小
評価である。ゲルにおける酵素のこの異常な溶出挙動は
、高分子の疎水性が通常高いことに起因する膜結合蛋白
に特有の性質である。
【００１３】ＥＣＢデアシラーゼは、その活性の発現の
ために、外来のリン脂質、コファクター、金属イオンま
たは還元剤を必要としない単純な酵素である（２個のサ
ブユニットを含有しているが）。また、通常のコファク
ター、金属イオンまたは還元剤はいずれも、このデアシ
ラーゼを刺激しない。驚くべきことに、Ｎ−エチルマレ
イミド（ＮＥＭ）は、ＥＣＢのＥＣＢ核への変換の割合
および精製されたデアシラーゼを約６−７倍高める。
ために、外来のリン脂質、コファクター、金属イオンま
たは還元剤を必要としない単純な酵素である（２個のサ
ブユニットを含有しているが）。また、通常のコファク
ター、金属イオンまたは還元剤はいずれも、このデアシ
ラーゼを刺激しない。驚くべきことに、Ｎ−エチルマレ
イミド（ＮＥＭ）は、ＥＣＢのＥＣＢ核への変換の割合
および精製されたデアシラーゼを約６−７倍高める。
【００１４】精製されたデアシラーゼの重要な特性は、
高い塩濃度の存在下でその活性が高められることである
。幾つかの通常の１価および２価の金属塩の存在下で、
活性は３倍まで高められる。塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリ
ウムまたはカリウムのような塩類は、好ましい刺激性の
塩である。この目的のために好ましい塩は、塩化カリウ
ムである。約０．１モルから約３．０モルまでの塩濃度
が最も好適であるらしい。より低い塩濃度でも活性が高
められることが、観察される。
高い塩濃度の存在下でその活性が高められることである
。幾つかの通常の１価および２価の金属塩の存在下で、
活性は３倍まで高められる。塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリ
ウムまたはカリウムのような塩類は、好ましい刺激性の
塩である。この目的のために好ましい塩は、塩化カリウ
ムである。約０．１モルから約３．０モルまでの塩濃度
が最も好適であるらしい。より低い塩濃度でも活性が高
められることが、観察される。
【００１５】ｐＨ７および９におけるネイティブ−ＰＡ
ＧＥでデアシラーゼが分割されないことが観察されたと
いうことは、この酵素の等電点が９より高いことを示し
ている。ネイティブ−ＰＡＧＥは、ブラックシェア（Ｂ
ｌａｃｋｓｈｅａｒ，Ｐ．Ｊ．）の（１９８４） Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０４，２３７−２５５
に従って行われた。
ＧＥでデアシラーゼが分割されないことが観察されたと
いうことは、この酵素の等電点が９より高いことを示し
ている。ネイティブ−ＰＡＧＥは、ブラックシェア（Ｂ
ｌａｃｋｓｈｅａｒ，Ｐ．Ｊ．）の（１９８４） Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０４，２３７−２５５
に従って行われた。
【００１６】精製酵素の速度論的および触媒的特性の研
究のために使用された基質は、エキノカンジンＢであっ
た。ＥＣＢは実質上、水性溶液に不溶性である。水性媒
質中でのＥＣＢの可溶化のために試験された幾つかの水
混和性溶媒の内、約１５％またはより低い低濃度でのジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、デアシラーゼによ
って触媒される反応およびその後の酵素活性のＨＰＬＣ
分析に最も好適であった。
究のために使用された基質は、エキノカンジンＢであっ
た。ＥＣＢは実質上、水性溶液に不溶性である。水性媒
質中でのＥＣＢの可溶化のために試験された幾つかの水
混和性溶媒の内、約１５％またはより低い低濃度でのジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、デアシラーゼによ
って触媒される反応およびその後の酵素活性のＨＰＬＣ
分析に最も好適であった。
【００１７】この酵素は、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４緩
衝液中、ｐＨ６．０、６０℃で最も活性である。本発明
者らは、反応（ＥＣＢからＥＣＢ核）が基質によってで
はなく、酵素によって開始された時、この酵素は少なく
とも２倍活性であることを見い出した。
衝液中、ｐＨ６．０、６０℃で最も活性である。本発明
者らは、反応（ＥＣＢからＥＣＢ核）が基質によってで
はなく、酵素によって開始された時、この酵素は少なく
とも２倍活性であることを見い出した。
【００１８】ラインウィーバー−バーク（Ｌｉｎｅｗｅ
ａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ）法によって決定した時、エキノカ
ンジンＢに対するこのデアシラーゼのＫｍ値は、５０μ
Ｍであった。
ａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ）法によって決定した時、エキノカ
ンジンＢに対するこのデアシラーゼのＫｍ値は、５０μ
Ｍであった。
【００１９】ＥＣＢ反応についてのＶｍａｘは、生成さ
れたペプチド（ＥＣＢ核）１０−１１μモル／分／ｍｇ
蛋白であった。
れたペプチド（ＥＣＢ核）１０−１１μモル／分／ｍｇ
蛋白であった。
【００２０】反応の化学量論については、ＥＣＢの消失
に対するＥＣＢ核の生成の割合は、約５２．４％である
と観察された。変換割合が低いという観察は、何か他の
反応が起こっているか、あるいは幾らか分解されている
かもしれないということに起因するかもしれない。
に対するＥＣＢ核の生成の割合は、約５２．４％である
と観察された。変換割合が低いという観察は、何か他の
反応が起こっているか、あるいは幾らか分解されている
かもしれないということに起因するかもしれない。
【００２１】前記のように、Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓデ
アシラーゼは、細胞に関連している。例えば、ＥＣＢデ
アシラーゼの高い全活性を示す、Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉ
ｓの通常の９０時間培養ブロスでは、９９％より高いデ
アシラーゼ活性が細胞に関連していた。５％より低い細
胞関連デアシラーゼ活性は、０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４
、ｐＨ６．０中で１日間、細胞をインキュベートするこ
とによって放出された。この緩衝液およびその他の緩衝
液のイオン強度を増大させても、可溶性デアシラーゼの
回収にわずかしか効果がなかった。しかしながら、本発
明者らは、塩化カリウムまたはナトリウム、硝酸カリウ
ムまたはナトリウム、およびマグネシウムまたはカルシ
ウム塩のような塩で細胞を処理することによって、可溶
性デアシラーゼの高い回収率（６０〜８０％）が実現さ
れるということを見い出した。 この塩処理の効果を以下の表２に示す。
アシラーゼは、細胞に関連している。例えば、ＥＣＢデ
アシラーゼの高い全活性を示す、Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉ
ｓの通常の９０時間培養ブロスでは、９９％より高いデ
アシラーゼ活性が細胞に関連していた。５％より低い細
胞関連デアシラーゼ活性は、０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４
、ｐＨ６．０中で１日間、細胞をインキュベートするこ
とによって放出された。この緩衝液およびその他の緩衝
液のイオン強度を増大させても、可溶性デアシラーゼの
回収にわずかしか効果がなかった。しかしながら、本発
明者らは、塩化カリウムまたはナトリウム、硝酸カリウ
ムまたはナトリウム、およびマグネシウムまたはカルシ
ウム塩のような塩で細胞を処理することによって、可溶
性デアシラーゼの高い回収率（６０〜８０％）が実現さ
れるということを見い出した。 この塩処理の効果を以下の表２に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎ
ｓｉｓを液中好気性発酵条件下で培養することによって
、ＥＣＢデアシラーゼを産生させる。使用した発酵方法
および条件は、既知である：ボエック等（Ｂｏｅｃｋ，
Ｌ．Ｄ．， Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．Ｓ．， Ａｂｂｏｔｔ
，Ｂ．Ｊ． ａｎｄ Ｄｅｂｏｎｏ，Ｍ．），１９８９
．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４２，３８
２−３８８。デアシラーゼ活性の最大産生は、培養培地
の接種後約９０時間で起こる。前記、および下記実施例
１の記載の如く、全細胞を好ましくは塩化カリウムで塩
処理することによって、粗製形の酵素を可溶化する。
ｓｉｓを液中好気性発酵条件下で培養することによって
、ＥＣＢデアシラーゼを産生させる。使用した発酵方法
および条件は、既知である：ボエック等（Ｂｏｅｃｋ，
Ｌ．Ｄ．， Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．Ｓ．， Ａｂｂｏｔｔ
，Ｂ．Ｊ． ａｎｄ Ｄｅｂｏｎｏ，Ｍ．），１９８９
．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４２，３８
２−３８８。デアシラーゼ活性の最大産生は、培養培地
の接種後約９０時間で起こる。前記、および下記実施例
１の記載の如く、全細胞を好ましくは塩化カリウムで塩
処理することによって、粗製形の酵素を可溶化する。
【００２４】粗製可溶化酵素は、疎水性相互作用クロマ
トグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび
ゲル濾過工程からなる本発明の精製法でほぼ均一まで精
製される。前記のように、ＥＣＢデアシラーゼは、ゆる
く細胞に結合した蛋白として作用し、Ａ．ｕｔａｈｅｎ
ｓｉｓの全細胞を無機塩で処理することによって、選択
的に可溶化される。塩化カリウムを使用するのが好まし
い。可溶化した酵素の溶液を望ましくは濾過し、濾液を
限外濾過によって濃縮して、以下の工程のためのより濃
縮されたデアシラーゼ溶液を得る。
トグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび
ゲル濾過工程からなる本発明の精製法でほぼ均一まで精
製される。前記のように、ＥＣＢデアシラーゼは、ゆる
く細胞に結合した蛋白として作用し、Ａ．ｕｔａｈｅｎ
ｓｉｓの全細胞を無機塩で処理することによって、選択
的に可溶化される。塩化カリウムを使用するのが好まし
い。可溶化した酵素の溶液を望ましくは濾過し、濾液を
限外濾過によって濃縮して、以下の工程のためのより濃
縮されたデアシラーゼ溶液を得る。
【００２５】この方法の第１工程では、濃縮された細胞
抽出物を約６０℃で１時間加熱し、温時、１４％硫酸ア
ンモニウムおよび１．２Ｍ塩化カリウムで処理する。熱
処理によって、６０℃で不安定な溶液中の他の蛋白は沈
澱する。ＥＣＢデアシラーゼは６０℃で安定であり、可
溶化が維持される。
抽出物を約６０℃で１時間加熱し、温時、１４％硫酸ア
ンモニウムおよび１．２Ｍ塩化カリウムで処理する。熱
処理によって、６０℃で不安定な溶液中の他の蛋白は沈
澱する。ＥＣＢデアシラーゼは６０℃で安定であり、可
溶化が維持される。
【００２６】次いで、熱処理抽出物を、例えば市販品と
して入手し得るオクチル・セファロース（Ｏｃｔｙｌ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の如き脂
質置換アガロースのような疎水性相互作用クロマトグラ
フィー用物質にて、約２５℃の温度で、疎水性相互作用
クロマトグラフィーにかける。 約０．０５Ｍリン酸二水素カリウムまたはその他の好適
な緩衝液、１．２Ｍ塩化カリウムおよび１４％硫酸アン
モニウムで、カラムをｐＨ６に平衡化する。カラムを望
ましくは同一緩衝液で洗浄し、結合している蛋白を、０
．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６緩衝液中、ＫＣｌ（１
．２−０．１Ｍ）と（ＮＨ４）２ＳＯ４（１４−０％）
の同時直線グラジエントで溶離する。ＥＣＢデアシラー
ゼは、単一の不均整な活性ピークとして溶出される。
して入手し得るオクチル・セファロース（Ｏｃｔｙｌ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の如き脂
質置換アガロースのような疎水性相互作用クロマトグラ
フィー用物質にて、約２５℃の温度で、疎水性相互作用
クロマトグラフィーにかける。 約０．０５Ｍリン酸二水素カリウムまたはその他の好適
な緩衝液、１．２Ｍ塩化カリウムおよび１４％硫酸アン
モニウムで、カラムをｐＨ６に平衡化する。カラムを望
ましくは同一緩衝液で洗浄し、結合している蛋白を、０
．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６緩衝液中、ＫＣｌ（１
．２−０．１Ｍ）と（ＮＨ４）２ＳＯ４（１４−０％）
の同時直線グラジエントで溶離する。ＥＣＢデアシラー
ゼは、単一の不均整な活性ピークとして溶出される。
【００２７】全デアシラーゼ活性の約９５％を含有して
いるピーク画分を集め、硫酸アンモニウム分画を行なう
。１０−３６％（ＮＨ４）２ＳＯ４画分を集め、０．８
Ｍ ＫＣｌを含有しているｐＨ６緩衝液中でゲル濾過を
行なう。使用し得るゲルのタイプは種々であってよいが
、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ−２００Ｈ
Ｒは好適なゲルである。酵素は、１つの主要な活性ピー
クおよびそれより小さい活性ピークとして溶出される。 主要なピークから、デアシラーゼ活性の９０％を含有す
るピーク画分を集め、０．０５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ５．６
に調節する。集めた画分を、例えばトリスアクリル−Ｃ
Ｍ（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ−ＣＭ，ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｃｓ）である、市販品として入手し得るトリスア
クリル樹脂の１種のような適当な陽イオン交換樹脂にて
、陽イオン交換クロマトグラフィーにかける。０．０５
Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ５．６および０．０５Ｍ ＫＣ
ｌでカラムを平衡化する。同一緩衝液でカラムを洗浄し
、結合している蛋白を、同一緩衝液中ＫＣｌの直線グラ
ジエント（０．０５Ｍ−０．５Ｍ）で溶離する。デアシ
ラーゼ酵素は、２つの活性ピークとして溶出される。
いるピーク画分を集め、硫酸アンモニウム分画を行なう
。１０−３６％（ＮＨ４）２ＳＯ４画分を集め、０．８
Ｍ ＫＣｌを含有しているｐＨ６緩衝液中でゲル濾過を
行なう。使用し得るゲルのタイプは種々であってよいが
、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ−２００Ｈ
Ｒは好適なゲルである。酵素は、１つの主要な活性ピー
クおよびそれより小さい活性ピークとして溶出される。 主要なピークから、デアシラーゼ活性の９０％を含有す
るピーク画分を集め、０．０５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ５．６
に調節する。集めた画分を、例えばトリスアクリル−Ｃ
Ｍ（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ−ＣＭ，ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｃｓ）である、市販品として入手し得るトリスア
クリル樹脂の１種のような適当な陽イオン交換樹脂にて
、陽イオン交換クロマトグラフィーにかける。０．０５
Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ５．６および０．０５Ｍ ＫＣ
ｌでカラムを平衡化する。同一緩衝液でカラムを洗浄し
、結合している蛋白を、同一緩衝液中ＫＣｌの直線グラ
ジエント（０．０５Ｍ−０．５Ｍ）で溶離する。デアシ
ラーゼ酵素は、２つの活性ピークとして溶出される。
【００２８】それぞれのピークからデアシラーゼ活性含
有画分を集めて０．０５Ｍ ＫＣｌに調節し、レッド−
セファロース（Ｒｅｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ， Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ， Ｉｎｃ．）またはダイマトレックス・
ブルーＡ（Ｄｙｅｍａｔｒｅｘ Ｂｌｕｅ Ａ， Ａｍ
ｉｃｏｎ）のような染色−リガンドゲルに適用する。使
用前に、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０および
０．０５Ｍ ＫＣｌでゲルを平衡化する。結合した蛋白
を、好ましくは同一緩衝液中、ＫＣｌのステップワイズ
グラジエント（０．０５−２−３．３Ｍ）でレッド−セ
ファロースから、または好ましくは同一緩衝液中ＫＣｌ
の直線グラジエント（０．０５−２．５Ｍ）でブルーＡ
ゲルから溶離する。染色−リガンドクロマトグラフィー
から、ブロードな広い不均整な活性ピークを得る。
有画分を集めて０．０５Ｍ ＫＣｌに調節し、レッド−
セファロース（Ｒｅｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ， Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ， Ｉｎｃ．）またはダイマトレックス・
ブルーＡ（Ｄｙｅｍａｔｒｅｘ Ｂｌｕｅ Ａ， Ａｍ
ｉｃｏｎ）のような染色−リガンドゲルに適用する。使
用前に、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０および
０．０５Ｍ ＫＣｌでゲルを平衡化する。結合した蛋白
を、好ましくは同一緩衝液中、ＫＣｌのステップワイズ
グラジエント（０．０５−２−３．３Ｍ）でレッド−セ
ファロースから、または好ましくは同一緩衝液中ＫＣｌ
の直線グラジエント（０．０５−２．５Ｍ）でブルーＡ
ゲルから溶離する。染色−リガンドクロマトグラフィー
から、ブロードな広い不均整な活性ピークを得る。
【００２９】染色−リガンドゲルから、全活性の約８０
％を含有しているピーク画分を集め、０．０５Ｍ ＫＨ
２ＰＯ４、ｐＨ６．０および０．２Ｍ ＫＣｌで予め平
衡化したウルトラゲルＡｃＡ４４（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｃｓ）のようなタイプのゲルでゲル濾過する。 酵素は単一の活性ピークとして溶出され、デアシラーゼ
の全てを含有しているピーク画分を集める。
％を含有しているピーク画分を集め、０．０５Ｍ ＫＨ
２ＰＯ４、ｐＨ６．０および０．２Ｍ ＫＣｌで予め平
衡化したウルトラゲルＡｃＡ４４（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｃｓ）のようなタイプのゲルでゲル濾過する。 酵素は単一の活性ピークとして溶出され、デアシラーゼ
の全てを含有しているピーク画分を集める。
【００３０】集めた画分を０．０４Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７
．０に調節し、次いで再び、トリスアクリル−ＣＭのよ
うな負に荷電した樹脂で陽イオン交換クロマトグラフィ
ーを行なう。使用前に、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐ
Ｈ７．０および０．０４Ｍ ＫＣｌ緩衝液で樹脂を平衡
化し、結合したデアシラーゼを同一緩衝液中ＫＣｌのス
テップワイズグラジエント（０．０４−０．５−２Ｍ）
で溶離する。１つのブロードな活性ピークおよび１つの
シャープなそれより小さい活性ピークが観察される。こ
れらの２つの活性ピークからの精製酵素画分を、使用時
まで−７０℃で貯蔵することができる。
．０に調節し、次いで再び、トリスアクリル−ＣＭのよ
うな負に荷電した樹脂で陽イオン交換クロマトグラフィ
ーを行なう。使用前に、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐ
Ｈ７．０および０．０４Ｍ ＫＣｌ緩衝液で樹脂を平衡
化し、結合したデアシラーゼを同一緩衝液中ＫＣｌのス
テップワイズグラジエント（０．０４−０．５−２Ｍ）
で溶離する。１つのブロードな活性ピークおよび１つの
シャープなそれより小さい活性ピークが観察される。こ
れらの２つの活性ピークからの精製酵素画分を、使用時
まで−７０℃で貯蔵することができる。
【００３１】ＥＣＢデアシラーゼの精製のための上記８
工程法の間に、２種類のサイズおよび２種類の電荷の形
の酵素が観察される。最後の陽イオン交換クロマトグラ
フィーで得た主要なピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析した結果、２本の近接した遅く移動するバンドと２
本の近接した速く移動するバンドを示した。小さい方の
陽イオン交換クロマトグラフィーピークは、１本の遅く
移動するバンドと２本の速く移動するバンドを示した。 第２の遅く移動するバンドが存在しないことは、この蛋
白がおそらく、第１の遅く移動するバンドからの分解産
物であることを示唆している。
工程法の間に、２種類のサイズおよび２種類の電荷の形
の酵素が観察される。最後の陽イオン交換クロマトグラ
フィーで得た主要なピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析した結果、２本の近接した遅く移動するバンドと２
本の近接した速く移動するバンドを示した。小さい方の
陽イオン交換クロマトグラフィーピークは、１本の遅く
移動するバンドと２本の速く移動するバンドを示した。 第２の遅く移動するバンドが存在しないことは、この蛋
白がおそらく、第１の遅く移動するバンドからの分解産
物であることを示唆している。
【００３２】本発明の精製法によって得られた精製ＥＣ
Ｂデアシラーゼは、リポ環状ペプチドを脱アシル化して
その環状ペプチド核を得るための方法に有用である。具
体的には、この酵素は、シクロヘキサペプチドであるエ
キノカンジンＢおよびアクレアシンを脱アシル化する。 更に、この精製酵素は、ダプトマイシンを包含する環状
ペプチド、Ａ２１９７８抗生物質因子から脂肪酸側鎖を
切断する。
Ｂデアシラーゼは、リポ環状ペプチドを脱アシル化して
その環状ペプチド核を得るための方法に有用である。具
体的には、この酵素は、シクロヘキサペプチドであるエ
キノカンジンＢおよびアクレアシンを脱アシル化する。 更に、この精製酵素は、ダプトマイシンを包含する環状
ペプチド、Ａ２１９７８抗生物質因子から脂肪酸側鎖を
切断する。
【００３３】本発明の方法は、式ＡまたはＢ：
【化２】
［式Ａにおいて、Ｒはリノレオイル、ミリストイルまた
はパルミトイルであり、式Ｂにおいて、Ｒ’はデカノイ
ル、８−メチルデカノイル、１０−メチルウンデカノイ
ルまたは１０−メチルドデカノイルである］で示される
環状ペプチドを、ｐＨ約５〜約７の水性媒質中、約２５
℃〜約７５℃の温度でエキノカンジンＢデアシラーゼと
混合し、ＲおよびＲ’が水素である式ＡまたはＢの化合
物を得ることからなる。
はパルミトイルであり、式Ｂにおいて、Ｒ’はデカノイ
ル、８−メチルデカノイル、１０−メチルウンデカノイ
ルまたは１０−メチルドデカノイルである］で示される
環状ペプチドを、ｐＨ約５〜約７の水性媒質中、約２５
℃〜約７５℃の温度でエキノカンジンＢデアシラーゼと
混合し、ＲおよびＲ’が水素である式ＡまたはＢの化合
物を得ることからなる。
【００３４】この方法は、約５５℃〜約６５℃の温度で
好適に行われる。適当な緩衝液を用いて媒質のｐＨを維
持することができる。例えばＫＣｌまたはＮａＣｌの如
き塩化アルカリ金属、またはＫＮＯ３の如き硝酸アルカ
リ金属のような塩は、酵素の活性に対して好ましい効果
を有するらしく、水性媒質に含有させることができる。 塩は、約０．０５Ｍ〜約３．０Ｍの濃度のＫＣｌである
のが好ましい。
好適に行われる。適当な緩衝液を用いて媒質のｐＨを維
持することができる。例えばＫＣｌまたはＮａＣｌの如
き塩化アルカリ金属、またはＫＮＯ３の如き硝酸アルカ
リ金属のような塩は、酵素の活性に対して好ましい効果
を有するらしく、水性媒質に含有させることができる。 塩は、約０．０５Ｍ〜約３．０Ｍの濃度のＫＣｌである
のが好ましい。
【００３５】基質の水溶解性が低い場合、媒質に水混和
性溶媒を加えてもよい。例えば、エキノカンジンＢは、
水に低い溶解性を有している。その溶解性を高めるため
に、反応媒質にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加
えることができる。ＤＭＳＯはデアシラーゼとも適合す
る。ＥＣＢおよびアクレアシンの場合に示されるように
、通常、約５％〜１５％ｖ：ｖの量でＤＭＳＯを加える
ことができる。
性溶媒を加えてもよい。例えば、エキノカンジンＢは、
水に低い溶解性を有している。その溶解性を高めるため
に、反応媒質にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加
えることができる。ＤＭＳＯはデアシラーゼとも適合す
る。ＥＣＢおよびアクレアシンの場合に示されるように
、通常、約５％〜１５％ｖ：ｖの量でＤＭＳＯを加える
ことができる。
【００３６】この方法は、緩衝化水性媒質で基質の溶液
を調製し、この混合物を反応温度に温め、酵素を加える
ことによって、好適に行なわれる。反応混合物を撹拌す
るか、振盪するか、またはかきまぜて、基質と酵素を十
分接触させる。反応混合物は、後述する分析方法で混合
物の少量を分析することによって、時々モニターするこ
とができる。また、緩衝化酵素溶液に基質の溶液を加え
てもよい。しかしながら、よりよい脱アシル化の結果は
通常、基質に酵素を加えることによって得られる。
を調製し、この混合物を反応温度に温め、酵素を加える
ことによって、好適に行なわれる。反応混合物を撹拌す
るか、振盪するか、またはかきまぜて、基質と酵素を十
分接触させる。反応混合物は、後述する分析方法で混合
物の少量を分析することによって、時々モニターするこ
とができる。また、緩衝化酵素溶液に基質の溶液を加え
てもよい。しかしながら、よりよい脱アシル化の結果は
通常、基質に酵素を加えることによって得られる。
【００３７】反応をモニターすることによって調べた時
、反応の進行が遅すぎるか、または早く終了しすぎたり
した場合、脱アシル化を完全にするために更に新しい酵
素を加えることができる。
、反応の進行が遅すぎるか、または早く終了しすぎたり
した場合、脱アシル化を完全にするために更に新しい酵
素を加えることができる。
【００３８】固定化された酵素で本方法を行なうことも
できる。適当な不活性樹脂支持体に酵素を結合させ、カ
ラムに充填することができる。水性緩衝化溶液をカラム
に負荷し、緩衝液で洗浄すればよい。完全な変換を行な
うために、再び環形成が必要かもしれない。
できる。適当な不活性樹脂支持体に酵素を結合させ、カ
ラムに充填することができる。水性緩衝化溶液をカラム
に負荷し、緩衝液で洗浄すればよい。完全な変換を行な
うために、再び環形成が必要かもしれない。
【００３９】本発明の方法の好ましい態様は、エキノカ
ンジンＢ（式Ａ、Ｒ＝リノレオイル）のエキノカンジン
Ｂ核（式Ａ、Ｒ＝Ｈ）への脱アシル化を包含する。その
他の好ましい態様は、アクレアシン（式Ａ、Ｒ＝パルミ
トイル）のそのＥＣＢ核への脱アシル化を包含する。
ンジンＢ（式Ａ、Ｒ＝リノレオイル）のエキノカンジン
Ｂ核（式Ａ、Ｒ＝Ｈ）への脱アシル化を包含する。その
他の好ましい態様は、アクレアシン（式Ａ、Ｒ＝パルミ
トイル）のそのＥＣＢ核への脱アシル化を包含する。
【００４０】本発明の精製デアシラーゼについて行なわ
れた基質特異性の研究から、式ＡのエキノカンジンＢタ
イプおよび式ＢのＡ２１９７８抗生物質タイプの環状ペ
プチドについて、かなりブロードな特異性が判明した。 Ａ２１９７８基質は、米国特許第４，５３７，７１７号
によって記載された既知の代謝物質である。この核のア
シル化によって製造される、ＥＣＢ核の幾つかの誘導体
もデアシラーゼのための基質であることが見い出された
。 このようなアシル誘導体の例は、Ｒが、パラ位がＣ７Ｈ
１５Ｏ−（３０％）、Ｃ５Ｈ１１Ｏ−（１２％）で置換
されている３−フェニルプロピオニル基であるか；パラ
位がＣ８Ｈ７Ｏ−（３０％）またはＣ１１Ｈ２３Ｃ（Ｏ
）ＮＨ−基（５％）で置換されているフェニルアセチル
基であるか；パラ位がＣ１１Ｈ２３Ｃ（Ｏ）ＮＨ−基で
置換されているベンゾイル基であるか；またはパラ位が
Ｃ１１Ｈ２３Ｃ（Ｏ）ＮＨ−基（１５％）で置換されて
いるシンナモイル基である時、上の式Ａによって表わさ
れる。括弧中の数は、ＥＣＢそれ自体のデアシラーゼ活
性を１００％とした時の活性パーセントである。以下の
実施例は本発明を更に例示および説明するが、その限定
を意図するものではない。
れた基質特異性の研究から、式ＡのエキノカンジンＢタ
イプおよび式ＢのＡ２１９７８抗生物質タイプの環状ペ
プチドについて、かなりブロードな特異性が判明した。 Ａ２１９７８基質は、米国特許第４，５３７，７１７号
によって記載された既知の代謝物質である。この核のア
シル化によって製造される、ＥＣＢ核の幾つかの誘導体
もデアシラーゼのための基質であることが見い出された
。 このようなアシル誘導体の例は、Ｒが、パラ位がＣ７Ｈ
１５Ｏ−（３０％）、Ｃ５Ｈ１１Ｏ−（１２％）で置換
されている３−フェニルプロピオニル基であるか；パラ
位がＣ８Ｈ７Ｏ−（３０％）またはＣ１１Ｈ２３Ｃ（Ｏ
）ＮＨ−基（５％）で置換されているフェニルアセチル
基であるか；パラ位がＣ１１Ｈ２３Ｃ（Ｏ）ＮＨ−基で
置換されているベンゾイル基であるか；またはパラ位が
Ｃ１１Ｈ２３Ｃ（Ｏ）ＮＨ−基（１５％）で置換されて
いるシンナモイル基である時、上の式Ａによって表わさ
れる。括弧中の数は、ＥＣＢそれ自体のデアシラーゼ活
性を１００％とした時の活性パーセントである。以下の
実施例は本発明を更に例示および説明するが、その限定
を意図するものではない。
【００４１】実施例１ ＥＣＢデアシラーゼの製造お
よび精製 Ａ．Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓの
発酵Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ
ＮＲＲＬ １２０５２を、ボエック等（Ｂｏｅｃｋ，Ｌ
．Ｄ．， Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．Ｓ．， Ａｂｂｏｔｔ，
Ｂ．Ｊ．， ａｎｄ Ｄｅｂｏｎｏ，Ｍ．） １９８９
． Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４２，
３８２−３８８によって記載された条件下、１５０リッ
トル発酵槽で増殖させた。 高い活性のエキノカンジンＢデアシラーゼを含有してい
る細胞（接種後９０時間）を遠心によって集め、０．０
５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０で洗浄し、酵素の単離
および精製のために使用した。
よび精製 Ａ．Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓの
発酵Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ
ＮＲＲＬ １２０５２を、ボエック等（Ｂｏｅｃｋ，Ｌ
．Ｄ．， Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．Ｓ．， Ａｂｂｏｔｔ，
Ｂ．Ｊ．， ａｎｄ Ｄｅｂｏｎｏ，Ｍ．） １９８９
． Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４２，
３８２−３８８によって記載された条件下、１５０リッ
トル発酵槽で増殖させた。 高い活性のエキノカンジンＢデアシラーゼを含有してい
る細胞（接種後９０時間）を遠心によって集め、０．０
５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０で洗浄し、酵素の単離
および精製のために使用した。
【００４２】Ｂ．酵素の可溶化および精製特に断らない
限り、約０℃〜４℃の温度で以下の分離精製法を行なっ
た。９０時間で発酵培地１００リットルの検定を行なっ
たところ、実質上全てのデアシラーゼ活性が細胞に関連
していることを示した。この実施例で使用した検定法を
以下に記載する。
限り、約０℃〜４℃の温度で以下の分離精製法を行なっ
た。９０時間で発酵培地１００リットルの検定を行なっ
たところ、実質上全てのデアシラーゼ活性が細胞に関連
していることを示した。この実施例で使用した検定法を
以下に記載する。
【００４３】新鮮な細胞（７．９ｋｇ湿重量）を０．０
５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０および０．８ＭＫＣｌ
に再懸濁して５７リットルの総容量とし、この懸濁液を
連続して１日間撹拌した。この塩処理によって、大部分
の細胞関連デアシラーゼ活性が選択的に可溶化した。
５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０および０．８ＭＫＣｌ
に再懸濁して５７リットルの総容量とし、この懸濁液を
連続して１日間撹拌した。この塩処理によって、大部分
の細胞関連デアシラーゼ活性が選択的に可溶化した。
【００４４】可溶化したデアシラーゼをワットマンＮｏ
．１ペーパーで濾過し、濾液をアミコンＹＭ３０スパイ
ラル限外濾過カートリッジで３．３リットル容量に濃縮
した。濃縮された抽出物を６０℃で１時間加熱した。
．１ペーパーで濾過し、濾液をアミコンＹＭ３０スパイ
ラル限外濾過カートリッジで３．３リットル容量に濃縮
した。濃縮された抽出物を６０℃で１時間加熱した。
【００４５】熱処理した酵素抽出物を１４％濃度の（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４および１．２Ｍ ＫＣｌで処理し、０．
０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０、１．２ＭＫＣｌお
よび１４％（ＮＨ４）２ＳＯ４で予め平衡化したオクチ
ル−セファロースカラム（５×３６ｃｍ）に負荷した。 カラムを２倍床容量の同一緩衝液で洗浄し、結合してい
る蛋白を０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０中、Ｋ
Ｃｌ（１．２−０．１Ｍ）および（ＮＨ４）２ＳＯ４（
１４−０％）の同時直線グラジエントで溶離した。この
クロマトグラフィー（疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー）を約２５℃の温度で行なった。ＥＣＢデアシラーゼ
は、単一であるが不均整な活性ピークとして溶出された
。
Ｈ４）２ＳＯ４および１．２Ｍ ＫＣｌで処理し、０．
０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０、１．２ＭＫＣｌお
よび１４％（ＮＨ４）２ＳＯ４で予め平衡化したオクチ
ル−セファロースカラム（５×３６ｃｍ）に負荷した。 カラムを２倍床容量の同一緩衝液で洗浄し、結合してい
る蛋白を０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０中、Ｋ
Ｃｌ（１．２−０．１Ｍ）および（ＮＨ４）２ＳＯ４（
１４−０％）の同時直線グラジエントで溶離した。この
クロマトグラフィー（疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー）を約２５℃の温度で行なった。ＥＣＢデアシラーゼ
は、単一であるが不均整な活性ピークとして溶出された
。
【００４６】全デアシラーゼ活性の９５％を含有してい
るピーク画分を集め、（ＮＨ４）２ＳＯ４で分画した。 １０−３６％（ＮＨ４）２ＳＯ４画分を、０．０５Ｍ
ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０および０．８Ｍ ＫＣｌ（緩
衝液Ａ）で予め平衡化したセファクリルＳ−２００ＨＲ
カラム（５×６９ｃｍ）に負荷した。デアシラーゼは、
主要な活性ピークおよびそれより小さい活性ピークとし
て溶出された。主要なピークから酵素活性の９０％を含
有しているピーク画分を集め、０．０５Ｍ ＫＣｌ、ｐ
Ｈ５．６に調節し、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ５
．６および０．０５Ｍ ＫＣｌ（緩衝液Ｂ）で予め平衡
化したトリアスクリル−ＣＭカラム（２．５×３３ｃｍ
）に負荷した。カラムを２倍床容量の緩衝液Ｂで洗浄し
、結合している蛋白を緩衝液Ｂ中、ＫＣｌの直線グラジ
エント（０．０５−０．５Ｍ）で溶離した。 デアシラーゼは、２つの活性ピークとして溶出された。
るピーク画分を集め、（ＮＨ４）２ＳＯ４で分画した。 １０−３６％（ＮＨ４）２ＳＯ４画分を、０．０５Ｍ
ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０および０．８Ｍ ＫＣｌ（緩
衝液Ａ）で予め平衡化したセファクリルＳ−２００ＨＲ
カラム（５×６９ｃｍ）に負荷した。デアシラーゼは、
主要な活性ピークおよびそれより小さい活性ピークとし
て溶出された。主要なピークから酵素活性の９０％を含
有しているピーク画分を集め、０．０５Ｍ ＫＣｌ、ｐ
Ｈ５．６に調節し、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ５
．６および０．０５Ｍ ＫＣｌ（緩衝液Ｂ）で予め平衡
化したトリアスクリル−ＣＭカラム（２．５×３３ｃｍ
）に負荷した。カラムを２倍床容量の緩衝液Ｂで洗浄し
、結合している蛋白を緩衝液Ｂ中、ＫＣｌの直線グラジ
エント（０．０５−０．５Ｍ）で溶離した。 デアシラーゼは、２つの活性ピークとして溶出された。
【００４７】２つのピークのそれぞれからデアシラーゼ
活性を含有している画分を集め、ピーク毎に集めた。こ
の２つの酵素プールを０．０５Ｍ ＫＣｌに調節し、一
方のプールをレッド−セファロースカラム（３．２×１
５．５ｃｍ）に、他方をダイマトレックス・ブルーＡカ
ラム（２．２×２２ｃｍ）に負荷した。両方のカラムを
、０．０５ＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０および０．０５
Ｍ ＫＣｌ（緩衝液Ｃ）で予め平衡化した。両方のカラ
ムを２倍床容量の緩衝液Ｃで洗浄した後、結合している
蛋白を、緩衝液Ｃ中ＫＣｌのステップワイズグラジエン
ト（０．０５−２−３．３Ｍ）でレッド−セファロース
カラムから、緩衝液Ｃ中ＫＣｌの直線グラジエント（０
．０５−２．５Ｍ）でブルーＡカラムから溶離した。各
染色−リガンドクロマトグラフィーから、ブロードかつ
不均整な活性ピークが観察された。
活性を含有している画分を集め、ピーク毎に集めた。こ
の２つの酵素プールを０．０５Ｍ ＫＣｌに調節し、一
方のプールをレッド−セファロースカラム（３．２×１
５．５ｃｍ）に、他方をダイマトレックス・ブルーＡカ
ラム（２．２×２２ｃｍ）に負荷した。両方のカラムを
、０．０５ＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０および０．０５
Ｍ ＫＣｌ（緩衝液Ｃ）で予め平衡化した。両方のカラ
ムを２倍床容量の緩衝液Ｃで洗浄した後、結合している
蛋白を、緩衝液Ｃ中ＫＣｌのステップワイズグラジエン
ト（０．０５−２−３．３Ｍ）でレッド−セファロース
カラムから、緩衝液Ｃ中ＫＣｌの直線グラジエント（０
．０５−２．５Ｍ）でブルーＡカラムから溶離した。各
染色−リガンドクロマトグラフィーから、ブロードかつ
不均整な活性ピークが観察された。
【００４８】レッド−セファロースのピークから全デア
シラーゼ活性の８０％を含有しているピーク画分を集め
、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０、および０．
２Ｍ ＫＣｌ（緩衝液Ｄ）で予め平衡化したウルトラゲ
ルＡｃ４４カラム（１×１１８ｃｍ）に負荷した。デア
シラーゼは、単一の活性ピークとして溶出された。
シラーゼ活性の８０％を含有しているピーク画分を集め
、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０、および０．
２Ｍ ＫＣｌ（緩衝液Ｄ）で予め平衡化したウルトラゲ
ルＡｃ４４カラム（１×１１８ｃｍ）に負荷した。デア
シラーゼは、単一の活性ピークとして溶出された。
【００４９】デアシラーゼ活性の全てを含有しているピ
ーク画分を集め、０．０４Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０に調
節し、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、および
０．０４Ｍ ＫＣｌ（緩衝液Ｅ）で予め平衡化したトリ
スアクリル−ＣＭカラム（１×３４ｃｍ）に負荷した。 ２倍床容量の緩衝液Ｅでカラムを洗浄した後、結合して
いる蛋白を、緩衝液Ｅ中ＫＣｌのステップ−ワイズグラ
ジエント（０．０４−０．５−２Ｍ）で溶離した。１つ
のブロードな主要な活性ピークおよび１つのシャープな
小さい活性ピークが観察された。この２つの活性ピーク
からの画分を、必要時までそれぞれ−７０℃で貯蔵した
。
ーク画分を集め、０．０４Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０に調
節し、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、および
０．０４Ｍ ＫＣｌ（緩衝液Ｅ）で予め平衡化したトリ
スアクリル−ＣＭカラム（１×３４ｃｍ）に負荷した。 ２倍床容量の緩衝液Ｅでカラムを洗浄した後、結合して
いる蛋白を、緩衝液Ｅ中ＫＣｌのステップ−ワイズグラ
ジエント（０．０４−０．５−２Ｍ）で溶離した。１つ
のブロードな主要な活性ピークおよび１つのシャープな
小さい活性ピークが観察された。この２つの活性ピーク
からの画分を、必要時までそれぞれ−７０℃で貯蔵した
。
【００５０】以下の表３は、上で詳述したＥＣＢデアシ
ラーゼの分離および精製の各工程で得られた結果を示す
。
ラーゼの分離および精製の各工程で得られた結果を示す
。
【表３】
【００５１】前記のように、トリスアクリル−ＣＭによ
る第１および第２の陽イオン交換クロマトグラフィーで
は２つの活性ピークが観察された。第１のクロマトグラ
フィーの２つのピーク、ＡおよびＢの各々から画分を集
め、示されたようにして別個に分析した。集めたＡ画分
をレッド−セファロース染色−リガンドクロマトグラフ
ィー（Ａ１）にかけ、一方、第２の活性ピークＢの画分
をダイマトレックス・ブルーＡ染色−リガンドクロマト
グラフィー（Ｂ１）にかけた。それぞれの染色−リガン
ドクロマトグラフィーの溶出液を分析した時、レッド−
セファロース処理では比活性が上昇したが、ブルーＡで
は比活性がわずかしか上昇しなかった。従って、この場
合、ウルトロゲル濾過（Ａｌａ）、次いでトリスアクリ
ル−ＣＭによる陽イオン交換クロマトグラフィーによっ
て更に精製するために、レッド−セファロースカラムの
溶出液が選択された。前記陽イオン交換クロマトグラフ
ィーの場合と同様に、２つの活性ピーク（酵素形）を集
め、別個に検定した。
る第１および第２の陽イオン交換クロマトグラフィーで
は２つの活性ピークが観察された。第１のクロマトグラ
フィーの２つのピーク、ＡおよびＢの各々から画分を集
め、示されたようにして別個に分析した。集めたＡ画分
をレッド−セファロース染色−リガンドクロマトグラフ
ィー（Ａ１）にかけ、一方、第２の活性ピークＢの画分
をダイマトレックス・ブルーＡ染色−リガンドクロマト
グラフィー（Ｂ１）にかけた。それぞれの染色−リガン
ドクロマトグラフィーの溶出液を分析した時、レッド−
セファロース処理では比活性が上昇したが、ブルーＡで
は比活性がわずかしか上昇しなかった。従って、この場
合、ウルトロゲル濾過（Ａｌａ）、次いでトリスアクリ
ル−ＣＭによる陽イオン交換クロマトグラフィーによっ
て更に精製するために、レッド−セファロースカラムの
溶出液が選択された。前記陽イオン交換クロマトグラフ
ィーの場合と同様に、２つの活性ピーク（酵素形）を集
め、別個に検定した。
【００５２】酵素検定
デアシラーゼ活性を決定および測定するために本発
明で使用した検定は、基質としてエキノカンジンＢを使
用する。ＥＣＢデアシラーゼ検定のための代表的反応混
合物１ｍｌは、ＥＣＢの溶液を調製するために、０．６
８Ｍ ＫＣｌおよび１５％ＤＭＳＯの存在下、０．０５
Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０中に、ＥＣＢ４２５μモ
ルおよび酵素０．０００００３〜０．００３単位を含有
した。酵素反応は、酵素を加えることによって開始され
、リン酸を加えて停止されるまで６０℃で２０分間続け
られた。低速遠心して沈殿した蛋白を除去した後、ＨＰ
ＬＣを使用し、２２５ｎｍでＥＣＢ核の形成をモニター
することによって、デアシラーゼ活性を測定した。
明で使用した検定は、基質としてエキノカンジンＢを使
用する。ＥＣＢデアシラーゼ検定のための代表的反応混
合物１ｍｌは、ＥＣＢの溶液を調製するために、０．６
８Ｍ ＫＣｌおよび１５％ＤＭＳＯの存在下、０．０５
Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０中に、ＥＣＢ４２５μモ
ルおよび酵素０．０００００３〜０．００３単位を含有
した。酵素反応は、酵素を加えることによって開始され
、リン酸を加えて停止されるまで６０℃で２０分間続け
られた。低速遠心して沈殿した蛋白を除去した後、ＨＰ
ＬＣを使用し、２２５ｎｍでＥＣＢ核の形成をモニター
することによって、デアシラーゼ活性を測定した。
【００５３】ＨＰＬＣの構成要素は、ＩＢＭ ＰＳ／
２モデル８０およびカラー・ディスプレイ（Ｃｏｌｏｒ
Ｄｉｓｐｌａｙ， ＩＢＭ，Ａｒｍｏｎｋ， Ｎ．Ｙ
．）、ウォーター７１５ウルトラＷＩＳＰサンプル・プ
ロセッサー（Ｗａｔｅｒ ７１５ Ｕｌｔｒａ ＷＩＳ
Ｐ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ， Ｗａｔｅｒ
ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ
）、およびベックマン・システム・ゴールド・プログラ
マブル・ソルベント・モジュール１２６（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌ
ｅ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ １２６）およびス
キャンニング・ディテクター・モジュール１６７（Ｓｃ
ａｎｎｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｍｏｄｕｌｅ １６
７， Ｂｅｃｋｍａｎ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ
）であった。
２モデル８０およびカラー・ディスプレイ（Ｃｏｌｏｒ
Ｄｉｓｐｌａｙ， ＩＢＭ，Ａｒｍｏｎｋ， Ｎ．Ｙ
．）、ウォーター７１５ウルトラＷＩＳＰサンプル・プ
ロセッサー（Ｗａｔｅｒ ７１５ Ｕｌｔｒａ ＷＩＳ
Ｐ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ， Ｗａｔｅｒ
ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ
）、およびベックマン・システム・ゴールド・プログラ
マブル・ソルベント・モジュール１２６（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌ
ｅ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ １２６）およびス
キャンニング・ディテクター・モジュール１６７（Ｓｃ
ａｎｎｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｍｏｄｕｌｅ １６
７， Ｂｅｃｋｍａｎ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ
）であった。
【００５４】アペックス・オクタデシル３μ（Ａｐｅｘ
Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ３μ）カラム（４．６×１０ｃｍ
）（Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｌ
ｉｔｔｌｅｔｏｎ， Ｃｏ．）から、３．９％ ＣＨ３
ＣＮ／０．１％ トリフルオロ酢酸の移動相および１ｍ
ｌ／分の流速でＥＣＢ核を溶離した。核の形成は、検定
の間、時間について直線状であった。ＨＰＬＣ分析を２
回行なった結果、平均２−３％の偏差があった。本明細
書で使用する時、酵素活性１単位は、上記の反応条件下
、ＥＣＢから１分間当たり１マイクロモルのＥＣＢ核を
形成させるのに必要なデアシラーゼの量として定義され
る。
Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ３μ）カラム（４．６×１０ｃｍ
）（Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｌ
ｉｔｔｌｅｔｏｎ， Ｃｏ．）から、３．９％ ＣＨ３
ＣＮ／０．１％ トリフルオロ酢酸の移動相および１ｍ
ｌ／分の流速でＥＣＢ核を溶離した。核の形成は、検定
の間、時間について直線状であった。ＨＰＬＣ分析を２
回行なった結果、平均２−３％の偏差があった。本明細
書で使用する時、酵素活性１単位は、上記の反応条件下
、ＥＣＢから１分間当たり１マイクロモルのＥＣＢ核を
形成させるのに必要なデアシラーゼの量として定義され
る。
【００５５】比活性（表３）は、蛋白１ｍｇ当たりの単
位として定義される。蛋白含有量は、標準としてウシ血
清アルブミンを使用するブラッドフォードの方法（Ｂｒ
ａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，（１９７６） Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４）によって決定さ
れた。
位として定義される。蛋白含有量は、標準としてウシ血
清アルブミンを使用するブラッドフォードの方法（Ｂｒ
ａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，（１９７６） Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４）によって決定さ
れた。
Claims (10)
- 【請求項１】 約１０Ｕ／ｍｇ〜約１１．２５Ｕ／ｍ
ｇの比活性を有し、アミノ末端配列：Ｓｅｒ−Ａｓｎ−
Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−（Ｔｒｐ）−Ｇｌ
ｎ−−−Ａｌａ−Ｇｌｕ−（Ａｒｇ）−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ
を有する６３−キロダルトンのサブユニットおよびアミ
ノ末端配列：Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−（Ｐｒｏ）
−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅを有する１８−キロダルトンのサブユニットを有
し、基質としてのエキノカンジンＢの脱アシル化におい
て、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中、約ｐＨ６．０
、約６０℃で至適触媒活性を示す、以下のアミノ酸組成
： を有する８１−キロダルトンのヘテロダイマーである、
精製エキノカンジンＢデアシラーゼ。 - 【請求項２】 １）約ｐＨ６．０で緩衝化された粗製
デアシラーゼの水性溶液を約６０℃の温度で約１時間加
熱し、２）ｐＨ６．０、１．２Ｍ ＫＣｌおよび１４％
（ＮＨ４）２ＳＯ４で緩衝化された熱処理抽出物を、疎
水性相互作用クロマトグラフィーにてクロマトグラフし
、３）工程３からのデアシラーゼ活性の９５％を含有し
ている溶出液を（ＮＨ４）２ＳＯ４によって分画して、
１０％〜３６％（ＮＨ４）２ＳＯ４画分を分離し、４）
該（ＮＨ４）２ＳＯ４画分を、０．８Ｍ ＫＣｌを含有
しているｐＨ６．０の緩衝液中でゲル濾過して、デアシ
ラーゼ活性の９０％を含有している溶出液画分を合し、
５）該画分を、ｐＨ５．６、０．０５Ｍ ＫＣｌ緩衝液
中、陽イオン交換クロマトグラフィーでクロマトグラフ
して、該クロマトグラフィーは該緩衝液中ＫＣｌの直線
グラジエント（０．０５−０．５Ｍ）で溶離し、６）工
程５のデアシラーゼ含有溶出液を０．０５Ｍ ＫＣｌに
調節して、該溶出液を、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐ
Ｈ６．０および０．０５Ｍ ＫＣｌ緩衝液中、染色−リ
ガンドクロマトグラフィーでクロマトグラフし、該クロ
マトグラフィーはＫＣｌの直線グラジエント（０．０５
Ｍ−２．５Ｍ）で溶離し、７）デアシラーゼ活性の８０
％を含有している工程６からの集めた溶出画分を０．０
５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０および０．２Ｍ ＫＣ
ｌ緩衝液中でゲル濾過し、８）工程７のデアシラーゼ含
有溶出液を０．０４Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７に調節して、該
溶出液を、０．０５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０およ
び０．０４Ｍ ＫＣｌ緩衝液中、陽イオン交換クロマト
グラフィーでクロマトグラフし、ＫＣｌのステップ−ワ
イズグラジエント（０．０４−０．５−２Ｍ）で精製デ
アシラーゼを溶離することからなる、請求項１の精製デ
アシラーゼの製造法。 - 【請求項３】 式ＡまたはＢ： 【化１】 ［式Ａにおいて、Ｒはリノレオイル、ミリストイルまた
はパルミトイルであり、式Ｂにおいて、Ｒ’はデカノイ
ル、８−メチルデカノイル、１０−メチルウンデカノイ
ルまたは１０−メチルドデカノイルである］で示される
環状ペプチドを、ｐＨ約５〜約７の水性媒質中、約２５
℃〜約７５℃の温度で請求項１の精製デアシラーゼと混
合し、ＲまたはＲ’が水素である式ＡまたはＢの化合物
を得ることからなる、該環状ペプチドの脱アシル化法。 - 【請求項４】 温度が約５５℃から約６５℃で維持さ
れる請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 水性媒質が塩化アルカリ金属または硝
酸アルカリ金属から選ばれる無機塩を含有する請求項３
に記載の方法。 - 【請求項６】 塩が約０．１Ｍから約３．０Ｍの濃度
の塩化カリウムである請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 式Ａにおいて、Ｒがリノレオイルであ
る請求項３に記載の方法。 - 【請求項８】 式Ａにおいて、Ｒがパルミトイルであ
る請求項３に記載の方法。 - 【請求項９】 式Ｂにおいて、Ｒ’がデカノイルであ
る請求項３に記載の方法。 - 【請求項１０】 水性媒質が約５％〜約１５％の濃度
でジメチルスルホキシドを含有する請求項３に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53439490A | 1990-06-07 | 1990-06-07 | |
| US534,394 | 1990-06-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04228072A true JPH04228072A (ja) | 1992-08-18 |
| JP2994486B2 JP2994486B2 (ja) | 1999-12-27 |
Family
ID=24129856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3132622A Expired - Fee Related JP2994486B2 (ja) | 1990-06-07 | 1991-06-04 | リポペプチドデアシラーゼ |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5573936A (ja) |
| EP (1) | EP0460882B1 (ja) |
| JP (1) | JP2994486B2 (ja) |
| KR (1) | KR0169994B1 (ja) |
| AT (1) | ATE140728T1 (ja) |
| CA (1) | CA2043762C (ja) |
| DE (1) | DE69121018T2 (ja) |
| DK (1) | DK0460882T3 (ja) |
| ES (1) | ES2089133T3 (ja) |
| GR (1) | GR3021292T3 (ja) |
| HU (1) | HU215232B (ja) |
| IE (1) | IE75885B1 (ja) |
| IL (1) | IL98349A (ja) |
| TW (1) | TW197471B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997032975A1 (en) * | 1996-03-08 | 1997-09-12 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for the deacylation of cyclic lipopeptides |
| WO2014044803A1 (en) | 2012-09-24 | 2014-03-27 | Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Method for producing a cyclic peptide |
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| EP0933422A4 (en) * | 1996-06-13 | 2005-02-02 | Fujisawa Pharmaceutical Co | CYCLIC LIPOPEPTIDE ACYLASE |
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| US6361988B1 (en) | 1997-03-25 | 2002-03-26 | California Institute Of Technology | ECB deacylase mutants |
| US5936074A (en) * | 1997-04-17 | 1999-08-10 | Eli Lilly And Company | Teicoplanin deacylation process and product |
| US6323176B1 (en) | 1998-02-25 | 2001-11-27 | Eli Lilly And Company | Cyclic peptide antifungal agents |
| DK1137663T3 (da) | 1998-12-09 | 2007-01-08 | Lilly Co Eli | Oprensning af Echinocandin-cyclopeptidforbindelser |
| ATE248187T1 (de) | 1999-03-03 | 2003-09-15 | Lilly Co Eli | Echinocandin-kohlenhydrate-komplexe |
| HK1040062A1 (zh) | 1999-03-03 | 2002-05-24 | Eli Lilly And Company | 含有成胶束表面活性剂的棘白菌素药物配方 |
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| AU767956B2 (en) | 1999-03-03 | 2003-11-27 | Eli Lilly And Company | Formation and anion-exchange of crystalline echinocandin ammonium salts |
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